CN118303510A - 一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用 - Google Patents
一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118303510A CN118303510A CN202410600619.XA CN202410600619A CN118303510A CN 118303510 A CN118303510 A CN 118303510A CN 202410600619 A CN202410600619 A CN 202410600619A CN 118303510 A CN118303510 A CN 118303510A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phytase
- feed
- solution
- mutant
- phytic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 title claims abstract description 103
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 7
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 claims abstract description 35
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims abstract description 30
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 29
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 claims abstract description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 13
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 10
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 3
- 229930195727 α-lactose Natural products 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 10
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 5
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 5
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 5
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 5
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 4
- 229940036811 bone meal Drugs 0.000 description 4
- 239000002374 bone meal Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 4
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 101150102326 1.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010037936 CCCGGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010055024 Pancreatic enlargement Diseases 0.000 description 1
- XIUMQSREFXCDGE-UHFFFAOYSA-L S(=O)(=O)([O-])O.[Na+].[Cl-].[Na+] Chemical compound S(=O)(=O)([O-])O.[Na+].[Cl-].[Na+] XIUMQSREFXCDGE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011960 computer-aided design Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- -1 trichloride-salicylic acid Chemical compound 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用，属于饲料技术领域。通过构建表达植酸酶突变体的重组枯草芽孢杆菌，表达的植酸酶加入粉碎的饲料原料中用混合机搅拌混匀，50~55℃作用10小时降解饲料中的植酸，然后制成饲料。植酸酶突变体比未突变的植酸酶在更宽的温度和pH范围具有较高酶活性。植酸酶突变体比未突变的植酸酶相对酶活力提高了36.79%，降解豆粕中植酸的活性提高了50.6%。植酸酶突变体应用于饲料原料处理，能充分降解饲料原料中豆粕等谷物中存在的植酸，减轻植酸抑制蛋白质、氨基酸等营养因子消化吸收的作用，从而有效降低饲料中豆粕的用量，降低饲料成本。
Description
技术领域
本发明属于饲料技术领域，尤其涉及一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用。
背景技术
豆粕、玉米、麦麸等谷物产品是动物饲料的主要原料，豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品。豆粕中粗蛋白质含量高达30~50%，是制作动物饲料的主要原料。豆粕作为蛋白饲料，是畜禽的主食，不易被替代，并且豆粕已经成为重要的期货交易品种，使得其价格波动的影响范围广、冲击面大。豆粕价格不断攀高已成为饲料价格上涨的主要因素。在中国，大豆主产区在黑龙江，由于大豆不算主粮，不像玉米、水稻、小麦，享受国家保护性的收储政策，种植面积不断减少。豆粕对进口依赖性强，其价格波动因素不可预测。因此，饲料中豆粕替代、减量技术成为饲料制造业亟需解决的问题。
人们已经发现直接摄入豆科籽实会导致人和动物产生胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及一些不良生理反应的现象，这些生理反应是由大豆中含有的多种抗营养因子共同介导，其中最主要的抗营养因子为植酸。植酸在豆类、谷类等作物中普遍存在，尤其在大豆中含量高。植酸在生物体内与金属阳离子、氨基酸、蛋白质和淀粉等物质结合从而抑制这些物质的消化吸收，被称为抗营养因子。植酸酶可以降解植酸生成无机磷和磷酸肌醇，从而解除植酸的抗营养作用，从而使得饲料中有限的豆粕蛋白被畜禽充分吸收利用，这是降低饲料中豆粕用量的可行之路。畜禽消化系统缺乏植酸酶，因此不能代谢植酸，进而限制了营养素在肠道的消化吸收，降低了饲料的转化率。使用植酸酶可高效地降解饲料豆粕中的植酸含量，消除抗营养作用。因此植酸酶可以作为一种新型饲料添加剂应用于饲料工业。然而，天然植酸酶应用于饲料制备过程中酶活性易受温度、pH等影响，限制植酸酶在饲料工业的应用。因此，需要对植酸酶进行改性优化，使其适用于饲料加工环节温度、pH宽泛的条件，从而充分消除饲料中抗营养因子，实现饲料豆粕减量的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用，属于饲料技术领域。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
其一，本发明提供了一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述植酸酶为重组枯草芽孢杆菌表达的植酸酶突变体，所述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
进一步地，所述饲料添加剂能够用于降解饲料中的植酸。
进一步地，所述饲料添加剂能够用于降低饲料中豆粕的用量。
进一步地，所述饲料添加剂的制备方法如下：
（1）重组枯草芽孢杆菌种子液按体积比1%的比例接种10ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备一级种子液；
（2）根据发酵量，将一级种子液按体积比1%的比例接种含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备二级种子液、多级种子液；
（3）多级种子液按体积比1%的比例接种LB培养液于发酵罐中37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～0.8时，加入0.5mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.05mol/L，进行诱导表达，继续培养5～7小时。培养结束后，将菌液6000rmp连续流离心，收集上清酶液，冷冻干燥，密封保存。
其二，本发明提供了一种植酸酶突变体。
其三，本发明提供了一种用于表达植酸酶突变体的基因，所述植酸酶突变体的基因序列为SEQ ID NO.2。
本发明的有益效果在于，通过构建表达植酸酶突变体的重组枯草芽孢杆菌，表达的植酸酶加入粉碎的饲料原料中用混合机搅拌混匀，50~55℃作用10小时降解饲料中的植酸，然后制成饲料。植酸酶突变体比未突变的植酸酶在更宽的温度和pH范围具有较高酶活性。植酸酶突变体比未突变的植酸酶相对酶活力提高了36.79%，降解豆粕中植酸的活性提高了50.6%。植酸酶突变体处理饲料，在饲料中豆粕含量减半的情况下能达到与不添加植酸酶高豆粕含量饲料接近的料肉比。植酸酶突变体应用于饲料原料处理，能充分降解饲料原料中豆粕等谷物中存在的植酸，减轻植酸抑制蛋白质、氨基酸等营养因子消化吸收的作用，从而有效降低饲料中豆粕的用量，降低饲料成本。
附图说明
图1：未突变植酸酶和植酸酶突变体的酶活力测定。
图2：温度对植酸酶相对活力的影响。
图3：pH对植酸酶相对活力的影响。
图4：重组植酸酶对豆粕中植酸降解活性检测
具体实施方式
实施例1：基于计算机辅助设计的酶结构改造和突变体设计
枯草芽孢杆菌VTT E-68013株植酸酶氨基酸序列GenBank登录号为：WP_342088197.1。应用Discovery Studio 软件对酶氨基酸序列进行分析，同源建模。分析酶与底物结合位点，通过点突变将231位、242位芳香族氨基酸酪氨酸Tyr突变为丙氨酸Ala，降低空间位阻，增强酶与底物结合能力。植酸酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
实施例2：表达植酸酶的重组枯草芽孢杆菌构建
1.1基因合成
（1）根据植酸酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO.1合成植酸酶突变体DNA序列SEQ IDNO.2，上下游分别添加BamHI和SmaI限制性内切酶位点，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并克隆到pUC57质粒上获得pUC57-phytase-Mut质粒。
（2）根据枯草芽孢杆菌VTT E-68013株WP_342088197.1的氨基酸序列合成未突变的植酸酶DNA序列SEQ ID NO.3。上下游分别添加BamHI和SmaI限制性内切酶位点，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并克隆到pUC57质粒上获得pUC57-phytase质粒。
1.2 重组表达载体的构建
(1)利用限制性内切酶BamHI和SmaI对pUC57-phytase-Mut、pUC57-phytase质粒进行双酶切，分别回收phytase-Mut、phytase基因片段；
(2)利用限制性内切酶BamHI和SmaI双酶切表达载体pHT43，并回收基因片段；
(3)将phytase-Mut和pHT43核酸片段用T4 DNA连接酶连接，将phytase和pHT43核酸片段用T4 DNA连接酶连接，分别转化到大肠杆菌E .coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，BamHI和SmaI双酶切鉴定，获得重组表达质粒pHT43-phytase-Mut和pHT43-phytase。
1.3 表达植酸酶、植酸酶突变体的重组枯草芽孢杆菌菌株构建
（1）重组质粒pHT43-phytase-Mut经酶切、测序鉴定正确后电转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，涂布40μg/mL氯霉素平板，挑取单菌落于5 mL的含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为种子液，命名为WB800N-phytase-Mut。
（2）重组质粒pHT43-phytase经酶切、测序鉴定正确后转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，涂布40μg/mL氯霉素平板，挑取单菌落于5 mL的含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为种子液，命名为WB800N-phytase。
1.4 植酸酶、植酸酶突变体的表达
（1）0.1ml种子液按体积比1%的比例转接10ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为一级种子液。
（2）10ml一级种子液按体积比1%的比例转接1000ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为二级种子液。
（3）校准发酵罐的pH电极、溶氧电极，并进行蠕动泵的流量校准。
（4）发酵罐通气培养，按发酵罐容积的70％配LB制培养基70L，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.2，按培养基总体积0.02%加入消泡剂。灭菌后待发酵罐内培养液冷却到 37℃时加入40μg/mL氯霉，将700ml二级种子液加入发酵罐中，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～0.8时，加入0.5mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.05mol/L，进行诱导表达，继续培养5～7小时。整个培养过程中，发酵罐参数设置为搅拌速度500～800r/min，罐内压力 9psi，温度37℃，设定DO值 (溶解氧) 在 20％以上。培养结束后，将菌液6000rmp连续流离心，收集上清酶液。
实施例2：未突变的植酸酶与植酸酶突变体的酶学性质检测
1.1将250μL酶液（0.005 mg/mL）与750 μL 0.25 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 4.5）混匀后加入离心管中，作为重组植酸酶的酶活力测定样品。向实验组中加入2 mL 1.5mmol/L植酸钠溶液（0.25 mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.5），向对照组中加入2 mL终点混合液（钼酸铵/钒酸铵/硝酸），充分混匀。于37 ℃反应30 min后，立即向实验组中加入2 mL终点混合液，对照组中加入2 mL 1.5 mmol/L植酸钠溶液，并充分混匀，然后于415 nm处测定光吸收值。植酸酶活力单位（U）定义为：在37℃、pH 4.5的条件下，每分钟从1.5 mmol/L植酸钠溶液中释放出1 μmol/L无机磷所需要的植酸酶量为一个酶活力单位（U）。
未突变植酸酶和植酸酶突变体的酶活力如图1所示，未突变的植酸酶的酶活力为3576.74U/mg，植酸酶突变体的酶活力为4892.69U/mg，突变后酶活力提高了36.79%。
1.2 最适温度
温度对酶相对活力的影响如图2所示。未突变的植酸酶的最适温度为55℃，植酸酶突变体的在50℃、55℃相对酶活力均接近100%，且植酸酶突变体的酶活力在较宽温度范围内保持较高相对活力。因此植酸酶突变体比未突变的植酸酶能在更宽的温度范围内保持较高酶活力。
1.3 最适 pH
pH对酶相对活力的影响如图3所示。从图中可以看出，未突变的植酸酶和植酸酶突变体的最适pH均为7.0，但是植酸酶突变体的酶活力在较宽pH范围内保持较高相对活力，而未突变的植酸酶相对活力对pH较敏感，酶活力因pH变化衰减程度较大。因此植酸酶突变体比未突变的植酸酶具有更好的pH稳定性。
实施例3：枯草芽孢杆菌表达重组植酸酶对豆粕中植酸降解活性检测
1.1 豆粕中植酸含量测定方法
1.1.1 样品制备、提取及净化
豆粕磨粉，过1.0mm筛，密封并标明标记。称取试样10.0g，加入10mL的硫酸钠-盐酸提取液（100g无水硫酸钠溶于1.2%浓度的盐酸溶液中，定容至1000mL），震荡提取2h后离心30min（4000r/min），收集的上清液用提取液继续定容至50mL，过滤后4℃冰箱保存。取上清液2.0mL和15%三氯乙酸 2.0mL于10mL玻璃试管中，混匀，4℃静置2h后离心，吸取上清液，用0.7mol/L NaOH调节pH值为6.0~6.5，加水定容至25mL。
1.1.2 制作标准曲线
吸取植酸溶液（准确称取1.56g纯度≥90%的植酸钠，加水溶解并定容至100mL，配得10.0mg/mL植酸钠溶液。使用前水稀释至0.1mg/mL）0mL、0.04mL、0.1mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL于6支10mL管中，稀释至5mL，制得含有植酸0mg、0.004mg、0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.5mg的系列溶液，加入4mL 反应溶液（三氯化铁-磺酸水杨酸溶液：取1.5g三氯化铁和15g磺酸水杨酸加水溶解并定容到500mL。使用前稀释15倍），静置20min后取清液加入比色皿中，500nm处测定吸光度，保证吸光度在0.2~0.8范围内。绘制标准曲线时以吸光度为纵坐标，植酸含量为横坐标（GB 5009.153）。
1.1.3 测定
吸取5mL豆粕溶液加入10mL离心管中，加入4 mL反应溶液，混匀，离心10min（2500r/min）后获得的上清液即为测定液；不加样品溶液，得比色空白溶液。将测定液和比色空白溶液分别倒入比色杯中，用空白液调“零点”，在500nm波长下测定吸光度。试样8次重复，2次平行比色，可在标准曲线上查得试液中植酸含量。
试样中植酸含量按公式计算：X=（m2×25×50）/（m1×5×V）
式中：X（g/kg）：试样中植酸含量；m2（mg）: 5mL供试液中的植酸质量；25（mL）：洗脱液定容体积；m1（g）：试样质量；5（mL）：测定用的试液体积；V（mL）：供净化的提取液体积；50（mL）：提取液定容体积。
结果保留3位有效数字，绝对差值不得超过平均数的5%。
1.2豆粕中植酸降解效果检测
取1kg豆粕粉两份，分别加入未突变的植酸酶、植酸酶突变体各1g，搅拌均匀，在55℃保温12小时，每过1个小时取样测定样品中植酸含量，计算植酸降解效率。
1.3结果
从图4中可以看出，未突变的植酸酶反应10小时达到最大降解率61.38%，植酸酶突变体反应9小时达到最大降解率92.44%。植酸酶突变体比未突变的植酸酶降解豆粕中植酸的活性提高了50.6%。
实施例4：植酸酶处理的豆粕减量饲料对白羽肉鸡生长性能的影响试验
1.1饲料制备
饲料一：将玉米60%、小麦麸10%、豆粕15%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，烘干，经粉碎机粉碎，造粒；
饲料二：将玉米60%、小麦麸17.5%、豆粕7.5%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，烘干，经粉碎机粉碎，造粒；
饲料三：将玉米60%、小麦麸17.5%、豆粕7.5%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%、未突变的植酸酶0.1%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，55℃保温10h，烘干，经粉碎机粉碎，造粒；
饲料四：将玉米60%、小麦麸17.5%、豆粕7.5%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%、植酸酶突变体0.1%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，55℃保温10h，烘干，经粉碎机粉碎，造粒。
1.2 动物试验
（1）400只1日龄健康白羽肉鸡随机分为4组，100只/组，隔离饲养；
（2）每天8：00和16：00各饲喂一次，自由采食、饮水，试验期为40天，饲养期间按照白羽肉鸡常规免疫程序免疫和饲养管理，实验结束统计鸡料肉比。
表1 植酸酶处理的豆粕减量饲料对白羽肉鸡生长性能的影响
| 分组 | 植酸酶 | 豆粕含量（%） | 料肉比 |
| 饲料一 | 不添加 | 15 | 1.84:1 |
| 饲料二 | 不添加 | 7.5 | 2.17:1 |
| 饲料三 | 未突变的植酸酶 | 7.5 | 2.01:1 |
| 饲料四 | 植酸酶突变体 | 7.5 | 1.86:1 |
从表1可以看出，未突变的植酸酶和植酸酶突变体处理饲料饲喂白羽肉鸡均能降低料肉比，植酸酶突变体效果更为突出。植酸酶突变体处理饲料，在饲料中豆粕含量减半的情况下能达到与不添加植酸酶高豆粕含量饲料接近的料肉比。
Claims (6)
1.一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述植酸酶为重组枯草芽孢杆菌表达的植酸酶突变体，所述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂能够用于降解饲料中的植酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂能够用于降低饲料中豆粕的用量。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂的制备方法如下：
（1）重组枯草芽孢杆菌种子液按体积比1%的比例接种10ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备一级种子液；
（2）根据发酵量，将一级种子液按体积比1%的比例接种含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备二级种子液、多级种子液；
（3）多级种子液按体积比1%的比例接种LB培养液于发酵罐中37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～0.8时，加入0.5mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.05mol/L，进行诱导表达，继续培养5～7小时。培养结束后，将菌液6000rmp连续流离心，收集上清酶液，冷冻干燥，密封保存。
5.一种如权利要求1所述的植酸酶突变体。
6.一种用于表达如权利要求1所述植酸酶突变体的基因，其特征在于，所述植酸酶突变体的基因序列为SEQ ID NO.2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410600619.XA CN118303510B (zh) | 2024-05-15 | 2024-05-15 | 一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410600619.XA CN118303510B (zh) | 2024-05-15 | 2024-05-15 | 一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118303510A true CN118303510A (zh) | 2024-07-09 |
| CN118303510B CN118303510B (zh) | 2024-09-13 |
Family
ID=91725717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410600619.XA Active CN118303510B (zh) | 2024-05-15 | 2024-05-15 | 一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118303510B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102649950A (zh) * | 2012-04-16 | 2012-08-29 | 盐城工学院 | 一种突变的中性植酸酶及其基因和用途 |
| CN103468660A (zh) * | 2013-09-26 | 2013-12-25 | 盐城工学院 | 高活性中性植酸酶突变体及其基因和用途 |
-
2024
- 2024-05-15 CN CN202410600619.XA patent/CN118303510B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102649950A (zh) * | 2012-04-16 | 2012-08-29 | 盐城工学院 | 一种突变的中性植酸酶及其基因和用途 |
| CN103468660A (zh) * | 2013-09-26 | 2013-12-25 | 盐城工学院 | 高活性中性植酸酶突变体及其基因和用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN118303510B (zh) | 2024-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4421596B2 (ja) | 酵素混合物 | |
| CN101080491B (zh) | 具有植酸酶活性的多肽和编码多肽的核苷酸序列 | |
| CN102823731A (zh) | 一种饲用复合小肽的制备方法 | |
| CN105379947A (zh) | 一种动物饲料的制备方法及其制备的动物饲料 | |
| CN103525790A (zh) | 一种优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy及其制备方法和应用 | |
| CN106520642B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103589705B (zh) | 一种角蛋白酶及其编码基因 | |
| CN114686386A (zh) | 一种生产甲醇菌体蛋白联产纤维素酶的毕赤酵母及其应用 | |
| CN104585505A (zh) | 一种用枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同发酵豆粕的方法 | |
| CN101638647A (zh) | 酸性蛋白酶及其制备方法 | |
| CN118303510B (zh) | 一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用 | |
| CN103695394B (zh) | 一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用 | |
| CN114621987B (zh) | 一种制备具有不同分子量分布特点的阿拉伯木聚糖方法 | |
| CN104342418A (zh) | 具有提升的酶活性的植酸酶 | |
| CN114317500B (zh) | 木聚糖酶Scxyn5及其编码基因和应用 | |
| CN117887681B (zh) | 一种辣根过氧化物酶在制备脱霉饲料中的应用 | |
| CN115851671B (zh) | 木聚糖酶突变体xynH及其与胆汁酸复合的酶制剂和应用 | |
| CN1302112C (zh) | 利用毕赤酵母生产高比活耐高温植酸酶 | |
| CN115851670B (zh) | 木聚糖酶突变体及与杜仲叶提取物的复配制剂和在饲料添加剂的应用 | |
| CN110506839A (zh) | 一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用 | |
| CN117296994B (zh) | 一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用 | |
| CN116218817B (zh) | β‐甘露聚糖酶突变体β‐ManM及其与胆汁酸制备的添加剂和应用 | |
| CN116064479B (zh) | 一种含木聚糖酶突变体和胆汁酸的复合制剂及其应用 | |
| CN116004585B (zh) | 一种桉树精油突变酶制剂及其在家畜养殖中的应用 | |
| Kumari et al. | Phytase from pearl millet: its partial purification and characterization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |