CN118374545A - miR1867在水稻种质资源改良中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR1867在水稻种质资源改良中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明根据miR1867的序列，设计扩增引物，构建过表达miR1867的载体；然后利用农杆菌介导法转化水稻品种日本晴，通过琼脂糖凝胶电泳和qRT‑PCR的方法分别对转基因株系中miR1867的表达量进行验证，结果显示转基因阳性株系中miR1867的表达量极显著提高。与野生型相比，过表达miR1867株系水稻的籽粒粒长、粒宽和千粒重显著增加，表明miR1867基因在调控水稻籽粒大小、粒重及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，能产生更高的经济效益，同时为水稻种质资源改良提供新的基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及miR1867在水稻种质资源改良中的应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
稻(Oryza sativa L.)，通常称为水稻，主要是禾本科一年生、水生草本(目前已有多年生稻品种)，其作为世界上最重要的粮食作物之一，为满足人类对粮食的巨大需求做出了重大贡献。水稻的产量是一个复杂的农艺性状，受分蘖数、穗数、每穗粒数、结实率和千粒重等因素的影响，其中，粒型是决定千粒重的重要指标之一。粒型包括粒长、粒宽、粒厚和长宽比，是由多基因控制的数量遗传性状。水稻粒型不仅关系到产量的高低，对稻米品质的优劣也至关重要。因此通过生物技术手段改善水稻籽粒的粒型，进而提高水稻籽粒大小，对于提高水稻产量具有重要意义。
目前已克隆出多个调控粒型的关键基因，这些基因主要参与植物激素合成和信号、泛素-蛋白酶体、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号、G蛋白信号及表观修饰等多个调控通路。但是，长期以来，水稻产量的提高一直没有出现巨大的突破，主要原因是现代栽培稻品种选育所用的种质资源遗传基础狭窄，优异种质资源利用的同质化较为严重。
MicroRNA(miRNA)是一类广泛的内源性小RNA分子，在调节真核生物的生长发育和信号转导途径中处于核心地位。以小RNA为基础的生物技术正成为作物改良的新目标和新策略，miRNA逐渐成为培育优良籽粒大小和作物产量的新靶标。近年来，随着研究手段的深入和实验技术的发展，单一miRNA调节水稻籽粒千粒重的研究陆续被报道。在水稻中过量表达miR156靶基因OsSPL16可以通过促进水稻籽粒细胞分裂的途径增加水稻籽粒的千粒重，进而提高水稻产量(Wang,Wu et al.,2012)。Gao等研究表明，在水稻中过量表达miR159d的靶基因OsGAMYBL2可以互补STTM159d的籽粒表型，且OsGAMYBL2作为上游调控因子能够激活GA合成关键酶基因CPS1和GA3ox2及BR信号通路基因BU1的表达，使得miR159d-OsGAMYBL2模块参与到植物生长激素GA和BR的信号通路中，从而对水稻生长发育发挥重要调节作用(Gaoet al.,2018)。Peng等采用STTM及Mimic的方式在水稻中低表达miR167，其下游靶基因生长素响应因子OsARFs的表达量显著上调，转基因植株的籽粒变大，千粒重提高(Peng et al.,2018)。OsmiR396-OsGRF4-OsGIF1模块在调节水稻籽粒千粒重方面发挥重要作用，此外，GSK2可以和OsGRF4发生互作并抑制后者转录活性，GSK2在BR信号通路中占据重要位置且负向调节水稻籽粒大小和千粒重(Duan et al.,2015,Gao et al.,2015)。Zhang等研究表明，过量表达miR397显著增加水稻籽粒大小，使水稻产量提高25％，通过5’RACE实验得出一个编码漆酶蛋白的基因OsLAC确定为OsmiR397下游直接的靶基因，对OXmiR397b转基因植株发育着的幼穗测序结果分析发现，OsLAC可能参与油菜素内酯BR的生物学过程，OXmiR397转基因植株对油菜素内酯更敏感，而OXLAC转基因植株对油菜素内酯不敏感(Zhang et al.,2013)。Zhao等研究结果表明，miR1432可通过负调控下游编码硫酯酶蛋白基因OsACOT，低表达miR1432(STTM1432)和过量表达抗miR1432切割版本靶基因OXmACOT可显著提高水稻籽粒中生长素和ABA的含量，增加STTM1432和OXmACOT转基因植株的千粒重，提高水稻产量(Zhaoet al.,2019)。miR1848-OsCYP5G3调控路径通过参与BR信号影响水稻籽粒大小(Xia etal.,2015)。综上所述，miRNA在水稻籽粒发育中具有重要的调节作用。虽然目前研究者已经挖掘出多个miRNA参与水稻籽粒的发育过程，但是挖掘新的基因资源，对于了解水稻籽粒发育机制和进一步提高水稻产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供miR1867在水稻种质资源改良中的应用，为现有技术中水稻产量的提高提供一种新的可利用基因资源。
为了实现上述目的，本发明miR1867在水稻种质资源改良中的应用所采用的技术方案是：
miR1867在水稻种质资源改良中的应用，所述miR1867的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述水稻种质资源改良为增加水稻的产量。
上述技术方案的有益效果在于：本发明的miR1867在水稻种质资源改良中的应用为开拓性发明。本发明提供了一种可用于调控水稻籽粒粒型和千粒重的miRNA，通过构建组成型启动子Ubi驱动的miR1867过表达载体，并利用农杆菌侵染水稻胚性愈伤组织，共培养、筛选、分化得到转基因阳性植株(即过表达miR1867的水稻植株)，对转基因阳性植株收获时期籽粒产量相关的表型进行鉴定，验证miR1867与水稻籽粒大小的关系。发现过表达miR1867的转基因株系籽粒粒长、粒宽和千粒重显著增加，表明miR1867在调控水稻籽粒大小和千粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，能产生更高的经济效益，同时为水稻种质资源改良提供新的基因资源。
作为进一步地改进，所述增加水稻的产量为增加水稻籽粒的粒长、粒宽和/或千粒重。
上述技术方案的有益效果在于：水稻籽粒的千粒重受库容大小及籽粒充实程度的影响。水稻籽粒由胚、胚乳、种皮和颖壳组成，颖壳作为库容对水稻籽粒大小(粒长、粒宽、粒厚)发挥一定限制作用。本发明通过增加水稻籽粒的粒长和粒宽，提高籽粒的库容进而增加水稻的千粒重，对于提高水稻的产量有重要意义。
作为进一步地改进，通过基因工程手段过表达miR1867，水稻籽粒的粒长、粒宽和千粒重显著增加。
作为进一步地改进，所述过表达为构建miR1867的过表达载体，对水稻中miR1867进行过表达。
作为进一步地改进，所述过表达载体由包括以下步骤的方法获得：将表达miR1867的基因片段插入出发载体中，转化、培养、验证获得过表达载体。
作为进一步地改进，所述出发载体为pTCK303。
作为进一步地改进，所述基因片段采用核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示的引物扩增获得。
作为进一步地改进，所述水稻为日本晴。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种可用于调控水稻籽粒粒型的和千粒重的miRNA—miR1867。本发明通过构建组成型启动子Ubi驱动的miR1867过表达载体，并利用农杆菌侵染水稻胚性愈伤组织，共培养、筛选、分化得到转基因阳性植株，对转基因阳性植株收获时期籽粒产量相关的表型进行鉴定，验证miR1867与水稻籽粒大小的关系，其中过表达miR1867的转基因株系籽粒粒长、粒宽和千粒重显著增加，表明miR1867在调控水稻籽粒大小和千粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，能产生更高的经济效益。
发明针对人口不断增长和粮食需求不断增加的现状，利用基因级联上游调控因子miRNA在调节水稻产量中的应用，探讨miRNA在水稻品种改良中的功能，从而为miR1867在培育高产水稻，特别是通过调节水稻籽粒大小进而增加千粒重提供依据。本发明构建的基于miR1867的过表达载体可以为培育高产水稻品系提供一种简单有效的技术手段，miR1867基因在提高水稻籽粒粒型(大小)和千粒重以及增加作物产量上具有潜在应用价值，可利用分子改良技术在生产中加以应用，为实现水稻种质资源的精确改良奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中miR1867 PCR扩增的凝胶电泳图；
图2为本发明实施例2中pTCK303-miR1867载体菌落PCR验证：
图3为本发明实施例2中miR1867过表达载体的结构示意图；
图4为本发明实施例3中miR1867基因过表达阳性植株PCR鉴定图；
图5为本发明实施例3中miR1867基因过表达株系花后10天miR1867表达量鉴定图(其中，WT为野生对照株，OXmiR1867为miR1867过表达转基因株系，**代表P<0.01)；
图6为本发明实施例4中野生型对照、miR1867过表达转基因株系收获后籽粒粒长比较(其中，WT为野生对照株，OXmiR1867为miR1867过表达转基因株系)；
图7为本发明实施例4中野生型对照、miR1867过表达转基因株系收获后籽粒粒长差异分析(其中，WT为野生对照株，OXmiR1867为miR1867过表达转基因株系，**代表P<0.01)；
图8为本发明实施例4中野生型对照、miR1867过表达转基因株系收获后籽粒粒宽差异比较(其中，WT为野生对照株，OXmiR1867为miR1867过表达转基因株系)；
图9为本发明实施例4中野生型对照、miR1867过表达转基因株系收获后籽粒粒宽差异分析(其中，WT为野生对照株，OXmiR1867为miR1867过表达转基因株系，**代表P<0.01)；
图10为本发明实施例4中野生型对照、miR1867过表达转基因株系收获后籽粒千粒重差异分析(其中，WT为野生对照株，OXmiR1867为miR1867过表达转基因株系，**代表P<0.01)。
具体实施方式
本发明前期通过大量的实验研究表明，miR1867在水稻籽粒中差异表达，且现有技术中对水稻miRNA1867的功能并未阐明，为进一步验证miRNA1867在水稻籽粒发育过程中起到的功能，设计miR1867扩增引物，构建pTCK303-miR1867表达载体；然后利用农杆菌介导法转化水稻品种日本晴，通过琼脂糖凝胶电泳和qRT-PCR的方法分别对pTCK303-miR1867转基因株系中miR1867的表达量进行验证，结果显示pTCK303-miR1867转基因株系中miR1867的表达量极显著提高。与野生型相比，miR1867高表达转基因株系籽粒粒长、粒宽和千粒重显著增加，表明miR1867基因在调控水稻籽粒大小、粒重及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，能产生更高的经济效益。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的引物如表1所示。
表1引物序列
本发明miR1867在水稻种质资源改良中的应用的具体实施例：
实施例1miR1867基因片段的扩增
本实施例以日本晴DNA为模板，扩增得到miR1867基因片段，具体实施操作如下：
根据miR1867基因的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)设计包含miR1867前体序列扩增引物Pre_miR1867_F(如SEQ ID NO.2所示)和Pre_miR1867_R(如SEQ ID NO.3所示)，根据目标载体pTCK303酶切位点，分别在正反引物5′端添加BamHI和KpnI酶切位点及保护碱基。以日本晴DNA为模板，扩增得到miR1867基因片段(tactggatccGCTGTTGAGGTAGCAAACAAGATTAGTGCAATTTACACATTTACTCCCTCTAT CCCAGAAAAAAACAATTCCTAGCTTTGCATTTGGATAAACAAT TGTTCAGATTTAAAGTT AGGAATTGTTTTTTTTCTAGGACAGAGGGAGTAGATGTGTAATTTGTGCATCTAGGAAGG TGGTAGTATGCCAggtaccaatt，如SEQ ID NO.13所示)，其中小写下划线碱基为保护碱基、小写无下划线碱基为酶切位点BamHI和KpnI、大写下划线碱基为miR1867前体序列、大写无下划线序列为miR1867前体侧翼序列。
miR1867基因片段扩增体系：正反引物(终浓度10μM)和DNA模板各取1μL，加入25μL2×高保真酶，加ddH2O至50μL。
PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃预变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，最终扩增得到186bp的双链miR1867基因片段，如图1所示，用于后续pTCK303-miR1867载体的构建。
注：(1)miR1867成熟体序列如SEQ ID NO.14所示；
(2)miR1867序列号为MI0008268，参考基因组版本为IRGSP-1.0。
实施例2miR1867过表达载体的构建
本实施例在实施例1克隆获得miR1867基因的基础上，为进一步对miR1867的功能进行验证，构建了miR1867过表达载体，具体实施操作如下：
使用限制性内切酶BamHI和KpnI分别酶切pTCK303质粒和miR1867基因片段。
酶切体系(50μL)如下：pTCK303质粒2μg(或miR1867基因片段1μg)，10×Buffer 5μL，KpnI 1μL，BamHI 1μL，ddH2O补加至50μL。
酶切条件为：37℃酶切2h。
将酶切产物分别纯化后加入如下连接体系：线性质粒4μL，miR1867基因片段4μL，10×Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL，4℃连接过夜。
连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液涂布于含50mg/L卡那霉素平板，过夜培养后选取单克隆摇菌扩繁，使用引物pTCK303_VF(如SEQ ID NO.4所示)和pTCK303_VR(如SEQ ID NO.5所示)进行菌落PCR验证。pTCK303空载体连接miR1867基因片段后扩增片段大小应为1079bp，经菌落PCR验证(如图2所示)后提取质粒送往测序，测序正确表明pTCK303-miR1867载体构建成功，pTCK303-miR1867载体的结构示意图如图3所示。
实施例3转基因阳性植株的构建
本实施例将实施例2构建成功的pTCK303-miR1867载体转入水稻中，培养鉴定获得转基因阳性植株(即过表达miR1867的水稻植株)，具体实施操作如下：
1、转基因阳性植株的获得
取1μg构建好的pTCK303-miR1867质粒转化土壤农杆菌EHA105，将阳性菌斑挑取放至50mL YM液体培养基(50mg/L Kan,50mg/LR中，培养至OD值为0.8-1.0之间，加入50μL乙酰丁香酮(100mM)室温放置2-3h后直接侵染水稻愈伤组织，经过含有头孢(50mg/mL)和潮霉素筛选培养基的筛选和分化，获得转基因阳性植株。
2、转基因阳性植株潮霉素筛选标记PCR鉴定
对分化出的miR1867转基因苗通过扩增潮霉素标记基因进行PCR扩增筛选。首先提取转基因株系全基因组DNA，使用引物Hyg_F(如SEQ ID NO.6所示)和Hyg_R(如SEQ ID NO.7所示)进行扩增。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，野生型对照应无扩增片段，miR1867阳性转株系扩增片段为1026bp，结果见图4。
3、转基因阳性植株miR1867表达量的检测
miR1867过表达植株表达量采用荧光定量PCR的方法进行检测。野生型对照和转基因植株花后10天籽粒总RNA用TRIzol进行提取，采用stem-loop qRT-PCR的方法(Chen etal.,2005)对miR1867的表达量进行测定。以β-actin为参照基因，以稀释(1:10)的cDNA为模板，采用2-ΔΔCt法(Livak et al.,2001)计算miR1867基因相对表达量，miR1867荧光定量反转录所使用的引物为miR1867_RT(SEQ ID NO.8)，定量是采用引物为miR1867_F(SEQ IDNO.9)和stem_loop_U(SEQ ID NO.10)，β-actin荧光定量所使用的引物为β_actin_F(SEQID NO.11)和β_actin_R(SEQ ID NO.12)。
荧光定量PCR采用20μL体系，其中模板cDNA按照1:20比例进行稀释后加5μL，正向引物miR1867_F和stem_loop_U引物各加1.0μL，再加入3μL的ddH2O，荧光染料(SYBR GreenqRT-PCR Master Mix；Toyobo)为10μL，使用CFX 96Real Time System(BioRad,USA)进行定量检测，结果见图5。由图5可知，miR1867在过表达miR1867的水稻植株(OXmiR1867转基因株系)中得到了高表达。
实施例4miR1867的功能验证
本实施例选取实施例3中的miR1867过表达株系(L2、L14和L15)作为研究对象，测量水稻籽粒的粒型和千粒重，具体实施操作如下：
分别选取过表达miR1867转基因株系中表达量升高的独立转基因株系，每个株系取5株，每株随机选取30粒成熟收获的籽粒，使用大米外观品质检测仪对籽粒的粒长和粒宽进行测定，5次重复取平均值，结果见图6-9。千粒重测定为随机选取1000粒种子称重，5次重复取平均值，结果见图8。
由图6和图7可知，过表达miR1867三个株系L2、L14和L15的粒长较野生型对照极显著增加。
由图8和图9可知，过表达miR1867三个株系L2、L14和L15的粒宽较野生型对照极显著增加。
由图10可知，过表达miR1867三个株系L2、L14和L15的千粒重较野生型对照极显著增加。
最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：所述miR1867的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述水稻种质资源改良为增加水稻的产量。
2.根据权利要求1所述的miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：所述增加水稻的产量为增加水稻籽粒的粒长、粒宽和/或千粒重。
3.根据权利要求1或2所述的miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：通过基因工程手段过表达miR1867，水稻籽粒的粒长、粒宽和千粒重显著增加。
4.根据权利要求3所述的miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：所述过表达为构建miR1867的过表达载体，对水稻中miR1867进行过表达。
5.根据权利要求4所述的miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：所述过表达载体由包括以下步骤的方法获得：将表达miR1867的基因片段插入出发载体中，转化、培养、验证获得过表达载体。
6.根据权利要求5所述的miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：所述出发载体为pTCK303。
7.根据权利要求5或6所述的miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：所述基因片段采用核苷酸序列如SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3所示的引物扩增获得。
8.根据权利要求1所述的miR1867在水稻种质资源改良中的应用，其特征在于：所述水稻为日本晴。
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