CN118252913B - 多肽偶联物及其在射血分数保留的心衰中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疾病治疗领域，具体地提供了降解Jun蛋白的多肽偶联物及其在射血分数保留的心衰中的应用。

Description

多肽偶联物及其在射血分数保留的心衰中的应用
技术领域
本发明涉及疾病治疗领域，具体地提供了降解Jun蛋白的多肽偶联物及其在射血分数保留的心衰中的应用。
背景技术
心血管疾病是全球人类死亡的主要原因之一，带来沉重的医疗和经济负担。心衰严重限制人的生活质量。心衰包括收缩功能障碍的心衰和舒张功能障碍的心衰，其中舒张功能障碍的心衰随着医学的发展，也被更广泛的定义为射血分数保留的心衰(HFpEF)。HFpEF是一种高发病率和高死亡率的综合征，据统计全世界因HF的死亡率为35%，其中HFpEF占比大于50%。
迄今为止，本领域缺乏很少有效的药物疗法被证明可以改变HFpEF患者的疾病进展和预后，从而产生了巨大的未满足的临床需求。
发明内容
本课题组前期通过单细胞测序发现靶点JUN与心衰密切相关，JUN的过表达会导致HFpEF，而干预JUN则可以改善疾病的进程。然而目前针对JUN的药物开发面临多种挑战。传统药物的设计思路主要是针对靶蛋白开发各类小分子、多肽、蛋白类抑制剂，通过占据和阻断靶蛋白的活性作用位点，抑制蛋白的功能活性，从而发挥治疗功效。然而，这些传统研发策略受其作用机制的限制，主要存在以下问题：1）靶蛋白大多是含有“可成药性”的活性口袋或结合位点的蛋白如激酶、离子通道等，对许多没有明确的活性位点的潜在药物靶点，如骨架蛋白、转录因子和非酶蛋白等，难以找到相应的高亲和力抑制剂；2）抑制剂以“占用驱动”（Occupancy-driven）的模式与靶蛋白的活性位点特异性结合，依赖于在一定时间内保持较高的药物浓度充分占据靶蛋白的结合位点，但较高的药物浓度易引起脱靶效应和不良反应等副作用；3）小分子抑制剂可能使蛋白代偿性增加或发生基因突变，产生耐药性。考虑到抑制剂的局限性，研究人员开发了从基因水平调控蛋白质表达的技术如基于RNA的RNA干扰技术和基于DNA的CRISPR/Cas9技术。尽管基因干扰技术突破了蛋白质结构层面对药物设计的限制，但该类技术存在作用效果不可逆、“脱靶”风险高、发挥效应时间长易导致细胞启动补偿机制等问题和挑战，严重制约其发展和治疗潜力。因此，开发一种可靶向降解特定蛋白质的方法将会突破现有药物研发技术的诸多瓶颈，为新药开发提供新的方向。
多肽偶联物
在一个方面，本发明提供了一种多肽偶联物（polypeptide conjugate）或其药学上可接受的盐，其包含：(a) 降解诱导配体、(b)环肽、以及(c) Jun蛋白靶向肽；其中，所述Jun蛋白靶向肽选自QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO: 24）或EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO: 25）。
在某些实施方案中，所述多肽偶联物从N端至C端包含所述降解诱导配体、环肽、以及Jun蛋白靶向肽。在某些实施方案中，所述多肽偶联物从N端至C端由所述降解诱导配体、环肽、以及Jun蛋白靶向肽组成，所述降解诱导配体、环肽、以及Jun蛋白靶向肽彼此之间任选地由接头连接。
在某些实施方案中，所述环肽具有通式I所示的结构：
环[isoD-X1-X2-Dap] (I)
其中，isoD为异天冬氨酸，Dap为2，3-二氨基丙酸（2，3-Diaminopropionic acid），X1、X2各自独立地选自天然氨基酸，所述isoD与Dap形成环化。
在某些实施方案中，X1、X2各自独立地选自L-氨基酸。
在某些实施方案中，所述环肽为Cyclo (isoD-E-I-Dap)或Cyclo (isoD-V-L-Dap)。
在某些实施方案中，所述isoD与Dap通过各自的侧链共价连接。在某些实施方案中，所述isoD通过侧链的羧基与Dap侧链的氨基通过酰胺键连接。
在某些示例性实施方案中，所述环肽具有所示的结构。
在某些实施方案中，所述环肽为Cyclo (isoD-E-I-Dap)，所述Jun蛋白靶向肽为QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO: 24）。
在某些实施方案中，所述环肽为Cyclo (isoD-V-L-Dap)，所述Jun蛋白靶向肽为EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO: 25）。
在某些实施方案中，所述降解诱导配体是指靶向蛋白降解（targeted proteindegradation，TPD）技术中负责靶向泛素-蛋白酶体系统（UPS）或自噬-溶酶体途径（ALP）以诱导蛋白降解的配体。
在某些实施方案中，所述降解诱导配体是基于泛素-蛋白酶体系统（UPS）的靶向蛋白降解技术中的配体。在某些实施方案中，所述基于泛素-蛋白酶体系统（UPS）的靶向蛋白降解技术是蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimaera，PROTAC），PROTAC是由靶蛋白配体和E3连接酶配体通过适当的连接子连接而成的一类异双功能分子，通过将E3连接酶募集到靶蛋白附近形成三元复合物，诱导靶蛋白的泛素化和蛋白酶体降解。
在某些实施方案中，所述降解诱导配体是E3泛素连接酶配体，例如LAP(OH)YI（Leu-Ala-ProOH-Tyr-Ile，SEQ ID NO: 26）。
在某些实施方案中，所述降解诱导配体是基于自噬-溶酶体途径（ALP）的靶向蛋白降解技术中的配体。在某些实施方案中，所述基于自噬-溶酶体途径（ALP）的靶向蛋白降解技术是自噬体绑定化合物（autophagosome-tethering compound，ATTEC），其中，LC3配体与不同的靶蛋白配体通过连接子连接形成异双功能的自噬降解剂。在细胞自噬诱导信号的调控下，微管相关蛋白1A/1B轻链3（microtubule-associated protein 1A/1B 1ight chain3，LC3）由胞浆型LC3（LC3-Ⅰ）脂化成自噬体膜型LC3（LC3-Ⅱ），吸附在由高尔基体、内质网等细胞器的游离膜形成的杯状双层膜结构的吞噬泡（phagophore）上，并进一步延伸；吞噬泡进一步包裹住胞质中的靶蛋白等底物形成双层膜结构的封闭隔室，即自噬体（autophagosome）；最后，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome）完成后续降解。
在某些实施方案中，所述降解诱导配体是LC3配体，例如WGPIWGPI（SEQ ID NO:27）。
在某些实施方案中，所述(a)、(b)、(c)彼此之间共价连接。
在某些实施方案中，所述(a)、(b)、(c)彼此之间任选地通过连接体（Linker）或直接（例如通过肽键）连接。
在某些实施方案中，所述连接体为间隔基团。在某些实施方案中，所述连接体选自氨基己酸（Ahx）或 12-氨基月桂酸（12-Ado）。
在某些实施方案中，所述(a)、(b)之间直接连接。在某些实施方案中，所述(a)、(b)之间通过连接体（Linker）连接；
在某些实施方案中，所述(b)、(c)之间直接连接。
在某些实施方案中，所述(a)、(b)之间直接连接或通过连接体（Linker）连接，所述(b)、(c)之间直接连接。
在某些实施方案中，所述降解诱导配体为LAP(OH)YI（SEQ ID NO: 26）或WGPIWGPI（SEQ ID NO: 27），所述环肽为Cyclo (isoD-E-I-Dap)，所述靶向Jun蛋白的肽为QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO: 24）。
在某些实施方案中，所述降解诱导配体为WGPIWGPI（SEQ ID NO: 27），所述环肽为Cyclo (isoD-V-L-Dap)，所述靶向Jun蛋白的肽为EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ IDNO: 25）。
在某些实施方案中，所述多肽偶联物具有选自下列的结构：
WGPIWGPI-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO: 16）；
WGPIWGPI-ahx-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO:17）；
WGPIWGPI-12Ado-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO:18）；
LAP(OH)YI-ahx-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO:19）；
LAP(OH)YI-12Ado-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO:20）。
在某些实施方案中，所述多肽偶联物具有选自下列的结构：
WGPIWGPI-Cyclo(isoD-V-L-Dap)EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ ID NO:21）；
WGPIWGPI-ahx-Cyclo(isoD-V-L-Dap)EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ IDNO: 22）；
WGPIWGPI-12Ado-Cyclo(isoD-V-L-Dap)EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKL（SEQ IDNO: 23）。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的多肽偶联物进一步包含核定位序列。术语“核定位序列”或“NLS”用于指标记蛋白以通过核转运使其输入细胞核的氨基酸序列。通常，核定位序列由富含带正电荷的氨基酸（例如赖氨酸和/或精氨酸）的短肽组成。在某些实施方案中，所述核定位序列位于所述多肽偶联物的C端。在某些实施方案中，所述核定位序列源自SV40病毒T抗原。在某些实施方案中，所述核定位序列为PKKKRKV（SEQ ID NO:28）。
在某些实施方案中，携带核定位序列的多肽偶联物具有选自下列的结构：
WGPIWGPI-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQ ID NO:5）；
WGPIWGPI-ahx-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQ IDNO: 6）；
WGPIWGPI-12Ado-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQID NO: 7）；
LAP(OH)YI-ahx-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQID NO: 8）；
LAP(OH)YI-12Ado-Cyclo(isoD-E-I-Dap)QLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQID NO: 9）；
WGPIWGPI-Cyclo(isoD-V-L-Dap)EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQ IDNO: 11）；
WGPIWGPI-ahx-Cyclo(isoD-V-L-Dap)EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQ ID NO: 12）；
WGPIWGPI-12Ado-Cyclo(isoD-V-L-Dap)EEIEQLEERNYALRKEIEDLQKQLEKLPKKKRKV（SEQ ID NO: 13）。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的多肽偶联物包含N-末端修饰和/或C-末端修饰，例如使用合适的氨基反应化学（amino-reactive chemistry）的N-末端修饰，和/或使用合适的羧基反应化学（carboxy-reactive chemistry）的C-末端修饰。在某些实施方案中，所述N-末端修饰或C-末端修饰包括添加效应基团，包括但不限于细胞毒性剂、放射性螯合剂或可检测的标记。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的多肽偶联物包含N末端封端基团，例如甲酰基、乙酰基、苯甲酰基。在某些实施方案中，所述多肽偶联物包含N末端乙酰基。在此类实施方案中，在肽合成过程中用乙酸酐或其他适当的试剂对N-末端残基进行加帽，得到N-末端被乙酰化的分子。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的多肽偶联物包含C-末端修饰。在某些实施方案中，所述C-末端修饰包括酰胺基团。在该实施方案中，C-末端残基在肽合成过程中合成为酰胺，得到C-末端被酰胺化的分子。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的多肽偶联物包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述多肽偶联物在其N端包含可检测的标记。可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学等手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等）、放射性核素（例如，3H、125I、35S、14C或32P）、荧光染料、化学发光物质（如吖啶酯类化合物）或生物素。在某些实施方案中，所述多肽偶联物在其N端包含生物素。
药学上可接受的盐
可以理解的是，盐形式在本发明的范围内，并且对多肽偶联物的引用包括所述多肽偶联物的盐形式。
本发明的多肽偶联物的药学可接受的盐可以为任何合适的药学可接受的盐形式。术语“药学上可接受的盐”是指，(i) 本发明所提供的多肽偶联物中存在的酸性官能团（例如-COOH）与适当的无机或者有机阳离子（碱）形成的盐，并且包括但不限于，碱金属盐，如钠盐、钾盐、锂盐等；碱土金属盐，如钙盐、镁盐等；其他金属盐，如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等；无机碱盐，如铵盐；有机碱盐，如叔辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己基胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙基胺盐、哌嗪盐、四甲基胺盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐。以及，(ii) 本发明所提供的多肽偶联物中存在的碱性官能团（例如-NH2）与适当的无机或者有机阴离子（酸）形成的盐，并且包括但不限于，氢卤酸盐，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐等；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；低级烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐等；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐、对苯磺酸盐等；有机酸盐，如醋酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等；氨基酸盐，如甘氨酸盐、三甲基甘氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐等。
本发明的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成，例如在Pharmaceutical Salts:Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl(Editor), Camille G.Wermuth(Editor), ISBN:3-90639-026-8, Hardcover, 388pages,August 2002中所述的方法。通常，这种盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸在水或有机溶剂中，或在两者的混合物中反应来制备。
药物组合物及治疗应用
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一方面，本发明提供了本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。还提供了用于在受试者中预防和/或治疗疾病的方法，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物。
在某些实施方案中，所述疾病为Jun相关疾病。
在某些实施方案中，所述疾病以Jun的过表达或过度的Jun活性为特征。
在某些实施方案中，所述Jun相关疾病涉及Jun过表达。Jun过表达是指Jun水平（例如受试者的血浆中或组织中优选心肌组织中存在的Jun水平）高于正常Jun水平（例如健康对照的相应水平）。
在某些实施方案中，所述Jun相关疾病将受益于Jun水平降低或表达抑制。
在某些实施方案中，本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物通过降解Jun蛋白从而预防或治疗所述疾病。
在某些实施方案中，所述疾病为射血分数保留的心衰（HFpEF）。
在某些实施方案中，所述受试者为人。
本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物可以单独使用，也可以与另外的药学活性剂联合使用。
本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂（包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液）、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的活性成分，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。
本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部（如，粉剂、药膏或滴剂），或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药（例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射）。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物通过静脉注射或推注给予。
本发明的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或药物组合物可以以剂量单位形式配制以易于施用。剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的经计算与所需的药物载体联合以产生的期望的治疗效果的活性成分。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“射血分数保留的心衰（HFpEF）”是指在心室收缩功能正常或轻度减低的情况下，心室舒张功能受损和顺应性减低使心室充盈减少和充盈压升高，从而导致肺循环和体循环淤血的一类临床综合征。HFpEF典型地是指舒张功能障碍的心衰。在某些实施方案中，HFpEF的临床诊断标准主要包括：（1）存在心衰的症状和（或）体征；（2）心脏影像学检查（主要指TTE检查）提示LVEF ≥ 50%；（3）存在与左心室舒张功能不全和（或）左心室充盈压升高一致的心脏结构和（或）功能异常的客观证据，其中左心室舒张功能不全和(或)心室充盈压升高的结构和(或)功能异常指标主要包括：（a）平均E/e'比值>15；（b）左心房容积指数＞40 ml/m2(心房颤动)。
如本文中所使用的，术语“Jun”是指Jun原癌基因,AP-1转录因子亚基（Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit），也称为AP1、AP-1、cJUN或c-Jun。Jun可以是人源的，也可以是来自其它物种（例如，非人哺乳动物、鱼、爬行动物或鸟，例如啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、灵长类等）的同源基因。Jun的序列是本领域技术人员熟知的，可参见各种公共数据库，人Jun的示例性基因序列可参见GenBank: NM_002228.4，示例性蛋白序列可参见NCBI: NP_002219.1；小鼠Jun的示例性基因序列可参见Ensembl：ENSMUSG00000052684，NCBI Gene ID: 16476，示例性蛋白序列可参见UniProtKB: P05627，NCBI: NP_034721.1。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed.Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。
如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定（即，不再恶化）疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状（无论部分或全部），无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比（如果未接受治疗），延长存活期。
如本文中所使用的，术语“有效量”至少是实现特定病症的可测量改善或预防需要的最小浓度。本文中的有效量可以随诸如患者的疾病状态，年龄，性别，体重等因素而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或不利效果的量。为了预防性使用，有益或期望的结果包括如下的结果，诸如消除或降低风险，减轻严重性，或者延迟疾病的发作，包括疾病的生物化学，组织学和/或行为症状，其并发症和疾病形成期间呈现的中间病理学表型。为了治疗性使用，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减少源自疾病的一种或多种症状，提高那些患有疾病的对象的生命质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，增强另一种药物的效果(诸如经由靶向)，延迟疾病的进展，和/或延长存活。可以在一次或多次施用中施用有效量。
有益效果
本申请的发明人首次提供了能够遏制HFpEF的发生发展并改善舒张功能的多肽偶联物，对于HFpEF的预防和治疗具有重要的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1：HFpEF模型的构建。A：实验流程示意图；B：小鼠喂养5周后舒张功能（E/A）的检测结果；C：小鼠喂养5周后舒张功能（E/E’）的检测结果。
图2：HFpEF小鼠模型的Jun表达情况。
图3A-图17A：多肽偶联物的HPLC图谱。
图3B-图17B：多肽偶联物的MS图谱。
图18-图19：多肽偶联物在细胞水平的降解活性评价。
图20：多肽J7在HFpEF小鼠模型中的体内疗效评价。A：实验流程示意图；B：舒张功能（E/E’）的检测结果。
序列信息
本申请涉及的序列的描述提供于下表中。
表1：序列信息。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本申请所要求保护的范围。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：Jun的表达与HFpEF存在相关性。
实验材料及方法
动物：C57BL/6N野生型小鼠购自北京维通利华。
试剂如下所示。
表2：试剂信息。
动物实验准则
本实施例中，所有动物研究均根据中国国家心血管病中心阜外医院动物保健和使用委员会实验动物中心的指导下进行。所有小鼠均在同一环境下进行扩繁和饲养，实验过程将小鼠随机分组。超声心动图分析由不知道研究目标的的独立研究者进行。
常规超声检测
所有小鼠在不同条件下喂养五周之后开始进行常规超声检测，每隔两周测一次，一直到十五周检测结束。具体地，使用配备MS400换能器(Visual Sonics)的VisualSonicsVevo 2100系统进行经胸超声心动图。左心室射血分数（LVEF）和其他收缩功能指标是从心室中部水平的短轴M型扫描获得的，如乳头肌的存在所表明的，在有意识的、轻轻约束的小鼠中。在麻醉小鼠中获得心尖四腔视图，用于在二尖瓣水平使用脉冲波和组织多普勒成像进行舒张功能测量。麻醉由2.5%异氟醚诱导，并通过对其中一只后爪上的坚定压力缺乏反应来证实。在超声心动图采集期间（在体温控制条件下）异氟烷降低至1.0-1.5%，并进行调整以将心率保持在每分钟500次的范围内。收集的参数包括：心率、左心室舒张末期直径、左心室收缩末期直径、舒张末期室间隔壁厚度、左心室舒张末期后壁、左心室缩短分数、LVEF、多普勒血流峰值舒张早期穿过二尖瓣的速度、舒张晚期穿过二尖瓣的峰值多普勒血流速度、等容舒张时间、舒张早期和早期充盈减速时间二尖瓣环处心肌松弛速度的组织多普勒峰值。在程序结束时，所有小鼠都从麻醉中恢复过来，没有任何异常。所有参数至少测量3次，并给出平均值。超声检测包括收缩功能及舒张功能检测。
射血分数保留的心衰模型诱导
八周龄到十周龄雄性C57BL/6N野生型小鼠被分为三组，即正常组（正常饮食饮水），模型组（高脂饮食配合给予N-硝基-L-精氨酸甲酯）。其中，模型组通过以下文献记载的方式进行造模：Gabriele G. Schiattarella等人，Nitrosative stress drives heartfailure with preserved ejection fraction，https://doi.org/10.1038/s41586-019-1100-z。具体地，使用高脂饮食(HFD) (60%千卡，来自脂肪(猪油))和N-硝基-L-精氨酸甲酯（缩写为L-NAME，于饮用水中0.5g/L）的方式来诱导射血分数保留的心衰，得到HFpEF动物模型。
在模型诱导第五周检测小鼠的收缩功能参数LVEF并没有发生变化，而舒张功能参数（E/E’）在模型诱导第五周时显著升高，表明已成功获得了前述文献所记载的射血分数保留的心衰模型，同时，五周时模型对照组和模型治疗组舒张功能参数（E/E’）无显著区别，在基线相同的情况下进行后续给药处理，如图1所示。
Jun的表达与HFpEF的相关性
在模型诱导到15周的时候，采用灌流的方法将正常小鼠和小鼠HFpEF动物模型的心肌细胞提取分离，进行定量RCR检测具体操作如下。
1、成年鼠心肌细胞分离：
为了从成年小鼠心脏中分离心肌细胞，我们采用经典的灌流的方法分离心肌细胞。具体小鼠在处死前20分钟向小鼠注射100μl肝素钠（在50ml中1000个单位）以防止操作过程中心脏凝血增大消化难度，之后，将小鼠麻醉，处死，取出心脏将心脏转移到无钙液中进行洗涤，之后使用Langendorff的方法进行消化，使用Langendorff装置用无钙液灌注心脏5分钟，然后用消化酶液（0.7mg / ml II型胶原酶和0.7mg / ml牛血清白蛋白无钙液）消化大约30分钟，大约20分钟的时候不断去触碰心脏，当心脏变软变滑表明消化基本结束，之后收集来自心室的组织，剪碎，并轻轻吹打解离成单个细胞，静置沉降，取上清，去掉没消化的及粘连的组织，100g 4℃ 离心2分钟，得到心肌细胞沉淀，上清则大部分为非心肌细胞，心肌细胞用含有10%FBS的无钙液重悬，用于后续实验，非心肌细胞可以用培养基或者PBS重选用于后续实验，如果为了得到更纯的心肌细胞和非心肌细胞，可以将细胞悬浮液离心（100g，室温下2分钟）三次，以将心肌细胞与非心肌细胞分离。收集心肌细胞用于进一步的实验。
2、定量PCR检测：
使用GeneJet RNA纯化试剂盒（Thermo Scientific，K0732）从细胞中提取总RNA，并使用iScript TM cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，1708890）逆转录0.1μg总RNA以产生cDNA，使用ABI Vii7实时系统（Life Technologies，Q6）上的iTaqUniversl SYBR Green supermix（1725121，Bio-Rad）进行qPCR（引物F为SEQ ID NO: 29；引物R为SEQ ID NO:30），b-Actin，用于标准化定量分析。如图2所示，与正常小鼠对比，在小鼠HFpEF动物模型中显著地观察到Jun的高表达。这表明，在小鼠中Jun的表达量与HFpEF存在相关性，在HFpEF中，Jun是高表达的。
实施例2：多肽偶联物的制备。
委托无锡亚肽生物科技有限公司合成表3中所述的多肽偶联物，其中，各多肽偶联物的N端连接生物素。多肽合成采用标准的Fmoc固相合成方法。选用Rink Amide树脂，通过脱保护、反应，使肽链由C端向N端延长合成。环肽使用四(三苯基膦)钯和 N ,N二甲基巴比妥酸的下脱去Alloc和Allyl保护基，在六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷,1-羟基苯并三唑以及N-甲基吗啡啉溶液中进行关环反应，侧链酰胺成环。取适量树脂于EP管中，加入1-2mL的TFA/TIPS/H2O/EDT剪切液震荡反应 1-2h，TFA、TIPS、H2O、EDT的体积比为94:1:2 .5:2 .5，用氮气把剪切液吹干，然后加入乙醚沉淀两分钟，离心弃去上清，沉淀的多肽于空气中挥干乙醚。J1、J4-J7、H1、H3、H6使用色谱柱Gemini 5 μm NX-C18 110A、其余多肽使用色谱柱YMC-Pack C4在高效液相色谱（HPLC）进行纯化，HPLC条件可以典型地包括：溶剂A：0.1%三氟乙酸溶于100%乙腈；溶剂B：0.1%三氟乙酸溶于100%水；梯度：0.01分钟：20%（A）、80%（B）；25分钟：80%（A）、20%（B）；25.01分钟：100%（A）、0%（B）；30分钟：停止；流速：1.0 毫升/分钟；波长：220 纳米；体积：20ul。使用液相色谱质谱联用仪（Agilent-6125B）质谱确证分子量，冻干得到多肽粉末。各多肽的HPLC图和MS图如下表中所示。
表3：多肽序列。
实施例3：多肽偶联物对Jun的降解活性评价。
1、多肽偶联物的Jun蛋白降解效果评价：将多肽偶联物与乳大鼠心肌细胞共孵育，设置浓度梯度或时间梯度，收集样品，分别使用免疫印迹实验（WB）和免疫荧光实验（IF）来分析候选多肽偶联物在乳大鼠心肌细胞中的降解效果。
多肽偶联物J1-J7的结果如图18所示。其中，WB结果如图18A-18C所示，IF结果如图18F-18G所示，多肽J7可以随着时间和浓度逐渐降解Jun蛋白，显示出显著的降解Jun蛋白的活性。多肽偶联物J8-J11以及H1-H6的WB结果如图19所示。
2、多肽偶联物对mRNA的影响：将多肽偶联物加入乳大鼠心肌细胞孵育，将不同浓度的多肽偶联物处理细胞后，提取细胞的RNA，通过荧光定量PCR实验检测基因c-jun，内参基因GAPDH的变化，评估稳定多肽降解剂对c-jun基因转录的影响。
qPCR结果如图18D-18E所示，发现J7多肽降解Jun蛋白不会影响其mRNA水平的变化。
实施例4：多肽偶联物的体内疗效评价。
使用实施例1中所述的HFD+L-NAME方法诱导的HFpEF动物模型，在获得动物模型后，即自诱导HFpEF模型的第五周起，对模型治疗组使用J7多肽对小鼠进行处理，对模型对照组用不含药物的溶剂PBS进行对照处理，诱导全程同时加以正常饮食和饮水的小鼠作为阴性对照。小鼠饲养到5周的时候进行给药处理，对于处理组，J7多肽按照100 mg/kg隔日腹腔注射给药；对照组给等体积的PBS溶液，除此以外其它处理方式相同。
结果如图20所示，在使用J7多肽处理后，HFpEF小鼠的舒张功能显著改善，可恢复至阴性对照小鼠的正常水平；但在没有用J7处理的模型对照组小鼠中，则观察到舒张功能的持续恶化。这表明作为J7多肽能够在小鼠HFpEF模型中对HFpEF产生预防和治疗的作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (5)

1. 一种多肽偶联物或其药学上可接受的盐，其包含：(a)降解诱导配体、(b)环肽、以及(c)Jun蛋白靶向肽；其中，所述Jun蛋白靶向肽选自SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 25；其中，所述多肽偶联物的序列如SEQ ID NO: 5-9、11-13任一项所示。
2.权利要求1所述的多肽偶联物或其药学上可接受的盐，其中，所述多肽偶联物在其N端包含可检测的标记。
3.权利要求2所述的多肽偶联物或其药学上可接受的盐，其中，所述可检测的标记为生物素。
4.药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的多肽偶联物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
5.权利要求1-3任一项所述的多肽偶联物或其药学上可接受的盐或权利要求4所述药物组合物在制备用于治疗射血分数保留的心衰（HFpEF）的药物中的用途。
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