CN118240832A - 一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1及其应用 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明提供一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1及其应用，尤其是在调控水稻孕穗期耐冷性和培育孕穗期耐冷的水稻株系等中的应用，属于基因工程技术领域。本发明首次发现水稻孕穗期耐冷基因OsACT1能够正向调控水稻孕穗期耐冷性，且受到启动子区域DNA甲基化的调控，通过过表达OsACT1或者去除OsACT1上游DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平可以提高水稻孕穗期耐冷性，进而有助于提高水稻低温胁迫下的产量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种水稻孕穗期耐冷基因(命名为OsACT1，本文中也简称ACT1)及其应用，尤其是在调控(尤其是提高)水稻孕穗期耐冷性和培育孕穗期耐冷的水稻株系等中的应用，还提供一种培育孕穗期耐冷的水稻株系的方法。
背景技术
水稻是一种重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以其为主食。黑龙江省是我国重要的商品粮基地，但由于地处高纬度地区，发生在水稻孕穗期的障碍型冷害一直是水稻生产的重要限制因子，孕穗期的耐冷性也成为黑龙江省水稻品种审定的重要指标。因此，鉴定耐冷基因并解析其分子调控网络，进而高效快速培育耐冷水稻品种，对于防范障碍型冷害，保证国家粮食安全具有十分重要的现实意义。
水稻障碍型冷害发生在对低温敏感的生殖生长阶段，会造成花粉发育不良，授粉、受精过程受阻，胚发育停止等，造成结实率降低而引起减产。因此，为了提高水稻的产量，保证粮食安全，亟需挖掘水稻孕穗期耐冷基因，以解决水稻孕穗期障碍型冷害问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明首次发现水稻基因OsACT1能够正向调控水稻孕穗期耐冷性，且受到启动子区域DNA甲基化的调控，因此可以通过过表达OsACT1基因或者靶向去除OsACT1基因上游DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平来提高水稻孕穗期耐冷性，进而提高水稻低温胁迫下的产量。本发明主要通过以下技术方案实现。
第一方面，本发明提供一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1在调控水稻孕穗期耐冷性中的应用，其中所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述调控优选为提高，可选通过提高所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1在水稻中的表达量(例如提高5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上或50％以上，或甚至提高100％以上、200％以上、300％以上或400％以上，其中所述提高是相对于野生型水稻中OsACT1的天然表达水平)，或通过去除所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的启动子区域DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平(例如降低5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上或50％以上，其中所述降低是相对于水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的启动子区域的天然DNA甲基化水平)，来提高水稻孕穗期耐冷性。
第二方面，本发明提供一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1或包含水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的表达盒/表达载体/重组微生物在提高水稻孕穗期耐冷性中的应用，其中所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列；优选通过提高所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1在水稻中的表达量，或通过去除所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的启动子区域DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平，来提高水稻孕穗期耐冷性。
第三方面，本发明提供一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1或包含水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的表达盒/表达载体/重组微生物在培育孕穗期耐冷的水稻株系中的应用。
第四方面，本发明提供一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1编码的蛋白在提高水稻孕穗期耐冷性中的应用。
第五方面，本发明提供一种培育孕穗期耐冷的水稻株系的方法，其中所述方法包括利用转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使水稻表达或过表达孕穗期耐冷基因OsACT1。
在一些实施方式中，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的重组表达载体导入水稻，获得所述孕穗期耐冷的水稻株系。
第六方面，本发明提供一种培育孕穗期耐冷的水稻株系的方法，其中所述方法包括利用基因编辑技术将靶向去除水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的启动子区域DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平的载体转化到受体水稻中，提高所述受体水稻中OsACT1基因在低温胁迫下的表达量，得到孕穗期耐冷的水稻株系。
以上第三方面至第六方面中，所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列。
第七方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的多肽的多核苷酸以及修饰的启动子，其中所述修饰的启动子与野生型水稻中对应于SEQ ID NO:1所示的水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的天然启动子相比具有降低(例如降低5％以上，10％以上、20％以上、30％以上、40％以上或50％以上)的DNA甲基化水平或没有DNA甲基化修饰，优选地，所述分离的核酸分子包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
第八方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含本发明第七方面提供的分离的核酸分子，或编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作连接的用于使所述多肽在表达宿主中表达或过表达的一个或多个启动子序列。
第九方面，本发明提供一种重组细胞，其包含本发明第八方面提供的核酸构建体。
本发明第七方面提供的分离的核酸分子、第八方面提供的核酸构建体或第九方面提供的重组细胞在提高水稻孕穗期耐冷性或培育孕穗期耐冷的水稻株系中的应用也属于本发明的内容。
基于以上技术方案，本发明提供了一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1及其在水稻的遗传育种和调控(尤其是提高)水稻孕穗期耐冷性等中的应用。本发明首次发现了OsACT1基因为水稻孕穗期耐冷基因，且其自身表达水平受到DNA甲基化的调控。本发明为水稻育种提供新的基因资源和育种资源，并可用于研究水稻孕穗期耐冷机理和发现更多的调控水稻孕穗期耐冷的基因，对于通过遗传育种和基因工程方法利用该基因资源有效地提高水稻孕穗期耐冷性具有重要的应用价值。
附图说明
图1为水稻OsACT1基因CRISPR/Cas9敲除株系的测序鉴定结果，其中A幅为序列缺失情况，B幅为测序峰图。
图2为水稻OsACT1基因CRISPR/Cas9敲除株系及其对照在常温条件下和冷处理条件下的结实数量照片(A)和结实率统计结果(B)。
图3为水稻OsACT1基因过表达株系的OsACT1表达量检测结果。
图4为水稻OsACT1基因过表达株系及其对照在常温条件下和冷处理条件下结实率统计结果。
图5为水稻品种KD8经过连续4代处理(常温和冷处理)所得自交结实种子发育的水稻株系在常温条件下和冷处理条件下结实率统计结果(A)和分别从KD8-4N和KD8-4C在常温条件下自交结实后代开始经过连续5代处理(常温)所得自交结实种子发育的水稻株系在常温条件下和冷处理条件下结实率统计结果(B)。
图6为水稻品种KD8(KD8-4N株系)和经历4代冷处理的KD8-4C材料OsACT1基因启动子区域DNA甲基化株系的检测结果。
图7为水稻品种KD8(KD8-4N株系)和经历4代冷处理的KD8-4C材料在常温条件下和冷处理条件下OsACT1表达量检测结果。
图8为靶向去除水稻OsACT1基因启动子区域DNA甲基化株系的检测结果。
图9为靶向去除水稻OsACT1基因启动子区域DNA甲基化株系及其对照在常温和冷处理条件的结实率统计结果。
图10为靶向去除水稻OsACT1基因启动子区域DNA甲基化株系及其对照在常温和冷处理条件的OsACT1表达量检测结果。
图11显示水稻OsACT1基因启动子区域DNA甲基化的自然变异情况。
图12显示水稻OsACT1基因启动子区域DNA甲基化与水稻品种耐冷性相关性。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均自常规生化试剂商店购买得到。
以下实施例中涉及的核苷酸或氨基酸序列均可通过已有技术合成。实施例中所用到的质粒pYLgRNA-U6和pYL-MH载体均由申请人实验室保存，构建方法可参考文献(MaXingliang等人,A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants[J],2015,Mol Plant)。
实施例1：水稻孕穗期调控基因OsACT1的生物学功能验证
1.1、水稻基因OsACT1敲除植株的获得
(1)引物设计
将水稻的OsACT1基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)输入CRISPR GE网站(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)进行在线引物设计。结果设计得到1对靶位点引物(如下正向引物F1和反向引物R1)，用于后续OsACT1基因敲除载体的构建。
正向引物F1：5'-gccgAGGCGTCGTCACTGGCGGCT-3'(SEQ ID NO:3)；
反向引物R1：5'-aaacAGCCGCCAGTGACGACGCCT-3'(SEQ ID NO:4)。
(2)水稻OsACT1基因CRISPR/Cas9敲除载体(以下也简称敲除载体)的构建
2.1)分别将上述步骤(1)设计的正向引物F1和反向引物R1加水稀释到100μM，并按照下表1所示的退火体系将引物进行退火，形成退火双链引物，其中退火操作为：使用PCR仪加热95℃孵育5分钟，之后关闭电源自然冷却至室温。
表1：引物退火体系
| 正向引物(100μM) | 1μL |
| 反向引物(100μM) | 1μL |
| ddH2O | 98μL |
2.2)按照下表2配制sgRNA表达盒连接反应体系，并使用PCR仪循环反应5个循环：37℃5min，20℃5min，得到连接产物。
表2：sgRNA表达盒连接反应体系
| 10×Cutsmart buffer(NEB) | 1μL |
| 10×T4 DNA ligase buffer(NEB) | 0.2μL |
| pYLgRNA-U6质粒 | 1μL |
| 退火双链引物 | 1μL |
| BsaI(NEB) | 0.25μL |
| T4 DNA ligase(NEB) | 0.1μL |
| ddH2O | 6.45μL |
2.3)以上述步骤2.2)得到的连接产物为模板进行第一轮PCR反应。以通用正向引物U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO:5)和反向引物R1扩增连接产物的前半部分片段，另外以正向引物F1和通用反向引物gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQID NO:6)扩增连接产物的后半部分片段。其中第一轮PCR反应的体系如下表3所示，PCR反应程序为：95℃，3min；(95℃，20s；60℃，20s，72℃，20s)30个循环，72℃，5min，4℃保持。最终得到两个第一轮PCR产物。
表3：第一轮PCR反应体系
| 2×Phanta max buffer(诺唯赞) | 7.5μL |
| 连接产物 | 1μL |
| dNTPs(各自为10mM)(诺唯赞) | 0.3μL |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞) | 0.3μL |
| 正向引物(5μM) | 0.6μL |
| 反向引物(5μM) | 0.6μL |
| ddH2O | 4.7μL |
2.4)分别将上述步骤2.3)所得两个第一轮PCR产物稀释10倍，使用正向引物B1’5’-TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO:7)和反向引物BL：5’-AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO:8)进行第二轮PCR反应。其中第二轮PCR反应的体系如下表4所示，PCR反应程序为：95℃，3min；(95℃，20s；60℃，20s，72℃，20s)30个循环，72℃，5min，4℃保持。最终得到第二轮PCR产物。
表4：第二轮PCR反应体系
2.5)按照下表5配制酶切反应体系，以将上述步骤2.4)所得第二轮PCR产物与终载体pYL-MH进行酶切，得到酶切片段。具体操作为：37℃酶切10分钟。之后向酶切反应体系中加入0.5μL 10×T4 DNA ligase buffer和0.2μL T4 DNA ligase进行连接反应，使用PCR仪设置程序：(37℃，5min；10℃，5min，20℃，5min)15个循环。
表5：酶切反应体系
| 第二轮PCR产物 | 0.5μL |
| pYL-MH载体 | 1μL |
| BsaI(NEB) | 0.5μL |
| 10×Cutsmart buffer(NEB) | 1.5μL |
2.6)将上述步骤2.5)所得连接产物转化大肠杆菌DH5α，测序正确后构建得到水稻OsACT1基因CRISPR/Cas9敲除载体。
(3)敲除载体转化农杆菌EHA105：将EHA105感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；将10ng敲除载体质粒加入100μL EHA105感受态中，冰上放置20min；使用电激法进行转化，电激后加入200μL无抗液体LB培养基，置于摇床中，28℃，200rpm孵育1h；将菌液全部涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)和利福平(100μg/mL)的LB固体培养基上，28℃倒置培养2天。待长出菌落后，挑取单个阳性克隆至加有卡那霉素(50μg/mL)和利福平(100μg/mL)的液体LB培养基中，28℃，180rpm培养16h，此时的菌液即为经敲除载体转化的农杆菌菌液，其可以用30％的甘油按1:1的体积比进行保存，存至-80℃冰箱，侵染愈伤组织时，从-80℃取出进行活化即可。
(4)经敲除载体转化的农杆菌侵染水稻愈伤组织：从-80℃冰箱取出步骤(3)获得的目的存菌，按1:100的比例加入含有卡那霉素(50μg/mL)和利福平(100μg/mL)的液体LB培养基中，180rpm，28℃培养过夜；将菌液培养至OD值为0.5左右，从培养箱中取出；取500μL左右菌液至1.5mL离心管中，5000rpm，28℃，离心3min，弃上清，用300μL含有20μg/mL的乙酰丁香酮的液体共培养培养基(AAM基础培养基(酷来搏，PM1961)，含有1mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，0.2mg/L KT(激动素)，20mg/L乙酰丁香酮(pH调至5.8))轻轻将菌块重悬，使其均匀的悬浮在液体共培养培养基中；挑选生长状态良好的水稻愈伤组织(来源于孕穗期耐冷水稻基因型KD8-4C株系的种子(其中孕穗期耐冷水稻基因型KD8-4C株系的获得方式在以下实施例3中详述)至50mL离心管中，大约至离心管刻度5mL左右；加入20mL含有20μg/ml的乙酰丁香酮的液体共培培养基，然后将上述悬浮好的300μL菌液全部加入到50mL离心管中；持续轻柔震荡2～3min，以进行侵染。将液体共培养培养基倒掉，然后将侵染好的愈伤组织转移至铺有滤纸的培养皿中，吸附多余的培养基；在平皿上铺一层滤纸，然后将上述侵染好的愈伤组织转移至滤纸上；22℃暗培养2～3天。
(5)被侵染水稻愈伤组织的恢复培养：被侵染的愈伤组织暗培养2～3天后，将由此获得的愈伤组织转移至50mL离心管中；用含有400μg/mL羧卞青霉素的灭菌水清洗愈伤组织4～5遍，每次持续1min左右，进行除菌；再用无菌水清洗愈伤组织2～3遍，转移至铺有滤纸的培养皿上，吸干多余水分；将上述愈伤组织转移至含有400μg/mL羧卞青霉素的筛选培养基(NB基础培养基盐(酷来搏，PM1301)，含有0.3mg/L酪蛋白，0.5mg/L脯氨酸，2mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，4g/L植物凝胶，400μg/mL羧卞青霉素，加入50μg/mL潮霉素(作为筛选剂)(pH调至5.8))上，28℃人工气候培养箱中暗培养30天左右。
(6)抗性水稻愈伤组织的分化培养：将筛选培养基上的抗性愈伤组织转移至分化培养基(MS基础培养基盐(Phytotech labs，M519)，含有2mg/L酪蛋白，30g/L山梨醇，30g/L蔗糖，4.3g/L植物凝胶，2mg/L KT，0.02mg/L NAA(萘乙酸)(pH调至5.8))上，每瓶移至一簇愈伤组织；将其置于28℃人工气候培养箱(24h光培养)中培养30天左右，即可分化出转基因水稻植株。
对再生出的转基因水稻植株进行基因型鉴定，鉴定到2种不同的OsACT1基因敲除类型，如图1中的敲除株系1和敲除株系2的序列缺失情况(图1中A幅)及测序峰图(图1中B幅)所示，可见敲除株系1相对于对照(KD8-4C株系)缺失4bp，敲除株系2相对于对照缺失23bp。
1.2、对水稻基因OsACT1敲除植株进行孕穗期冷处理
对孕穗期耐冷水稻基因型KD8-4C株系(作为对照)，和该实施例鉴定得到的两个不同的OsACT1基因敲除株系(敲除株系1和敲除株系2)进行孕穗期冷处理。具体为：在水稻分蘖生长到水稻的剑叶与倒二叶叶枕距为-5～-2cm(即花药处于减数分裂期至单核期)时，在控温日光温室对水稻进行15℃低温处理7天、处理结束后转移回正常的生长条件，在成熟时统计结实率。水稻孕穗期冷处理后结实率结果如图2中A和B幅所示，其中图2中A幅为水稻孕穗期冷处理后结实数量照片，图2中B幅为水稻孕穗期冷处理后结实率统计结果。
由图2中A和B幅所示结果可见敲除株系1和敲除株系2经冷处理后的结实率均显著低于对照KD8-4C，表现为敲除株系1和敲除株系2的水稻实粒数量均显著低于对照KD8-4C，且敲除株系1和敲除株系2的水稻空粒数量均显著高于对照KD8-4C。这一结果表明，OsACT1基因对于水稻孕穗期耐冷是必需的，OsACT1基因很可能正向调控水稻孕穗期耐冷性。
实施例2：过表达OsACT1基因增强水稻孕穗期耐冷性
2.1、OsACT1基因过表达载体的构建
2.1.1)以水稻品种KD8的cDNA为模板，参照诺唯赞公司的Phanta Super-FidelityDNA Polymerase操作说明书，使用下列引物对F2和R2，和下表6所示的PCR反应体系，以水稻幼穗cDNA为模板扩增OsACT1基因的CDS序列，得到扩增片段。其中PCR反应程序为：95℃，3min；(95℃，20s；60℃，20s，72℃，30s)32个循环，72℃，5min，4℃保持。
正向引物F2：5'-actctagaggatcaattc atggcgcgcctccacctcg-3'(SEQ ID NO:9)；
反向引物R2：5'-atccttgtaatctcccat gtagaacgccgcgacggctg-3'(SEQ ID NO:10)。
表6：PCR反应体系
| 2×Phanta max buffer(诺唯赞) | 25μL |
| 水稻幼穗cDNA | 3μL |
| dNTPs(10mM each)(诺唯赞) | 1μL |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞) | 1μL |
| 正向引物(10μM) | 2μL |
| 反向引物(10μM) | 2μL |
| ddH2O | 16μL |
2.1.2)使用SacI和BamHI限制性内切酶对XF426m载体(由申请人实验室保存，参见Zu X,等人.A mitochondrial pentatricopeptide repeat protein enhances coldtolerance by modulating mitochondrial superoxide in rice[J].NatureCommunications,2023,14(1):6789。该XF426m载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，由玉米Ubiquitin启动子驱动)进行酶切，得到酶切的片段化载体。具体为按照下表7配制酶切体系，并37℃酶切过夜。
表7：酶切体系
| XF426m载体质粒 | 1μg |
| 10×Cutsmart buffer(NEB) | 5μL |
| SacI(NEB) | 1μL |
| BamHI(NEB) | 1μL |
| ddH2O | 补至50μL |
2.1.3)将上述步骤2.1.1)扩增获得的片段和上述步骤2.1.2)酶切的片段化载体使用诺唯赞试剂盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2(诺唯赞，C116-01)进行同源重组连接，得到连接产物。连接体系如下表8所示，连接方法为：50℃连接30分钟。
表8：连接体系
| 2×CE mix(诺唯赞) | 5μL |
| 片段化载体 | 1μL |
| OsACT1 CDS片段(扩增片段) | 1μL |
| ddH2O | 3μL |
2.1.4)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，测序正确后构建获得OsACT1基因过表达载体。
2.2、OsACT1基因过表达载体转化水稻品种KD8
将上述步骤2.1构建完成的OsACT1基因过表达载体按照实施例1的1.1中步骤(3)-(6)的农杆菌介导的转化方法转化水稻品种KD8，并对于再生出的转基因植株进行OsACT1基因表达量检测，筛选鉴定到2个OsACT1基因表达量高的过表达株系(过表达株系1和过表达株系12)进行孕穗期冷处理(具体操作方法见实施例1中1.2)，具体操作如实施例1中1.2中所述。OsACT1基因表达量的检测结果如图3所示(纵坐标的相对表达量是以水稻Ubiquintin基因作为内参，基因号是LOC_Os01g22490，下同)，对过表达株系冷处理后的结实率的统计结果如图4所示。
由图3可见，在常温和冷处理条件下，过表达株系1和过表达株系2中OsACT1基因的表达量均显著高于对照(野生型水稻品种KD8)，其中相对于对照，过表达株系1中OsACT1基因的表达量提高约5-10倍，过表达株系2中OsACT1基因的表达量提高约15-25倍，也可见相对于过表达株系1，过表达株系2中OsACT1基因的表达量进一步显著提高。由图4可见，在常温条件下，过表达株系1、过表达株系2和对照植株的结实率基本相同，然而在冷处理条件下，过表达株系1和过表达株系2的结实率显著高于对照植株，尤其是过表达株系2的结实率更是显著高于过表达株系1的结实率，这进一步证明了OsACT1基因可以正向调控水稻孕穗期耐冷性，其过表达可以增强水稻孕穗期耐冷性，并且表达量越高，可能越有利于提高水稻孕穗期耐冷性，进而提高其在低温胁迫下的结实率。
实施例3：靶向去除OsACT1基因上游DNA甲基化可以提高水稻孕穗期耐冷性
3.1、孕穗期耐冷水稻基因型KD8-4C的获得及其OsACT1基因上游DNA甲基化水平
对水稻品种KD8进行连续多代的孕穗期冷处理(具体操作方法见实施例1中1.2)，收获上一代次水稻株系经冷处理后的自交结实种子产生下一代次，同时收获上一代次水稻株系在常温条件下(即不经冷处理)的自交结实种子产生下一代次作为对照。在连续进行4代冷处理后，鉴定到一个孕穗期耐冷性提高的水稻株系(命名为KD8-4C)，如图5中A幅所示(图中NS表示没有显著差异)，其中KD8-1N至KD8-4N表示由未经过冷处理的自交结实种子发育的水稻株系，例如KD8-1N是由KD8在常温条件下的自交结实种子发育而来，KD8-2N是由KD8-1N在常温条件下的自交结实种子发育而来，以此类推；KD8-1C至KD8-4C表示由冷处理后的自交结实种子发育的水稻株系，例如KD8-1C是由KD8在冷处理条件下的自交结实种子发育而来，KD8-2C是由KD8-1C在冷处理条件下的自交结实种子发育而来，以此类推。可见在冷处理条件下，KD8-3C和KD8-4C株系的结实率显著高于KD8-3N和KD8-4N，并且KD8-3C和KD8-4C株系的结实率基本相当，表明KD8-3C和KD8-4C株系的孕穗期耐冷性相对于水稻品种KD8明显提高。为了验证KD8-4C株系的孕穗期耐冷性能是否可以稳定遗传，还分别利用获自KD8-4N在常温条件下的自交结实种子和获自KD8-4C在常温条件下的自交结实种子进行连续传代，其中获得下一代次株系的种子均来自于上一代次株系在常温条件下的自交结实种子，并统计各代次水稻株系在常温和冷处理条件下的结实率，结果如图5中B幅所示，示出了连续传代5次的结实率统计结果，其中KD8-5N是由KD8-4N在常温条件下的自交结实种子发育而来，KD8-6N是由KD8-5N在常温条件下的自交结实种子发育而来，以此类推；KD8-5C是由KD8-4C在常温条件下的自交结实种子发育而来，KD8-6C是由KD8-5C在常温条件下的自交结实种子发育而来，以此类推。明显可见，水稻株系KD8-4C经过连续5代次的传代，其孕穗期耐冷性能稳定保持，且相对于水稻品种KD8及其后代均明显提高，可证明该实施例获得的水稻株系KD8-4C具有明显提高的孕穗期耐冷性，且可以稳定遗传。
在该实施例中，还分析比较了KD8-4C和KD8-4N的全基因组DNA甲基化水平。结果如图6所示，可见OsACT1上游启动子区域DNA甲基化在KD8-4N和KD8-4C中存在差异，在耐冷的KD8-4C品种中OsACT1位点上游表现为低甲基化而在KD8-4N中OsACT1位点上游表现为高甲基化。相对应的，在冷处理的条件下KD8-4N中的DNA甲基化抑制了OsACT1的表达，如图7所示，可见KD8-4N中的OsACT1表达量显著低于KD8-4C中OsACT1的表达量，该结果表明OsACT1的表达可能受到该基因上游启动子区域DNA甲基化的调控，当DNA甲基化水平较高时，OsACT1的表达受到抑制，而当DNA甲基化水平较低时，OsACT1的表达较高，进而会降低或提高水稻孕穗期耐冷性和低温胁迫下的结实率。
3.2、靶向去除DNA甲基化载体的构建
3.2.1)利用靶向DNA甲基化去除编辑技术对水稻品种KD8上游启动子区域的DNA甲基化进行编辑去除，具体以pYLgRNA-U6质粒为模板，参照诺唯赞公司的Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase操作说明书，分别以下列引物对F3+R3和F4+R4进行扩增。其中PCR扩增的体系如下表9所示，PCR扩增的程序为：95℃，3min；(95℃，20s；60℃，20s，72℃，30s)32个循环，72℃，5min，4℃保持。琼脂糖凝胶电泳，回收两个PCR产物，分别命名为OsU6PCR产物1(使用引物F3+R3)和OsU6 PCR产物2(使用引物F4+R4)。
正向引物F3：5'-gacacggggtggtttggttttatgtacagcattacgtagg-3'(SEQ ID NO:12)；
反向引物R3：5'-ctgaactttttgacagtgacAACCTGAGCCTCAGCGCAGC-3'(SEQ ID NO:13)；
正向引物F4：5'-gtcactgtcaaaaagttcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA-3'(SEQID NO:14)；
反向引物R4：5'-catctatgttacgtttgtttgatggtgcttactgtttag-3'(SEQ ID NO:15)。
表9：PCR扩增体系
| 2×Phanta max buffer(诺唯赞) | 25μL |
| pYLgRNA-U6质粒 | 3μL |
| dNTPs(10mM each)(诺唯赞) | 1μL |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞) | 1μL |
| 正向引物(10μM) | 2μL |
| 反向引物(10μM) | 2μL |
| ddH2O | 16μL |
3.2.2)使用PmeI限制性内切酶对靶向去除DNA甲基化的SunTag-dCas9-Tet1cd载体(由申请人实验室保存，参见文献Tang,Shanjie,等人."Targeted DNA demethylationproduces heritable epialleles in rice."Science China.Life sciences 65.4(2022):753-756.)进行酶切，得到酶切的片段化载体。其中酶切体系如下表10所示，酶切的方法为：37℃酶切过夜。
表10：酶切体系
| SunTag-dCas9-Tet1cd | 1μg |
| 10×Cutsmart buffer(NEB) | 5μL |
| PmeI(NEB) | 1μL |
| ddH2O | 补至50μL |
3.2.3)将上述步骤3.2.1)扩增获得的两个PCR产物(OsU6 PCR产物1和OsU6 PCR产物2)和上述步骤3.2.2)酶切的片段化载体使用诺唯赞ClonExpress Ultra One StepCloning Kit V2(诺唯赞，C116-01)进行同源重组连接。其中配制如下表11所示的连接体系，并在50℃连接30分钟，得到连接产物。
表11：连接体系
| 2×CE mix(诺唯赞) | 5μL |
| 片段化载体 | 1μL |
| OsU6 PCR产物1 | 1μL |
| OsU6 PCR产物2 | 1μL |
| ddH2O | 2μL |
3.2.4)将上述步骤3.2.3)获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α，测序正确后构建获得OsACT1靶向去除DNA甲基化载体。
3.3、对OsACT1去甲基化株系进行水稻孕穗期冷处理
将上述步骤3.2构建完成的靶向去除DNA甲基化载体按照实施例1的1.1中步骤(3)-(6)的方法转化水稻品种KD8，对再生出的转基因植株进行DNA甲基化检测，筛选鉴定到2个OsACT1去甲基化株系(分别命名为：去甲基化株系1和去甲基化株系2，均为DNA甲基化水平降低的株系，其中相对于对照的DNA甲基化水平，去甲基化株系1的DNA甲基化水平降低约50％，去甲基化株系1的DNA甲基化水平降低约55％)，如图8所示。
对OsACT1去甲基化株系及其正常对照(水稻品种KD8)进行孕穗期冷处理，具体操作如实施例1中1.2所述。不同株系的结实率统计结果如图9所示。可见，在常温处理条件下，去甲基化株系1、去甲基化株系2和正常对照的结实率基本相同，而当在冷处理条件下时，去甲基化株系1和去甲基化株系2的结实率显著高于正常对照的结实率。该结果表明，靶向去除OsACT1启动子区域DNA甲基化或降低该DNA甲基化的水平可以显著提高冷胁迫条件下的水稻结实率。
还对OsACT1去甲基化株系及其正常对照的OsACT1表达量进行检测，结果如图10所示。可见，在常温处理条件下，去甲基化株系1、去甲基化株系2和正常对照的OsACT1表达量基本相同，而当在冷处理条件下时，去甲基化株系1和去甲基化株系2的OsACT1表达量显著高于正常对照中OsACT1的表达量。该结果表明，靶向去除OsACT1启动子区域DNA甲基化或降低该DNA甲基化的水平可以显著提高冷胁迫条件下的OsACT1表达量，进而可以显著提高冷胁迫条件下的水稻结实率。
以上结果表明，通过靶向去除水稻OsACT1基因上游启动子区域DNA甲基化或降低该DNA甲基化的水平可以显著提高水稻孕穗期耐冷性，进而显著提高冷胁迫条件下的水稻结实率和产量。由此可以提供一种分离的核酸分子(例如从已经靶向去除水稻OsACT1基因上游启动子区域DNA甲基化或降低该DNA甲基化的水平的水稻株系中提取获得的分离的核酸分子)，其包含编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽的多核苷酸以及修饰的启动子，其中所述修饰的启动子与野生型水稻中对应于SEQ ID NO:1所示的水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的天然启动子相比具有降低(例如降低5％以上，10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上或60％以上)的DNA甲基化水平或没有DNA甲基化修饰，可选地，该分离的核酸分子可包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。基于此，本发明还可提供一种核酸构建体，其包含本发明提供的分离的核酸分子，或编码氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的多肽的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作连接的用于使所述多肽在表达宿主中表达或过表达的一个或多个启动子序列(例如玉米Ubiquitin启动子)。基于此，本发明还可提供一种重组细胞，其包含本发明提供的核酸构建体。本发明提供的分离的核酸分子、核酸构建体和重组细胞均可用于提高水稻孕穗期耐冷性或培育孕穗期耐冷的水稻株系。
实施例4：水稻OsACT1基因上游启动子区域DNA甲基化的自然变异情况及其与水稻品种耐冷性的相关性
DNA甲基化是一类在真核生物中广泛存在的表观遗传修饰，对调控基因表达、维持基因组稳定性以及协调生物正常生长发育具有重要的作用。植物的DNA甲基化可发生在CHG和CHH(其中H表示A、T、G三种类型的碱基)的序列上。通常情况下启动子区域的DNA甲基化对基因的表达起到抑制的作用。DNA甲基化的自然变异频率要远高于DNA序列自身的变异，而且在植物中，大部分DNA甲基化是可以在世代交替过程中稳定遗传，这也决定了DNA甲基化变异可以稳定遗传，某些介导优异性状的DNA甲基化变异可成为作物育种的变异源泉。该实施例的目的是研究水稻OsACT1基因启动子区域DNA甲基化的自然变异情况及其与水稻品种耐冷性的相关性，具体操作如下。
该实施例对22种水稻耐冷品种(具体为：中花11、TEJ3、合江1号、东农423、松粳8、龙稻7、富士光、吉粳81、青年特号、梧农七一、吉粳83、延粳19、龙稻3、龙粳14、松粳3、松粳10、白大肚、龙粳16、龙稻5、大粒粘、红芒、白刃，分别命名为耐冷品种1-22)和9种水稻冷敏感品种(具体为：上育397、延粳16、大生产、垦稻12、朴洪根粘稻、三江1号、垦稻8、中牧农8、龙粳11，分别命名为冷敏感品种1-9)的甲基化水平(包括CHH甲基化水平、CG甲基化水平和CHG甲基化水平)进行检测和统计。具体包括以下操作。
4.1、使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根，DP305)提取每一个水稻检测品种的DNA，获得的DNA使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH,D5005)进行重亚硫酸盐处理。处理的DNA使用下列引物对ACT1-F和ACT1-R进行扩增。其中PCR扩增的体系如下表12所示，PCR扩增程序为：95℃，3min；(95℃，20s；55℃，20s，68℃，30s)40个循环，68℃，5min，4℃保持。琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物。
ACT1-F：5’-agtaagatgYYgtgagaaaa-3’(SEQ ID NO:17)
ACT1-R：5’-AACATAACACCTTTTAAAACCATA-3’(SEQ ID NO:18)
表12：PCR扩增体系
| 2×PCR buffer for KOD-Multi&Epi-(东洋纺) | 12.5μL |
| 经过重亚硫酸盐处理的DNA | 2μL |
| ACT1-F(10μM) | 1μL |
| ACT1-R(10μM) | 1μL |
| KOD-Multi&Epi-(东洋纺) | 0.5μL |
| ddH2O | 8μL |
4.2、将上述步骤4.1所得PCR产物使用pEASY-Blunt Cloning Kit(全式金，CB101-01)连接Blunt载体。每个材料挑取15个单克隆进行测序，测序结果使用https://katahdin.girihlet.com/kismeth/revpage.pl网站进行在线分析计算每个胞嘧啶位点(C碱基)的DNA甲基化水平。
结果如图11所示，可见相对于9种水稻冷敏感品种，22种水稻耐冷品种的甲基化水平均较低。另外对水稻品种的OsACT1基因上游的DNA甲基化水平与水稻品种孕穗期耐冷性(以结实率表示)的相关性进行分析，结果如图12所示，可见OsACT1基因上游的DNA甲基化水平与水稻品种的孕穗期耐冷性呈现较高的负相关性(R＝-0.855)，即OsACT1上游DNA甲基化水平越低，水稻品种具有越强的孕穗期耐冷性，表现为冷处理结实率/正常条件的结实率越高。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1在调控水稻孕穗期耐冷性中的应用，其特征在于，所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ IDNO:2所述的氨基酸序列；优选在提高水稻孕穗期耐冷性中的应用，可选通过提高所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1在水稻中的表达量，或通过去除所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的启动子区域DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平，来提高水稻孕穗期耐冷性。
2.一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1或包含水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的表达盒/表达载体/重组微生物在提高水稻孕穗期耐冷性中的应用，其特征在于，所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列；优选通过提高所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1在水稻中的表达量，或通过去除所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的启动子区域DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平，来提高水稻孕穗期耐冷性。
3.一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1或包含水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的表达盒/表达载体/重组微生物在培育孕穗期耐冷的水稻株系中的应用，其特征在于，所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列。
4.一种水稻孕穗期耐冷基因OsACT1编码的蛋白在提高水稻孕穗期耐冷性中的应用，其特征在于，所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或者所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1编码的蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.一种培育孕穗期耐冷的水稻株系的方法，其特征在于，所述方法包括利用转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使水稻表达或过表达孕穗期耐冷基因OsACT1，其中所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列；
可选地，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的重组表达载体导入水稻，获得所述孕穗期耐冷的水稻株系。
6.一种培育孕穗期耐冷的水稻株系的方法，其特征在于，所述方法包括利用基因编辑技术将靶向去除水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的启动子区域DNA甲基化或降低所述DNA甲基化的水平的载体转化到受体水稻中，提高所述受体水稻中OsACT1基因在低温胁迫下的表达量，得到孕穗期耐冷的水稻株系，其中所述水稻孕穗期耐冷基因OsACT1具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列。
7.一种分离的核酸分子，其包含编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽的多核苷酸以及修饰的启动子，其中所述修饰的启动子与野生型水稻中对应于SEQ ID NO:1所示的水稻孕穗期耐冷基因OsACT1的天然启动子相比具有降低的DNA甲基化水平或没有DNA甲基化修饰，优选地，所述分离的核酸分子包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
8.一种核酸构建体，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子，或编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作连接的用于使所述多肽在表达宿主中表达或过表达的一个或多个启动子序列。
9.一种重组细胞，其包含权利要求8所述的核酸构建体。
10.权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的核酸构建体或权利要求9所述的重组细胞在提高水稻孕穗期耐冷性或培育孕穗期耐冷的水稻株系中的应用。
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