CN118389507A - 一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 - Google Patents
一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118389507A CN118389507A CN202410531339.8A CN202410531339A CN118389507A CN 118389507 A CN118389507 A CN 118389507A CN 202410531339 A CN202410531339 A CN 202410531339A CN 118389507 A CN118389507 A CN 118389507A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- mrna
- car
- pseudouridine
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 208000037914 B-cell disorder Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 20
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 12
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 claims description 10
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 10
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 9
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 claims description 7
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 5
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 5
- 101800001779 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 108010027510 vaccinia virus capping enzyme Proteins 0.000 claims description 4
- KYEKLQMDNZPEFU-KVTDHHQDSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1,3,5-triazine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)N=C1 KYEKLQMDNZPEFU-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- MUSPKJVFRAYWAR-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)thiolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)S[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MUSPKJVFRAYWAR-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 3
- SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 2'-O-methyl uridine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methyluridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 0.000 claims description 3
- JCNGYIGHEUKAHK-DWJKKKFUSA-N 2-Thio-1-methyl-1-deazapseudouridine Chemical compound CC1C=C(C(=O)NC1=S)[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)CO)O)O JCNGYIGHEUKAHK-DWJKKKFUSA-N 0.000 claims description 3
- CWXIOHYALLRNSZ-JWMKEVCDSA-N 2-Thiodihydropseudouridine Chemical compound C1C(C(=O)NC(=S)N1)[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)CO)O)O CWXIOHYALLRNSZ-JWMKEVCDSA-N 0.000 claims description 3
- JUMHLCXWYQVTLL-KVTDHHQDSA-N 2-thio-5-aza-uridine Chemical compound [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C(=S)NC(=O)N=C1 JUMHLCXWYQVTLL-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- VRVXMIJPUBNPGH-XVFCMESISA-N 2-thio-dihydrouridine Chemical compound OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1O)N1CCC(=O)NC1=S VRVXMIJPUBNPGH-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 3
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 3
- VTGBLFNEDHVUQA-XUTVFYLZSA-N 4-Thio-1-methyl-pseudouridine Chemical compound S=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 VTGBLFNEDHVUQA-XUTVFYLZSA-N 0.000 claims description 3
- DDHOXEOVAJVODV-GBNDHIKLSA-N 5-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=S)NC1=O DDHOXEOVAJVODV-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 3
- ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 5-methoxyuridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YKWUPFSEFXSGRT-JWMKEVCDSA-N Dihydropseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1C(=O)NC(=O)NC1 YKWUPFSEFXSGRT-JWMKEVCDSA-N 0.000 claims description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 3
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 claims description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims description 3
- BNAWMJKJLNJZFU-GBNDHIKLSA-N 5-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=S BNAWMJKJLNJZFU-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 2
- FGFVODMBKZRMMW-XUTVFYLZSA-N 4-Methoxy-2-thiopseudouridine Chemical compound COC1=C(C=NC(=S)N1)[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)CO)O)O FGFVODMBKZRMMW-XUTVFYLZSA-N 0.000 claims 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 10
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- -1 1-methyl uracil nucleoside Chemical class 0.000 description 2
- HOCJTJWYMOSXMU-XUTVFYLZSA-N 4-Methoxypseudouridine Chemical compound COC1=C(C=NC(=O)N1)[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)CO)O)O HOCJTJWYMOSXMU-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- XBCXJKGHPABGSD-UHFFFAOYSA-N methyluracil Natural products CN1C=CC(=O)NC1=O XBCXJKGHPABGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用，该mRNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1；还提供了一种制备该mRNA的体外转录载体，该体外转录载体核苷酸序列选自SEQ ID NO.2；还提供了一种基于该mRNA制备通用型CAR‑NK细胞的方法，以及该通用型CAR‑NK细胞，和该通用型CAR‑NK细胞在制备防治恶性转化B细胞疾病的药物中的应用。采用本发明提供的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA工程化改造获得的通用型CAR‑NK细胞能够高效表达CAR分子，对恶性转化B细胞具有强效杀伤作用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种mRNA及其制备方法与应用，具体地涉及一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用。
背景技术
免疫细胞疗法是一种利用患者自身或异体来源免疫细胞治疗肿瘤的新型治疗方法。它通过改造患者自身或异体免疫细胞，如T细胞、NK细胞和巨噬细胞等，增强其攻击肿瘤细胞的能力，从而达到治疗肿瘤的效果。CAR-T细胞疗法为目前最为成熟和成功的免疫细胞疗法之一，也是目前唯一一种有产品获批上市销售的免疫细胞疗法。在CAR-T细胞疗法中，患者自身或异体的T细胞被分离提取出来，然后通过基因工程技术将其主要利用逆转录或慢病毒载体改造成能够特异识别和攻击癌细胞的CAR-T细胞，最后再将这些改造后的CAR-T细胞重新输注回患者体内，让其攻击患者体内的癌细胞。
虽然CAR-T细胞疗法在治疗恶性肿瘤方面表现出了巨大的潜力，特别是在血液肿瘤治疗方面取得了巨大的成功，但它仍然存在着诸多挑战和限制，例如昂贵的价格和产能限制带来的可及性问题，高昂的CAR-T细胞生产成本，以及治疗相关的毒副作用等。另外，2023年7月，美国FDA注意到基于病毒载体制备的CAR-T细胞治疗后继发T细胞肿瘤的风险，在2023年11月底正式启动调查。截止2023年12月底，已经统计到22例在CAR-T细胞治疗后发生T细胞肿瘤的案例。2024年1月19日，美国FDA正式要求目前美国已上市的6种CAR-T细胞治疗产品，全部要求在说明书上添加新的“黑框警告”，提示存在继发T细胞恶性肿瘤的风险。
因此，有必要进一步开发成本降低、快速制备且安全性提升的通用型免疫细胞疗法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用，采用本发明提供的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA制备得到的通用型CAR-NK细胞，能够高效表达CAR分子，能够强效杀伤恶性转化B细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种通用型CAR-NK细胞的制备方法，其中，所述方法为：采用编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA转染NK细胞，制备得到通用型CAR-NK细胞；所述编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述转染为电转染、囊泡转染、外泌体转染和脂质纳米颗粒转染中的至少一种。
更进一步地，所述转染为电转染，采用电转染仪，20μL电击杯，电转染电压为480～520V，时间为10～50ms。
本发明还提供了一种上述的方法制备得到的通用型CAR-NK细胞。
本发明还提供了一种上述的通用型CAR-NK细胞的应用，其中，所述通用型CAR-NK细胞用于制备防治恶性转化B细胞疾病的药物。
进一步地，所述恶性转化B细胞疾病包括B细胞白血病、B细胞淋巴瘤和B细胞相关自身免疫性疾病中的任意一种或几种。
优选地，所述恶性转化B细胞疾病包括B细胞白血病和B细胞淋巴瘤。
本发明还提供了一种上述的方法中采用的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，其中，所述mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种用于体外转录上述的mRNA的体外转录载体，其中，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种以上述的体外转录载体单酶切后为模板的mRNA的制备方法，其中，所述制备方法为：以所述的体外转录载体单酶切后为模板，加入转录所需的NTP，并用修饰型核苷替代尿嘧啶核苷，使用T7聚合酶，转录获得编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，然后通过酶加帽法同时使用牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶进行一步式加帽，将纯化后的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA加上7-甲基鸟苷帽结构，用氯化锂纯化获得加帽后的mRNA。
进一步地，所述修饰型核苷选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷中的至少一种。
优选地，所述修饰型核苷为假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷。
更优选地，所述修饰型核苷为N1-甲基假尿苷，可降低编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA在生物体内的免疫原性并提高体内稳定性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用本发明的方法制备获得的编码CD19/CD22 CAR基因的mRNA替代现有逆转录或慢病毒载体制备CAR免疫细胞，不仅可以大大降低CAR免疫细胞的生产成本，还可以有效避免病毒载体随机整合宿主细胞基因组引起的T细胞恶性肿瘤风险；
(2)采用本发明的方法制备的通用型CAR-NK细胞具有高电转染效率的特性，显著增强了NK细胞外源CAR基因的表达能力，降低了对NK细胞进行基因工程改造的难度，增强了体外扩增培养异体NK细胞作为CAR免疫细胞的潜力；
(3)采用本发明的方法制备的通用型CAR-NK细胞具有高效的B细胞肿瘤杀伤能力，显著增强了NK细胞的抗肿瘤活性；
(4)采用本发明的方法制备的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA对体外扩增培养的NK细胞进行电转染获得功能增强型通用型CAR-NK细胞，不仅仅是NK细胞和CAR的简单叠加，由于本发明的方法制备的NK细胞具有更高的活率和电转染效率(细胞活率和电转染效率均超过90％)，因此可以进一步促进CAR分子的膜表达，从而进一步增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，显著优于目前病毒载体制备的CAR-NK细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A～D为通用型CAR-NK细胞中CD19/CD22 CAR的表达阳性率和平均荧光强度图。
图2A、B为通用型CAR-NK细胞杀伤B细胞肿瘤效率的数据统计图。
图3A、B为通用型CAR-NK细胞体内控制B细胞肿瘤生长的曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
应当理解的是，本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
本发明提供了一种通用型CAR-NK细胞的制备方法，该方法为：采用编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA转染NK细胞，制备得到通用型CAR-NK细胞；该编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
该NK细胞优选为外周血单个核细胞、脐血单个核细胞或诱导多能干细胞。
优选地，该转染为电转染、囊泡转染、外泌体转染和脂质纳米颗粒转染中的至少一种。
更优选地，该转染为电转染。
最优选地，该电转染采用Celetrix电转染仪，20μL电击杯，电转染电压为480～520V，时间为10～50ms。
本发明还提供了一种基于该方法制备得到的通用型CAR-NK细胞。
本发明还提供了该通用型CAR-NK细胞在制备防治恶性转化B细胞疾病的药物中的应用。本发明对该药物剂型没有特殊限定，采用CAR免疫细胞在医学上可以接受的剂型即可。
该恶性转化B细胞疾病优选包括B细胞白血病、B细胞淋巴瘤和B细胞相关自身免疫性疾病中的一种或几种。
注射方式优选为生理盐水重悬通用型CAR-NK细胞，静脉注射。
本发明还提供了一种该方法中采用的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，该mRNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1。
本发明还提供了一种体外转录载体，该载体用于体外转录编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，该载体的核苷酸序列选自SEQ ID NO.2。
本发明还提供了一种mRNA的制备方法，该方法为：以该体外转录载体单酶切后为模板，按照合适的比例加入转录所需的NTP，并用修饰型核苷替代尿嘧啶核苷，使用T7聚合酶，转录获得编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，然后通过酶加帽法同时使用牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶一步法进行加帽，将纯化后的mRNA进一步加上7-甲基鸟苷帽结构，用氯化锂纯化获得加帽后的mRNA。
该修饰型核苷选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷中的至少一种。
更优选地，该修饰型核苷为假尿苷或N1-甲基假尿苷或N1-乙基假尿苷。
最优选地，该修饰型核苷为N1-甲基假尿苷，可降低编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA在生物体内的免疫原性并提高体内稳定性。
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本申请，并不用于限定本申请。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：制备编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA。
制备合适的体外转录DNA构建体：以含CD19/CD22双靶向CAR的DNA编码序列为构建体，并且根据真核生物密码子的偏好性和RNA的二级结构进行优化，用于后续的体外转录实验。相对应的DNA编码序列如SEQ ID NO.3所示。
通过制备合适的体外转录DNA构建体，获得用于编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA的体外转录载体，即：包括SEQ ID NO.3序列在内的质粒。所得的质粒序列如SEQ IDNO.2所示。mRNA体外转录试剂盒购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司(货号：E131-01A)。
以序列SEQ ID NO.3所在的SEQ ID NO.2序列的质粒，单酶切后为线性化模板，按照合适的比例加入转录所需的NTP，并用1-甲基尿嘧啶核苷替代尿嘧啶核苷，使用T7聚合酶，转录得到相应的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，序列如SEQ ID NO.1所示。然后通过酶加帽法同时使用牛痘病毒加帽酶(苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号：GMP-M062-01A)和2’-O-甲基转移酶(苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号：GMP-M072-01A)，进行一步法加帽，将纯化后的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA加上7-甲基鸟苷帽结构，用氯化锂纯化加帽后的mRNA，用于电转染制备通用型CAR-NK细胞。
实施例2：NK细胞体外扩增培养。
从健康产妇捐赠者的脐血中分离出单个核细胞，利用市售NK细胞扩增试剂盒(上海吉泰依科赛生物科技有限公司，货号：NE000-N022)进行脐血单个核细胞的NK细胞扩增，具体步骤如下：
(1)T75培养瓶预处理：室温下融化活化细胞因子I，取50mL离心管，加入15mLDPBS，吸取45μL活化细胞因子I至DPBS中，上下颠倒混匀，加入底面积75cm2的细胞培养瓶(T75)中，前后左右晃动，使液体分散在瓶底，4℃活化过夜；
(2)第0天，取出4℃活化过夜的T75培养瓶，弃掉包被液，使用15mL添加10％的热灭活自体血浆的NK细胞培养基重悬脐血单个核细胞接种于T75瓶中，细胞接种密度为2×106cells/mL，添加细胞因子Ⅱ150μL，前后左右晃动，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；
(3)第3天，沿培养瓶侧壁缓慢补加15mL的新鲜10％的热灭活自体血浆的NK细胞培养基，注意不要碰到培养瓶底部，切勿吹打细胞，尽量减少计数、观察等操作，避免影响细胞初期生长；
(4)第5天，取样计数，补加新鲜10％的热灭活自体血浆的NK细胞培养基，调整细胞密度为1.0～1.5×106cells/mL，根据细胞悬液体积进行扩瓶或转入细胞培养袋培养；
(5)第7天后，每隔一天或两天取样计数补液，调整细胞密度0.5～1.0×106cells/mL，根据细胞悬液体积进行扩瓶或转入细胞培养袋培养，从第7天开始，可将补加的新鲜NK培养基中的热灭活自体血浆含量降至1％；
(6)培养至第14天收获细胞NK细胞并计数，取1×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗CD3和抗CD56抗体)。
由该方法制备的NK细胞的纯度超过90％，参见图1A所示，总细胞数扩增倍数达1000倍。
注：
NK细胞扩增完全培养基配制：
a.取NK无血清培养基添加组分，用75％酒精喷洒瓶身。在生物安全柜内打开NK细胞无血清基础培养基P01与NK无血清培养基添加组分的盖子，每1000mL基础培养基中加入8mL添加组分，盖好基础培养基的盖子，颠倒3～5次混匀，混合后的培养基建议一个月内使用。
b.每1000mL NK细胞无血清基础培养基P01(已加入添加组分)加入1支310μL细胞因子Ⅲ，为NK细胞扩增完全培养基(简称“NK细胞培养基”)。配制后有效期为3周，也可将细胞因子III(冻融次数不超过3次)进行分装，根据比例减少完全培养基配制量，延长使用时间。
实施例3：通用型CAR-NK制备。
利用体外扩增培养的NK细胞进行编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA电转染，具体过程如下：
将实施例2制备的1×106个NK细胞与实施例1制备的2μg编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA(CD19/CD22 CAR mRNA)混合于20μL电转染缓冲液中，置于20μL电击杯中；使用Celetrix电转仪，在500V电压、20ms脉冲时间的条件下进行电转；电转后，将细胞取出置于2mL NK细胞培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中恢复过夜；24小时后收集细胞，对电转细胞进行流式细胞表型分析(抗CAR抗体)。
结果：如图1B～D所示，相比于慢病毒载体工程化改造的CAR-NK细胞活率、CAR阳性率和CAR平均荧光强度(MFI)，基于编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA电转染制备获得的CD19/CD22 CAR-NK细胞活率高达97.57％(图1B)，阳性率高达90.0％，CD19/CD22 CAR MFI高达9446(图1C)，显著优于慢病毒载体制备的CAR-NK细胞活率(56.73％)、阳性率(49.0％)和CD19/CD22 CAR MFI(1482.0)，且具有统计学差异(***P≤0.001，****P≤0.0001)。
实施例4：通用型CAR-NK细胞的B细胞肿瘤杀伤作用。
对脐血单个核细胞制备的通用型CAR-NK细胞进行体外B细胞肿瘤杀伤实验，具体实验步骤如下：
第一步：通用型CAR-NK细胞制备。
如实施例3。
第二步：细胞增殖染料eFluor 450标记靶细胞。
(1)将细胞增殖染料eFluor 450用DMSO稀释成5mM；
(2)将人B细胞白血病细胞系NALM6或B细胞淋巴瘤细胞系Raji用DPBS重悬成1×106cells/mL的细胞密度；
(3)以1:1000加入5mM细胞增殖染料eFluor 450，使得工作浓度为5μM，37℃水浴10min；
(4)水浴结束后继续加入20％FBS中和剩余的细胞增殖染料eFluor 450，冰上孵育5min；
(5)500×g离心，去上清，再用完全培养基重悬，重复洗脱两遍后重悬备用。
第三步：杀伤。
(1)将预先标记好的人B细胞白血病细胞系NALM6或B细胞淋巴瘤细胞系Raji按照5×105cells/mL的密度重悬，取100μL加入到96孔U底板中；
(2)按照适当的比例加入CAR-NK细胞100μL，使得CAR-NK细胞与肿瘤细胞的数目比分别为0.5:1、1:1和2:1，每组3个平行孔。同时，设置单独靶细胞阴性对照组，合计3个平行孔。其中，慢病毒载体购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，通过传统的离心感染法制备CAR-NK细胞。
第四步：流式细胞仪检测。
(1)37℃、5％CO2培养12小时后，离心，去上清，用预冷DPBS重悬洗脱两遍；
(2)采用凋亡检测试剂盒进行死活细胞标记染色15min，通过流式细胞仪检测样品，并记录死活细胞占比数据。
结果：如图2A和B所示，人B细胞淋巴瘤细胞系Raji或Daudi高表达CD19和CD22靶抗原(图2A)，可以作为CD19/CD22 CAR-NK细胞特异杀伤的靶细胞。相比于慢病毒载体工程化改造的CAR-NK细胞针对Raji或Daudi肿瘤细胞的杀伤率，基于编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA电转染制备获得的CD19/CD22 CAR-NK细胞的肿瘤细胞杀伤率显著提升，效靶比为2:1情况下，Raji杀伤率提升32.40％，Daudi杀伤率提升44.14％，且具有统计学差异(*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001)(图2B)。
实施例5：通用型CAR-NK细胞体内控制B细胞肿瘤生长。
对实施例2制备得到的通用型CAR-NK细胞验证其体内抗肿瘤疗效。
利用荷瘤小鼠模型验证实施例2构建的通用型CAR-NK细胞的有效性，具体步骤如下：
一、淋巴瘤小鼠模型的构建。
通过皮下注射人B细胞淋巴瘤细胞系Raji的方式构建小鼠的人淋巴瘤模型，该细胞系表达高水平CD19/CD22靶抗原，可以作为本发明的CAR-NK细胞的靶细胞。用生理盐水重悬Raji细胞，调整其活细胞浓度为1×107cells/mL，用注射器吸取100μL进行皮下接种，一周后进行实施例2制备得到的通用型CAR-NK细胞静脉回输治疗。
二、CAR-NK细胞治疗。
荷瘤一周后，采用实施例2制备得到的CAR-NK细胞进行静脉回输治疗。用生理盐水重悬CAR-NK细胞，调整其活细胞浓度为1×107cells/mL，每隔3天用注射器吸取100μL进行静脉注射，合计回输治疗5次，每次回输治疗前用游标卡尺测量肿瘤大小，回输结束后每隔3天测量肿瘤大小。
结果：如图3A和B所示，注射通过编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA体外制备的CAR-NK细胞可以有效地杀灭B细胞淋巴瘤细胞，从而消除体内肿瘤(***P≤0.001)，而对照NK细胞仅能减缓肿瘤的生长。
本发明提供的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用，该mRNA的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1；还提供了一种制备该mRNA的体外转录载体，该体外转录载体核苷酸序列选自SEQ ID NO.2；还提供了一种基于该mRNA制备通用型CAR-NK细胞的方法，以及该通用型CAR-NK细胞，和该通用型CAR-NK细胞在制备防治恶性转化B细胞疾病的药物中的应用。采用本发明提供的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA工程化改造获得的通用型CAR-NK细胞能够高效表达CAR分子，对恶性转化B细胞具有强效杀伤作用，为进一步开发成本降低、快速制备且安全性提升的通用型免疫细胞疗法提供了新的途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
本发明中所涉及相关序列如下：
SEQ ID NO.1——编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA序列。GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCGGAUCCGCCACCAUGCUGCUCCUCGUGACAUCCCUCCUGCUGUGCGAGCUGCCCCACCCAGCCUUCCUCCUGAUUCCUGACUACAAGGACGACGACGACAAGGACAUUCAGAUGACCCAGACAACAUCUUCCCUGAGCGCCAGCCUCGGCGACCGGGUGACAAUUUCUUGCAGAGCCUCUCAGGACAUUUCUAAGUACCUGAACUGGUAUCAGCAGAAGCCCGACGGCACAGUGAAGCUGCUGAUUUACCACACAUCUAGGCUGCACUCUGGCGUGCCUUCUAGGUUCAGCGGCUCUGGCUCCGGCACCGACUACUCCCUCACCAUUAGCAACUUAGAGCAGGAGGACAUUGCCACCUACUUCUGCCAGCAGGGCAACACACUCCCAUACACCUUCGGCGGCGGCACAAAACUGGAGAUCACAGGCGGCGGCGGCUCUCAGGUGCAGCUCCAGCAGUCCGGCCCAGGCCUCGUGAAGCCUUCUCAGACACUGUCUCUCACAUGCGCCAUUAGCGGCGACUCUGUGUCUUCUAACUCCGCCGCCUGGAACUGGAUUAGGCAGUCCCCAUCGCGCGGCCUGGAGUGGCUGGGCAGAACAUACUACCGCUCUAAGUGGUACAACGACUACGCCGUGUCCGUGAAGUCUCGGAUCACAAUUAACCCCGACACAUCUAAGAACCAGUUCUCCCUCCAGCUCAACUCUGUGACCCCUGAGGACACCGCCGUGUACUACUGCGCAAGGGAGGUGACAGGCGACCUAGAGGACGCCU UCGACAUUUGGGGCCAGGGCACGAUGGUGACCGUGUCUAGCGGCUCCACAUCUGGCUCUGGCAAGCCCGGCUCUGGCGAGGGCUCCACCAAGGGCGACAUUCAGAUGACCCAGUCCCCAUCUUCUCUGAGCGCCAGCGUGGGCGACCGGGUGACAAUUACAUGCCGCGCCUCUCAGACCAUUUGGUCUUACCUGAACUGGUAUCAGCAGAGACCCGGCAAGGCCCCAAACCUCCUGAUUUACGCCGCCUCUAGCCUCCAGUCUGGCGUGCCAUCUCGGUUCUCUGGCCGGGGCUCUGGCACCGACUUCACACUCACAAUUUCUUCCUUGCAAGCCGAGGACUUCGCCACAUACUACUGCCAGCAGUCUUACUCUAUUCCUCAGACCUUCGGCCAGGGCACCAAGCUGGAGAUCAAGGGCGGCGGCGGCUCCGAGGUGAAGCUCCAGGAGUCUGGCCCAGGCCUGGUGGCCCCAUCUCAGUCCCUGAGCGUGACAUGCACAGUGUCUGGCGUGUCCCUGCCCGACUACGGCGUGUCUUGGAUUAGACAGCCACCUAGAAAGGGCCUAGAGUGGCUCGGCGUGAUUUGGGGCUCCGAGACAACAUACUACAACAGCGCCCUCAAGUCCAGGCUCACCAUUAUUAAGGACAACUCUAAGUCUCAGGUGUUCCUCAAGAUGAACUCUCUACAGACCGACGACACCGCCAUUUACUACUGCGCCAAGCACUACUACUACGGCGGCUCUUACGCUAUGGACUACUGGGGCCAGGGCACAUCCGUGACAGUGUCUUCUAGCGGCACAACAACCCCCGCCCCUAGACCACCAACACCCGCCCCAACAAUUGCCUCUCAGCCACUGUCCCUGAGACCUGAGGCAUGUAGACCCGCCGCCGGCGGCGCCGUGCACACACGGGGCCUGGACUUCGCCUGCGACAUUUACAUUUGGGCCCCACUCGCCGGCACAUGCGGCGUGCUGCUGCUGUCCCUCGUGAUUACACUGUACUGCAAGAGAGGCCGGAAGAAGCUGCUGUACAUUUUCAAGCAGCCUUUCAUGAGACCCGUGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCUGCUCUUGCCGGUUCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCUGCGAGCUGAGAGUGAAGUUCUCUAGGUCCGCCGACGCCCCCGCCUACAAGCAGGGCCAGAACCAGCUGUACAACGAGCUGAACCUGGGCAGACGCGAGGAGUACGACGUGCUGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCCGAGAUGGGCGGCAAGCCACGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGCCUGUACAACGAACUUCAGAAGGACAAGAUGGCCGAGGCCUACAGCGAGAUUGGCAUGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCUGUACCAGGGCCUGUCUACAGCCACAAAGGACACAUACGACGCCCUCCACAUGCAGGCCCUCCCACCUAGAUAAACCGGUUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGACAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCAUGCCAGCCACGAAUUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGUAUGUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAAGUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAUUGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCUGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUACUGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCUUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO.2——用于编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA的体外转录载体的DNA序列。
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAG
TTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGC
TACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGC
TTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATT
ACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC
TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAA
TAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAA
GTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGC
CCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA
TGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGT
CTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCG
TAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAG
CTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG
ACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACGTGTAATACGACTCACTATAAGGGGGAAATAAG
AGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCGGATCCGCCACCATGCTGCTCCTCGTGACAT
CCCTCCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCAGCCTTCCTCCTGATTCCTGACTACAAGGACGACGACGAC
AAGGACATTCAGATGACCCAGACAACATCTTCCCTGAGCGCCAGCCTCGGCGACCGGGTGACAATTTC
TTGCAGAGCCTCTCAGGACATTTCTAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACAGTGA
AGCTGCTGATTTACCACACATCTAGGCTGCACTCTGGCGTGCCTTCTAGGTTCAGCGGCTCTGGCTCC
GGCACCGACTACTCCCTCACCATTAGCAACTTAGAGCAGGAGGACATTGCCACCTACTTCTGCCAGCA
GGGCAACACACTCCCATACACCTTCGGCGGCGGCACAAAACTGGAGATCACAGGCGGCGGCGGCTCTC
AGGTGCAGCTCCAGCAGTCCGGCCCAGGCCTCGTGAAGCCTTCTCAGACACTGTCTCTCACATGCGCC
ATTAGCGGCGACTCTGTGTCTTCTAACTCCGCCGCCTGGAACTGGATTAGGCAGTCCCCATCGCGCGG
CCTGGAGTGGCTGGGCAGAACATACTACCGCTCTAAGTGGTACAACGACTACGCCGTGTCCGTGAAGT
CTCGGATCACAATTAACCCCGACACATCTAAGAACCAGTTCTCCCTCCAGCTCAACTCTGTGACCCCT
GAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCAAGGGAGGTGACAGGCGACCTAGAGGACGCCTTCGACATTTG
GGGCCAGGGCACGATGGTGACCGTGTCTAGCGGCTCCACATCTGGCTCTGGCAAGCCCGGCTCTGGCG
AGGGCTCCACCAAGGGCGACATTCAGATGACCCAGTCCCCATCTTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGCGAC
CGGGTGACAATTACATGCCGCGCCTCTCAGACCATTTGGTCTTACCTGAACTGGTATCAGCAGAGACC
CGGCAAGGCCCCAAACCTCCTGATTTACGCCGCCTCTAGCCTCCAGTCTGGCGTGCCATCTCGGTTCT
CTGGCCGGGGCTCTGGCACCGACTTCACACTCACAATTTCTTCCTTGCAAGCCGAGGACTTCGCCACA
TACTACTGCCAGCAGTCTTACTCTATTCCTCAGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGG
CGGCGGCGGCTCCGAGGTGAAGCTCCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTGGCCCCATCTCAGTCCCTGA
GCGTGACATGCACAGTGTCTGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCTTGGATTAGACAGCCACCT
AGAAAGGGCCTAGAGTGGCTCGGCGTGATTTGGGGCTCCGAGACAACATACTACAACAGCGCCCTCAA
GTCCAGGCTCACCATTATTAAGGACAACTCTAAGTCTCAGGTGTTCCTCAAGATGAACTCTCTACAGA
CCGACGACACCGCCATTTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCTCTTACGCTATGGACTAC
TGGGGCCAGGGCACATCCGTGACAGTGTCTTCTAGCGGCACAACAACCCCCGCCCCTAGACCACCAAC
ACCCGCCCCAACAATTGCCTCTCAGCCACTGTCCCTGAGACCTGAGGCATGTAGACCCGCCGCCGGCG
GCGCCGTGCACACACGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATTTACATTTGGGCCCCACTCGCCGGCACA
TGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTCGTGATTACACTGTACTGCAAGAGAGGCCGGAAGAAGCTGCTGTA
CATTTTCAAGCAGCCTTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCTCTTGCCGGT
TCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCTCTAGGTCCGCCGACGCCCCCGCC
TACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAGGAGTACGACGTGCT
GGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCACGGAGAAAGAACCCACAGGAGGGCC
TGTACAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATTGGCATGAAGGGCGAGCGG
AGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCTACAGCCACAAAGGACACATACGACGC
CCTCCACATGCAGGCCCTCCCACCTAGATAAACCGGTTGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGC
TTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGA
ATAAAGTCTGACAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAAC
AGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAAT
TTCATGCCAGCCACGAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTATGACTAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTATGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAG
CAAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGATTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAGGCTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATACTGCAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAGGCTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTAGAGGGCCCGTTT
AAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG
CCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA
TTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGG
AAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGG
GGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCG
CAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCG
CCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCT
TTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATA
GACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAA
CAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGG
TTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGG
TGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAAC
CAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAG
CAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCG
CCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCA
GAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCA
TTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCA
GGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTC
TGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCG
GTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGC
GCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCA
GGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGC
TGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGT
ACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGC
CGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATG
CCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGT
GTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATG
GGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCC
TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGC
CATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGAC
GCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTAT
TGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCAC
TGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCT
AGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCC
ACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACAT
TAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATC
GGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCT
GCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAG
AATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAG
GCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAG
TCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGC
GCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCG
CTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGT
GCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGG
TAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGC
GGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTG
CGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCG
CTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCT
TTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG
ATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTA
TATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGT
CTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACC
ATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAA
ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATT
AATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGC
TACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAA
GGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTC
AGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCAT
GCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGC
GGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAA
GTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAG
TTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGT
GAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTC
ATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATT
TGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACG
TC
SEQ ID NO.3——用于制备合适的体外转录DNA构建体的含CD19/CD22双靶向CAR的DNA编码序列。
ATGCTGCTCCTCGTGACATCCCTCCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCAGCCTTCCTCCTGATTCCTGA
CTACAAGGACGACGACGACAAGGACATTCAGATGACCCAGACAACATCTTCCCTGAGCGCCAGCCTCG
GCGACCGGGTGACAATTTCTTGCAGAGCCTCTCAGGACATTTCTAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAG
AAGCCCGACGGCACAGTGAAGCTGCTGATTTACCACACATCTAGGCTGCACTCTGGCGTGCCTTCTAG
GTTCAGCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTACTCCCTCACCATTAGCAACTTAGAGCAGGAGGACATTG
CCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACACTCCCATACACCTTCGGCGGCGGCACAAAACTGGAGATC
ACAGGCGGCGGCGGCTCTCAGGTGCAGCTCCAGCAGTCCGGCCCAGGCCTCGTGAAGCCTTCTCAGAC
ACTGTCTCTCACATGCGCCATTAGCGGCGACTCTGTGTCTTCTAACTCCGCCGCCTGGAACTGGATTA
GGCAGTCCCCATCGCGCGGCCTGGAGTGGCTGGGCAGAACATACTACCGCTCTAAGTGGTACAACGAC
TACGCCGTGTCCGTGAAGTCTCGGATCACAATTAACCCCGACACATCTAAGAACCAGTTCTCCCTCCA
GCTCAACTCTGTGACCCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCAAGGGAGGTGACAGGCGACCTAG
AGGACGCCTTCGACATTTGGGGCCAGGGCACGATGGTGACCGTGTCTAGCGGCTCCACATCTGGCTCT
GGCAAGCCCGGCTCTGGCGAGGGCTCCACCAAGGGCGACATTCAGATGACCCAGTCCCCATCTTCTCT
GAGCGCCAGCGTGGGCGACCGGGTGACAATTACATGCCGCGCCTCTCAGACCATTTGGTCTTACCTGA
ACTGGTATCAGCAGAGACCCGGCAAGGCCCCAAACCTCCTGATTTACGCCGCCTCTAGCCTCCAGTCT
GGCGTGCCATCTCGGTTCTCTGGCCGGGGCTCTGGCACCGACTTCACACTCACAATTTCTTCCTTGCA
AGCCGAGGACTTCGCCACATACTACTGCCAGCAGTCTTACTCTATTCCTCAGACCTTCGGCCAGGGCA
CCAAGCTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCCGAGGTGAAGCTCCAGGAGTCTGGCCCAGGCCTGGTG
GCCCCATCTCAGTCCCTGAGCGTGACATGCACAGTGTCTGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTC
TTGGATTAGACAGCCACCTAGAAAGGGCCTAGAGTGGCTCGGCGTGATTTGGGGCTCCGAGACAACAT
ACTACAACAGCGCCCTCAAGTCCAGGCTCACCATTATTAAGGACAACTCTAAGTCTCAGGTGTTCCTC
AAGATGAACTCTCTACAGACCGACGACACCGCCATTTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGG
CTCTTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGCACATCCGTGACAGTGTCTTCTAGCGGCACAACAACCC
CCGCCCCTAGACCACCAACACCCGCCCCAACAATTGCCTCTCAGCCACTGTCCCTGAGACCTGAGGCA
TGTAGACCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACACGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATTTACATTTG
GGCCCCACTCGCCGGCACATGCGGCGTGCTGCTGCTGTCCCTCGTGATTACACTGTACTGCAAGAGAG
GCCGGAAGAAGCTGCTGTACATTTTCAAGCAGCCTTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAG
GACGGCTGCTCTTGCCGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCTCTAG
GTCCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAC
GCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCACGGAGA
AAGAACCCACAGGAGGGCCTGTACAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGAT
TGGCATGAAGGGCGAGCGGAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGTCTACAGCCA
CAAAGGACACATACGACGCCCTCCACATGCAGGCCCTCCCACCTAGATAA
Claims (10)
1.一种通用型CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法为：
采用编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA转染NK细胞，制备得到通用型CAR-NK细胞；所述编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的通用型CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述转染为电转染、囊泡转染、外泌体转染和脂质纳米颗粒转染中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的通用型CAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述转染为电转染，采用电转染仪，20μL电击杯，电转染电压为480～520V，时间为10～50ms。
4.一种根据权利要求1～3中任意一项所述的方法制备得到的通用型CAR-NK细胞。
5.一种如权利要求4所述的通用型CAR-NK细胞的应用，其特征在于，所述通用型CAR-NK细胞用于制备防治恶性转化B细胞疾病的药物。
6.根据权利要求5所述的通用型CAR-NK细胞的应用，其特征在于，所述恶性转化B细胞疾病包括B细胞白血病、B细胞淋巴瘤和B细胞相关自身免疫性疾病中的任意一种或几种。
7.一种如权利要求1所述的方法中采用的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，其特征在于，所述mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种用于体外转录如权利要求7所述的mRNA的体外转录载体，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.一种以权利要求8所述的体外转录载体单酶切后为模板的mRNA的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
以所述的体外转录载体单酶切后为模板，加入转录所需的NTP，并用修饰型核苷替代尿嘧啶核苷，使用T7聚合酶，转录获得编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA，然后通过酶加帽法同时使用牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶进行一步式加帽，将纯化后的编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA加上7-甲基鸟苷帽结构，用氯化锂纯化获得加帽后的mRNA。
10.根据权利要求9所述的mRNA的制备方法，其特征在于，所述修饰型核苷选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基T-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷或5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410531339.8A CN118389507A (zh) | 2024-04-29 | 2024-04-29 | 一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410531339.8A CN118389507A (zh) | 2024-04-29 | 2024-04-29 | 一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118389507A true CN118389507A (zh) | 2024-07-26 |
Family
ID=91992441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410531339.8A Pending CN118389507A (zh) | 2024-04-29 | 2024-04-29 | 一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118389507A (zh) |
-
2024
- 2024-04-29 CN CN202410531339.8A patent/CN118389507A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105671083B (zh) | PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用 | |
| CN107723275A (zh) | 通用型car‑t细胞及其制备方法和应用 | |
| CN108103026B (zh) | 用于肿瘤免疫治疗的γδ-T细胞外泌体及其制备方法 | |
| WO2011147086A1 (zh) | 载有干扰核糖核酸的细胞微粒子、其制备方法及其应用 | |
| CN113728096B (zh) | 一种靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途 | |
| CN107699591A (zh) | 一种敲除pd‑1的t细胞制备方法及其应用 | |
| CN107213471A (zh) | 一种用于肝癌与肝癌微环境相互作用的新的长链非编码rna检测及其应用 | |
| CN116716350A (zh) | 表达il-12的sinv载体及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN114053294A (zh) | miR-150及负载miR-150模拟物的外泌体在制备治疗结直肠癌药物上的应用 | |
| CN116769723B (zh) | 一种gd2嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 | |
| CN118389507A (zh) | 一种编码CD19/CD22双靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 | |
| CN118389508A (zh) | 一种编码CD22靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 | |
| CN118389509A (zh) | 一种编码CD19靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 | |
| CN118389506A (zh) | 一种编码AXL靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 | |
| CN118421626A (zh) | 一种编码PD-L1靶向CAR基因的mRNA及其制备方法与应用 | |
| CN110423812A (zh) | Skiv2l2（MTR4）基因在肿瘤治疗中的用途 | |
| CN113476606A (zh) | Upk1a-as1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN113980907B (zh) | 一种抗flt3嵌合抗原受体修饰的t细胞及其在制备治疗aml药物中的应用 | |
| CN117338914B (zh) | 一种同种异体树突细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN101787368B (zh) | 抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用 | |
| CN101974557A (zh) | 一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体及其用途 | |
| RU2777371C2 (ru) | Клетка-естественный киллер, содержащая экзогенную митохондрию, и фармацевтическая композиция, включающая такую клетку | |
| CN116496985A (zh) | 一种dc-cik细胞和用于制备肿瘤细胞治疗药物的用途 | |
| CN118680942A (zh) | 葡萄糖-1-磷酸在治疗肿瘤中的用途 | |
| CN117126811A (zh) | 一种装载减毒沙门氏菌的中性粒细胞及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |