CN118325856A

CN118325856A - 谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体及其构建方法与应用

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Publication number: CN118325856A
Application number: CN202410490726.1A
Authority: CN
Inventors: 郑仁朝; 陈庆涛; 许孔亮; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2024-04-23
Filing date: 2024-04-23
Publication date: 2024-07-12

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体及其构建方法与应用。本发明借鉴革兰氏阳性菌酿脓链球菌菌毛蛋白中两个结构域（A和B）之间的自发组装方式，将结构域上的氨基酸序列分别连接到GshF和PPK的末端，在体外实现了无细胞自组装构建谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体，提高了谷胱甘肽的合成速率。通过将无细胞自组装体系成功应用于体外谷胱甘肽的合成，有效缩短了底物传递路径，显著提升反应速度和催化效率。该合成方法不仅实现了ATP在谷胱甘肽合成过程中的高效循环再生，降低了生产成本，而且操作简便、稳定性高，减少了副反应，提高了生产速率，使得产物收率接近理论值。

Description

谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体及其构建方法与应用。

背景技术

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的一种生物活性类三肽化合物。在生物体内，谷胱甘肽能参与体内氧化还原过程，结合过氧化物及自由基以对抗氧化剂对巯基的破坏，同时还可对抗自由基对重要脏器的损害。此外，谷胱甘肽提高人体免疫力，抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大，谷胱甘肽对于治疗放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状也都具有非常显著的效果。同时，其可保护生物细胞免受活性氧、自由基、过氧化物和重金属等物质的侵害，其在医疗、化妆品、食品等领域都具有极大的应用价值。

相较于传统的两步合成法，以谷胱甘肽双功能合成酶（GshF）为生物催化剂，一步法合成谷胱甘肽具有催化剂用量少、催化速度快、产物浓度高等优点。由于谷胱甘肽的合成过程需要消耗腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），以多聚磷酸激酶（PPK）构建ADP-ATP循环再生系统，并与谷胱甘肽双功能合成酶联用，共同构建的双酶催化合成系统具有催化效率高、成本低廉等优点，受到了国内外产业界的广泛关注。

然而，在谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶（GshF/PPK）双酶催化系统中，游离酶的稳定性差，且两个酶之间的适配性较差，该GshF/PPK双酶催化合成系统的催化效率仍有待提高。崔向伟等人构建了一个在细胞内高效催化合成谷胱甘肽的双酶复合体催化系统，并通过基因复制和共表达来提高该双酶复合体在细胞内的表达水平，从而提高了酶的稳定性，然而全细胞催化相较于酶催化的副产物较多（J. Agric. Food Chem., 2021, 69(13): 3887-94）。张晓楠等人开发了一种基于谷氨酰胺转氨酶的双酶交联方法，将谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶交联于谷氨酰胺转氨酶的表面，提高了酶的稳定性，但其催化活性并未有较大提高（北京化工大学. 双酶法生产谷胱甘肽体系的构建, 2022）。以上方法构建的双酶复合体提高了酶的稳定性，但其催化速率并未有明显提高。

因此，开发一种新的构建谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶双酶复合体的方法，并提高谷胱甘肽合成速率，具有重要的研究意义。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中构建的谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶双酶复合体合成谷胱甘肽催化效率低、催化速率慢、酶稳定性差的缺陷，提供了一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体及其构建方法与应用。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体的构建方法，包括以下步骤：

（S.1）质粒基因构建及酶的表达

将组装标签结合至谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶氨基酸序列的N端或C端，制备带有组装标签的脱氧核糖核苷酸序列的重组质粒并表达带有组装标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，得到带有组装标签的谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶；

所述组装标签包括SP A或SP B；所述组装标签SP A、SP B 来源于革兰氏阳性菌酿脓链球菌Streptococcus pyogenes；

（S.2）仿生双酶复合体的组装

将步骤（S.1）中得到的带有组装标签的谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶置于缓冲液中进行混合、胞外自组装，得到谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体。

一方面，本发明借鉴自然界中革兰氏阳性菌酿脓链球菌Streptococcus pyogenes（SP）菌毛蛋白中两个结构域（A和B）之间的自发组装方式，将结构域上的氨基酸序列分别连接到谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶的末端，在体外实现了无细胞自组装构建谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶（GshF/PPK）仿生双酶复合体，提高了谷胱甘肽的合成速率。另一方面，本发明还提供了一种无细胞体外高效合成谷胱甘肽的方法，包括多聚磷酸激酶和谷胱甘肽双功能合成酶的筛选组装，由自组装体系中的多聚磷酸激酶利用多聚磷酸盐和二磷酸腺苷（ADP），循环催化生成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），经自组装体系中的谷胱甘肽双功能合成酶作用，利用自组装系统在体外将甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸以及生成的ATP催化合成谷胱甘肽。

此外，本发明的无细胞自组装体系中多聚磷酸激酶利用反应体系中的副产物二磷酸腺苷（ADP）循环合成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），供谷胱甘肽双功能合成酶将三种前体合成谷胱甘肽，反应体系的多聚磷酸盐为多聚磷酸激酶（PPK）不断提供合成ATP所需的磷酸基，达到ATP的循环再生。

另外，本发明建立了一种无细胞自组装体系，通过组装标签SP A和SP B的特异性结合，有效缩短酶间距离，有助于提高催化效率并推动热力学平衡。有效避免了有毒中间产物的积累，通过构建纳米级底物通道结构，实现中间产物的快速传递，从而优化多酶反应。同时，本发明通过在大肠杆菌中过表达谷胱甘肽双功能合成酶（GshF）和多聚磷酸激酶（PPK），提供重组酶源。本发明中的多聚磷酸激酶包括经过重组菌表达破碎得到的粗酶液，或者经过纯化得到的纯酶。本发明中的谷胱甘肽双功能合成酶包括经过重组菌表达破碎得到的粗酶液，或者经过纯化得到的纯酶。

除此之外，本发明通过应用仿生学原理，将无细胞自组装体系成功应用于体外谷胱甘肽的合成，有效缩短了底物传递路径，显著提升了反应速度和催化效率。该合成方法不仅实现了ATP在谷胱甘肽合成过程中的高效循环再生，降低了生产成本，而且操作简便、稳定性高，减少了副反应，提高了生产速率，使得产物收率接近理论值。

作为优选，步骤（S.1）中组装标签SP A的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；组装标签SP B的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

作为优选，步骤（S.1）中质粒基因构建的具体过程如下：

将组装标签SP A插入谷胱甘肽双功能合成酶基因片段的N端、组装标签SP B插入多聚磷酸激酶基因片段的C端，然后分别将修饰过的基因片段整合到质粒载体上，进行酶切和连接，得到带有组装标签的脱氧核糖核苷酸序列的重组质粒。

作为优选，步骤（S.1）中酶的表达的具体过程如下：

将步骤（S.1）中构建好的带有组装标签的脱氧核糖核苷酸序列的重组质粒进行转化和筛选、验证、培养，表达带有组装标签的脱氧核糖核苷酸序列的蛋白质基因片段，得到带有组装标签的谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶。

作为优选，步骤（S.1）中将组装标签SP A、SP B分别连接在谷胱甘肽双功能合成酶的N端和C端，得到带有组装标签的谷胱甘肽双功能合成酶基因为如下基因GshF-SP A(N)、GshF-SP A(C)、GshF-SP B(N)、GshF-SPB(C)中的任意一种。

作为进一步优选，所述GshF-SP A(N)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述GshF-SP A(C)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述GshF-SP B(N)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述GshF-SP B(C)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为更进一步优选，步骤（S.1）中将组装标签SP A连接在谷胱甘肽双功能合成酶的N端，得到带有组装标签的谷胱甘肽双功能合成酶基因为基因GshF-SP A(N)， GshF-SP A(N)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，步骤（S.1）中将组装标签SP A、SP B分别连接在多聚磷酸激酶的N端和C端，得到带有组装标签的多聚磷酸激酶基因为如下基因PPK-SP A(N)、PPK-SP A(C)、PPK-SPB(N)、PPK-SPB(C) 中的任意一种。

作为进一步优选，所述PPK-SP A(N)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述PPK-SP A(C)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述PPK-SP B(N)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述PPK-SP B(C)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

作为更进一步优选，步骤（S.1）中将组装标签SP B连接在多聚磷酸激酶的C端，得到带有组装标签的多聚磷酸激酶基因为基因PPK-SP B(C)，PPK-SP B(C)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

作为优选，步骤（S.2）中进行胞外自组装的温度为20~37℃，谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶质量之比为1~5:1。

作为优选，步骤（S.1）以及（S.2）中的谷胱甘肽双功能合成酶来源于如下微生物Streptococcus thermophilus，Streptococcus sanguini，Streptococcus uberis， Streptococcus gordonii，Actinobacillus succinogenes，Actinobacillus pleuropneumoniae中的任意一种。

作为进一步优选，步骤（S.1）以及（S.2）中的谷胱甘肽双功能合成酶来源于如下微生物Streptococcus thermophilus。

作为优选，步骤（S.1）以及（S.2）中的多聚磷酸激酶来源于如下微生物Cytophaga hutchinsonii，Thermus thermophilus，Thermosynechococcus elongates，Jhaorihella thermophila，Hydrogenophilaceae bacterium，Nocardipides dokdonensis，Pseudonocardia thermophile，oseofilum reptotaenium中的任意一种。

作为进一步优选，步骤（S.1）以及（S.2）中的多聚磷酸激酶来源于如下微生物Cytophaga hutchinsonii。

如上所述的一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体在合成谷胱甘肽中的应用。

一种利用如上所述的谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体合成谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：

由自组装体系中的多聚磷酸激酶利用多聚磷酸盐、ADP循环催化生成ATP，经自组装体系中的谷胱甘肽双功能合成酶作用，在体外将甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸以及生成的ATP催化合成谷胱甘肽。

作为优选，所述多聚磷酸盐的通式为poly(P)n。

作为优选，所述多聚磷酸盐为焦磷酸盐、三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六聚磷酸盐中的任意一种或多种的组合。

作为更进一步优选，所述多聚磷酸盐为六聚磷酸盐。

作为优选，催化合成谷胱甘肽的反应温度为20-55℃，反应pH为6.5-9.0。

作为进一步优选，催化合成谷胱甘肽的反应温度为35℃，反应pH为8.0。

作为优选，催化合成谷胱甘肽的反应初始阶段提供浓度为1~5mM的ATP。

作为进一步优选，催化合成谷胱甘肽的反应初始阶段提供浓度为2mM的ATP。

因此，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明借鉴自然界中革兰氏阳性菌酿脓链球菌Streptococcus pyogenes（SP）菌毛蛋白中两个结构域（A和B）之间的自发组装方式，将结构域上的氨基酸序列分别连接到谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶的末端，在体外实现了无细胞自组装构建谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶（GshF/PPK）仿生双酶复合体，提高了谷胱甘肽的合成速率；

（2）本发明的无细胞自组装体系中多聚磷酸激酶利用反应体系中的副产物ADP循环合成ATP，供谷胱甘肽双功能合成酶将三种前体合成谷胱甘肽，反应体系的多聚磷酸盐为多聚磷酸激酶不断提供合成ATP所需的磷酸基，达到ATP的循环再生；

（3）本发明建立了一种无细胞自组装体系，通过组装标签SP A和SP B的特异性结合，有效缩短酶间距离，有助于提高催化效率并推动热力学平衡。有效避免了有毒中间产物的积累，通过构建纳米级底物通道结构，实现中间产物的快速传递，从而优化多酶反应；

（4）本发明通过应用仿生学原理，将无细胞自组装体系成功应用于体外谷胱甘肽的合成，有效缩短了底物传递路径，显著提升了反应速度和催化效率。该合成方法不仅实现了ATP在谷胱甘肽合成过程中的高效循环再生，降低了生产成本，而且操作简便、稳定性高，减少了副反应，提高了生产速率，使得产物收率接近理论值。

附图说明

图1为在不同末端（C/N）连接不同氨基酸序列（SP A/SP B）的谷胱甘肽双功能合成酶的比酶活。

图2为在不同末端（C/N）连接不同氨基酸序列（SP A/SP B）的多聚磷酸激酶的比酶活。

图3为实施例6中GshF/PPK仿生双酶复合体的SDS-PAGE分析图。

图4为实施例6中GshF/PPK仿生双酶复合体催化合成谷胱甘肽的反应进程曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1：谷胱甘肽双功能合成酶重组菌、多聚磷酸激酶重组菌的构建、表达

来源于Streptococcus thermophilus的谷胱甘肽双功能合成酶（GshF）基因由实验室保藏得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。来源于Cytophaga hutchinsonii的多聚磷酸激酶（PPK）基因由合成得到，其核苷酸序列如SEQID NO.11所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

a .将含有GshF的pET-28a(+)载体和含有PPK的pET-28a(+)载体用氯化钙法转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，得到转化子，涂布于含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养16h，挑取单菌落，对单菌落接种于含有LB液体培养基的小瓶中培养12h后，提质粒，送杭州擎科生物技术有限公司测序。测序正确，则BL21/pET-28a-GshF与BL21/pET-28a-PPK构建成功。

b .将BL21(DE3)/pET28a-GshF接种至LB培养基中，37℃培养8h后，按2%接种量接种至新鲜LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG终浓度至0.1mM，28℃诱导12h。

c .酶纯化方法：将诱导后菌体，离心收集，利用高压破碎得到粗酶液，离心得到上清液。将上清液通过Ni柱进行纯化。Ni柱平衡缓冲液：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，300mM NaCl，50mM咪唑，磷酸，将缓冲液pH值调到7.0；洗脱液：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，300mM NaCl，500mM咪唑，磷酸，将缓冲液pH值调到7.0。由于在洗脱时引入了大量盐离子，不适于酶的保存，故利用透析袋去除盐分，透析溶液选用50mMTris-HCl溶液，需要放置在冰上，再放入冰箱，透析12h。蛋白的定量通过BCA试剂盒（碧云天生物技术有限公司）进行测定。

实施例2：含SP A和SP B组装标签的谷胱甘肽双功能合成酶的构建与表达。

组装标签SP A/SP B基因序列从NCBI获取。其中，组装标签SP A基因由合成得到，组装标签SP B基因由引物扩增得到。组装标签SP A的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；组装标签SP B的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

以质粒pET-28a-GshF作为模板，引物P1、P2与P3、P4扩增分别得到N端与C端线性载体GshF-N/GshF-C。以组装标签SP A基因为模板，引物P5、P6和引物P7、P8获得插入N端和C端的线性片段。组装标签SP B基因由引物P9、P10和引物P11、P12，PCR扩增直接插入质粒载体中。PCR试剂盒及一步克隆试剂盒来自诺唯赞生物科技股份有限公司。

引物委托杭州擎科生物技术有限公司合成。引物如下：

P1: GTGGTGGTTCGATGACCCTGAACCAGCTGCTG

P2: GGATCCGCGACCCATTTG

P3:CACCCATCGAACCACCACCACCCGAACCACCACCACCGGTCTGACCAGCAACGATTTCC

P4: AAGCTTGCGGCCGCACTC

P5:CGACCAAAGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCATGACCCTGAACCAGCTGCTG

P6:CCACCACCACCTTTGGTCGGTTTATATGCATCAACCATCACAATGTGGGCGGATCCGCGACCCATTTG

P7: GTTCGGGTGGTGGTGGTTCGATGGGTGCAATGGTTGATACAC

P8: TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTCCAGGATGTGTGCATCACC

P9:CGACCAAAGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCATGACCCTGAACCAGCTGCTG

P10:CAGGGTCATCGAACCACCACCACCCGAACCACCACCACCTTCCAGG ATGTGTGCATCAC

P11:GCGCCCACATTGTGATGGTTGATGCATATAAACCGACCAAAAAGCTTGCGGCCGCACTC

P12:CCATCACAATGTGGGCGCTACCACCACCACCGCTACCACCACCACCGGTCTGACCAGCAACGATTTC

50μL PCR扩增体系：25.0μL 2×Phanta Max Buffer，1.0μL10mM dNTP，10μM上下游引物各1.0μL，1.0μL 10ng DNA模板，1.0μL Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，20.0μL ddH₂O。

PCR扩增程序：预变性95℃ 2min，循环32次（变性98℃ 10s，退火温度随引物标注温度15s，延伸72℃ 5min），终延伸72℃ 10min，4℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。确定PCR产物条带正确后，加入1μL碧云天DpnⅠ内切酶37℃过夜处理去除模板。核酸纯化采用诺唯赞核酸凝胶纯化试剂盒，严格按说明书处理。纯化产物通过一步克隆获得线性化载体，一步克隆采用诺唯赞ClonExpress Ⅱ同源重组试剂盒。

20μL一步克隆体系：冰上配制，4μL 5×CE Ⅱ Buffer，2μL Exnase Ⅱ，线性化载体2μL（使用量为0.02×碱基对数ng），插入片段1μL（使用量为0.04×碱基对数ng），ddH₂O补至20μL。

实施例3：含SP A和SP B组装标签的多聚磷酸激酶的构建与表达。

以质粒pET-28a-PPK作为模板，引物P13、P14与P15、P16扩增分别得到N端与C端线性载体PPK-N/PPK-C。以SP A基因为模板，引物P17、P18和引物P19、P20获得插入N端和C端的线性片段。SP B基因由引物P21、P22和引物P23、P24，PCR扩增直接插入质粒载体中。PCR试剂盒及一步克隆试剂盒来自诺唯赞生物科技股份有限公司。

引物委托杭州擎科生物技术有限公司合成。引物如下：

P13: ATGGCAACCGACTTTAGCAAAC

P14: GAATTCGGATCCGCGACC

P15: CATCACCACCATCACCATTAGAAG

P16: ATCGCTGCTTTTTTCTGCCAC

P17: GGGTCGCGGATCCGAATTCATGGGTGCAATGGTTGATACAC

P18:AGTTTGCTAAAGTCGGTTGCCGAACCACCACCACCCGAACCACCACCACCTTCCAGGATGTGTGCATCACC

P19:GGCAGAAAAAAGCAGCGATGGTGGTGGTGGTTCGGGTGGTGGTGGTTCGATGGGTGCAATGGTTGATACAC

P20: TAATGGTGATGGTGGTGATGTTCCAGGATGTGTGCATCACC

P21:GACCAAAGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTAGCGCAACCGACTTTAGCAAACTGA

P22:ACCACCACCACCTTTGGTCGGTTTATATGCATCAACCATCACAATGTGGGCCATGAATTCGGATCCGCG

P23:GGTGGTAGCGCCCACATTGTGATGGTTGATGCATATAAACCGACCAAACATCACCACCATCACCATTAG

P24:ACAATGTGGGCGCTACCACCACCACCGCTACCACCACCACCATCGCTGCTTTTTTCTGC

PCR扩增程序：预变性95℃ 2min，循环32次（变性98℃ 10s，退火温度随引物标注温度15s，延伸72℃ 4min），终延伸72℃ 10min，4℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。确定PCR产物条带正确后，加入1μL碧云天DpnⅠ内切酶37℃过夜处理去除模板。核酸纯化采用诺唯赞核酸凝胶纯化试剂盒，严格按说明书处理。纯化产物通过一步克隆获得线性化载体，一步克隆采用诺唯赞ClonExpress Ⅱ同源重组试剂盒。

实施例4：含SP A和SP B组装标签的谷胱甘肽双功能合成酶的酶活测定

（1）将保存的诱导表达4种GshF转化菌种GshF-SP A(N)、GshF-SP B(N)、GshF-SP A(C)、GshF-SP B(C)以及GshF原始菌种按上述方法重悬，超声破碎制得粗酶液；

（2）以谷氨酸20mM，半胱氨酸20mM，甘氨酸20mM，硫酸镁20mM，ATP 10mM，100mMTris-HCl（pH=8.0）配制底物溶液；

（3）取15个2mL EP管，每种样品取3个平行对照做好标记，每个EP管加入500μL底物，置于35℃，800rpm的恒温金属浴上预热2min；

（4）向每个EP管中加入500μL菌液，在35℃，800rpm的恒温金属浴上反应10min；

（5）加入100μL 2M HCL溶液终止反应，振荡混匀后加入等量2M NaOH溶液中和，8000rpm离心1min去除蛋白沉淀；

（6）按0g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、0.8g/L、1.0g/L配制谷胱甘肽（GSH）标准溶液，标准溶液和各管反应样液各取0.1-0.15mL至进样瓶，采用高效液相色谱分析；

（7）以GSH浓度为横坐标，对应标准溶液的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。测定反应样液对应峰面积，据标准曲线得到GSH浓度，计算酶活，定义一个酶活单位为35℃下每分钟催化生成1μmol GSH所需的酶量；

（8）将4种GshF转化菌种的酶活与GshF原始菌种对比，选择酶活损失最小的改造酶蛋白，确定SP A/SP B组装标签的最优接入位点。在不同末端（C/N）连接不同氨基酸序列（SPA/SP B）的谷胱甘肽双功能合成酶的比酶活结果如图1所示，与未接入组装标签的GshF相比，所有接入组装标签的酶均出现催化活性降低的情况。在GshF的N端接入SP B组装标签时对酶活影响最大，在GshF的N端接入SP A组装标签时对酶活影响最小，从而确定在GshF的N端插入SP A组装标签为最优的标签接入方法。

实施例5：含SP A和SP B组装标签的多聚磷酸激酶的酶活测定

（1）将保存的诱导表达4种PPK转化菌种PPK-SP A(N)、PPK-SP B(N)、PPK-SP A(C)、PPK-SP B(C)以及PPK原始菌种分别称取0.05g于不同烧杯中，各加入40mL 50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液溶解并做好标记；

（2）使用超声破碎仪处理粗菌液，功率200W，超声每开1s暂停2s，每个样品处理10min直至清亮；

（3）以ADP 25mM，六偏磷酸钠50mM，硫酸镁100mM，Tris-HCl（pH=7.5）50mM配制底物溶液；

（4）取15个2mL EP管，每种样品取3个平行对照做好标记，每个EP管加入150μL底物，置于35℃，800rpm的恒温金属浴上预热2min；

（5）向每个EP管中加入100μL粗酶液，在35℃，800rpm的恒温金属浴上反应5min；

（6）加入50μL 2M HCl溶液终止反应，振荡混匀后加入等量2M NaOH溶液中和，8000rpm离心1min去除蛋白沉淀；

（7）按0g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、0.8g/L、1.0g/L配制ATP标准溶液，标准溶液和各管反应样液各取0.1-0.15mL至进样瓶，采用高效液相色谱分析；

（8）以ATP浓度为横坐标，对应标准溶液的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。测定反应样液对应峰面积，据标准曲线得到ATP浓度，计算酶活，定义一个酶活单位为35℃下每分钟催化生成1μmol ATP所需的酶量；

（9）将4种PPK转化菌种的酶活与PPK原始菌种对比，选择酶活损失最小且与最优带组装标签GshF蛋白匹配的带组装标签PPK酶蛋白，确定SP A/SP B组装标签的最优接入位点。在不同末端（C/N）连接不同氨基酸序列（SP A/SP B）的多聚磷酸激酶的比酶活结果如图2所示，与未接入组装标签的PPK相比，所有接入组装标签的酶均出现催化活性降低的情况。在PPK的C端接入SP A组装标签时对酶活影响最大，在PPK的N端接入SP A组装标签时对酶活影响最小，在保证GSH合成催化活性选用酶GshF-SP A(N)的情况下，选定在PPK的C端插入SPB组装标签为最优的标签接入方法。

实施例6：GshF与PPK仿生双酶复合体的构建与性能测定

a. GshF/PPK仿生双酶复合体的构建

（1）分别称取最优GshF转化菌种（GshF-SP A(N)）、最优PPK转化菌种（PPK-SP B(C)）、PPK原始菌种0.1g于不同烧杯中，各加入10mL 100mM pH=8.0的Tris-HCl缓冲液溶解并做好标记；

（2）使用超声破碎仪处理粗菌液，功率200W，超声每开1s暂停2s，每个样品处理10min直至清亮，8000rpm离心1min获取上清液；

（3）以4:1比例将最优GshF转化菌种与最优PPK转化菌种的破碎液上清液混合，短暂室温孵育10min，构建GshF/PPK仿生双酶复合体。再以4:1比例将最优GshF转化菌种与PPK原始菌种的破碎液上清液混合作为对照；

（4）通过SDS-PAGE分析检测改造蛋白结合情况。GshF/PPK仿生双酶复合体的SDS-PAGE分析图如图3所示，通道1，2为GshF-SP A(N)和PPK-SP B(C)结合体系电泳结果。通道3，4为GshF-SP A(N)和PPK游离体系电泳结果。与通道3，4相比，结合体系（即通道1，2）在135-180kDa处有额外的重条带，进一步说明结合体系内存在游离体系中没有的仿生双酶复合体。

b. GshF/PPK仿生双酶复合体的性能测定

（1）称取最优GshF-SP A(N)转化菌种2g于烧杯中，加入40mL100mM pH=8.0的Tris-HCl缓冲液溶解；作为另一种实施方式，加入40mL 100mM pH=6.5-9.0的Tris-HCl缓冲液溶解；

（2）分别称取最优PPK-SP B(C)转化湿菌体、PPK原始湿菌体0.25g于不同烧杯中，各加入5mL 100mM pH=8.0的Tris-HCl缓冲液溶解；

（3）使用超声破碎仪处理粗菌液，功率200W，超声每开1s暂停2s，每个样品处理15min直至清亮；

（4）以谷氨酸90mM，半胱氨酸60mM，甘氨酸100mM，硫酸镁60mM，ATP 2mM，六偏磷酸钠35mM，100mM Tris-HCl（pH=8.0）配制底物溶液；作为另一种实施方式，加入的ATP浓度为1~5mM；

（5）取2个50mL反应瓶，各加入25mL底物溶液，置于25℃恒温水浴锅内的磁力搅拌器上预热；作为另一种实施方式，取2个50mL反应瓶，各加入25mL底物溶液，置于20-55℃恒温水浴锅内的磁力搅拌器上预热；

（6）以20mL GshF转化菌种菌液与5mL PPK转化菌种菌液混合，短暂室温孵育10min构建的GshF/PPK仿生双酶复合体加入到反应瓶开始反应，作为反应组。同时以20mLGshF转化菌种菌液与5mL PPK原始菌种菌液混合，加入到另一反应瓶进行反应，作为对照组，开始记录反应时间；

（7）反应持续8h，每经过1h分别从反应组与对照组各取样1mL，加入100μL 2M盐酸终止反应。同时实时监测反应系统pH，将体系pH维持在7.0；

（8）将样液以8000rpm离心1min处理去除蛋白沉淀，上清使用100mM pH=8.0的Tris-HCl稀释10倍；

（9）按0g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L、0.8g/L、1.0g/L配制GSH和ATP标准溶液，标准溶液和反应样液各取0.1-0.15mL至进样瓶，采用高效液相色谱分析；

（10）以GSH或ATP浓度为横坐标，对应标准溶液的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。测定反应样液对应峰面积，据标准曲线得到GSH或ATP浓度，计算酶活，定义一个酶活单位为35℃下每分钟催化生成1μmol GSH或ATP所需的酶量；

（11）比对反应组和对照组的GSH的合成催化活性并进行分析。GshF/PPK仿生双酶复合体催化合成谷胱甘肽的反应进程曲线图如图4所示，在相同反应时间内，双酶体系的谷胱甘肽含量均高于游离体系，且双酶体系ATP短缺并恢复发生的时间较游离体系更早，说明双酶体系有效提高了谷胱甘肽双功能合成酶GshF的催化合成能力，减少了合成反应与ATP再生偶联的通道效应，且复合体系的PPK仍可对ATP有较好的再生作用。本反应在加入极少ATP的情况下，极大缩短了生产成本，提高了转化率。

以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体，其特征在于，由如下方法构建获得：

（S.1）质粒基因构建及酶的表达

（S.2）仿生双酶复合体的组装

2.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体，其特征在于，步骤（S.1）中组装标签SP A的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；组装标签SP B的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

3.根据权利要求2所述的一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体，其特征在于，步骤（S.1）中质粒基因构建的具体过程如下：

4.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体，其特征在于，步骤（S.1）中酶的表达的具体过程如下：

5.根据权利要求1所述的一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体，其特征在于，步骤（S.2）中进行胞外自组装的温度为20~37℃，谷胱甘肽双功能合成酶和多聚磷酸激酶质量之比为1~5:1。

6.如权利要求1~5中任意一项所述的一种谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体在合成谷胱甘肽中的应用。

7.一种利用权利要求1~5中任意一项所述的谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的一种利用谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述多聚磷酸盐为焦磷酸盐、三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、六聚磷酸盐中的任意一种或多种的组合。

9.根据权利要求7所述的一种利用谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，

催化合成谷胱甘肽的反应温度为20-55℃，反应pH为6.5-9.0。

10.根据权利要求7所述的一种利用谷胱甘肽双功能合成酶/多聚磷酸激酶仿生双酶复合体合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，催化合成谷胱甘肽的反应初始阶段提供浓度为1~5mM的ATP。