CN118272297A - 一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法及应用，属于干细胞技术领域。包括：S1.清洗；S2.消毒；S3.消化；S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离；S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集。本发明制得的脐带基质胶初始状态化干细胞能从脐带组织中脱附，缩短后续原代培养的时间，提高细胞提取量以及提取效率；减少分离过程中细胞的损伤、老化，提高细胞的增殖活性，有利于脐带间充质干细胞的体外快速扩增，制得的干细胞可以用于肿瘤治疗等疑难杂症，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法及应用。
背景技术
近年来随着生命科学与医学的快速发展，国内外创新性生物治疗技术进展迅速，细胞治疗已发展成为药物治疗和手术治疗后的第三次医疗革命，在恶性肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、抗衰老、再生医学等多个领域显示出巨大的应用潜力。细胞治疗包括免疫细胞治疗和干细胞治疗，干细胞治疗包括胚胎干细胞(ESC)、组织特异性前体干细胞(TSPSC)、间充质干细胞(MSC)、脐带干细胞(UCSC)、骨髓干细胞(BMSC)和诱导多潜能干细胞(iPSC)等。目前，干细胞在重大慢性疾病、严重创伤修复的再生医学领域，已经成为弥补传统治疗不可或缺的有效手段。
脐带基质细胞胞质内含有大量线粒体以及脯氨酰4-羟化酶，在成软骨诱导条件有聚集倾向，并能分泌胶原Ⅰ、Ⅱ、肝素、类肝素及聚集蛋白聚糖。胞浆内和胞膜下有平滑肌细胞典型的局部密集斑及大量10mm厚的胞浆内丝。表达某些收缩性蛋白如肌动蛋白、非肌性肌球蛋白、结合蛋白及α-平滑肌肌动蛋白等和弹性蛋白。弹性蛋白与结合蛋白的共表达提示脐带基质细胞在本质上可能是一种成肌纤维细胞。脐带基质细胞具备明显高于体细胞的端粒酶活性和比骨髓干细胞更快的扩增速度，并没有发展成肿瘤的趋势，推测脐带基质细胞同时对端粒酶活性具有一定的限制功能，从而保证细胞能扩增30-60倍，但是不会达到肿瘤细胞的水平。
发明内容
本发明的目的在于提出一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法及应用，能从脐带组织中脱附，缩短后续原代培养的时间，提高细胞提取量以及提取效率；减少分离过程中细胞的损伤、老化，提高细胞的增殖活性，有利于脐带间充质干细胞的体外快速扩增，制得的干细胞可以用于肿瘤治疗等疑难杂症，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.清洗：将切除的脐带组织用组织保护液清洗，直到清除皮肤组织残留的脂肪、结蹄组织及血液；
S2.消毒：依次用医用酒精、消毒液浸泡，再用组织保护液清洗；
S3.消化：将消毒后的组织经过消化液消化，终止消化，过滤，离心，弃上清，收集消化后的组织；
S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离：将步骤S3制得的消化后的组织清洗，加入胶原酶和DNA酶，孵育，离心，收集上清，再加入DNA酶，加入DMEM全培2-3次，加入基质胶，孵育，离心，弃上清，收集细胞；
S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集：将步骤S4中细胞加入活化培养基中，孵育，离心，弃上清，洗涤，制得脐带基质胶初始状态化干细胞。
作为本发明的进一步改进，所述组织保护液的配方：EDTA 1-3g/L，蔗糖3-7g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/L，链霉素0.5-1g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述消化液为含有0.5-1wt％胰蛋白酶、1-2wt％中性蛋白酶的pH为7.4-7.6的PBS缓冲液。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述消化的温度为35-40℃，时间为10-15min。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述消化后的组织、胶原酶和DNA酶的质量比为100:0.5-1:0.2-0.4；所述孵育的温度为35-40℃，时间为30-60min。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述活化培养基为每100mL DMEM培养基液中加入0.2-0.4g IL-1和0.1-0.3g IL-6。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.将切除的脐带组织用组织保护液清洗，直到清除皮肤组织残留的脂肪、结蹄组织及血液；
所述组织保护液的配方：EDTA 1-3g/L，蔗糖3-7g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量；
S2.消毒：依次用医用酒精、消毒液浸泡，再用组织保护液清洗；
所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/L，链霉素0.5-1g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量；
S3.消化：将消毒后的组织经过消化液，35-40℃消化10-15min，终止消化，过滤，离心，弃上清，收集消化后的组织；
所述消化液为含有0.5-1wt％胰蛋白酶、1-2wt％中性蛋白酶的pH为7.4-7.6的PBS缓冲液；
S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离：将100重量份步骤S3制得的消化后的组织清洗，加入0.5-1重量份胶原酶和0.1-0.2重量份DNA酶，35-40℃孵育30-60min，离心，收集上清，再加入0.1-0.2重量份DNA酶，加入DMEM全培2-3次，加入基质胶，35-40℃孵育30-60min，离心，弃上清，收集细胞；
S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集：将步骤S4中细胞加入活化培养基中，35-40℃孵育30-60min，离心，弃上清，洗涤，制得脐带基质胶初始状态化干细胞；
所述活化培养基为每100mL DMEM培养基液中加入0.2-0.4g IL-1和0.1-0.3g IL-6。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的脐带基质胶初始状态化干细胞。
本发明进一步保护一种上述脐带基质胶初始状态化干细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明具有如下有益效果：本发明制得的脐带基质胶初始状态化干细胞能从脐带组织中脱附，缩短后续原代培养的时间，提高细胞提取量以及提取效率；减少分离过程中细胞的损伤、老化，提高细胞的增殖活性，有利于脐带间充质干细胞的体外快速扩增，制得的干细胞可以用于肿瘤治疗等疑难杂症，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.将切除的脐带组织用组织保护液清洗，直到清除皮肤组织残留的脂肪、结蹄组织及血液；
所述组织保护液的配方：EDTA 1g/L，蔗糖3g/L，pH＝7的磷酸盐缓冲液余量；
S2.消毒：依次用医用酒精、消毒液浸泡，再用组织保护液清洗；
所述消毒液的配方：青霉素0.5g/L，链霉素0.5g/L，pH＝7的磷酸盐缓冲液余量；
S3.消化：将消毒后的组织经过消化液，35℃消化10min，终止消化，过滤，离心，弃上清，收集消化后的组织；
所述消化液为含有0.5wt％胰蛋白酶、1wt％中性蛋白酶的pH为7.4的PBS缓冲液；
S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离：将100重量份步骤S3制得的消化后的组织清洗，加入0.5重量份胶原酶和0.1重量份DNA酶，35℃孵育30min，离心，收集上清，再加入0.1重量份DNA酶，加入DMEM全培2次，加入基质胶，35℃孵育30min，离心，弃上清，收集细胞；
S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集：将步骤S4中细胞加入活化培养基中，35℃孵育30min，离心，弃上清，洗涤，制得脐带基质胶初始状态化干细胞；
所述活化培养基为每100mL DMEM培养基液中加入0.2g IL-1和0.1g IL-6。
实施例2
本实施例提供一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.将切除的脐带组织用组织保护液清洗，直到清除皮肤组织残留的脂肪、结蹄组织及血液；
所述组织保护液的配方：EDTA 3g/L，蔗糖7g/L，pH＝7.5的磷酸盐缓冲液余量；
S2.消毒：依次用医用酒精、消毒液浸泡，再用组织保护液清洗；
所述消毒液的配方：青霉素1g/L，链霉素1g/L，pH＝7.5的磷酸盐缓冲液余量；
S3.消化：将消毒后的组织经过消化液，40℃消化15min，终止消化，过滤，离心，弃上清，收集消化后的组织；
所述消化液为含有1wt％胰蛋白酶、2wt％中性蛋白酶的pH为7.6的PBS缓冲液；
S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离：将100重量份步骤S3制得的消化后的组织清洗，加入1重量份胶原酶和0.2重量份DNA酶，40℃孵育60min，离心，收集上清，再加入0.2重量份DNA酶，加入DMEM全培3次，加入基质胶，40℃孵育60min，离心，弃上清，收集细胞；
S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集：将步骤S4中细胞加入活化培养基中，40℃孵育60min，离心，弃上清，洗涤，制得脐带基质胶初始状态化干细胞；
所述活化培养基为每100mL DMEM培养基液中加入0.4g IL-1和0.3g IL-6。
实施例3
本实施例提供一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.将切除的脐带组织用组织保护液清洗，直到清除皮肤组织残留的脂肪、结蹄组织及血液；
所述组织保护液的配方：EDTA 2g/L，蔗糖5g/L，pH＝7.2的磷酸盐缓冲液余量；
S2.消毒：依次用医用酒精、消毒液浸泡，再用组织保护液清洗；
所述消毒液的配方：青霉素0.7g/L，链霉素0.7g/L，pH＝7.2的磷酸盐缓冲液余量；
S3.消化：将消毒后的组织经过消化液，37℃消化12min，终止消化，过滤，离心，弃上清，收集消化后的组织；
所述消化液为含有0.7wt％胰蛋白酶、1.5wt％中性蛋白酶的pH为7.5的PBS缓冲液；
S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离：将100重量份步骤S3制得的消化后的组织清洗，加入0.7重量份胶原酶和0.15重量份DNA酶，37℃孵育45min，离心，收集上清，再加入0.15重量份DNA酶，加入DMEM全培3次，加入基质胶，37℃孵育45min，离心，弃上清，收集细胞；
S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集：将步骤S4中细胞加入活化培养基中，37℃孵育45min，离心，弃上清，洗涤，制得脐带基质胶初始状态化干细胞；
所述活化培养基为每100mL DMEM培养基液中加入0.3g IL-1和0.2g IL-6。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，活化培养基中未添加IL-1。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，活化培养基中未添加IL-6。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，活化培养基中未添加IL-1和IL-6。
测试例1
将裸鼠腋下种植SMMC-7721细胞，4×107个/只，待肿瘤长至直径为2-3mm时随机分为7组，实施例1-5和对比例1组、模型组，每组10只，均经尾静脉给药。将制得的脐带基质胶初始状态化干细胞用生理盐水配制成2×105个/mL的水溶液，给与2mL/只，每周2次，模型组给与等量的生理盐水。实验周期为2周，观察瘤体积抑制率及瘤重抑制率。结果见表1。
表1
| 组别 | 瘤体积抑制率(％) | 瘤重抑制率(％) |
| 模型组 | / | / |
| 实施例1 | 86.15±6.72 | 84.21±6.20 |
| 实施例2 | 86.09±5.22 | 84.13±6.70 |
| 实施例3 | 87.05±4.96 | 84.72±7.03 |
| 实施例4 | 75.62±4.67 | 73.81±6.96 |
| 实施例5 | 72.19±5.91 | 70.29±5.28 |
| 对比例1 | 42.21±4.28 | 40.02±3.59 |
由上表可知，本发明实施例1-3制得的脐带基质胶初始状态化干细胞液具有较好的抗肿瘤效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种脐带基质胶初始状态化干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.清洗：将切除的脐带组织用组织保护液清洗，直到清除皮肤组织残留的脂肪、结蹄组织及血液；
S2.消毒：依次用医用酒精、消毒液浸泡，再用组织保护液清洗；
S3.消化：将消毒后的组织经过消化液消化，终止消化，过滤，离心，弃上清，收集消化后的组织；
S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离：将步骤S3制得的消化后的组织清洗，加入胶原酶和DNA酶，孵育，离心，收集上清，再加入DNA酶，加入DMEM全培2-3次，加入基质胶，孵育，离心，弃上清，收集细胞；
S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集：将步骤S4中细胞加入活化培养基中，孵育，离心，弃上清，洗涤，制得脐带基质胶初始状态化干细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述组织保护液的配方：EDTA 1-3g/L，蔗糖3-7g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/L，链霉素0.5-1g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述消化液为含有0.5-1wt％胰蛋白酶、1-2wt％中性蛋白酶的pH为7.4-7.6的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述消化的温度为35-40℃，时间为10-15min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述消化后的组织、胶原酶和DNA酶的质量比为100:0.5-1:0.2-0.4；所述孵育的温度为35-40℃，时间为30-60min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述活化培养基为每100mLDMEM培养基液中加入0.2-0.4g IL-1和0.1-0.3g IL-6。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.将切除的脐带组织用组织保护液清洗，直到清除皮肤组织残留的脂肪、结蹄组织及血液；
所述组织保护液的配方：EDTA 1-3g/L，蔗糖3-7g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量；
S2.消毒：依次用医用酒精、消毒液浸泡，再用组织保护液清洗；
所述消毒液的配方：青霉素0.5-1g/L，链霉素0.5-1g/L，pH＝7-7.5的磷酸盐缓冲液余量；
S3.消化：将消毒后的组织经过消化液，35-40℃消化10-15min，终止消化，过滤，离心，弃上清，收集消化后的组织；
所述消化液为含有0.5-1wt％胰蛋白酶、1-2wt％中性蛋白酶的pH为7.4-7.6的PBS缓冲液；
S4.脐带基质胶初始状态化干细胞的分离：将100重量份步骤S3制得的消化后的组织清洗，加入0.5-1重量份胶原酶和0.1-0.2重量份DNA酶，35-40℃孵育30-60min，离心，收集上清，再加入0.1-0.2重量份DNA酶，加入DMEM全培2-3次，加入基质胶，35-40℃孵育30-60min，离心，弃上清，收集细胞；
S5.脐带基质胶初始状态化干细胞的收集：将步骤S4中细胞加入活化培养基中，35-40℃孵育30-60min，离心，弃上清，洗涤，制得脐带基质胶初始状态化干细胞；
所述活化培养基为每100mL DMEM培养基液中加入0.2-0.4g IL-1和0.1-0.3g IL-6。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的脐带基质胶初始状态化干细胞。
10.一种如权利要求9所述脐带基质胶初始状态化干细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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