CN118271453A - 一种负载rspo蛋白的细胞外囊泡的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载RSPO蛋白的细胞外囊泡的制备方法及其应用。本发明将细胞外囊泡作为具有生物活性的RSPO蛋白的运输载体,可获得分别或同时负载RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4蛋白的细胞外囊泡,将RSPO蛋白负载于细胞外囊泡膜外表面或细胞外囊泡内部,可用于调控体外干细胞增殖、干性和分化、类器官培养和体内组织器官再生、Wnt信号通路的增强;本发明发现细胞外囊泡负载的RSPO蛋白更容易纯化富集、具有更好的生物活性和稳定性,可进行内容物或靶向功能化改造,并进一步研究RSPO作用机制或临床价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种负载RSPO蛋白的细胞外囊泡的制备方法及其应用。
背景技术
哺乳动物R-脊椎蛋白(Roof plate-specific spondin,R-spondin,简称RSPO)是一类典型的分泌型蛋白,共有4个成员(RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4)。RSPO是一个在进化上相当保守的的蛋白家族,氨基酸相似性为40%~60%,其N端是一段长度为20~25个氨基酸的信号肽,其后为两个富含半胱氨酸的furin-like结构域、1个TSP1结构域(thrombospondin type 1domain)和富含碱性氨基酸的C端区域。其中,furin-like结构域是RSPO蛋白结构中最保守的区域,也是在RSPO发挥功能中起决定作用。
Wnt/β-catenin信号通路是调控干细胞自我更新和干性维持的主要信号通路,而RSPO蛋白与Wnt蛋白具有独特的协同作用。当RSPO蛋白不存在时,跨膜E3泛素化酶RNF43、ZNRF3靶向Wnt信号通路关键受体Frizzled并诱导其降解,从而抑制Wnt信号通路;当RSPO蛋白存在时,RSPO蛋白通过与受体Lgr4/5/6结合,招募RNF43、ZNRF3,使得Wnt与Frizzled结合更加稳定,进而增强Wnt/β-catenin信号通路(Science.2005.309(5738):1256.)。早期研究发现RSPO1在Lgr5+肠组织干细胞、Lgr5+肝组织干细胞类器官培养中必不可少。利用携带RSPO1的病毒感染小鼠或人重组RSPO1蛋白注射小鼠,可观测到RSPO1能有效促进肿瘤放化疗引起的肠绒毛损伤修复(Proc Natl Acad Sci USA.2009.106(7):2331.)。另外,RSPO2在四肢、肺和毛囊发育过程中是必须的,RSPO3在胎盘的发育中是至关重要的,而RSPO4在指甲形成中发挥重要调控作用(Genome Biology.2012,13:242)。最新的研究发现RSPO2作用于LGR4受体,是脂肪生成的功能性调节因子(Nat Metab.2022.4(1):90-105.);RSPO3则能够作用于LGR5+干细胞,促进胃腺细胞增生(Nat Cell Biol.2019.21(7):812-823.)。总体而言,RSPO蛋白调控骨骼、肌肉、血管等组织和消化系统、呼吸系统的发育,并影响肢体和性腺的形成,在脊椎动物个体发育和多种疾病的发生过程中起重要作用。另外,分泌型RSPO蛋白是体内和体外成体干细胞增殖、干性维持和功能分化的有效刺激物,在多种组织器官再生与疾病治疗中具有重要的临床应用潜能。
传统途径获得人源重组RSPO蛋白的方法为:在RSPO蛋白的C端添加His标签,利用慢病毒表达系统或杆状病毒表达系统分别在哺乳动物细胞或者昆虫细胞中表达RSPO-His重组蛋白,进而使用镍亲和层析的方法捕获细胞分泌至培养上清液中的目的重组蛋白。也可通过离子交换色谱和凝胶过滤色谱(分子筛)技术纯化获得。
细胞外囊泡是活细胞分泌释放到细胞外空间、具有双层生物膜的囊泡结构。根据其粒径大小主要可分为凋亡小体(>1000nm)、微囊泡(200~1000nm)、小细胞外囊泡或外泌体(30~200nm)。微囊泡和外泌体携带来源亲本细胞的多种生物活性成分,如蛋白质、核酸和脂质等,通过近距离或远距离运输后被受体细胞所摄取,调控受体细胞的生物学行为与功能,在细胞与细胞间物质运输和信息传递中发挥了重要功能。由于微囊泡和外泌体具有较小的尺寸和双层生物膜结构,作为药物载体在基础研究中发挥了重要功能,具有潜在的临床应用价值。微囊泡和外泌体可通过内源性途径和外源性途径进行加载药物或治疗物质。因此,利用微囊泡和外泌体负载RSPO蛋白应用于体内外干细胞行为与功能调控、进而作为生物药物在再生医学中发挥治疗作用具有重要潜力。
然而目前为止,只有Adám Oszvald等人在2020年发表于Stem Cells杂志上的文章指出细胞外囊泡能够运输表皮生长因子(EGF),但在RSPO蛋白运输中没有作用(Incontrast,EVs have no role in transporting R-Spondin.)(Stem Cells.2020Feb;38(2):291-300)。尚未发现其他关于微囊泡和外泌体与RSPO蛋白的研究报导。
发明内容
本发明的目的在于通过遗传学手段和基因编辑技术,实现了制备高效携带具有生物活性的R-脊椎蛋白(R-spondin,RSPO)的细胞外囊泡(包括微囊泡和外泌体),能够用于高效调控体内外干细胞干性维持、增殖和分化等行为功能,可应用于促进多组织器官再生。
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一方面,提供一种重组蛋白,包括RSPO蛋白和/或细胞外囊泡骨架蛋白。
在本发明的一些实施方式中,所述RSPO蛋白RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白、RSPO4蛋白中的至少一种、至少两种、至少三种或四种。
优选地,所述RSPO蛋白选自RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白、RSPO4蛋白的全长蛋白、蛋白片段、衍生物或突变体。
优选地,所述RSPO蛋白包括RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白、RSPO4蛋白。
优选地,所述RSPO蛋白定位于所述细胞外囊泡的膜外侧或膜内侧。
优选地,所述骨架蛋白选自单次或多次跨膜蛋白。
优选地,所述多次跨膜蛋白选自:四次跨膜蛋白、五次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白中的至少一种。
优选地,所述四次跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD9、CD20、Claudin18.2、Claudin6、TM4SF、LAPTM4B、Tarp中的至少一种。
优选地,所述五次跨膜蛋白为CD133。
优选地,所述七次跨膜蛋白选自GPRC5D、CXCR4、CCR5、CCR8、SSTR2中的至少一种。
优选地,所述单次跨膜蛋白选自Lamp2b、L1CAM、β-Klotho、CD147、PTGFRN、BASP1中的至少一种。
优选地,所述骨架蛋白为Lamp2b。
优选地,所述骨架蛋白选自上述蛋白的全长蛋白、蛋白片段、衍生物或突变体。
优选地,所述蛋白片段包含其中一种骨架蛋白的跨膜结构域或锚定结构域、或者跨膜结构域和/或锚定结构域的组合,或者选自不同骨架蛋白的一种或多种跨膜结构域和/或锚定结构域的组合。
优选地,所述细胞外囊泡包括微囊泡、外泌体。
本发明的第二方面,提供一种细胞外囊泡,所述细胞外囊泡负载RSPO蛋白和/或骨架蛋白。
优选地,所述RSPO蛋白包括RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白、RSPO4蛋白中的至少一种、至少两种、至少三种或四种。
优选地,所述RSPO蛋白选自RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白、RSPO4蛋白的全长蛋白、蛋白片段、衍生物或、突变体或类似物。
优选地,所述RSPO蛋白包括RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白和RSPO4蛋白。
优选地,所述骨架蛋白选自单次或多次跨膜蛋白。
优选地,所述多次跨膜蛋白选自:四次跨膜蛋白、五次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白中的至少一种。
优选地,所述四次跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD9、CD20、Claudin18.2、Claudin6、TM4SF、LAPTM4B、Tarp中的至少一种。
优选地,所述五次跨膜蛋白为CD133。
优选地,所述七次跨膜蛋白选自GPRC5D、CXCR4、CCR5、CCR8、SSTR2中的至少一种。
优选地,所述单次跨膜蛋白选自Lamp2b、L1CAM、β-Klotho、CD147、PTGFRN、BASP1中的至少一种。
优选地,所述骨架蛋白为Lamp2b。
优选地,所述骨架蛋白选自上述蛋白的全长蛋白、蛋白片段、衍生物或突变体。
优选地,所述蛋白片段包含其中一种骨架蛋白的跨膜结构域或锚定结构域、或者跨膜结构域和/或锚定结构域的组合,或者选自不同骨架蛋白的一种或多种跨膜结构域和/或锚定结构域的组合。
优选地,所述RSPO蛋白定位于所述细胞外囊泡的膜外侧或膜内侧。
优选地,所述RSPO蛋白定位于所述细胞外囊泡的膜内侧。
优选地,当RSPO蛋白位于细胞外囊泡骨架蛋白Lamp2b的N端时,所述细胞外囊泡骨架蛋白不包括Lamp2b蛋白的信号肽;可将RSPO蛋白负载于细胞外囊泡膜外表面。
优选地,当使用细胞外囊泡骨架蛋白CD63、CD81、CD9、GPCR时,需要去除上述蛋白N端至少一个跨膜结构,使得蛋白N端处于细胞外囊泡外部;可将RSPO蛋白负载于细胞外囊泡膜外表面。
优选地,当RSPO蛋白位于细胞外囊泡骨架蛋白C端时,所述RSPO蛋白不包括RSPO蛋白信号肽;可将RSPO蛋白负载于细胞外囊泡内部。
优选地,所述细胞外囊泡包括微囊泡、外泌体。
优选地,所述细胞外囊泡装载有载荷;所述的载荷选自核酸、肽、蛋白质和小分子药物中的至少一种。
优选地,所述细胞外囊泡还包括标签。
优选地,所述标签选自具有靶向功能和/或荧光的抗体、蛋白、多肽和核酸适配体中的至少一种。
优选地,所述RSPO可来源于:人、小鼠、大鼠、牛、羊、马、犬、兔、鸡、鱼、猴、豚鼠、鹿。
本发明的第三方面,提供与本发明第一方面所述重组蛋白相关的生物材料,所述生物材料为下述(a1)~(d1)中的任一种:
(a1)编码本发明第一方面所述重组蛋白的核酸分子;
(b1)含有(a1)所述核酸分子的表达盒;
(c1)含有(a1)所述核酸分子的重组载体、或含有(b1)所述表达盒的重组载体;
(d1)含有(a1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(b1)所述表达盒的重组微生物、或含有(c1)所述重组载体的重组细胞。
优选地,所述载体包括病毒性载体或非病毒性载体。
优选地,所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种。
优选地,所述非病毒性载体包括:质粒载体、阳离子多聚物载体、壳聚糖、聚乙烯亚胺、纳米颗粒载体、脂质体中的至少一种。
优选地,所述慢病毒载体包括pLVX、pCDH、pQCXIP、pLNCX、pLenti、pRRLSIN、pTRIP中的至少一种。
优选地,所述慢病毒载体包括pLVX和/或pCDH。
优选地,所述细胞包括原核细胞或真核细胞。所述细胞非植物或动物新品种。
优选地,所述原核细胞包括大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的原核细胞。
优选地,所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中的至少一种。
优选地,所述哺乳动物细胞包括HEK293T、HEK293、BHK、MDCK、Hela、CHO、Vero、COS-7、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、诱导全能干细胞等永生化细胞系或原代细胞系中的至少一种。
本发明的第四方面,提供一种制备本发明第一方面所述的重组蛋白的方法,包括培养本发明第三方面所述的细胞,获得培养上清液、分离获得所述重组蛋白。
本发明的第五方面,提供一种本发明第二方面所述细胞外囊泡的方法,包括培养本发明第三方面所述细胞,以及从所述细胞培养基中分离出细胞外囊泡。
优选地,所述方法还包括利用离心、尺寸排阻色谱、超滤、切向流过滤、膜亲和试剂盒、色谱法、免疫磁珠分选、聚合沉淀法、免疫亲和、微流控技术、亲和色谱法中的至少一种进行纯化的步骤。
优选地,所述离心包括差速离心、密度梯度离心。
优选地,所述差速离心的条件包括:2~8℃、200~400g离心3~10min去除悬浮死细胞、1500~2500g离心8~15min去除细胞碎片、8000~12000g离心20~40min获得RSPO蛋白功能化微囊泡。
优选地,所述差速离心还包括:2~8℃、90000~120000g离心50~70min获得RSPO蛋白功能化外泌体。
更优选的,所述差速离心的条件包括:4℃、300g离心5min后去除死细胞、2,000g离心10min去除细胞碎片、10000g离心30min获得RSPO蛋白功能化微囊泡。
更优选的,所述差速离心的条件还包括:4℃、100000g离心60min获得RSPO蛋白功能化外泌体。
本发明的第六方面,提供本发明第一方面所述的重组蛋白或本发明第二方面所述的细胞外囊泡在筛选产品和/或制备产品和/或研究RSPO蛋白功能研究或临床价值中的应用;
所述产品用于以下至少一种:
(a2)防治肝脏、胰腺、肺脏、心脏、胃、小肠、结肠、神经、骨骼或肌肉类疾病;
(b2)递送药物;
(c2)调控体内外干细胞干性维持、增殖、分化;
(d2)激活Wnt信号通路;
(e2)促进器官再生;
(f2)类器官培养。
在本发明的一些实施方式中,所述干细胞包括成体干细胞、诱导多能干细胞、诱导全能干细胞、胚胎干细胞等。
在本发明的一些实施方式中,所述实施方式中,所述成体干细胞包括小肠干细胞、肾脏干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞。
在本发明的一些实施方式中,所述器官包括:肝脏、胰腺、肺脏、心脏、胃、小肠、结肠、神经、骨骼或肌肉等。
优选地,所述骨骼类疾病选自肩周炎、腰椎间盘突出、风湿关节炎、脊柱炎症或损伤、骨质疏松症、佝偻病、骨软化症、成骨不全、大理石骨病、纤维异常增生、类风湿性关节炎、Gorham-Stout病、McCune-Albright综合征、各种癌症的溶骨性转移或多发性骨髓瘤、骨量丢失、全身骨骼脆弱、关节退变、非愈合性骨折、由糖尿病引起的骨科和牙科问题、植入性牙周炎、对骨移植物/植入物/骨替代性材料的不良反应、牙周病、骨骼老化、骨折、骨缺损、骨移植、植骨、骨癌、关节置换、关节修复、融合、关节修复、骨质退变、牙种植体和修复、骨髓缺损。
在本发明的一些实施方式中,所述产品包括药物、试剂。
在本发明的一些实施方式中,所述药物还包括药学上可接受的添加剂。
本发明的第七方面,提供一种药物组合物,包括本发明第一方面所述的重组蛋白或本发明第二方面所述的细胞外囊泡。
优选地,所述药物组合物包括有效剂量的发明第一方面所述的重组蛋白或本发明第二方面所述的细胞外囊泡和药学上可接受的添加剂。
本文所用的“药学上可接受的添加剂”旨在包括但不限于本领域技术人员在配制本发明化合物以制备药物组合物时所考虑使用的载剂、赋形剂、稀释剂、佐剂、着色剂、芳香剂、防腐剂等。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种重组RSPO蛋白高效富集的细胞外囊泡的制备方法,将细胞外囊泡作为具有生物活性的RSPO蛋白的运输载体,可获得分别或同时负载RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4蛋白的细胞外囊泡,也可借助跨膜蛋白将RSPO蛋白负载于细胞外囊泡膜外表面或细胞外囊泡内部,可用于调控体外干细胞增殖、干性和分化、类器官培养和体内组织器官再生、Wnt信号通路的增强;本发明发现细胞外囊泡负载的RSPO蛋白更容易纯化富集、成本更低、具有更好的生物活性和稳定性,可进行内容物或靶向功能化改造,并进一步研究RSPO作用机制或临床价值。
附图说明
图1为RSPO蛋白功能化细胞外囊泡结构示意图。图1A为游离RSPO重组蛋白负载于细胞外囊泡内部;图1B为Lamp2b-RSPO重组蛋白负载于细胞外囊泡,其中RSPO蛋白存在细胞外囊泡内部;图1C为RSPO-Lamp2b重组蛋白负载于细胞外囊泡,其中RSPO蛋白存在细胞外囊泡外表面。
图2为real-time PCR技术检测RSPO蛋白稳定表达细胞中RSPO基因表达。
图3为Western blot技术检测RSPO蛋白稳定表达细胞中RSPO蛋白表达。
图4为Western blot技术检测RSPO蛋白细胞外囊泡负载RSPO蛋白水平。
图5为ELISA技术检测传统方法提取RSPO1蛋白和功能化细胞外囊泡负载RSPO1蛋白水平。使用镍亲和层析的方法可从100mL培养液中提取400~500μg RSPO1蛋白,而每100mL培养液中提取外泌体负载RSPO1蛋白可高到1500~1600μg。
图6为TOPFlash双荧光素酶报告细胞系检测RSPO功能化外泌体对Wnt/β-catenin信号通路的激活效应。其中RSPO1功能化外泌体比相同浓度水平RSPO1蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的激活效应更高,意味着其具有更好的生物活性。
图7为体外小肠类器官培养评估RSPO功能化细胞外囊泡对类器官生长维持功能,显示RSPO功能化细胞外囊泡能够更好的维持小肠类器官增殖生长。
图8为负载RSPO蛋白融合Lamp2b蛋白功能化细胞外囊泡示意图。图8A为RSPO蛋白融合于Lamp2b蛋白N端,展示于细胞外囊泡外;图8B为RSPO蛋白融合于Lamp2b蛋白C端,展示于细胞外囊泡内。
图9为负载RSPO蛋白融合Lamp2b蛋白功能化细胞外囊泡鉴定。图9A为real-timePCR技术检测稳定表达细胞中RSPO基因表达,图9B为Western blot技术检测稳定表达细胞中RSPO蛋白表达,图9C为Western blot技术检测细胞外囊泡负载蛋白水平,图9D为ELISA技术检测细胞外囊泡负载RSPO蛋白水平,图9E为TOPFlash双荧光素酶报告细胞系检测细胞外囊泡活性。
术语:
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体,直径从30nm到1000nm不等。细胞外囊泡主要包括微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes,Exos)。微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡,直径约为200~1000nm。外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicularbodies,MBV)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外,直径约为30~200nm。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中,携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等,参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。
细胞外囊泡具有天然的生物相容性、高递送效率、低毒性和低免疫原性等特点,是新兴的药物递送载体。细胞外囊泡通常是通过对其供体细胞进行基因改造来设计的,在某些方面,本文所述的细胞外囊泡还负载有感兴趣的载荷,即细胞外囊泡封装了如蛋白质、核酸、多肽、小分子等分子。所述的载荷为外源或内源载荷。所述的载荷具有预防和/或治疗疾病的用途,具体的,所述的核酸选自由反义寡核苷酸、siRNA、miRNA、mRNA、gRNA或质粒组成的组的核酸;所述的多肽或蛋白质包括抗体、补体、酶、运载蛋白、细胞因子、多肽类激素等。
本文还公开了生产负载有感兴趣载荷的细胞外囊泡的方法,该方法包括允许RSPO蛋白在细胞外囊泡外表面负载或内表面负载的条件下使细胞外囊泡与感兴趣的载荷接触,如包括使用使细胞外囊泡与载荷接触并电穿孔以用细胞外囊泡封装载荷的步骤,其他可采用的封装载荷的方法包括超声处理、脂质转染或低渗透析等;所述封装载荷的步骤可以在细胞外囊泡负载RSPO蛋白之前或之后进行。
本文还公开了包含一种或多种本文公开的细胞外囊泡的组合物。组合物中至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或基本上所有的细胞外囊泡负载RSPO蛋白。在一些情况下,组合物中至少0%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或基本上所有的细胞外囊泡负载感兴趣的载荷。
该组合物可以是药物组合物。该组合物可包含一种或多种细胞外囊泡,以及任选的药学上可接受的添加剂。药物组合物可以配制用于通过特定给药途径给药。例如,药物组合物可以配制用于静脉内、肿瘤内、腹膜内、皮内、皮下、鼻内或其他给药途径。
细胞外囊泡的治疗方法和用途:本文公开的细胞外囊泡特别适用于预防和/或治疗机体发育、肝脏、胰腺、肺脏、心脏、胃、小肠、结肠、神经、骨骼或肌肉类疾病。主要通过促进各组织器官内干细胞的增殖与分化实现组织再生和器官损伤修复作用。感兴趣的载荷可以是用于抑制或增强靶基因表达或进行基因编辑以使特定基因沉默的核酸、蛋白或小分子药物是用于抑制或清除或提高靶蛋白或靶细胞的表达量或数量。
药物和组合物可以以流体或固体形式配制。流体制剂可以配制用于通过注射到人体或动物体的选定区域来给药。
细胞外囊泡可以单独给药或与其他治疗联合给药,根据待治疗的病症同时或依次给药。
装载有如本文所述的载荷的细胞外囊泡可用于将该细胞外囊泡或药物组合物递送至靶细胞。在一些情况下,该方法是体外方法。在特别优选的体外方法中,所述载荷包括靶细胞或靶基因定位标记。
待治疗的受试者可以是任何动物或人。受试者优选哺乳动物,更优选人类。受试者可以是非人类哺乳动物,但更优选是人类。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。治疗用途可用于人类或动物(兽医用途)。
“标签”,可以是核酸、多肽、蛋白质或分子标记。标签优选是外源的,意味着它通常不在细胞外囊泡的表面上发现。标签可以与细胞外囊泡共价连接或通过细胞外囊泡跨膜蛋白连接。例如,标签可以与细胞外囊泡的膜共价连接。它可以连接到细胞外囊泡膜内的蛋白质,例如具有N-末端甘氨酸或具有侧链氨基的残基的蛋白质,例如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。肽、多肽或蛋白质可以与小分子例如生物素、FLAG表位(FLAG标签)、HA-标签或多组氨酸(例如6×His标签)缀合。在某些情况下,标签促进检测、分离或纯化。肽或小分子任选地是被靶细胞表面上的受体结合的配体。肽、多肽或蛋白质可以是靶向部分或结合部分。在一些情况下,靶向部分或结合部分是抗体或抗原结合片段。在一些方面,抗原结合片段是单域抗体(sdAb)或单链抗体(scAb)。sdAb/scAb可能对靶细胞具有结合亲和力。标签可以包括治疗分子或实体。标签可以包括标记分子或实体。在某些情况下,标签是分子标记,在一些情况下是荧光蛋白或荧光标记,例如绿色荧光蛋白、荧光染料、CY3、CY5等。
“跨膜蛋白”,又称整合膜蛋白或膜内在蛋白,指附连至生物膜的蛋白质或多肽。跨膜蛋白分为单次跨膜或多次跨膜蛋白,其一次或多次跨越生物膜脂双层。单次跨膜蛋白仅一次跨越该膜,而多次跨膜蛋白以跨越数次的方式内外交织。I型单次跨膜蛋白利用其氨基末端位于膜的外侧或“膜外”,而其羧基末端位于膜的内侧或“膜内”。II型单次跨膜蛋白的氨基末端位于膜内侧。多次跨膜的跨膜蛋白两次或更多次通过膜,并且可具有多种不同拓扑结构。具有偶数个跨膜结构域的那些蛋白质的氨基末端和羧基末端均位于膜同侧。具有奇数个跨膜结构域的那些的氨基和羧基末端将位于膜的相对侧。某些跨膜蛋白不具有跨膜结构域,而是锚定至膜,例如,通过脂质如糖基磷脂酰肌醇或棕榈酰基团锚着。跨膜蛋白具有的生物功能包括但不限于转运蛋白、接头、通道、受体、酶、能量转运或细胞粘附。
多次跨膜蛋白可以是四次跨膜蛋白、五次跨膜蛋白或七次跨膜蛋白。四次跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD9、CD20、Claudin18.2、Claudin6、TM4SF、LAPTM4B、Tarp;五次跨膜蛋白为CD133;七次跨膜蛋白选自GPRC5D、CXCR4、CCR5、CCR8或SSTR2;单次跨膜蛋白选自Lamp2b、L1CAM、β-Klotho、CD147、PTGFRN或BASP1。其中,骨架蛋白还可选自上述跨膜蛋白的全长蛋白、蛋白片段、衍生物、突变体。
“蛋白片段、衍生物或突变体”包括保持对应的原蛋白的一种或多种性质,在本发明中,所述载体蛋白的“蛋白片段、衍生物或突变体”优选包含或保留原蛋白的跨膜性质或锚定膜的性质;所述RSPO蛋白的“蛋白片段、衍生物或突变体”优选包含或保留其调控骨骼、肌肉、血管等组织和消化系统、呼吸系统的发育,调控肢体和性腺的形成、脊椎动物个体发育的功能。多肽的片段还包括,例如,蛋白酶水解片段以及缺失片段。例如,多肽的突变体包括如上所述的片段,以及因氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些方面中,突变体可以是非天然产生的。可使用本领域已知的诱变技术生成非天然产生变体。变体多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已经改变从而显示原始多肽上不存在的其它特征的多肽。例如包括融合蛋白。突变体在本文中也可称作“多肽类似物”。“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸替代的情况。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸的家族,包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如,苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方式中,本发明的多肽序列中的保守取代不废除包含所述氨基酸序列的多肽的原有功能。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
本发明提供了RSPO蛋白功能化细胞外囊泡,其结构示意图如图1所示;提供三种形式的包含RSPO蛋白的功能化细胞外囊泡:可将游离RSPO蛋白可负载于细胞外囊泡内部;还可将Lamp2b-RSPO重组蛋白负载于细胞外囊泡,RSPO蛋白存在细胞外囊泡内部;还可将RSPO-Lamp2b重组蛋白负载于细胞外囊泡,RSPO蛋白存在细胞外囊泡外表面。
实施例1
分别合成人源RSPO1(Gene ID:284654)、RSPO2(Gene ID:340419)、RSPO3(GeneID:84870)和RSPO4(Gene ID:343637)蛋白编码全长基因序列,将上述基因序列构建到pLVX慢病毒载体上,得到RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4蛋白慢病毒表达质粒,Sanger测序无误后用于下一步实施工作。将上述表达质粒加入感受态细胞,冰上静置30min、42℃水浴热激90s、冰上静置2min进行质粒转化。将转化的感受态细胞转移至500μL LB液体培养基中,37℃孵育1h。去除部分上清液后吹打均匀,涂布于含有氨苄西林的LB固体培养基上。倒置平板于37℃孵育12~18h,挑选菌落进行验证。将阳性菌落加入20mL含有氨苄西林LB液体培养基中,37℃、180rpm摇床孵育12~18h。提取纯化质粒,并检测其质粒和浓度,Sanger测序无误后用于后续实施工作。培养HEK293T细胞,待细胞融合度为70%~80%时,分别将RSPO蛋白表达质粒、慢病毒包装辅助质粒和转染试剂混合后与HEK293T细胞共孵育,分别于48h和72h收集毒液,混匀后1200rpm离心5min,吸取上清并经0.45μm滤器过滤,获得RSPO蛋白表达病毒溶液,可在4℃保存一周或-80℃保存一年。
将RSPO蛋白表达病毒溶液与感染试剂混合后,与HEK293T细胞孵育24h后更换新鲜培养基,72h后加入1μg/mL嘌呤霉素新鲜培养基筛选阳性细胞,每24h更换含有1μg/mL嘌呤霉素新鲜培养基,待无明显悬浮死细胞后获得RSPO蛋白稳定表达细胞系。该稳转细胞扩增培养后可冻存于液氮中保存,通过real-time PCR技术检测基因表达水平,显示RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4 mRNA表达水平均提高15个循环以上(图2);Western blot技术检测蛋白表达水平,显示RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4在细胞中高效表达(图3)。
将上述稳定表达细胞扩增培养,获得培养上清液,分别经4℃、300g离心5min去除死细胞、2000g离心10min去除细胞碎片、10000g离心30min获得RSPO蛋白功能化微囊泡、100000g离心60min获得RSPO蛋白功能化外泌体。通过Western blot技术和ELISA技术检测RSPO蛋白功能化细胞外囊泡(微囊泡和外泌体)负载相应RSPO蛋白量;Western blot检测结果显示RSPO1、RSPO2、RSPO3蛋白有效负载于细胞外囊泡(图4),ELISA检测结果显示RSPO1有效负载于外泌体中,每100mL培养液中提取外泌体负载RSPO1蛋白可高到1500~1600μg,而使用镍亲和层析的方法从100mL培养液中提取RSPO1蛋白为400~500μg,是其2~3倍(图5)。因此,利用外泌体负载RSPO1蛋白提取效率更高。
利用TOPFlash双荧光素酶报告细胞系检测RSPO功能化细胞外囊泡对Wnt/β-catenin信号通路的激活效应。其中RSPO1功能化外泌体比RSPO1蛋白对Wnt/β-catenin信号通路的激活效应更高,意味着其具有更好的生物活性。(图6)。
体外培养人小肠组织来源类器官:通过肠镜活检获得正常肠组织样本,用含青霉素和链霉素的DPBS彻底清洗,除去小肠样本表面粘液后将组织标本剪碎至小于1mm,加入EDTA消化30min,获得肠隐窝;用基质胶混合隐窝,加入24孔细胞培养板中,37℃静置10min;待基质胶完全凝固后,加入小肠类器官培养基,该培养基中需要加入RSPO1等细胞因子以维持小肠类器官生长。移除小肠类器官培养基中的RSPO1,加入RSPO功能化细胞外囊泡,通过类器官形态评估检测RSPO功能化细胞外囊泡维持小肠类器官生长增殖和形态的功能。结果显示,体外小肠类器官培养中,RSPO1、RSPO2、RSPO3功能化细胞外囊泡,可取代小肠类器官培养基中需的商品化重组人源RSPO1因子(如R&D Systems,4645-RS),其隐窝数量甚至高于含商品化RSPO1因子的培养基(图7)。进一步,将RSPO功能化细胞外囊泡移植至急性小肠疾病小鼠模型体内,评估RSPO功能化细胞外囊泡对疾病治疗的作用。
实施例2
根据RSPO蛋白和Lamp2b蛋白氨基酸序列,分别合成人源RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4与Lamp2b(Gene ID:3920)蛋白编码全长基因序列,将RSPO蛋白置于Lamp2b蛋白N端,并删除Lamp2b蛋白信号肽编码序列(1~28AA),见图8A。获得融合基因序列并构建至pLVX慢病毒载体上,得到RSPO1-Lamp2b、RSPO2-Lamp2b、RSPO3-Lamp2b和RSPO4-Lamp2b蛋白慢病毒表达质粒,Sanger测序无误后用于下一步实施工作。将上述表达质粒加入感受态细胞,冰上静置30min、42℃水浴热激90s、冰上静置2min进行质粒转化。将转化的感受态细胞转移至500μL LB液体培养基中,37℃孵育1h。去除部分上清液后吹打均匀,涂布于含有氨苄西林的LB固体培养基上。倒置平板于37℃孵育12~18h,挑选菌落进行验证。将阳性菌落加入20mL含有氨苄西林LB液体培养基中,37℃、180rpm摇床孵育12~18h。提取纯化质粒,并检测其质粒和浓度,Sanger测序无误后用于后续实施工作。培养HEK293T细胞,待细胞融合度为70%~80%时,分别将蛋白表达质粒、慢病毒包装辅助质粒和转染试剂混合后与HEK293T细胞共孵育,分别于48h和72h收集毒液,混匀后1200rpm离心5min,吸取上清并经0.45μm滤器过滤,获得蛋白表达病毒溶液,可在4℃保存一周或-80℃保存一年。
将蛋白表达病毒溶液与感染试剂混合后,与HEK293T细胞孵育24h后更换新鲜培养基,72h后加入1μg/mL嘌呤霉素新鲜培养基筛选阳性细胞,每24h更换含有1μg/mL嘌呤霉素新鲜培养基,待无明显悬浮死细胞后获得RSPO-Lamp2b蛋白稳定表达细胞系。该稳转细胞扩增培养后可冻存于液氮中保存,通过real-time PCR技术检测基因表达水平,显示RSPO1mRNA表达水平均提高15个循环以上(图9A);Western blot技术检测蛋白表达水平,显示RSPO1、Lamp2b蛋白在细胞中高效表达(图9B)。
细胞扩增培养获得培养上清液,分别经4℃、300g离心5min去除死细胞、2000g离心10min去除细胞碎片、10000g离心30min获得RSPO-Lamp2b蛋白功能化微囊泡、100000g离心60min获得RSPO-Lamp2b蛋白功能化外泌体。Western blot检测结果显示RSPO1、Lamp2b蛋白有效负载于细胞外囊泡(图9C),ELISA检测结果也显示RSPO1有效富负载于细胞外囊泡(图9D)。利用TOPFlash双荧光素酶报告细胞系检测RSPO-Lamp2b功能化细胞外囊泡对Wnt/β-catenin信号通路具有显著的激活效应(图9E)。
与实施例1相比,区别仅在于实施例2将RSPO蛋白基因序列融合于Lamp2b蛋白N端基因序列,并删除Lamp2b蛋白信号肽编码序列,其它与实施例1相同。实施例2可通过膜蛋白Lamp2b蛋白获得RSPO蛋白负载于细胞外囊泡膜外表面。
实施例3
根据RSPO蛋白和Lamp2b蛋白氨基酸序列,分别合成人源RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4与Lamp2b蛋白编码全长基因序列,将RSPO蛋白置于Lamp2b蛋白C端,并删除RSPO蛋白信号肽编码序列(1~20AA),见图8B。获得融合基因序列并构建至pLVX慢病毒载体上,得到Lamp2b-RSPO1、Lamp2b-RSPO2、Lamp2b-RSPO3和Lamp2b-RSPO4蛋白慢病毒表达质粒,Sanger测序无误后用于下一步实施工作。将上述表达质粒加入感受态细胞,冰上静置30min、42℃水浴热激90s、冰上静置2min进行质粒转化。将转化的感受态细胞转移至500μL LB液体培养基中,37℃孵育1h。去除部分上清液后吹打均匀,涂布于含有氨苄西林的LB固体培养基上。倒置平板于37℃孵育12~18h,挑选菌落进行验证。将阳性菌落加入20mL含有氨苄西林LB液体培养基中,37℃、180rpm摇床孵育12~18h。提取纯化质粒,并检测其质粒和浓度,Sanger测序无误后用于后续实施工作。培养HEK293T细胞,待细胞融合度为70%~80%时,分别将蛋白表达质粒、慢病毒包装辅助质粒和转染试剂混合后与HEK293T细胞共孵育,分别于48h和72h收集毒液,混匀后1200rpm离心5min,吸取上清并经0.45μm滤器过滤,获得蛋白表达病毒溶液,可在4℃保存一周或-80℃保存一年。
将蛋白表达病毒溶液与感染试剂混合后,与HEK293T细胞孵育24h后更换新鲜培养基,72h后加入1μg/mL嘌呤霉素新鲜培养基筛选阳性细胞,每24h更换含有1μg/mL嘌呤霉素新鲜培养基,待无明显悬浮死细胞后获得Lamp2b-RSPO蛋白稳定表达细胞系。该稳转细胞扩增培养后可冻存于液氮中保存,通过real-time PCR技术检测基因表达水平,显示RSPO1mRNA表达水平均提高15个循环以上(图9A);Western blot技术检测蛋白表达水平,显示RSPO1、Lamp2b蛋白在细胞中高效表达(图9B)。
细胞扩增培养获得培养上清液,分别经4℃、300g离心5min去除悬浮死细胞、2000g离心10min去除细胞碎片、10000g离心30min获得Lamp2b-RSPO蛋白功能化微囊泡、10000g离心60min获得Lamp2b-RSPO蛋白功能化外泌体。Western blot检测结果显示RSPO1、Lamp2b蛋白有效负载于细胞外囊泡(图9C),ELISA检测结果也显示RSPO1有效负载于细胞外囊泡(图9D)。利用TOPFlash双荧光素酶报告细胞系检测Lamp2b-RSPO功能化细胞外囊泡对Wnt/β-catenin信号通路具有显著的激活效应(图9E)。
与实施例1相比,区别仅在于实施例3将RSPO蛋白基因序列融合于Lamp2b蛋白C端基因序列,并删除RSPO蛋白信号肽编码序列,其它与实施方式一相同。实施例3可通过膜蛋白Lamp2b蛋白获得RSPO蛋白负载于细胞外囊泡膜内部。
实施例4
将RSPO蛋白或融合蛋白表达病毒溶液感染于HEK293、Hela、CHO、Vero、COS-7、人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞和诱导全能干细胞等永生化细胞系或原代细胞孵育。
与实施例1、实施例2、实施例3相比,区别仅在于实施例4将蛋白表达病毒溶液感染HEK293、Hela、CHO、COS-7、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞和诱导全能干细胞等永生化细胞系或原代细胞孵育,分别获得其相应的RSPO蛋白稳定表达细胞。
实施例4可获得人、小鼠、猴等不同哺乳动物来源永生细胞系或原代细胞制备的RSPO蛋白稳定表达细胞,其RSPO蛋白表达量和细胞外囊泡产量会有所差异。
实施例5
利用膜亲和试剂盒、免疫磁珠分选、切向流等方法分离纯化RSPO蛋白功能化细胞外囊泡。
与实施例1、实施例2、实施例3、实施例4相比,区别仅在于实施例5利用膜亲和试剂盒、免疫磁珠分选、切向流等方法分离纯化RSPO蛋白功能化细胞外囊泡。
实施例5中不同细胞外囊泡分离方法获得细胞外囊泡的纯度、结构、产量可能会存在差异。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (18)
1.一种重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白包括RSPO蛋白和/或细胞外囊泡骨架蛋白。
2.一种细胞外囊泡,其特征在于,所述细胞外囊泡负载RSPO蛋白和/或骨架蛋白。
3.根据权利要求1所述的重组蛋白或权利要求2所述的细胞外囊泡,其特征在于,所述RSPO蛋白包括RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白、RSPO4蛋白中的至少一种;
优选地,所述RSPO蛋白选自RSPO1蛋白、RSPO2蛋白、RSPO3蛋白、RSPO4蛋白的全长蛋白、蛋白片段、衍生物或突变体。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白或权利要求2所述的细胞外囊泡,其特征在于,所述RSPO蛋白定位于所述细胞外囊泡的膜外侧或膜内侧。
5.根据权利要求1所述的重组蛋白或权利要求2所述的细胞外囊泡,其特征在于,所述骨架蛋白选自单次或多次跨膜蛋白;
优选地,所述多次跨膜蛋白选自四次跨膜蛋白、五次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白中的至少一种;
优选地,所述四次跨膜蛋白选自CD63、CD81、CD9、CD20、Claudin18.2、Claudin6、TM4SF、LAPTM4B、Tarp中的至少一种;
优选地,所述五次跨膜蛋白为CD133;
优选地,所述七次跨膜蛋白选自GPRC5D、CXCR4、CCR5、CCR8、SSTR2中的至少一种;
优选地,所述单次跨膜蛋白选自Lamp2b、L1CAM、β-Klotho、CD147、PTGFRN、BASP1中的至少一种;
优选地,所述骨架蛋白为Lamp2b;
优选地,所述骨架蛋白选自上述蛋白的全长蛋白、蛋白片段、衍生物或突变体;
优选地,所述蛋白片段包含其中一种骨架蛋白的跨膜结构域或锚定结构域、或者跨膜结构域和/或锚定结构域的组合,或者选自不同骨架蛋白的一种或多种跨膜结构域和/或锚定结构域的组合。
6.根据权利要求1所述的重组蛋白或权利要求2所述的细胞外囊泡,其特征在于,所述细胞外囊泡包括微囊泡、外泌体。
7.根据权利要求2-6任一项所述的细胞外囊泡,其特征在于,所述细胞外囊泡装载有载荷,所述的载荷选自核酸、肽、蛋白质或小分子药物。
8.根据权利要求2-6任一项所述的细胞外囊泡,其特征在于,所述细胞外囊泡还包括标签;优选地,所述的标签选自具有靶向功能和/或荧光的抗体、蛋白、多肽或核酸适配体。
9.与权利要求1-6任一项所述重组蛋白相关的生物材料,所述生物材料为下述(a1)~(d1)中的任一种:
(a1)编码权利要求1-6任一项所述重组蛋白的核酸分子;
(b1)含有(a1)所述核酸分子的表达盒;
(c1)含有(a1)所述核酸分子的重组载体、或含有(b1)所述表达盒的重组载体;(d1)含有(a1)所述核酸分子的重组微生物、或含有(b1)所述表达盒的重组微生物、或含有(c1)所述重组载体的重组细胞。
10.根据权利要求9所述的生物材料,其特征在于,所述载体包括病毒性载体或非病毒性载体;优选地,所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种;优选地,所述慢病毒载体包括pLVX、pCDH、pQCXIP、pLNCX、pLenti、pRRLSIN、pTRIP中的至少一种。
11.根据权利要求9所述的生物材料,其特征在于,所述细胞包括原核细胞或真核细胞;优选地,所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中的至少一种;所述哺乳动物细胞优选为HEK293T、HEK293、BHK、MDCK、Hela、CHO、Vero、COS-7、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、诱导全能干细胞中的至少一种。
12.一种制备权利要求1-6任一项所述的重组蛋白的方法,包括培养权利要求9~11任一项所述的细胞,获得培养上清液、分离获得所述重组蛋白。
13.一种制备权利要求2-8任一项所述的细胞外囊泡的方法,包括培养权利要求9~11任一项所述的细胞,以及从所述细胞培养基中分离出细胞外囊泡。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其特征在于,所述方法还包括利用离心、尺寸排阻色谱、超滤、切向流过滤、膜亲和试剂盒、色谱法、免疫磁珠分选、聚合沉淀法、免疫亲和、微流控技术、亲和色谱法中的至少一种进行纯化的步骤;
优选地,所述离心包括差速离心、密度梯度离心;
优选地,所述差速离心的条件包括:2~8℃、200~400g离心3~8min去除悬浮死细胞、1500~2500g离心8~15min去除细胞碎片、8000~12000g离心20~40min获得RSPO蛋白功能化微囊泡;
更优选地,所述差速离心还包括:2~8℃、90000~120000g离心50~70min获得RSPO蛋白功能化外泌体。
15.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,还包括将感兴趣的载荷引入至少一部分细胞外囊泡的步骤;优选地,还包括在细胞外囊泡表面引入标签的步骤。
16.权利要求1-6任一项所述的重组蛋白或权利要求2-8任一项所述的细胞外囊泡在筛选产品和/或制备产品和/或研究RSPO蛋白作用机制方面或临床价值中的应用;
所述产品用于以下至少一种:
(a2)防治肝脏、胰腺、肺脏、心脏、胃、小肠、结肠、神经、骨骼或肌肉类疾病;(b2)递送药物;
(c2)调控体内外干细胞干性维持、增殖、分化;
(d2)激活Wnt信号通路;
(e2)促进器官再生;
(f2)培养类器官;
优选地,所述产品包括药物、试剂。
17.药物组合物,包括权利要求1-6任一项所述的重组蛋白或权利要求2-8任一项所述的细胞外囊泡。
18.根据权利要求17所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括有效剂量的权利要求1-6任一项所述的重组蛋白或权利要求2-8任一项所述的细胞外囊泡和药学上可接受的添加剂。
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