CN118490724A - 一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用 - Google Patents
一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用。本发明利用安全性高的瑞士乳杆菌LZ‑R‑5及其生产的胞外多糖能够调控肠道菌群结构与功能，减少有害菌，提高有益菌丰度。在小鼠模型中，改善了溃疡性结肠炎，对于葡聚糖硫酸钠引起的肠道炎症、粪便隐血、肠渗漏和菌群失调等病症具有显著的效果。同时，丰富了微生物及其胞外多糖的应用方向，利用具有肠道菌群调节作用的瑞士乳杆菌LZ‑R‑5，对益生菌的开发及其在药物、食品上的应用具有积极意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用。
背景技术
乳酸菌是一类能够通过发酵糖类物质产生乳酸的细菌，广泛存在于自然界中，包括人类和动物的肠道中。它们在食品加工、医药和畜牧业等多个领域都有重要的应用。乳酸菌发酵可以赋予食品独特的风味口感并改善产品的质地营养，同时能够降解蛋白、乳糖，生成具有益生功能的次级代谢产物。
瑞士乳杆菌是乳酸菌的一种，具有公认的安全性和益生特性，在调节肠道菌群平衡和调节机体免疫特性、增强肠道定殖能力等方面能够发挥重要作用。其发酵生产的胞外多糖，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗炎症、降低胆固醇等免疫调节功能，能够影响肠道菌群和宿主的免疫反应。
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性、非感染性的炎症性肠道疾病，主要影响结肠(大肠)的黏膜及黏膜下层，伴有特征性溃疡或开放性损伤，临床主要表现为黏液脓血便、腹泻、腹痛、体重减轻等。尽管针对溃疡性结肠炎已有常规的治疗策略和药物，但在控制炎症和维持疾病缓解时，并不能缓解肠道生态失调的问题。因此开发具有肠道菌群调节作用的瑞士乳杆菌产品，对抑制肠道有害菌繁殖、促进有益菌生长，以及维护动物或人体肠道微生态平衡具有积极的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用。
其中，所述的瑞士乳杆菌，其分类命名为瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus，菌株号为LZ-R-5，保藏编号为CGMCC No.17870，已于2019年5月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的详细信息已公开在专利CN114196561A中。
其中，所述的肠道菌群包括科水平的Bacteroidaceae、Marinifilaceae、Lactobacillaceae中的任意或几种的组合、属水平的Erysipelatoclostridium、Roseburiaspp.、Clostridium leptum和Christensenellaceae中的任意或几种的组合。
其中，所述的人或动物为患有溃疡性结肠炎的人或动物。
其中，所述的产品包括食品、药品中的任意一种。
具体的，将产胞外多糖的瑞士乳杆菌制备成活菌数为108～109CFU/mL菌剂，或将产胞外多糖的瑞士乳杆菌制备成灭活菌体OD600为1.2～1.6的菌剂，或将产胞外多糖的瑞士乳杆菌制备成胞外多糖浓度为5～20mg/mL的菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述的产胞外多糖的瑞士乳杆菌在调节肠道菌群中得具体表现为：
(1)所述的产胞外多糖的瑞士乳杆菌菌体及其产生的胞外多糖在体外厌氧发酵中提高了短链脂肪酸的产量。
(2)所述的产胞外多糖的瑞士乳杆菌菌体及其产生的胞外多糖在体外厌氧发酵中减少了有害菌的比例，提高了乳杆菌和双歧杆菌等有益菌的丰度。
(3)所述的产胞外多糖的瑞士乳杆菌可以缓解葡聚糖硫酸钠引起的肠道炎症和粪便隐血。
(4)所述的产胞外多糖的瑞士乳杆菌可以缓解葡聚糖硫酸钠引起的肠渗漏和菌群失调。
有益效果：本发明利用安全性高的瑞士乳杆菌LZ-R-5及其生产的胞外多糖能够调控肠道菌群结构与功能，减少有害菌，例如炎性相关菌的比例，提高有益菌，例如乳杆菌和双歧杆菌等的丰度。在小鼠模型中，改善了溃疡性结肠炎，对于葡聚糖硫酸钠引起的肠道炎症、粪便隐血、肠渗漏和菌群失调等病症具有显著的效果。为后续利用具有肠道菌群调节作用的瑞士乳杆菌LZ-R-5对益生菌的开发及其在药物、食品上的应用产生积极的意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为瑞士乳杆菌LZ-R-5及其胞外多糖在厌氧发酵中对短链脂肪酸的影响。
图2为瑞士乳杆菌LZ-R-5及其胞外多糖在厌氧发酵中对pH的影响。
图3为小鼠结肠炎造模流程图。其中，即Normal control，缩写NC，为正常对照组、DSS control，缩写DC，为葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎对照组、DH为高浓度瑞士乳杆菌溶液组)、DL为低浓度瑞士乳杆菌溶液组。
图4为结肠炎小鼠体重变化图。
图5为结肠炎小鼠疾病活动指数和DAI曲线积分图。
图6为结肠炎小鼠结肠长度变化图。
图7为结肠炎小鼠粪便SCFAs浓度。对于相同的SCFA，每一组的浓度按顺时针降序排列，弧长代表酸的总量。
图8为结肠炎小鼠组织和血清炎症因子水平图。其中，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。MPO：髓过氧化物酶、TNF-α：肿瘤坏死因子-α、IL-6：白介素-6、IL-1β：白介素-1β、IL-10：白介素-10。
图9为结肠炎小鼠肠道群落科水平的丰度弦图(按顺时针降序排列)。
图10为有差异的十个科的丰度气泡图，气泡颜色代表门级分类。
图11为组间差异显著的前六个属的柱状图。
图12为Christennelleae、Roseburia spp.和Clostridium leptum物种相对含量对数正态分布散点图，红色和黑色虚线分别为组内、组间的平均值。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述的MRS培养基、脱脂牛奶均为市售产品，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述的瑞士乳杆菌LZ-R-5，其分类命名为瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus，菌株号为LZ-R-5，保藏编号为CGMCC No.17870，已于2019年5月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株的详细信息已公开在专利CN114196561A中。
实施例1：瑞士乳杆菌LZ-R-5发酵产胞外多糖(EPS)
(1)菌株种子液的制备：将瑞士乳杆菌LZ-R-5接种于MRS培养基中，在37℃培养24h获得菌株种子液。
(2)发酵培养：将步骤(1)获得的菌株种子液按照2％的体积比接种量接种于脱脂牛奶中，在37℃发酵培养，获得发酵液。
(3)胞外多糖的提取：将步骤(2)获得的发酵液以10000rpm离心15min后收集上清液，添加TCA至浓度为4％(w/v)，4℃静置6h后，10000rpm离心10min后去除蛋白沉淀。浓缩上清液至原体积的1/6，加入三倍体积的无水乙醇静置过夜，10000rpm离心10min得到的沉淀溶于适量去离子水。4℃透析3d，透析液冻干后即可得到EPS。该菌株在MRS培养基发酵24h胞外多糖R-5-EPS产量达126mg/L。
实施例2：瑞士乳杆菌LZ-R-5及其胞外多糖体外厌氧发酵实验
采集六名年龄在20～30岁之间的健康志愿者(三名女性和三名男性)提供的粪便样本，志愿者至少三个月没有服用抗生素。将每位志愿者的新鲜粪便样本(20g)与20mL无菌改性生理盐水迅速混合，在4℃下300rpm低速离心5min。收集每份粪便样品的上清液(10％)，将六份样品混合后得到粪便悬浮液。
设置五组体外厌氧发酵实验，发酵于10mL三角瓶中进行，每组样品平行5次。空白组(Control)：将0.5mL粪便悬浮液加入4.5mL基础营养培养基中。阳性对照组(Inulin)：将0.5mL粪便悬浮液加入含有50mg菊糖的4.5mL基础营养培养基中。多糖样品组(R-5-EPS)：将0.5mL粪便悬浮液加入含有50mg R-5-EPS的4.5mL基础营养培养基中。瑞士乳杆菌样品组1(LZ-R-5-Live)：将0.5mL粪便悬浮液加入含有LZ-R-5活菌的4.5mL基础营养培养基中，其中，瑞士乳杆菌的终浓度为1×108CFU/mL。瑞士乳杆菌样品组2(LZ-R-5-Dead)：将0.5mL粪便悬浮液加入含有OD600＝1.0的LZ-R-5热灭活菌体的4.5mL基础营养培养基中。
将所有的实验组加入厌氧盒内，摆放整齐，然后加入厌氧包，厌氧指示剂，迅速密封，置于37℃培养箱培养24h，获得不同的粪便发酵液。
待厌氧发酵培养结束后，取粪便发酵液在10,000rpm下离心5min。然后取发酵上清液置于相应的离心管中，将发酵上清液通过0.22μm的滤膜进行过滤，备用。用配备了二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1200型高效液相色谱仪(HPLC)进行发酵上清液的短链脂肪酸(SCFAs)浓度分析。色谱条件：Beckman Ultrasphere色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱箱温度设定为30℃；流动相为：A：20mM KH2PO4溶液(用H3PO4调节pH到2.5)，B：甲醇；运行梯度：0-16min，A为95％，B为5％；16-30min，A从95％到70％，B从5％到30％；30-50min，A为70％，B为30％；流速设置为0.8mL/min。
(1)体外厌氧发酵中短链脂肪酸和pH的变化。
体外厌氧发酵24h后，从图1可以看出，所述菌株菌体及其产生的胞外多糖在体外厌氧发酵中提高了乙酸、丙酸等短链脂肪酸的产量，其中乙酸含量显著增加，从57.0μM显著增加到160.0μM(P<0.05)，总酸含量从134.3μM增加到220.3μM。与空白组相比，添加了LZ-R-5胞外多糖R-5-EPS的体外厌氧发酵体系中，乙酸和总酸含量显著提高，其中乙酸从71μM增加到160μM(P<0.05)，总酸从134.3μM增加到222.3μM(P<0.05)；添加了LZ-R-5活菌的体外厌氧发酵体系中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸的产量都有一定量的增加，其中丙酸显著增加，从5.0μM显著增加到16.0μM(P<0.05)；添加了LZ-R-5热灭活菌体的体外厌氧发酵体系中丙酸和丁酸的产量都显著增加，丙酸从5.0μM显著增加到26.0μM(P<0.05)，丁酸从0.3μM显著增加到0.8μM(P<0.05)。另外，瑞士乳杆菌LZ-R-5活菌、热灭活菌体及其胞外多糖通过促进有机酸产生，使体系pH值接近益生元菊糖组(图2)，这有利于抑制有害菌粘附与成膜，调节发酵粪菌体系中微生物的群落共生与代谢。
(2)体外厌氧发酵体系中肠道微生物菌群分析。
体外厌氧发酵24h后，将空白组、阳性对照组、多糖样品组、瑞士乳杆菌样品组1和瑞士乳杆菌样品组2共五组粪便发酵液取出，转移到10mL无菌离心管，12,000rpm离心5min。用DNA提取试剂盒提取沉淀中菌体的总DNA，并扩增16S rDNA的V3和V4高变区。扩增所用引物序列为338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806F：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。所有的DNA样品由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析工作。将样品通过Miseq测序得到双端序列数据，然后通过reads拼接(merge)成一条序列。然后使用FLASH、Trimmomatic软件进行数据的去杂和优化。将得到的非重复序列用Uparse软件按照97％相似性进行OTU(OperationalTaxonomic Units)聚类分析。群落Heatmap图、PCA分析用R语言工具进行统计和作图。
根据在门水平的基于Bray-Curtis距离矩阵的瑞士乳杆菌LZ-R-5及其胞外多糖厌氧发酵样本聚类结果可知，空白组(NFB)和多糖组YX_5聚在一类中，菊糖阳性对照组(CFB)和乳杆菌(YX_5L、YX_5D)组聚在一类中，且各组之间菌群结构差异明显。这表明空白组和多糖组的微生物多样性相似，阳性对照组和乳杆菌组微生物多样性相似，且相互之间存在一定的差异性。同时发现，Bacteroidetes和Proteobacteria是样品中粪便微生物群的主要细菌门，具有潜在抗炎功能，而Firmicutes和Fusobacteria的丰度相对较低，与样品组有害菌减少有关。通过对瑞士乳杆菌LZ-R-5及其胞外多糖厌氧发酵生物多样性的主坐标分析发现，阳性对照组(CFB)和乳杆菌(YX_5L、YX_5D)组之间的距离接近，物种组成相似，空白组(NFB)和多糖组(YX_5)的物种组成接近。横纵坐标解释了样品组成差异值为75.06％(PC1：59.01％和PC2：16.05％)，表明微生物组成响应L.helveticus LZ-R-5参与厌氧发酵呈现明显变化。
实施例3：结肠炎小鼠实验
动物实验条件：环境温度23～25℃，湿度70～75％，明暗循环12小时。驯化一周后，将6周龄SPF级雄性BALB/c小鼠(购于北京维通利华)四组：NC(正常对照组，即Normalcontrol)、DC(葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎对照组，即DSS control)，DH(高浓度瑞士乳杆菌溶液组)和DL(低浓度瑞士乳杆菌溶液组)，每组10只。NC和DC组用生理盐水灌胃，而DH和DL从第8天开始接受109和108个CFU细菌(0.2mL/小鼠/天)。对于DC、DH和DL组，在第12天后使用5％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液代替饮用水。记录体重和粪便状况以评估DAI(疾病活动指数)，量化指标的平均值为DAI得分。小鼠结肠炎造模流程如图3所示。在最后一次灌胃后禁食10小时，眼球取血，收集血清，部分组织样品(肝脏、回肠和结肠)用4％多聚甲醛在4℃下固定，其余保存在-80℃下备用。
1、结肠炎小鼠的基础体征指标测定
(1)体重变化
实验结果如图4所示，DC组小鼠的体重在摄入葡聚糖硫酸钠(DSS)后的前三天内迅速下降，最终体重比正常组低10.96％(P<0.001)。结肠炎建模结束时，DH的体重高于DC(P＝0.042)，但二者与NC的差异不显著(P＝0.086)。
(2)疾病活动指数DAI的评估
DAI通过结合粪便稠度和肠道出血以及体重变化来量化结肠炎损伤。DC和DL小鼠在前3天排出液体粪便，然后逐渐出现便血。DH的粪便中也存在受损肠粘膜的血红蛋白渗漏，但稀液状粪便较少。因此DH产生的DAI得分低于DC(P＝0.025)，而DL介于两者之间。疾病活动指数和DAI曲线积分如图5所示。
(3)小鼠结肠长度
DC组小鼠在解剖后盲肠和结肠出现萎缩和溃疡，伴有刺激性气味和充血性肠粘膜。DC小鼠的平均结肠长度为8.98cm，明显短于NC(10.69cm)和DH(10.23cm)，但与DL(9.53cm)的差异较小。小鼠结肠长度及差异如图6所示。
(4)组织和血清炎症因子水平
组织和血清炎症因子水平结果如图7所示，图中*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。从图9可以看出，中性粒细胞募集导致小鼠结肠MPO活性显著升高(P＝0.014)，而DH组高剂量LZ-R-5干预后有所缓解。同时，LZ-R-5有助于降低结肠炎小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β的异常升高。因此，瑞士乳杆菌LZ-R-5的持续干预，有助于缓解葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎产生的便血与肠屏障损伤。
2、小鼠粪便SCFAs浓度测定
DSS干预后，小鼠粪便中不同有机酸均有不同程度的减少，甲酸(P＝0.033)和乙酸(P＝0.013)显著低于对照组。DH组高浓度LZ-R-5处理后测得的这六种SCFA的总浓度几乎是DC的两倍，达到199.69μmol/g。DH中的乙酸和丁酸均显著高于DC(P＝0.006，P＝0.019)，并且LZ-R-5对乙酸浓度的变化有剂量效应。图8展示了粪便SCFA浓度。对于相同的SCFA，每一组的浓度按顺时针降序排列，弧的长度代表酸的总量。
3、结肠炎小鼠科属水平下的肠道菌群组成
通过通用引物338F和806R扩增小鼠粪便16S rDNA序列(扩增区域：V3-V4)。使用荧光法测量PCR产物，建立Miseq文库。对相似度为97％的非重复序列(不包括单个序列)进行聚类，并在聚类过程中去除嵌合体，以获得具有代表性的OTU(Operational TaxonomicUnits)聚类分析。
(1)科水平的群落丰度与差异物种
如图9展示了科水平的群落丰度弦图，从图中可以看出，葡聚糖硫酸钠(DSS)会引起明显的菌群失调，DC组的Bacteroidaceae增加，Muribaculaceae、Lachnospiraceae、Rikenellaceae和Oscillospiraceae科的物种减少，DH组和DL组LZ-R-5都降低了Bacteroidaceae的群落丰度，并使Marinifilaceae比例提高。图10为差异物种丰度气泡图，可以发现DH中乳杆菌科Lactobacillaceae的丰度也在上升，但与DC的差异无统计学意义(P＝0.086)。
(2)属水平群落变化与组间差异
如图11所示，属水平组间差异表明Bacteroides和Erysipelatoclostridium是丰度最高的差异细菌，与肠道疾病正相关，其中Erysipelatoclostridium的异常升高受到DH组高剂量LZ-R-5抑制(P＝0.027)。
(3)有益菌的物种丰度变化
如图12所示，Roseburia spp.、Clostridium leptum和Christensenellaceae等物种被公认为下一代益生菌，与菌群稳态关系密切。大多数Clostridium leptum和Roseburiaspp.在DSS作用后被消除(P<0.01)，而LZ-R-5干预部分保存了Clostridium leptum和Roseburia spp.，且DH组中Christensenellaceae的平均丰度超过了其他处理组，提高了肠道有益菌比例。这说明瑞士乳杆菌LZ-R-5菌株有助于缓解葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎引起的肠道菌群紊乱，有助于提高柔嫩梭菌Clostridium leptum和克里斯滕森菌Christensenellaceae等有益菌群的含量。
本发明提供了一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (4)
1.一株产胞外多糖的瑞士乳杆菌在制备调节人或动物的肠道菌群的产品中的应用，所述的人或动物为患有溃疡性结肠炎的人或动物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的瑞士乳杆菌，其分类命名为瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus，菌株号为LZ R 5，保藏编号为CGMCC No.17870，已于2019年5月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肠道菌群包括科水平的Bacteroidaceae、Marinifilaceae、Lactobacillaceae中的任意或几种的组合、属水平的Erysipelatoclostridium，、Roseburia spp.、Clostridium leptum和Christensenellaceae中的任意或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将产胞外多糖的瑞士乳杆菌制备成活菌数为108～109CFU/mL菌剂，或将产胞外多糖的瑞士乳杆菌制备成灭活菌体OD600为1.2～1.6的菌剂，或将产胞外多糖的瑞士乳杆菌制备成胞外多糖浓度为5～20mg/mL的菌剂。
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