CN118318989A - 一种富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含γ‑氨基丁酸的鱼椒酸及其制备方法，属于微生物发酵技术领域。所述制备方法包括以下步骤：首先将泥鳅丁、辣椒与拌料混合，向得到的混合料中加入植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌，之后密封发酵，即得所述富含γ‑氨基丁酸的鱼椒酸。本发明以泥鳅、辣椒为原料，筛选接种发酵鱼椒酸，利用植物乳杆菌快速产酸抑菌和植物乳杆菌、食窦魏斯氏菌高产γ‑氨基丁酸的作用，提升鱼椒酸的功能性品质，缩短发酵时间，提高产品安全性和功能性物质，为实现鱼椒酸工业化、规模化生产提供有效的解决途径。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸及其制备方法。
背景技术
鱼椒酸是贵州省黔东南州极具有民族特色的一种发酵调味品，因其独特的风味和较高的营养价值，深受人们的喜爱。由于其制作方式具有典型的区域性、季节性和民族性，因此很难大规模生产。传统鱼椒酸在发酵过程中采用自然发酵的方式，发酵周期长，产品品质不稳定，不能产生特定的功能性物质，工业化生产困难，经济价值低。利用筛选出来的菌种进行发酵，能够缩短发酵周期，提高产品的品质特性，减少微病原菌的污染，使食品的安全性增加，增加鱼椒酸在发酵过程中的稳定性，能够工业化生产。传统鱼椒酸原料主要采用爬岩鱼等野生鱼类，原料资源受限，很难大规模工业化生产。泥鳅具有较高的营养价值，容易人工养殖，不受季节、地域限制，将其作为鱼椒酸的原料，能够使其大规模生产。γ-氨基丁酸具有降低神经元性、防止神经细胞过热的作用，还具有防止动脉硬化、调节心律失常、降低血脂、增强肝功能等生理功效。
近年来，一些安全性高的微生物，如乳酸菌、酵母菌、曲霉菌被用于发酵合成γ-氨基丁酸。而利用微生物中谷氨酸脱羧酶脱羧形成γ-氨基丁酸，具有成本低、富集含量高、安全性高的优点，因此，利用植物乳杆菌、食窦魏斯氏菌对鱼椒酸进行混菌发酵，能够提高鱼椒酸的品质特性，增加鱼椒酸中γ-氨基丁酸的含量，提高鱼椒酸的功能特性。
发明内容
为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸的制备方法，包括以下步骤：首先将泥鳅丁、辣椒与拌料混合，向得到的混合料中加入植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌，之后密封发酵，即得所述富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸。
作为本发明的优选技术方案，所述拌料包括质量比为(3～5):7:(2～4)的生姜、白酒和食盐，所述泥鳅丁、辣椒与拌料的质量比为500:(45～55):(5～9)。
作为本发明的优选技术方案，所述植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌的加入量均为所述混合料质量的0.5～1.5％。
作为本发明的优选技术方案，所述植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌加入混合料之前还经过驯化处理，具体方法为：将植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌接种于含有谷氨酸钠和磷酸比多醛的MRS培养基中培养。
作为本发明的优选技术方案，所述培养的具体方法为：在35～40℃下培养18～20h。
作为本发明的优选技术方案，所述MRS培养基中谷氨酸钠和磷酸比多醛的添加量分别为18～22g/L和0.05～0.15mg/L。
作为本发明的优选技术方案，驯化后得到的植物乳杆菌液和食窦魏斯氏菌液在加入混合料前还经过两次活化处理，；所述活化处理具体为：将驯化后得到的植物乳杆菌液和食窦魏斯氏菌液分别接入MRS液体培养基中培养，每次活化时间均为18h。
作为本发明的优选技术方案，所述发酵温度为20～25℃，时间为8～16d。
本发明还提供了一种根据上述所述的制备方法制备得到的富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)由于野生爬岩鱼的数量锐减，受季节限制，使得传统鱼椒酸的制作受限，寻找可替代爬岩鱼的原料制作鱼椒酸，能够有效保护和传承这一原生态传统调味品。本发明经过研究发现，泥鳅是较好的可替代爬岩鱼的原料。泥鳅营养丰富，经济价值高，可人工养殖，不受季节、区域性限制，可大规模生产鱼椒酸。
(2)本发明以小泥鳅等淡水鱼、辣椒为原料，筛选接种发酵鱼椒酸，利用植物乳杆菌快速产酸抑菌和植物乳杆菌、食窦魏斯氏菌高产γ-氨基丁酸的作用，提升鱼椒酸的功能性品质，缩短发酵时间，提高产品安全性和功能性物质，为实现鱼椒酸工业化、规模化生产提供有效的解决途径。本发明利用乳酸菌控制鱼椒酸发酵过程，利用植物乳杆菌的快速生长产酸降低pH值，植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌的使用，可使鱼椒酸在短时间内产生大量γ-氨基丁酸(GABA)，显著高于自然发酵组；植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌的添加还可以显著提高产品的感官特性，生产周期较自然发酵缩短50％以上。在传统鱼椒酸制作工艺的基础上，以泥鳅替代爬岩鱼为原料，并进行接菌发酵，并对接菌发酵后的鱼椒酸进行了分析，接菌发酵的鱼椒酸等同或优于自然发酵鱼椒酸。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为驯化前后食窦魏斯氏菌、植物乳杆菌的γ-氨基丁酸变化图。
图2为实施例1～4及对比例1～3发酵过程中γ-氨基丁酸变化图。
图3为实施例1～4及对比例1～3发酵过程中pH变化图。
图4为实施例1～4及对比例1～3发酵过程中总酸变化图。
图5为实施例1～4及对比例1～3发酵过程中氨基酸态氮变化图。
图6为实施例1～4及对比例1～3发酵过程中亚硝酸盐变化图。
图7为实施例1～4及对比例1～3发酵过程中丙二醛变化图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例及对比例中，所采用的白酒为市售53度红星二锅头酒；所采用的植物乳杆菌购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No.1.2685，有效活菌数为108～109CFU/mL；所采用的食窦魏斯氏菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.15075，有效活菌数为108～109CFU/mL；植物乳杆菌及食窦魏斯氏菌的驯化方法均为：向MRS液体培养基中加入谷氨酸钠和磷酸比多醛，使谷氨酸钠浓度为20g/L，磷酸比多醛的浓度为0.1mg/L，分别接入植物乳杆菌、食窦魏斯氏菌(接入量均为10mL/L培养基)，37℃培养18～20h，得到菌液。驯化时的MRS液体培养基及活化采用的MRS培养基的配方如下：
每升培养基中含有：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g；pH调节为6.2。
MRS液体培养基的成分和含量可根据本领域技术人员的常识做适当调整，pH在6～6.5均可，其功效与上述基本相当即可。
以下不再重复描述。
实施例1
鱼椒酸的制备，步骤如下：
(1)鲜活小泥鳅敲头宰杀，去除头部、尾部及内脏，清洗沥干，切成1-5g条状，即泥鳅丁；新鲜的二荆条红辣椒去缔，清洗沥干，剁碎；
(2)新鲜生姜洗净，刮皮，切成姜丁备用；取白酒，备用；取食盐，备用；
(3)按照质量比为生姜:白酒:食盐为4:7:3充分混合均匀，得到拌料；
(4)将步骤(1)得到的泥鳅丁、辣椒与步骤(3)得到的拌料按照质量比为500:50:7混合，搅拌均匀，得到混合料；
(5)取驯化后的植物乳杆菌菌液和食窦魏斯氏菌菌液，分别接入MRS液体培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)培养18h，之后将所得菌液再次接入MRS培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)，继续培养18h，将得到的菌液加入混合料中，添加量分别为混合料总质量的1％，将菌液和上述物料混匀；
(6)将步骤(5)得到的物料装入发酵罐中，其容量为发酵罐的三分之二，用盖子盖紧罐口，在25℃条件下密封发酵16天，得到鱼椒酸，记为HY。
实施例2
鱼椒酸的制备，步骤如下：
(1)鲜活小泥鳅敲头宰杀，去除头部、尾部及内脏，清洗沥干，切成1-5g条状，即泥鳅丁；新鲜的二荆条红辣椒去缔，清洗沥干，剁碎；
(2)新鲜生姜洗净，刮皮，切成姜丁备用；取白酒，备用；取食盐，备用；
(3)按照质量比为生姜:白酒:食盐为3:7:4充分混合均匀，得到拌料；
(4)将步骤(1)得到的泥鳅丁、辣椒与步骤(3)得到的拌料按照质量比为500:45:9混合，搅拌均匀，得到混合料；
(5)取驯化后的植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌菌液，分别接入MRS液体培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)培养18h，之后将所得菌液再次接入MRS培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)，继续培养18h，将得到的菌液加入混合料中，添加量分别为混合料总质量的0.5％、1.5％，将菌液和上述物料混匀；
(6)将步骤(5)得到的物料装入发酵罐中，其容量为发酵罐的三分之二，用盖子盖紧罐口，在20℃条件下密封发酵16天，得到鱼椒酸，记为HY-1。
实施例3
鱼椒酸的制备，步骤如下：
(1)鲜活小泥鳅敲头宰杀，去除头部、尾部及内脏，清洗沥干，切成1-5g条状，即泥鳅丁；新鲜的二荆条红辣椒去缔，清洗沥干，剁碎；
(2)新鲜生姜洗净，刮皮，切成姜丁备用；取白酒，备用；取食盐，备用；
(3)按照质量比为生姜:白酒:食盐为5:7:2充分混合均匀，得到拌料；
(4)将步骤(1)得到的泥鳅丁、辣椒与步骤(3)得到的拌料按照质量比为100:11:1混合，搅拌均匀，得到混合料；
(5)取驯化后的植物乳杆菌菌液和食窦魏斯氏菌菌液分别接入MRS液体培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)培养18h，之后将所得菌液再次接入MRS培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)，继续培养18h，将得到的菌液加入混合料中，添加量分别为混合料总质量的1.5％、0.5％，将菌液和上述物料混匀；
(6)将步骤(5)得到的物料装入发酵罐中，其容量为发酵罐的三分之二，用盖子盖紧罐口，在25℃条件下密封发酵8天，得到鱼椒酸，记为HY-2。
实施例4
同实施例1，区别在于，步骤(5)中加入的为未经驯化的植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌，具体如下：
(5)取植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌菌液，分别接入MRS液体培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)培养18h，之后将所得菌液再次接入MRS培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)，继续培养18h，将得到的菌液加入混合料中，添加量分别为混合料总质量的1％，将菌种和上述物料混匀。
本实施例得到的鱼椒酸记为HY-3。
对比例1
鱼椒酸的制备，步骤如下：
(1)鲜活小泥鳅敲头宰杀，去除头部、尾部及内脏，清洗沥干，切成1-5g小丁状，即泥鳅丁；新鲜的二荆条红辣椒清洗沥干，去蒂，剁碎；
(2)新鲜生姜洗净，刮皮，切成姜丁备用；取白酒，备用；取食盐，备用；
(3)按照质量比为生姜:白酒:食盐为4:7:3充分混合均匀，得到拌料；
(4)将步骤(1)得到的泥鳅丁、辣椒与步骤(3)得到的拌料按照质量比为500:50:7混合，搅拌均匀，得到混合料；
(5)将步骤(4)得到的混合料装入发酵罐中，其容量为发酵罐的三分之二，用盖子盖紧罐口，在25℃条件下密封发酵16天，得到鱼椒酸，记为ZY。
对比例2
鱼椒酸的制备，步骤如下：
(1)鲜活小泥鳅敲头宰杀，去除头部、尾部及内脏，清洗沥干，切成1-5g条状，即泥鳅丁；新鲜的二荆条红辣椒清洗沥干，去蒂，剁碎；
(2)新鲜生姜洗净，刮皮，切成姜丁备用；取白酒，备用；取食盐，备用；
(3)按照质量比为生姜:白酒:食盐为4:7:3充分混合均匀，得到拌料；
(4)将步骤(1)得到的泥鳅丁、辣椒与步骤(3)得到的拌料按照质量比为500:50:7混合，搅拌均匀，得到混合料；
(5)取驯化后的食窦魏斯氏菌菌液，接入MRS液体培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)培养18h，之后将所得菌液再次接入MRS培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)，继续培养18h，将得到的菌液加入混合料中，添加量为混合料总质量的1％，将菌液和上述物料混匀；
(6)将步骤(5)得到的物料装入发酵罐中，其容量为发酵罐的三分之二，用盖子盖紧罐口，在25℃条件下密封发酵16天，得到鱼椒酸，记为WY。
对比例3
鱼椒酸的制备，步骤如下：
(1)鲜活小泥鳅敲头宰杀，去除头部、尾部及内脏，清洗沥干，切成1-5g条状，即泥鳅丁；新鲜的二荆条红辣椒清洗沥干，去蒂，剁碎；
(2)新鲜生姜洗净，刮皮，切成姜丁备用；取白酒，备用；取食盐，备用；
(3)按照质量比为生姜:白酒:食盐为4:7:3充分混合均匀，得到拌料；
(4)将步骤(1)得到的泥鳅丁、辣椒与步骤(3)得到的拌料按照质量比为500:50:7混合，搅拌均匀，得到混合料；
(5)取驯化后的植物乳杆菌菌菌液，接入MRS液体培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)培养18h，之后将所得菌液再次接入MRS培养基中(每升培养基中的菌液接入量均为10mL)，继续培养18h，将得到的菌液加入混合料中，添加量为混合料总质量的1％，将菌液和上述物料混匀；
(6)将步骤(5)得到的物料装入发酵罐中，其容量为发酵罐的三分之二，用盖子盖紧罐口，在25℃条件下密封发酵16天，得到鱼椒酸，记为LY。
效果验证
1.将驯化前后的食窦魏斯氏菌分别记为Y113和Y113-X，驯化前后的植物乳杆菌分别记为Y279和Y279-X。经过驯化后的菌株GABA含量变化如图1所示，经过驯化后的菌株，GABA含量显著提高。
2.实施例1～4及对比例1～3发酵过程中微生物含量变化如表1所示。
表1实施例1～4及对比例1～3发酵过程中微生物含量变化
由表1可以看出，在发酵0天时，HY组的乳酸菌数量迅速增长，达到了7.81log CFU/g，WY组和LY组中的乳酸菌含量比ZY组中更高，说明加入的这两种微生物均能很好的生长。在发酵一周后，乳酸菌数量增长缓慢，总含量减少，可能是与可发酵碳水化合物的减少有关。在HY组中，酵母菌含量始终低于ZY组，可能是由于乳酸菌的快速生长抑制了酵母菌的生长。在发酵8天后，HY组、LY组、WY组和ZY组的大肠杆菌均低于检出限。大肠杆菌数量的迅速降低说明鱼椒酸的食品安全性高。
实施例1～4及对比例1～3发酵过程中鱼椒酸的GABA含量变化如图2所示，由图2可以看出，在不同发酵组的鱼椒酸中，HY组GABA产量最高，且随着发酵时间的延长，HY组、LY组和WY组中的GABA含量均比ZY组更高，说明接菌发酵能够提高鱼椒酸的GABA含量。所有发酵鱼椒酸在发酵过程中的GABA含量均呈现不同程度的下降，可能是由于菌株的活性下降，导致产GABA的能力减弱。
实施例1～4及对比例1～3发酵过程中鱼椒酸的pH值变化如图3所示，由图3可以看出，四组鱼椒酸的pH值都随着时间的延长而降低。发酵一周后，各组别鱼椒酸的pH值均低于4.6以下，且其他三组接菌发酵的鱼椒酸均低于自然发酵组，说明接入微生物进行发酵后，鱼椒酸的pH值能够快速降低，有利于抑制腐败菌和致病菌，保障发酵食品的安全性。在发酵后期，发酵鱼椒酸的体系中氧气逐渐耗尽，乳酸菌生长缓慢，产酸能力下降，使得pH值保持在一个稳定状态。
实施例1～4及对比例1～3发酵过程中鱼椒酸的总酸含量变化如图4所示，由图4可以看出，随着时间的延长，各组别鱼椒酸中总酸含量均呈现上升趋势。接菌发酵组中总酸含量的迅速增长可能是在接菌发酵组中接入混合菌株使得乳酸菌成为优势菌，乳酸菌数量迅速增加，产酸速率增加，因此总酸含量上升，而HY组中的总酸含量始终比其他三组鱼椒酸更高，表明接入混合菌株后，鱼椒酸酸化更迅速，更能提高鱼椒酸的安全性。
实施例1～4及对比例1～3发酵过程中鱼椒酸的氨基酸态氮含量变化如图5所示，由图5可以看出，氨基酸态氮的含量是鉴定发酵食品品质的重要指标之一，氨基酸态氮含量还可用来表示蛋白质的水解程度。各组别鱼椒酸的氨基酸态氮含量均随时间的延长而上升。在发酵4天时，HY组中氨基酸态氮含量迅速增加，表明蛋白质在发酵初期以较快的速度水解，并且HY组中蛋白质水解程度更高。在发酵后期，鱼椒酸中氨基酸态氮的含量增加变缓，可能是由于在持续较低的pH值下，蛋白质的水解会变得缓慢。
实施例1～4及对比例1～3发酵过程中鱼椒酸的亚硝酸盐含量变化如图6所示，由图6可以看出，四组鱼椒酸的亚硝酸盐含量均远低于20mg/kg，符合国家标准对腌渍蔬菜中亚硝酸盐含量最大残留量的要求。在整个发酵过程中，其他三组接菌发酵鱼椒酸中的亚硝酸盐含量均远远低于自然发酵，说明接菌发酵有利于抑制亚硝酸盐的形成，并减少亚硝酸盐含量的积累。而混合菌株发酵的鱼椒酸中，亚硝酸盐含量更低，说明混合菌株发酵鱼椒酸的安全性更高，对人体的危害也更小。
实施例1～4及对比例1～3发酵过程中鱼椒酸的丙二醛含量变化如图7所示，丙二醛是衡量脂肪氧化的指标之一，适度的脂肪氧化能够带来良好的风味，而过度的脂肪氧化则会形成刺激性气味，影响食品品质。由图7可以看出，在发酵4天后，其他三组接菌发酵鱼椒酸的丙二醛含量始终低于自然发酵组，这说明接入的优势菌能够抑制不饱和脂肪酸的氧化，可能具有抗氧化活性的物质。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将泥鳅丁、辣椒与拌料混合，向得到的混合料中加入植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌，之后密封发酵，即得所述富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述拌料包括质量比为(3～5):7:(2～4)的生姜、白酒和食盐，所述泥鳅丁、辣椒与拌料的质量比为500:(45～55):(5～9)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌的加入量均为所述混合料质量的0.5～1.5％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌加入混合料之前还经过驯化处理，具体方法为：将植物乳杆菌和食窦魏斯氏菌接种于含有谷氨酸钠和磷酸比多醛的MRS培养基中培养。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在35～40℃下培养，时间为18～20h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述MRS培养基中谷氨酸钠和磷酸比多醛的添加量分别为18～22g/L和0.05～0.15mg/L。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，驯化后得到的植物乳杆菌液和食窦魏斯氏菌液在加入混合料前还经过两次活化处理；所述活化处理具体为：将驯化后得到的植物乳杆菌液和食窦魏斯氏菌液分别接入MRS液体培养基中培养，每次活化时间均为18h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为20～25℃，时间为8～16d。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的富含γ-氨基丁酸的鱼椒酸。
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