CN118307509A - [2.2]环仿香豆素荧光探针、制备方法和检测手性分子的方法 - Google Patents
[2.2]环仿香豆素荧光探针、制备方法和检测手性分子的方法Info
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Abstract
本发明公开一种[2.2]环仿香豆素荧光探针、制备方法、检测手性分子的方法，荧光探针包括：荧光探针结构，荧光探针结构如式(Ⅰ)所示，通过将[2.2]环仿骨架引入香豆素分子内，可以将其应用于对手性分子的荧光识别。该荧光探针可在四氢呋喃、HEPES水溶液的混合溶液中化学选择性和对映选择性识别组氨酸，并且可以定量检测组氨酸的浓度和组氨酸的ee值，该探针为非手性荧光探针，可以减少手性化合物分离的困难，大大降低荧光探针的合成成本，开拓新的氨基酸识别探针。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种[2.2]环仿香豆素荧光探针、制备方法、检测手性分子的方法。
背景技术
手性是自然界的基本属性，手性化合物互为镜像，但不能相互重叠。手性α氨基酸是一种重要的有机分子，在生物、医疗和化学工业中发挥着不可或缺的作用，是多种手性药物和功能性有机分子的重要起始材料和手性来源。D-氨基酸存在于生物体中，并在哺乳动物和人类中发挥特定的生理功能，而L-氨基酸在自然界中广泛存在，如在蛋白质和多肽中。由于手性氨基酸的重要性和易于制取的优点，许多快速有效的手性鉴定方法已被报道，用于测定氨基酸的浓度或对映体组成。在这些方法中，因荧光探针识别具有响应速度快、灵敏度高、无创实时成像和高通量分析等优点，利用荧光分子探针测定手性氨基酸的浓度和对映体组成受到了广泛的关注。然而，这些荧光探针大多是手性的，包括轴手性和中心手性，它们中的大多数不能化学选择性地识别18种常见氨基酸中的一种氨基酸，且不能对氨基酸浓度定量和ee值[ee＝([L]-[D])/([L]+[D])]进行定量检测。
发明内容
本发明实施例的目的是提供一种[2.2]环仿香豆素荧光探针、制备方法、检测手性分子的方法，用于解决荧光探针不能化学选择性地识别氨基酸，不能对氨基酸定量检测的问题。
第一方面，本发明实施例提供了一种[2.2]环仿香豆素荧光探针，包括：荧光探针结构，所述荧光探针结构如式(Ⅰ)所示：
其中，R为Br或H。
第二方面，本发明实施例提供了一种[2.2]环仿香豆素荧光探针的制备方法，包括：
将环仿化合物和4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素加入到反应瓶中，加入催化剂，再加入溶剂，搅拌反应，制得[2.2]环仿香豆素荧光探针；所述催化剂包括三乙胺与二异丙基乙基胺中的至少一种；
所述环仿化合物包括4-氨基[2.2]环仿与4-氨基-12-溴[2.2]环仿中的至少一种。
可选地，环仿化合物、4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素与催化剂的摩尔比为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(3-6)。
可选地，在氮气环境下加入催化剂。
可选地，反应温度为60-90℃。
可选地，反应时间为16-36h。
可选地，所述溶剂包括乙醇和甲醇中的至少一种。
可选地，还包括：
搅拌反应后对反应产物进行减压蒸馏，除去溶剂，然后以淋洗液进行淋洗，进行柱层析提纯，制得[2.2]环仿香豆素荧光探针；
所述淋洗液包括石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷中的至少一种。
可选地，所述淋洗液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯体积比为4:1-1:1。
第三方面，本发明实施例提供了一种检测手性分子的方法，包括：
将上述实施例所述的[2.2]环仿香豆素荧光探针、助剂液、缓冲液和组氨酸混合，测定荧光响应值，根据荧光响应值判断待测物质的构型、浓度及对映异构体组成比例中的至少一种；
所述助剂液包括四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的至少一种；
所述缓冲液包括HEPES缓冲液、磷酸缓冲液中的至少一种。
本发明实施例的[2.2]环仿香豆素荧光探针，通过将[2.2]环仿骨架引入香豆素分子内，可以将其应用于对手性分子的荧光识别。该荧光探针可在四氢呋喃、HEPES水溶液的混合溶液中化学选择性和对映选择性识别组氨酸，并且可以定量检测组氨酸的浓度和组氨酸的ee值，该探针为非手性荧光探针，可以减少手性化合物分离的困难，大大降低荧光探针的合成成本，开拓新的氨基酸识别探针。
附图说明
图1a是实施例1中溴环仿香豆素的氢谱数据；
图1b是实施例1中溴环仿香豆素的碳谱数据；
图1c是实施例1中溴环仿香豆素质谱数据；
图2a是实施例2中环仿香豆素的氢谱数据；
图2b是实施例2中环仿香豆素的碳谱数据；
图2c是实施例2中环仿香豆素质谱数据；
图3a为溴环仿香豆素在四氢呋喃：HEPES水溶液＝1:1的混合溶液中对D-和L-组氨酸的荧光响应情况；
图3b为环仿香豆素在四氢呋喃：HEPES水溶液＝1:1的混合溶液中对D-和L-组氨酸的荧光响应情况；
图4a为溴环仿香豆素荧光强度随D-/L-组氨酸浓度增加的变化情况；
图4b为环仿香豆素荧光强度随D-/L-组氨酸浓度增加的变化情况；
图5a为溴环仿香豆素荧光强度随组氨酸对映体组成比例的变化情况；
图5b为环仿香豆素荧光强度随组氨酸对映体组成比例的变化情况。
图6a为溴环仿香豆素对18种氨基酸的荧光响应情况；
图6b为环仿香豆素对18种氨基酸的荧光响应情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，说明书以及权利要求中“和/或”表示所连接对象的至少其中之一，字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明实施例提供了一种[2.2]环仿香豆素荧光探针，包括：荧光探针结构，所述荧光探针结构如式(Ⅰ)所示：
其中，R为Br或H。
本发明实施例的[2.2]环仿香豆素荧光探针，通过将[2.2]环仿骨架引入香豆素分子内，可以将其应用于对手性分子的荧光识别。该荧光探针可在四氢呋喃：HEPES水溶液的混合溶液中化学选择性和对映选择性识别组氨酸，并且可以定量检测组氨酸的浓度和组氨酸的ee值，该探针为非手性荧光探针，可以减少手性化合物分离的困难，大大降低荧光探针的合成成本，开拓新的氨基酸识别探针。
本发明实施例提供了一种[2.2]环仿香豆素荧光探针的制备方法，包括：
将环仿化合物和4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素加入到反应瓶中，加入催化剂，再加入溶剂，搅拌反应，制得[2.2]环仿香豆素荧光探针；所述催化剂包括三乙胺与二异丙基乙基胺中的至少一种；
所述环仿化合物包括4-氨基[2.2]环仿与4-氨基-12-溴[2.2]环仿中的至少一种。
加入催化剂的过程中，可以在惰性环境下加入。加入三乙胺的过程中，可以在惰性环境下加入，比如，可以在氮气、氩气或氦气环境下加入三乙胺。溶剂可以选自乙醇、甲醇中的至少一种，比如，溶剂可以为乙醇。搅拌反应可以在60-90℃下进行反应，比如，搅拌反应可以在78℃下进行反应。
可选地，环仿化合物、4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素与三乙胺的摩尔比可以为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(3-6)。
可选地，在氮气环境下加入催化剂。
可选地，反应温度可以为60-90℃，比如，反应温度可以为60、70、80或90℃。
可选地，反应时间可以为16-36h，比如，反应时间可以为16、20、26、30或36h。
可选地，所述溶剂可以包括乙醇和甲醇中的至少一种，比如，溶剂可以选自乙醇。
可选地，制备方法还可以包括：
搅拌反应后对反应产物进行减压蒸馏，除去溶剂，然后以淋洗液进行淋洗，进行柱层析提纯，制得[2.2]环仿香豆素荧光探针；
所述淋洗液包括石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷中的至少一种。淋洗液可以包括石油醚和乙酸乙酯，通过减压蒸馏除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯进行淋洗，进行柱层析提纯，得到纯度高的[2.2]环仿香豆素荧光探针。
可选地，所述淋洗液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯体积比为4:1-1:1，比如，石油醚和乙酸乙酯的体积比可以为3:1或1:1。
本发明实施例提供了一种检测手性分子的方法，包括：
将上述实施例所述的[2.2]环仿香豆素荧光探针、助剂液、缓冲液和组氨酸混合，测定荧光响应值，根据荧光响应值判断待测物质的构型、浓度及对映异构体组成比例中的至少一种；
所述助剂液包括四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的至少一种；
所述缓冲液包括HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、磷酸缓冲液中的至少一种，比如，助剂液可以为四氢呋喃，缓冲液可以为HEPES缓冲液。助剂液可以为四氢呋喃，缓冲液可以为HEPES缓冲液，四氢呋喃：HEPES溶液可以为1:1，该荧光探针能够实现对四氢呋喃与HEPES溶液混合溶液中的组氨酸的对映选择性识别，并且可以定量检测组氨酸的浓度和组氨酸的ee值。
本发明荧光探针通过在香豆素结构上引入[2.2]环仿基团合成，结合生成的分子表现出来的特性，是两个基团共同作用的结果，不是单一某个基团导致的。香豆素基团为识别氨基酸提供了反应位点，但其对氨基酸不具有选择性识别，而[2.2]环仿基团的引入可以增加探针的空间位阻，防止π-π的堆积，从而通过加入不同构型的D/L-组氨酸，形成不同的手性对映体，该手性对映体与对应的过量氨基酸在四氢呋喃、HEPES水溶液的混合溶液中形成手性聚集体的速率不同，从而产生不同的光物理性质。此外，该探针可在四氢呋喃、HEPES水溶液的混合溶液中特异性识别18种常见氨基酸中的组氨酸。本发明克服了大多数荧光探针只能在有机试剂中识别氨基酸的缺点，可以利用[2.2]环仿基团设计合成识别氨基酸的荧光探针，且仅用消旋的探针便可达到手性识别效果，简化了荧光探针合成的步骤，开拓新的氨基酸识别探针。
本发明的荧光探针具有较好的稳定性，以及较高的化学选择性和对映选择性等特点。消旋的溴环仿香豆素和环仿香豆素可作为手性荧光传感器识别四氢呋喃、HEPES水溶液的混合溶液中的D/L-组氨酸，显示对D-组氨酸的荧光响应超过对L-组氨酸的荧光响应，ef值(ef＝(ID-I0)/(IL-I0),ID为溴环仿香豆素/环仿香豆素加D-组氨酸的荧光强度，IL为溴环仿香豆素/环仿香豆素加L-组氨酸的荧光强度，I0为溴环仿香豆素/环仿香豆素的荧光强度)分别为17.3和8.7。溴环仿香豆素和环仿香豆素也可定量测定D/L-组氨酸的浓度和对映体组成，该探针在18对常见氨基酸对映体中仅对D/L-组氨酸具有高度的化学选择性和对映选择性荧光识别。
下面通过一些具体的实施例对本发明作进一步说明。
其反应式如下：
R为Br时，制备得到溴环仿香豆素；R为H时，制备得到环仿香豆素。
实施例1
[2.2]环仿香豆素荧光探针的制备方法，具体如下：
在氮气条件下，将4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素(121mg，0.41mmol)、4-氨基-12-溴[2.2]环仿(125mg，0.41mmol)和三乙胺(207mg，2.05mmol)加入到10mL乙醇中，78℃搅拌24小时。待反应完成，反应液冷却到室温，减压蒸馏。再将所得混合物进行柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)，最终得到产物溴环仿香豆素(90mg,38％)为黄色固体。
图1a、图1b、图1c分别是溴环仿香豆素的氢谱、碳谱、质谱数据，具体数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ12.75(s,1H),10.29(s,1H),7.39(d,J＝1.8Hz,1H),6.90(d,J＝1.3Hz,1H),6.84(d,J＝9.5Hz,1H),6.64(d,J＝1.1Hz,2H),6.57(d,J＝7.8Hz,1H),6.52(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),6.36(d,J＝2.6Hz,1H),6.07(dd,J＝9.5,2.7Hz,1H),3.47(ddd,J＝13.4,9.8,2.1Hz,1H),3.16–3.10(m,1H),3.09–3.05(m,2H),3.05–3.01(m,1H),2.98(s,6H),2.97–2.92(m,1H),2.84(ddd,J＝13.3,10.3,6.7Hz,1H),2.65(ddd,J＝13.2,10.7,6.4Hz,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ191.7,163.9,157.7,157.6,154.1,142.3,141.8,138.6,138.0,136.0,135.4,135.3,132.6,132.4,131.8,128.8,127.0,126.7,108.0,101.3,98.1,95.8,39.8,35.5,33.1,32.6,32.5。
实施例2
在氮气条件下，将4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素(147mg，0.5mmol)、4-氨基[2.2]环仿(112mg，0.5mmol)和三乙胺(347μL，2.5mmol)加入到10mL乙醇中，78℃搅拌24小时。待反应完成，反应液冷却到室温，减压蒸馏。再将所得混合物进行柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，最终得到产物环仿香豆素(92mg，42％)为黄色固体。
图2a、图2b、图2c分别是环仿香豆素的氢谱、碳谱、质谱数据，具体数据如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ12.77(s,1H),10.29(s,1H),7.31(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.76(d,J＝9.5Hz,1H),6.66(dd,J＝7.8,1.8Hz,1H),6.58(ddt,J＝7.8,4.9,2.5Hz,3H),6.48(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.35(d,J＝2.7Hz,1H),6.18(d,J＝1.7Hz,1H),6.04(dd,J＝9.5,2.7Hz,1H),3.10(q,J＝3.8Hz,4H),3.09–2.99(m,3H),2.97(s,6H),2.71–2.62(m,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ191.6,163.9,157.7,157.5,154.0,142.3,139.7,139.1,137.8,135.9,135.9,133.6,133.3,132.3,132.1,131.6,128.9,128.3,107.9,101.3,98.1,95.7,39.8,35.2,34.8,34.0,32.6。
实施例3
[2.2]环仿香豆素荧光探针识别组氨酸的条件
1.不同pH
取5.9575g的HEPES和7.5g的氯化钠，定容至1L，均匀的分到12个锥形瓶中，分别加入氢氧化钠溶液和盐酸溶液配成pH为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5的缓冲液；
称取溴环仿香豆素/环仿香豆素于离心管中，加入四氢呋喃配成浓度为2×10- 3mol/L的浓储；
分别称取D-组氨酸/L-组氨酸于玻璃瓶中，分别加入不用pH的HEPES缓冲液配成浓度为8×10-2mol/L的溶液；
取300μL的D-组氨酸或L-组氨酸溶液，加入到240μL的四氢呋喃中，再加入60μL的溴环仿香豆素/环仿香豆素浓储，在37℃的条件下反应2h，分别加入不同pH值的HEPES缓冲液(1200μL)和四氢呋喃(1200μL)。激发波长为360nm。
结果表明，在2.5到11.5范围内，该探针对组氨酸都有选择性识别，在pH为7.5的条件下对组氨酸对映选择性最好。
2.四氢呋喃和HEPES不同比例
(1)pH＝7.5的HEPES缓冲液的配置：取5.9575g的HEPES，495mg的氢氧化钠和7.5g的氯化钠，定容至1L；
(2)称取溴环仿香豆素/环仿香豆素于离心管中，加入四氢呋喃配成浓度为2×10- 3mol/L的浓储；
(3)分别称取D-组氨酸/L-组氨酸于玻璃瓶中，加入pH＝7.5的HEPES缓冲液配成浓度为8×10-2mol/L的溶液；
(4)分别取60μL的浓储加入到9个离心管，分别加入240μL四氢呋喃和300μL的D/L-组氨酸，在37℃的条件下反应2h，再分别加入2.4、2.1、1.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0mL的THF溶液，然后补加HEPES缓冲液至各个离心管中总液体体积都为3mL，即，即得含水比例分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的混合溶液。激发波长为360nm。
该探针在四氢呋喃和HEPES不同比例的条件下对组氨酸的识别过程中，当HEPES的含量为30％-70％范围内都有较好的对映选择性，但在50％条件下对组氨酸的对映选择性最好。
实施例4
对组氨酸的识别
1.对组氨酸的手性识别
(1)pH＝7.5的HEPES缓冲液的配置：取5.9575g的HEPES，495mg的氢氧化钠和7.5g的氯化钠，定容至1L；
(2)称取溴环仿香豆素/环仿香豆素于离心管中，加入四氢呋喃配成浓度为2×10- 3mol/L的浓储；
(3)分别称取D-组氨酸和L-组氨酸于玻璃瓶中，加入pH＝7.5的HEPES缓冲液配成浓度为8×10-2mol/L的溶液；
(4)取300μL的D-组氨酸或L-组氨酸溶液，加入到240μL的四氢呋喃中，再加入60μL的溴环仿香豆素浓储，在37℃的条件下反应2h，最后加入1200μL的水和1200μL的四氢呋喃。取210μL的D-组氨酸或L-组氨酸溶液，加入到240μL的四氢呋喃中，再加入60μL的溴环仿香豆素浓储，在37℃的条件下反应2h，最后加入1200μL的水和1200μL的四氢呋喃。激发波长为360nm。
[2.2]环仿香豆素荧光探针溴环仿香豆素/环仿香豆素对映选择性识别组氨酸的结果见图3a和图3b。由图可知，溴环仿香豆素/环仿香豆素对D-和L-组氨酸表现出不同的荧光响应，对D-组氨酸的荧光响应超过对L-组氨酸，其ef分别为17.3和8.7，有较好的对映选择性。
2.对D/L-组氨酸浓度的定量检测
(1)pH＝7.5的HEPES缓冲液的配置：取5.9575g的HEPES，495mg的氢氧化钠和7.5g的氯化钠，定容至1L；
(2)称取溴环仿香豆素/环仿香豆素于离心管中，加入四氢呋喃配成浓度为2×10- 3mol/L的浓储；
(3)分别称取D-组氨酸和L-组氨酸于玻璃瓶中，加入pH＝7.5的HEPES缓冲液配成浓度为8×10-2mol/L的溶液；
(4)分别取15、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300μL的D-组氨酸或L-组氨酸溶液到玻璃瓶中，即氨基酸的浓度依次为0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、4.8、5.6、6.4、7.2、8.0Mm，再依次加入285、270、240、210、180、150、120、90、60、30、0μL的HEPES缓冲液，然后向11个玻璃瓶分别加入240μL的四氢呋喃，再加入60μL的溴环仿香豆素/环仿香豆素浓储，在37℃的条件下反应2h，最后加入1200μL的水和1200μL的四氢呋喃。激发波长为360nm。
由图4a可知，溴环仿香豆素对组氨酸的识别在0.4-8mM范围内，D-组氨酸浓度与荧光强度有良好的线性关系(R2＝0.99473)，对L-组氨酸也具有良好的线性关系(R2＝0.99904)。由图4b可知，环仿香豆素对组氨酸的识别在0.4-5.6mM范围内，D-组氨酸浓度与荧光强度有良好的线性关系(R2＝0.99859)，对L-组氨酸也具有良好的线性关系(R2＝0.99644)。由此可知，溴环仿香豆素/环仿香豆素可以用来定量检测组氨酸的浓度。
3.对D/L-组氨酸ee％的定量检测
(1)pH＝7.5的HEPES缓冲液的配置：取5.9575g的HEPES，495mg的氢氧化钠和7.5g的氯化钠，定容至1L；
(2)称取溴环仿香豆素/环仿香豆素于离心管中，加入四氢呋喃配成浓度为2×10- 3mol/L的浓储；
(3)分别称取D-组氨酸和L-组氨酸于玻璃瓶中，加入pH＝7.5的HEPES缓冲液配成浓度为4×10-2mol/L的溶液；
(4)分别称取不同体积的D-组氨酸和L-组氨酸于玻璃瓶中，加入240μL的四氢呋喃，再加入60μL的溴环仿香豆素/环仿香豆素浓储，在37℃的条件下反应2h，最后加入1200μL的水和1200μL的四氢呋喃。ee值及D-和L-组氨酸的体积配比如下：ee％＝0％(0μL的D-组氨酸和300μL的L-组氨酸)；ee％＝10％(30μL的D-组氨酸和270μL的L-组氨酸)；ee％＝20％(60μL的D-组氨酸和240μL的L-组氨酸)；ee％＝30％(90μL的D-组氨酸和210μL的L-组氨酸)；ee％＝40％(120μL的D-组氨酸和180μL的L-组氨酸)；ee％＝50％(150μL的D-组氨酸和150μL的L-组氨酸)；ee％＝60％(180μL的D-组氨酸和120μL的L-组氨酸)；ee％＝70％(210μL的D-组氨酸和90μL的L-组氨酸)；ee％＝80％(240μL的D-组氨酸和60μL的L-组氨酸)；ee％＝90％(270μL的D-组氨酸和30μL的L-组氨酸)；ee％＝100％(300μL的D-组氨酸和0μL的L-组氨酸)；激发波长为360nm。
由图5a和图5b可知，溴环仿香豆素/环仿香豆素在445nm/440nm处的荧光强度与ee值具有较好的线性关系(0-100％)，R2分别为0.99013和0.99552。因此，该探针可以用来定量检测组氨酸的ee值。
4.对组氨酸的化学选择性识别
(1)pH＝7.5的HEPES缓冲液的配置：取5.9575g的HEPES，495mg的氢氧化钠和7.5g的氯化钠，定容至1L；
(2)称取溴环仿香豆素/环仿香豆素于离心管中，加入四氢呋喃配成浓度为2×10- 3mol/L的浓储；
(3)分别称取组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)的对映体于玻璃瓶中，加入pH＝7.5的HEPES缓冲液分别配成浓度为8×10-2mol/L的溶液；
(4)分别取300μL的18种常见氨基酸对映体的溶液于玻璃瓶中，分别加入240μL的四氢呋喃，再加入60μL的溴环仿香豆素/环仿香豆素浓储，在37℃的条件下反应2h，最后加入1200μL的水和1200μL的四氢呋喃。激发波长为360nm。
溴环仿香豆素/环仿香豆素在18种常见氨基酸对映体中对D-组氨酸具有高度的化学选择性荧光识别，具体见图6a和图6b。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，均属于本发明的保护之内。
Claims (10)
1.一种[2.2]环仿香豆素荧光探针，其特征在于，包括：荧光探针结构，所述荧光探针结构如式(Ⅰ)所示：
其中，R为Br或H。
2.一种[2.2]环仿香豆素荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将环仿化合物和4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素加入到反应瓶中，加入催化剂，再加入溶剂，搅拌反应，制得[2.2]环仿香豆素荧光探针；所述催化剂包括三乙胺与二异丙基乙基胺中的至少一种；
所述环仿化合物包括4-氨基[2.2]环仿与4-氨基-12-溴[2.2]环仿中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，环仿化合物、4-溴-7-(二甲氨基)-香豆素与催化剂的摩尔比为(0.5-1.5):(0.5-1.5):(3-6)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在氮气环境下加入催化剂。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应温度为60-90℃。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应时间为16-36h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂包括乙醇和甲醇中的至少一种。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括：
搅拌反应后对反应产物进行减压蒸馏，除去溶剂，然后以淋洗液进行淋洗，进行柱层析提纯，制得[2.2]环仿香豆素荧光探针；
所述淋洗液包括石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述淋洗液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯体积比为4:1-1:1。
10.一种检测手性分子的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1中所述的[2.2]环仿香豆素荧光探针、助剂液、缓冲液和组氨酸混合，测定荧光响应值，根据荧光响应值判断待测物质的构型、浓度及对映异构体组成比例中的至少一种；
所述助剂液包括四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的至少一种；
所述缓冲液包括HEPES缓冲液、磷酸缓冲液中的至少一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |