CN118256544A - 一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水稻OsPDCD5基因改良技术领域，具体涉及一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，包括如下步骤：步骤S1：构建pBWA(V)H‑cas9‑OsPDCD5载体，步骤S2、pBWA(V)H‑cas9‑PDCD5.2载体的遗传转化，步骤S3、转化植株筛选与检测，步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，通过在OsPDCD5基因CDS区域选取靶标片段，将该靶标片段构建到敲除载体，然后转入籼稻品种T025中，获得重要经济性状发生改良的敲除株系。
Description
技术领域
本发明涉及水稻OsPDCD5基因改良技术领域，具体为一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法。
背景技术
水稻起源于热带和亚热带地区，因此与其他谷类作物相比，水稻更容易受到低温胁迫的影响。水稻在不同发育阶段都可能受到低温胁迫的影响，在营养生长期，低温胁迫会导致水稻黄化、枯萎或死亡。CRISPR/Cas是最新的基因编辑技术，在植物上，CRISPR/Cas9系统广泛应用于多种模式植物和作物的基因编辑。而水稻作为最主要的农作物之一，其遗传育种改良一直是科研人员的研究重点。利用CRISPR/Cas9系统精确编辑水稻基因组的目标碱基，获得性状改良的稳定突变株系，在实验室理论研究中已经取得多项成果。这揭示了CRISPR/Cas9技术在转基因育种上的重要价值，相对于传统的技术，CRISPR/Cas9技术具有育种时间短、效率高、目标明确等优点。因此，在水稻作物性状改良和培育新品种上，CRISPR/Cas9技术的应用前景十分广阔。
通过对已克隆的基因OsPDCD5进行功能分析，发现花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的OsPDCD5组成性表达引起转基因植株生长发育受阻，甚至表现出细胞程序性死亡的典型特征，包括鲜重减少，总蛋白含量降低，基因组DNA断裂等。而下调OsPDCD5的表达可以增强对盐、干旱和低温胁迫的抗性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，实现了基因OsPDCD5具备耐低温形状的功能。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，包括如下步骤：
步骤S1：构建pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5载体，
1)使用引物yjstgt(+):cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagcta和yjstgt(-):cagtGGTCTCaaaacgatagcttccaactctg扩增OsPDCD5基因CDS区域中20bp的靶标序列；
2)割胶回收PCR产物，并使用试剂盒纯化该DNA片段；
3)配制酶切连接体系:
| Component | Volumes |
| pBWA(V)H-cas9i | 4μL |
| PCR | 4μL |
| BsaI/Eco31I | 1μL |
| T4_ligase:1 | 1μL |
| Buffer | 2μL |
| H2O | 8μL |
| Total | 20μL |
37℃for20min，5cycles；37℃for10min；20℃for10min；37℃for20min；获得连接产物；
4)将5-10μL连接产物转化到大肠杆菌感受态，培养转化后的大肠杆菌使用卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定；
5)挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，扩增片段长度为422bp，取3个阳性条带对应的菌液，送样测序，将测序结果正确的菌液进行保菌处理；
步骤S2、pBWA(V)H-cas9-PDCD5.2载体的遗传转化，
1)将pBWA(V)H-cas9-PDCD5载体转化EHA105农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(WuZMet，2007)，得到转化子，将转化子提取质粒送样测序，结果表明质粒为pBWA(V)H-cas9-PDCD5；
2)T025成熟种子愈伤的诱导与培养
培养基如下表所示：
取T025成熟种子去壳，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，无菌水清洗5次，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次，接种于诱导培养基中，26℃黑暗条件下培养，20天后选取愈伤组织继代培养；
3)农杆菌侵染，
28℃培养EHA105/cas9-PDCD5.2农杆菌16小时，收集菌液，并稀释到含有100μmol/L的YEP液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，浸泡时间分为10min、20min、30min三组，浸泡期间不时摇匀，浸泡完成后，取出愈伤块，铺在灭菌的滤纸上吸干多余菌液后，转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在26℃温度条件下，共培养6天；
4)转化愈伤的筛选，
共培养完成后，取出愈伤块，用无菌水清洗3-5次，再用含利福平50mg/L与卡那霉素50mg/L抗性的无菌水清洗2-3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤转移至初级筛选培养基中；
转化愈伤进行初级、次级两轮筛选，在2-4周筛选完成后，转移至分化培养基中再生植株，在26℃、16h光照/每天的条件下，继续培养，直至分化出绿苗后，把小苗转移到生根培养基中培养，当小植株长到约10cm高时，将其从生根培养基中移出，洗净残留培养基，炼苗一段时间后，移栽到温室或大田；
步骤S3、转化植株筛选与检测，
1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；
2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；
3)采用PCR扩增检测候选的转化植株,检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得21个含pBWA(V)H-cas9-PDCD5的阳性转化植株；
步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，
将筛选到的T0阳性转化植株收种，再种植一代获得T1代，取叶片抽提基因组DNA，并使用OsPCDC5检测引物MPCD6-F：TGGAGGGAGTACATGTTTTAGGTG和MPCD6-R：ATAAACATGGTTGACAAATAGAGC，确定含有9株发生OsPDCD5功能突变的株系；
步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，
生长10天左右的水稻幼苗低温胁迫，环境温度4℃下处理2天，随后幼苗被再次转移回温室恢复生长3～8天，最后测定存活率、离子泄露率以及叶绿素含量。
作为本发明的一种优选方案，步骤S1中，核苷酸序列为：acccagagttgg aagctatc，扩增PCR产物为：cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagctatcgttttGA GACCagtg。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤S2中，将含有pBWA(V)H-cas9-PDCD5的转化子命名为EHA105/cas9-PDCD5。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤S2中，培养基中均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤S3中，扩增检测所使用的扩增引物为Hyg-CX-S：AGATGTTGGCGACCTCGTATT；Hyg-CX-A：AAGATCGTTATGTTTATCG GCACT。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过在OsPDCD5基因CDS区域选取靶标片段，将该靶标片段构建到敲除载体，然后转入籼稻品种T025中，获得重要经济性状发生改良的敲除株系。
附图说明
图1为水稻OsPDCD5基因结构。
图2为水稻OsPDCD5基因的表达载体结构图。
图3为水稻OsPDCD5敲除株系一代测序检测结果图。
图4为水稻OsPDCD5敲除株系与对照T025在成熟期大田图片及单株比较。
图5为水稻OsPDCD5敲除株系与对照T025在成熟期植株穗型及粒型比较。
图6为OsPDCD5敲除株系与对照T025在低温胁迫下的表型比较。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
步骤S1：构建pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5载体，
1)使用引物yjstgt(+):cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagcta和yjstgt(-):cagtGGTCTCaaaacgatagcttccaactctg扩增OsPDCD5基因CDS区域中20bp的靶标序列，核苷酸序列为：acccagagttggaagctatc，扩增PCR产物为：cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagctatcgttttGAGACCagtg；
2)割胶回收PCR产物，并使用试剂盒纯化该DNA片段；
3)配制酶切连接体系:
| Component | Volumes |
| pBWA(V)H-cas9i | 4μL |
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| BsaI/Eco31I | 1μL |
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| Total | 20μL |
37℃for20min，5cycles；37℃for10min；20℃for10min；37℃for20min；获得连接产物；
4)将5-10μL连接产物转化到大肠杆菌感受态，培养转化后的大肠杆菌使用卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定；
5)挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，扩增片段长度为422bp，取3个阳性条带对应的菌液，送样测序，将测序结果正确的菌液进行保菌处理；
步骤S2、pBWA(V)H-cas9-PDCD5.2载体的遗传转化，
1)将pBWA(V)H-cas9-PDCD5载体转化EHA105农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(WuZMet，2007)，得到转化子，将转化子提取质粒送样测序，结果表明质粒为pBWA(V)H-cas9-PDCD5，将含有pBWA(V)H-cas9-PDCD5的转化子命名为EHA105/cas9-PDCD5；
2)T025成熟种子愈伤的诱导与培养
培养基如下表所示：
培养基中均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，
取T025成熟种子去壳，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，无菌水清洗5次，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次，接种于诱导培养基中，26℃黑暗条件下培养，20天后选取愈伤组织继代培养；
3)农杆菌侵染，
28℃培养EHA105/cas9-PDCD5.2农杆菌16小时，收集菌液，并稀释到含有100μmol/L的YEP液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，浸泡时间分为10min、20min、30min三组，浸泡期间不时摇匀，浸泡完成后，取出愈伤块，铺在灭菌的滤纸上吸干多余菌液后，转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在26℃温度条件下，共培养6天；
4)转化愈伤的筛选，
共培养完成后，取出愈伤块，用无菌水清洗3-5次，再用含利福平50mg/L与卡那霉素50mg/L抗性的无菌水清洗2次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤转移至初级筛选培养基中；
转化愈伤进行初级、次级两轮筛选，在2周筛选完成后，转移至分化培养基中再生植株，在26℃、16h光照/每天的条件下，继续培养，直至分化出绿苗后，把小苗转移到生根培养基中培养，当小植株长到约10cm高时，将其从生根培养基中移出，洗净残留培养基，炼苗一段时间后，移栽到温室或大田；
步骤S3、转化植株筛选与检测，
1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；
2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；
3)采用PCR扩增检测候选的转化植株,检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得21个含pBWA(V)H-cas9-PDCD5的阳性转化植株。扩增检测所使用的扩增引物为Hyg-CX-S：AGATGTTGGCGACCTCGTATT；Hyg-CX-A：AAGATCGTTATGTTTATCGGCACT；
步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，
将筛选到的T0阳性转化植株收种，再种植一代获得T1代，取叶片抽提基因组DNA，并使用OsPCDC5检测引物MPCD6-F：TGGAGGGAGTACATGTTTTAGGTG和MPCD6-R：ATAAACATGGTTGACAAATAGAGC，确定含有9株发生OsPDCD5功能突变的株系；
步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，
生长10天左右的水稻幼苗低温胁迫，环境温度4℃下处理2天，随后幼苗被再次转移回温室恢复生长3天，最后测定存活率、离子泄露率以及叶绿素含量。
实施例2：
步骤S1：构建pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5载体，
1)使用引物yjstgt(+):cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagcta和yjstgt(-):cagtGGTCTCaaaacgatagcttccaactctg扩增OsPDCD5基因CDS区域中20bp的靶标序列，核苷酸序列为：acccagagttggaagctatc，扩增PCR产物为：cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagctatcgttttGAGACCagtg；
2)割胶回收PCR产物，并使用试剂盒纯化该DNA片段；
3)配制酶切连接体系:
37℃for20min，5cycles；37℃for10min；20℃for10min；37℃for20min；获得连接产物；
4)将5-10μL连接产物转化到大肠杆菌感受态，培养转化后的大肠杆菌使用卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定；
5)挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，扩增片段长度为422bp，取3个阳性条带对应的菌液，送样测序，将测序结果正确的菌液进行保菌处理；
步骤S2、pBWA(V)H-cas9-PDCD5.2载体的遗传转化，
1)将pBWA(V)H-cas9-PDCD5载体转化EHA105农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(WuZMet，2007)，得到转化子，将转化子提取质粒送样测序，结果表明质粒为pBWA(V)H-cas9-PDCD5，将含有pBWA(V)H-cas9-PDCD5的转化子命名为EHA105/cas9-PDCD5；
2)T025成熟种子愈伤的诱导与培养
培养基如下表所示：
培养基中均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，
取T025成熟种子去壳，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，无菌水清洗5次，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次，接种于诱导培养基中，26℃黑暗条件下培养，20天后选取愈伤组织继代培养；
3)农杆菌侵染，
28℃培养EHA105/cas9-PDCD5.2农杆菌16小时，收集菌液，并稀释到含有100μmol/L的YEP液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，浸泡时间分为10min、20min、30min三组，浸泡期间不时摇匀，浸泡完成后，取出愈伤块，铺在灭菌的滤纸上吸干多余菌液后，转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在26℃温度条件下，共培养6天；
4)转化愈伤的筛选，
共培养完成后，取出愈伤块，用无菌水清洗5次，再用含利福平50mg/L与卡那霉素50mg/L抗性的无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤转移至初级筛选培养基中；
转化愈伤进行初级、次级两轮筛选，在3周筛选完成后，转移至分化培养基中再生植株，在26℃、16h光照/每天的条件下，继续培养，直至分化出绿苗后，把小苗转移到生根培养基中培养，当小植株长到约10cm高时，将其从生根培养基中移出，洗净残留培养基，炼苗一段时间后，移栽到温室或大田；
步骤S3、转化植株筛选与检测，
1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；
2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；
3)采用PCR扩增检测候选的转化植株,检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得21个含pBWA(V)H-cas9-PDCD5的阳性转化植株。扩增检测所使用的扩增引物为Hyg-CX-S：AGATGTTGGCGACCTCGTATT；Hyg-CX-A：AAGATCGTTATGTTTATCGGCACT；
步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，
将筛选到的T0阳性转化植株收种，再种植一代获得T1代，取叶片抽提基因组DNA，并使用OsPCDC5检测引物MPCD6-F：TGGAGGGAGTACATGTTTTAGGTG和MPCD6-R：ATAAACATGGTTGACAAATAGAGC，确定含有9株发生OsPDCD5功能突变的株系；
步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，
生长10天左右的水稻幼苗低温胁迫，环境温度4℃下处理2天，随后幼苗被再次转移回温室恢复生长5天，最后测定存活率、离子泄露率以及叶绿素含量。
实施例3：
步骤S1：构建pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5载体，
1)使用引物yjstgt(+):cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagcta和yjstgt(-):cagtGGTCTCaaaacgatagcttccaactctg扩增OsPDCD5基因CDS区域中20bp的靶标序列，核苷酸序列为：acccagagttggaagctatc，扩增PCR产物为：cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagctatcgttttGAGACCagtg；
2)割胶回收PCR产物，并使用试剂盒纯化该DNA片段；
3)配制酶切连接体系:
| Component | Volumes |
| pBWA(V)H-cas9i | 4μL |
| PCR | 4μL |
| BsaI/Eco31I | 1μL |
| T4_ligase:1 | 1μL |
| Buffer | 2μL |
| H2O | 8μL |
| Total | 20μL |
37℃for20min，5cycles；37℃for10min；20℃for10min；37℃for20min；获得连接产物；
4)将5-10μL连接产物转化到大肠杆菌感受态，培养转化后的大肠杆菌使用卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定；
5)挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，扩增片段长度为422bp，取3个阳性条带对应的菌液，送样测序，将测序结果正确的菌液进行保菌处理；
步骤S2、pBWA(V)H-cas9-PDCD5.2载体的遗传转化，
1)将pBWA(V)H-cas9-PDCD5载体转化EHA105农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(WuZMet，2007)，得到转化子，将转化子提取质粒送样测序，结果表明质粒为pBWA(V)H-cas9-PDCD5，将含有pBWA(V)H-cas9-PDCD5的转化子命名为EHA105/cas9-PDCD5；
2)T025成熟种子愈伤的诱导与培养
培养基如下表所示：
培养基中均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，
取T025成熟种子去壳，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，无菌水清洗5次，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次，接种于诱导培养基中，26℃黑暗条件下培养，20天后选取愈伤组织继代培养；
3)农杆菌侵染，
28℃培养EHA105/cas9-PDCD5.2农杆菌16小时，收集菌液，并稀释到含有100μmol/L的YEP液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，浸泡时间分为10min、20min、30min三组，浸泡期间不时摇匀，浸泡完成后，取出愈伤块，铺在灭菌的滤纸上吸干多余菌液后，转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在26℃温度条件下，共培养6天；
4)转化愈伤的筛选，
共培养完成后，取出愈伤块，用无菌水清洗4次，再用含利福平50mg/L与卡那霉素50mg/L抗性的无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤转移至初级筛选培养基中；
转化愈伤进行初级、次级两轮筛选，在2-4周筛选完成后，转移至分化培养基中再生植株，在26℃、16h光照/每天的条件下，继续培养，直至分化出绿苗后，把小苗转移到生根培养基中培养，当小植株长到约10cm高时，将其从生根培养基中移出，洗净残留培养基，炼苗一段时间后，移栽到温室或大田；
步骤S3、转化植株筛选与检测，
1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；
2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；
3)采用PCR扩增检测候选的转化植株,检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得21个含pBWA(V)H-cas9-PDCD5的阳性转化植株。扩增检测所使用的扩增引物为Hyg-CX-S：AGATGTTGGCGACCTCGTATT；Hyg-CX-A：AAGATCGTTATGTTTATCGGCACT；
步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，
将筛选到的T0阳性转化植株收种，再种植一代获得T1代，取叶片抽提基因组DNA，并使用OsPCDC5检测引物MPCD6-F：TGGAGGGAGTACATGTTTTAGGTG和MPCD6-R：ATAAACATGGTTGACAAATAGAGC，确定含有9株发生OsPDCD5功能突变的株系；
步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，
生长10天左右的水稻幼苗低温胁迫，环境温度4℃下处理2天，随后幼苗被再次转移回温室恢复生长6天，最后测定存活率、离子泄露率以及叶绿素含量。
本发明涉及的序列
SEQ ID NO.1：
水稻OsPDCD5基因全长cDNA序列：
GGAGAGAGGCCCAGATGAGTTGCGTTAAATCCACGGGTGAGGAGAGAGAAAAAGGAGGTCAAGTTCTCTCTCTCTTCCTCTCGTCGCCGGAGGCGGGAGGCCATCGACGCTGAAGTGAAGGGGATCGCGATCTCCGGCGAGCGTGCGGGGGAAGATGGCTGACCCAGAGTTGGAAGCTATCAGGCAGAGGAGAATGCAAGAGCTAATGGCACAGCATGGTGCGGCAAATCCGCAAAATGCTGGGCAACAAAAAGCTCAAGAAGATGCAAAGCAGGAAGCTGAGGAACGGCGGCAGATGATGCTTGCTCAGATTTTATCTTCTGAAGCTAGAGAAAGGCTCTCCCGCATAGCTTTGGTCAAACCTGATAAAGCAAGAGGGGTGGAGGATGTTCTTCTGAGAGCTGCTCAGTCCGGTGGAATATCTGAAAAGGTGTCTGAAGAAAGGCTTATCTCACTTCTGGAGCAAATCAATACCCACACTAGCAAACAGACGAAAGTTACGATTCAGAGGCGCCGGAGCGTCCTTGACGATGATGACTAGCTGCATGTGTGTTGTGTGTACGATGAGCTGGTGGAGGAGTCTGCTGTAGCGCAAAACTACTTAGAAATGATGATTATCAAACGCTATATCAACAACCATCAAAACTTGAGCGACTATTTGATGGATATTTGGCCGTATATGAATTAATTCGAGTTTGGTTTGGCTTGTTCCATTGATGACATTCAAACTTTTGACTGCTCCGAAGGGGAATTGCCACACGTCCGACTGGTATGTACGACTTAGCATCCGACCAGTACTTACCTGCTCCTTGCTCTGGCCCACATGGAGAGCAGCTGGCTCGTTGGAGTAAATT
GATTAGCGAACAATAGGGTCGGATGTATAGCAGTACTCGCTCCGAAGTGTGTATCCATCAT
ATCATGAGTATCTTA
SEQ ID NO.2：
水稻OsPDCD5基因CDS区域的靶标序列：
ACCCAGAGTTGGAAGCTATCAGG
SEQ ID NO.3：
水稻OsPDCD5基因编码氨基酸序列：
MADPELEAIRQRRMQELMAQHGAANPQNAGQQKAQEDAKQEAEERRQMMLAQILSSEARERL SRIALVKPDKARGVEDVLLRAAQSGGISEKVSEERLISLLEQINTHTSKQTKVTIQRRRSVLDDDD*
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：构建pBWA(V)H-cas9-OsPDCD5载体，
1)使用引物yjstgt(+):cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagcta和yjstgt(-):cagtGGTCTCaaaacgatagcttccaactctg扩增OsPDCD5基因CDS区域中20bp的靶标序列；
2)割胶回收PCR产物，并使用试剂盒纯化该DNA片段；
3)配制酶切连接体系:
37℃for 20min，5cycles；37℃for 10min；20℃for 10min；37℃for 20min；获得连接产物；
4)将5-10μL连接产物转化到大肠杆菌感受态，培养转化后的大肠杆菌使用卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定；
5)挑取10个菌斑同时进行1.5ml EP管接菌和PCR鉴定是否连接成功,鉴定引物Pbw2+：GGCGTCTTCTACTGGTGCTA,Pbw2-：GTCTTTACGGCGAGTTCTGT，扩增片段长度为422bp，取3个阳性条带对应的菌液，送样测序，将测序结果正确的菌液进行保菌处理；
步骤S2、pBWA(V)H-cas9-PDCD5.2载体的遗传转化，
1)将pBWA(V)H-cas9-PDCD5载体转化EHA105农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(WuZM et，2007)，得到转化子，将转化子提取质粒送样测序，结果表明质粒为pBWA(V)H-cas9-PDCD5；
2)T025成熟种子愈伤的诱导与培养
培养基如下表所示：
取T025成熟种子去壳，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，无菌水清洗5次，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次，接种于诱导培养基中，26℃黑暗条件下培养，20天后选取愈伤组织继代培养；
3)农杆菌侵染，
28℃培养EHA105/cas9-PDCD5.2农杆菌16小时，收集菌液，并稀释到含有100μmol/L的YEP液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，浸泡时间分为10min、20min、30min三组，浸泡期间不时摇匀，浸泡完成后，取出愈伤块，铺在灭菌的滤纸上吸干多余菌液后，转移到共培养培养基上，培养基表面铺一层无菌滤纸，愈伤在滤纸上与培养基不直接接触，在26℃温度条件下，共培养6天；
4)转化愈伤的筛选，
共培养完成后，取出愈伤块，用无菌水清洗3-5次，再用含利福平50mg/L与卡那霉素50mg/L抗性的无菌水清洗2-3次，无菌滤纸吸干净多余水分后，将愈伤转移至初级筛选培养基中；
转化愈伤进行初级、次级两轮筛选，在2-4周筛选完成后，转移至分化培养基中再生植株，在26℃、16h光照/每天的条件下，继续培养，直至分化出绿苗后，把小苗转移到生根培养基中培养，当小植株长到约10cm高时，将其从生根培养基中移出，洗净残留培养基，炼苗一段时间后，移栽到温室或大田；
步骤S3、转化植株筛选与检测，
1)将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天；
2)待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室；
3)采用PCR扩增检测候选的转化植株,检测T0代转化植株中是否含有潮霉素筛选标记，获得21个含pBWA(V)H-cas9-PDCD5的阳性转化植株；
步骤S4、OsPDCD5的CDS区域突变的植株筛选与检测，
将筛选到的T0阳性转化植株收种，再种植一代获得T1代，取叶片抽提基因组DNA，并使用OsPCDC5检测引物MPCD6-F：TGGAGGGAGTACATGTTTTAGGTG和MPCD6-R：ATAAACATGGTTGACAAATAGAGC，确定含有9株发生OsPDCD5功能突变的株系；
步骤S5、OsPDCD5突变株系的低温抗性测定，
生长10天左右的水稻幼苗低温胁迫，环境温度4℃下处理2天，随后幼苗被再次转移回温室恢复生长3～8天，最后测定存活率、离子泄露率以及叶绿素含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，其特征在于：所述步骤S1中，核苷酸序列为：acccagagttggaagctatc，扩增PCR产物为：cagtGGTCTCaggcacccagagttggaagctatcgttttGAGACCagtg。
3.根据权利要求1所述的一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，其特征在于：所述步骤S2中，将含有pBWA(V)H-cas9-PDCD5的转化子命名为EHA105/cas9-PDCD5。
4.根据权利要求1所述的一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，其特征在于：所述步骤S2中，培养基中均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar。
5.根据权利要求1所述的一种基于水稻OsPDCD5基因改良水稻低温性状的方法，其特征在于：所述步骤S3中，扩增检测所使用的扩增引物为Hyg-CX-S：AGATGTTGGCGACCTCGTATT；Hyg-CX-A：AAGATCGTTATGTTTATCGGCACT。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN118256544A true CN118256544A (zh) | 2024-06-28 |
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