CN117887681B - 一种辣根过氧化物酶在制备脱霉饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种辣根过氧化物酶在制备脱霉饲料中的应用，属于饲料制备技术领域。通过构建表达辣根过氧化物酶突变体的重组枯草芽孢杆菌，表达辣根过氧化物酶，菌体超声裂解，裂解液加入粉碎的饲料原料中用混合机搅拌混匀，30℃作用10小时降解霉菌毒素，然后用造粒机造粒成形制成饲料。辣根过氧化物酶突变体比未突变的辣根过氧化物酶降解黄曲霉毒素B1的活性提高了54.79%，降解玉米赤霉烯酮的活性提高了28.03%。辣根过氧化物酶突变体应用于饲料原料处理，能将霉菌毒素降解为低毒、无毒产物，是脱霉制备健康饲料的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于饲料制备技术领域，尤其涉及一种辣根过氧化物酶在制备脱霉饲料中的应用。
背景技术
霉菌毒素是指霉菌在其所污染的食物中产生的有毒代谢产物，它们可通过饲料或食品进入人和动物体内，引起人和动物的急性或慢性毒性，损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等。霉菌毒素可在农作物在大田收获时形成；在不适宜的贮存条件下，霉菌毒素也可继续在收获后的农作物上形成。动物饲料以玉米、豆粕、麦麸等粮食为主要原料，其中霉菌毒素污染的程度不易控制，在养殖过程中，经常遇到育肥猪生长速度缓慢、母猪假发情、哺乳仔猪拉稀、蛋鸡产蛋率下降、奶牛奶质不符合要求等情况。饲料中霉菌毒素超标已经造成严重的经济损失。其中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮是饲料中最为普遍的霉菌毒素。
黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉、集蜂曲霉以及某些曲霉亚种等多种真菌所产生的一类次级代谢产物，具有极强的毒性，可诱导发生致癌、致毒和致畸形作用。黄曲霉毒素在多种恶劣环境中有极高的稳定性，该毒素分布广泛，被认为是人类和动物最重要的饮食风险因素之一。尽管降解黄曲霉毒素的方法多种多样，但仍未能找出一种比较完美的方法解决黄曲霉毒素的污染问题。玉米赤霉烯酮是一种著名的F2毒素，由镰刀菌产生，主要污染玉米、小麦、大麦、燕麦等谷物及其制品，是世界上分布最广泛的霉菌毒素之一，不仅影响食品安全，而且在食物链中积累，对动物甚至人类造成严重伤害。
目前霉菌毒素的脱除方法主要有物理、化学和生物法。物理和化学方法因成本高、效率低、环境污染风险等缺点在工业生产应用中受到限制，而生物酶法由于具有低毒、高效的优点。因此过氧化物酶如辣根过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的氧化降解被认为是一种高效降解霉菌毒素的方法。辣根过氧化物酶，在过氧化氢作用下，能够用于催化氧化多种化合物，如芳香胺化合物、酚类化合物、吲哚类和多种霉菌毒素的催化氧化。市售辣根过氧化物酶是从植物辣根中提取获得的，植物辣根含酶量低，提取工艺复杂，成本高，多用于生物医疗等高附加值的产品，这限制了辣根过氧化物酶在饲料制备中的应用。另一方面，天然辣根过氧化物酶氧化降解霉菌毒素的活性偏低、易受温度、pH的影响。因此，需要开发成本低廉、对霉菌毒素氧化降解活力高的辣根过氧化物酶用于饲料脱霉，制造安全健康的饲料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辣根过氧化物酶在制备脱霉饲料中的应用，属于饲料制备技术领域。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
其一，本发明提供了一种辣根过氧化物酶在制备脱霉饲料中的应用，所述辣根过氧化物酶为重组枯草芽孢杆菌表达的辣根过氧化物酶突变体。
进一步地，所述辣根过氧化物酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
进一步地，所述脱霉饲料的制备方法如下：
（1）表达辣根过氧化物酶突变体的重组枯草芽孢杆菌按体积比1%的比例接种含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备一级种子液；
（2）根据发酵量，将一级种子液按体积比1%的比例接种含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备二级种子液、多级种子液；
（3）多级种子液按体积比1%的比例接种LB培养液于发酵罐中发酵培养12 h表达辣根过氧化物酶突变体，收集培养的菌液；
（4）菌液经超声波破碎仪超声裂解，饲料原料质量：超声裂解菌液质量比为10:1，用混合机搅拌混匀，30℃作用10小时降解霉菌毒素，然后用造粒机造粒成形制成脱霉饲料。
其二，本发明提供了一种辣根过氧化物酶突变体，所述辣根过氧化物酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
本发明的有益效果在于，构建表达辣根过氧化物酶突变体的重组枯草芽孢杆菌，表达辣根过氧化物酶，菌体超声裂解，裂解液加入粉碎的饲料原料中用混合机搅拌混匀，30℃作用10小时降解霉菌毒素，然后用造粒机造粒成形制成饲料。辣根过氧化物酶突变体比未突变的辣根过氧化物酶降解黄曲霉毒素B1的活性提高了54.79%，降解玉米赤霉烯酮的活性提高了28.03%。并且酶突变体比未突变的酶能耐受更宽范围的温度和pH变化。辣根过氧化物酶突变体应用于饲料原料处理，能将霉菌毒素降解为低毒、无毒产物，是脱霉制备健康饲料的有效方法。
附图说明
图1为温度对酶相对活性的影响。
图2为pH对酶相对活性的影响。
图3为黄曲霉毒素B1降解效果检测。
图4为玉米赤霉烯酮降解效果检测。
图5为辣根过氧化物酶突变体制备脱霉饲料效果检测。
具体实施方式
实施例1：基于计算机辅助设计的酶结构改造和突变体设计
辣根过氧化物酶氨基酸序列GenBank登录号为：CCJ34819.1。应用DiscoveryStudio 软件对酶氨基酸序列进行分析。避开61,64,65,67,68,71,72,103,105,169,172,178,182,193,196,197,199,200,202,206,208,209,251,274,276,311位的酶催化活性位点；避开61,64,65,67,68,71,100,103,105,169,171,178,182,193,196,197,199,200,202,206,209,251,274,276,311位的血红素结合位点；避开68,98,99,169,172,206,208,209位的酶底物结合位点。通过点突变将215位、231位芳香族氨基酸酪氨酸Tyr突变为丙氨酸Ala，辣根过氧化物酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
实施例2：表达辣根过氧化物酶的重组枯草芽孢杆菌构建
1.1基因合成
（1）根据辣根过氧化物酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO.1合成辣根过氧化物酶突变体DNA序列SEQ ID NO.2，上下游分别添加BamHI和EcoRV限制性内切酶位点，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并克隆到pUC57质粒上获得pUC57-HRP-Mut2质粒。
（2）根据GenBank登录号为CCJ34819.1的氨基酸序列合成未突变的辣根过氧化物酶DNA序列SEQ ID NO.3。上下游分别添加BamHI和EcoRV限制性内切酶位点，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并克隆到pUC57质粒上获得pUC57-HRP-WT质粒。
1.2 重组表达载体的构建
(1)利用限制性内切酶BamHI和EcoRV对pUC57-HRP-Mut2、pUC57-HRP-WT质粒进行双酶切，分别回收HRP-Mut2、HRP-WT基因片段；
(2)利用限制性内切酶BamHI和EcoRV双酶切表达载体p7257，并回收基因片段；
(3)将HRP-Mut2和p7257核酸片段用T4 DNA连接酶连接，将HRP-WT和p7257核酸片段用T4 DNA连接酶连接，分别转化到大肠杆菌E .coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，BamHI和EcoRV双酶切鉴定，获得重组表达质粒p7257-HRP-Mut2和p7257-HRP-WT。
1.3 表达辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶突变体的重组枯草芽孢杆菌菌株构建
（1）重组质粒p7257-HRP-Mut2经酶切、测序鉴定正确后转化枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞，涂布40μg/mL氯霉素平板，挑取单菌落于5 mL的含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为种子液，命名为WB800-HRP-Mut2。
（2）重组质粒p7257-HRP-WT经酶切、测序鉴定正确后转化枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞，涂布40μg/mL氯霉素平板，挑取单菌落于5 mL的含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为种子液，命名为WB800-HRP-WT。
1.4 辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶突变体的表达
（1）0.1ml种子液按体积比1%的比例转接10ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为一级种子液。
（2）10ml一级种子液按体积比1%的比例转接1000ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为二级种子液。
（3）校准发酵罐的pH电极、溶氧电极，并进行蠕动泵的流量校准。
（4）配制70L LB培养基，加入100L发酵罐，121℃，30min高压灭菌培养基、发酵罐及管道。
（5）待发酵罐内培养液冷却到 37℃时，将700ml二级种子液加入发酵罐中，开始发酵罐培养，发酵罐参数设置为搅拌速度500～800r/min，罐内压力 9psi，温度37℃，设定DO值 (溶解氧) 在 20％以上。
（6）发酵培养12 h，将菌液超声波破碎。
实施例3：未突变的辣根过氧化物酶与辣根过氧化物酶突变体的酶学性质检测
1.1 用邻苯三酚显色法测定辣根过氧化物酶的活性。该方法基于 H2O2 存在下，辣根过氧化物酶催化显色底物吸光度的变化。将2.89 mL溶于磷酸缓冲溶液(0.1 mol/L, pH7.0)的焦性没食子溶液(13 mmol/L)，与 10μL酶液混合，30℃孵育10 min。然后将混合物快速倒入1 cm的石英试管中，加入0.1 mL H2O2 (0.3%, v/v)。用紫外分光光度计在 420 nm(邻苯三酚氧化产物的最大吸收波长)处监测邻苯三酚的氧化过程。将1分钟内可产生1μmol紫杉醇(邻苯三酚的氧化产物)的酶量定义为一个酶活性单位(U)，酶活性单位表示为U/L。
未突变的辣根过氧化物酶的酶活力为434.74U/L，辣根过氧化物酶突变体的酶活力为1327.86U/L，突变后酶活力提高了3.05倍。
1.2 最适温度
温度对酶相对活性的影响如图1所示。 未突变的辣根过氧化物酶的最适温度为35℃，辣根过氧化物酶突变体的最适温度为30℃，且辣根过氧化物酶突变体的酶活力在较宽温度范围内保持较高相对活力。因此辣根过氧化物酶突变体比未突变的辣根过氧化物酶具有更好的热稳定性。
1.3 最适 pH
pH对酶相对活性的影响如图2所示。从图中可以看出，未突变的辣根过氧化物酶和辣根过氧化物酶突变体的最适pH均为6.5，但是辣根过氧化物酶突变体的酶活力在较宽pH范围内保持较高相对活力，而未突变的辣根过氧化物酶相对活力对pH较敏感，酶活力容易因pH变化而衰减。因此辣根过氧化物酶突变体比未突变的辣根过氧化物酶具有更好的酸碱稳定性。
实施例4：未突变的辣根过氧化物酶与辣根过氧化物酶突变体对霉菌毒素降解效果检测
1.1 玉米赤霉烯酮含量测定参考《食品安全国家标准-食品中玉米赤霉烯酮的测定 》（GB 5009.209 -2016）；黄曲霉毒素B1含量测定参考《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法》（GB/Ｔ30955-2014），《饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法》（NY/T2071-2011）测定。
1.2 黄曲霉毒素B1降解效果检测
未突变的辣根过氧化物酶在最适温度为35℃、最适pH6.5、过氧化氢浓度为 25mmol/L条件下反应，辣根过氧化物酶突变体在最适温度为30℃、最适pH6.5、过氧化氢浓度为 25 mmol/L条件下反应。检测不同反应时间黄曲霉毒素B1降解效率。从图3中可以看出，未突变的辣根过氧化物酶反应9小时达到最大降解率54.37%，辣根过氧化物酶突变体反应7小时达到82.48%降解率，9小时达到最大降解率84.16%。辣根过氧化物酶突变体比未突变的辣根过氧化物酶降解黄曲霉毒素B1的活性提高了54.79%。
1.3 玉米赤霉烯酮降解效果检测
未突变的辣根过氧化物酶在最适温度为35℃、最适pH6.5、过氧化氢浓度为 25mmol/L条件下反应，辣根过氧化物酶突变体在最适温度为30℃、最适pH6.5、过氧化氢浓度为 25 mmol/L条件下反应。检测不同反应时间对玉米赤霉烯酮降解效率。从图4中可以看出，未突变的辣根过氧化物酶反应8小时达到最大降解率68.31%，辣根过氧化物酶突变体反应7小时达到最大降解率87.46%。辣根过氧化物酶突变体比未突变的辣根过氧化物酶降解玉米赤霉烯酮的活性提高了28.03%。
实施例5：辣根过氧化物酶突变体制备脱霉饲料效果检测
将玉米60%、小麦麸10%、花生饼15%、鱼粉10%、骨粉1.5%、酵母粉3%、食盐0.5%配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，经粉碎机粉碎。表达辣根过氧化物酶突变体的重组枯草芽孢杆菌发酵液经超声裂解后加入到粉碎的饲料原料中，分别按照饲料原料质量：菌液质量5:1、10:1、15:1、20:1的比例添加，用混合机搅拌混匀，30℃作用10小时降解霉菌毒素，然后用造粒机造粒成形制成饲料。分别检测对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解效率。
从图5中可以看出，饲料原料质量：辣根过氧化物酶突变体菌液质量比为5:1和10:1时对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解效率均能达到80%及以上，质量比为15:1时，对两种霉菌毒素的降解效率均有所下降。在保证辣根过氧化物酶突变体对霉菌毒素降解效率的情况下，兼顾生产经济性，饲料原料质量：辣根过氧化物酶突变体菌液质量比为10:1适合脱霉饲料的生产工艺。
Claims (3)
1.一种辣根过氧化物酶在制备脱霉饲料中的应用，其特征在于，所述辣根过氧化物酶为重组枯草芽孢杆菌表达的辣根过氧化物酶突变体，所述辣根过氧化物酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脱霉饲料的制备方法如下：
（1）表达辣根过氧化物酶突变体的重组枯草芽孢杆菌按体积比1%的比例接种含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备一级种子液；
（2）根据发酵量，将一级种子液按体积比1%的比例接种含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备二级种子液、多级种子液；
（3）多级种子液按体积比1%的比例接种LB培养液于发酵罐中发酵培养12 h表达辣根过氧化物酶突变体，收集培养的菌液；
（4）菌液经超声波破碎仪超声裂解，饲料原料质量：超声裂解菌液质量比为10:1，用混合机搅拌混匀，30℃作用10小时降解霉菌毒素，然后用造粒机造粒成形制成脱霉饲料。
3.一种辣根过氧化物酶突变体，其特征在于，所述辣根过氧化物酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
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