CN118225917A - 一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法，属于医药检测分析技术领域，本申请通过利用新冠药中有效成分的特征离子的子离子，使用多反应监测模式，可快速、准确定量药物中抗新冠病毒的有效成分含量；通过对待测样品进行前处理，不仅过程简单还能有效去除杂质干扰，可以同时快速检测并准确定量新冠药中有效成分的，灵敏度高、通量高。
Description
技术领域
本申请涉及医药检测分析技术领域，特别涉及一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法。
背景技术
新冠病毒的流行带来了大量宣称含抗新冠病毒有效成分的仿制药的问世，并导致“假药”风波此起彼伏。从而使得新冠药的真假鉴定方法以及抗新冠病毒有效成分的检测方法成为当下急需，帮助消费者合理用药、降低药物治疗费用。
现有技术所提供的抗新冠病毒有效成分的检测方法，并不能覆盖全部所有抗新冠病毒有效成分，且现有的液相色谱法检测方法，在检测过程中，还存在特异性差、分析时间长，灵敏度低的问题。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请实施例提供了一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法。所述技术方案如下：
提供了一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法，所述方法包括：
对待测样品进行前处理：用研钵或研磨机将新冠药片研磨至粉末状，在甲醇溶液中加入药物样本进行提取，震荡，离心取上清液，上清液稀释后即得待测样品；
富集：将处理后的样品用流动相送至色谱柱进行富集；
分离和洗脱：采用梯度洗脱的模式改变流动相比例将富集后的样品进行分离、依次洗脱至三重四级杆质谱进行检测。
可选的，所述色谱柱为C18(50×2.0mm，3μm)；流动相：A相为含0.05-0.3％甲酸的甲醇，B相为含0.05-0.3％甲酸的水，流速为0.2-0.6mL/min。
可选的，所述液相色谱的进样量为1～30μL，柱温为35-50℃。
可选的，流动相采用梯度洗脱的模式，所述梯度洗脱的模式内，所述流动相比例的改变方式包括：
0-1.0min，流动相中A相与B相的体积比为68:32；
1.0-1.1min，A相与B相体积比由68:32线性变化为85:15；
1.1-3.5min，A相与B体积比为85：15；
3.5-3.6min，A相与B相体积比由85:15线性变化为68:32；
3.6-5.0min，A相与B相体积比为68:32。
可选的，所述将富集后的样品进行分离过程中的离心的条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间5-10min。
可选的，所述三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的质谱条件包括正离子模式，所述三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的扫描方式为多反应监测离子扫描MRM。
可选的，所述检测方法还包括：
根据待测样品，设置所述正离子模式中的目标定量/定性离子对。
可选的，所述检测方法还包括：
根据待测样品，设置所述目标定量/定性离子的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件。
可选的，所述三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的质谱条件包括正离子模式还包括离子源参数，所述离子源参数包括：
电离源为电喷雾电离(ESI)源，反吹气流速为2.5-5.0L/min，干燥气流速为10-15L/min，雾化气流速为1.0-1.5L/min，碰撞气为氮气，其流速为0.20-0.4mL/min，喷雾电压为4500-5500V，干燥气温度450-550℃。
可选的，所述方法还包括：
根据所述待测样品，设置所述待测样品所对应定量离子对的去簇电压、入口电压、碰撞电压以及出口电压；
根据所述待测样品，设置所述待测样品所对应定性离子对的去簇电压、入口电压、碰撞电压以及出口电压。
本申请实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1、通过利用新冠药中有效成分的特征离子的子离子，使用多反应监测模式，可快速、准确定量药物中抗新冠病毒的有效成分含量。
2、通过对待测样品进行前处理，不仅过程简单还能有效去除杂质干扰，可以同时快速检测并准确定新冠药中有效成分的，灵敏度高、通量高。
3、本申请检测方法前处理简单，样本处理时间短，处理单个样本约15min，处理一批(50个)约需要60min，而常用的萃取法处理单个样本至少需60min，处理一批(50个)也至少需要150min。即本申请的检测方法缩短了检测时间，提高了样本的检测通量。
4、本申请的检测方法成本低，只需要少量的有机试剂，上机时间短，相对于高效液相色谱法大大降低了时间与经济成本。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法流程示意图；
图2是本申请实施例提供的总离子流图(TIC图)；
图3是本申请实施例提供的奈玛特韦的标准曲线图；
图4是本申请实施例提供的利托那韦的标准曲线图；
图5是本申请实施例提供的奥司他韦的标准曲线图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请实施例所述的抗新冠病毒的有效成分包括奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦，进一步的，奈玛特韦(Nirmatrelvir，又名帕罗韦德)，为SARS-CoV-2的主要蛋白酶(Mpro)抑制剂，应用于抗新冠病毒的药物治疗。其分子式为C23H32F3N5O4，分子量为499.53,CAS：2628280□40□8，结构式如下：
利托那韦(Nirmatrelvir)是一种HIV蛋白酶抑制剂，用于治疗HIV感染和AIDS，其分子式为C37H48N6O5S2，分子量为720.9，CAS编号为155213-67-5，结构式如下：
需要说明的是，在实际应用中，利托那韦为奈玛特韦的药效增强剂，两者联合应用治疗新冠病毒感染，主要用于治疗成人伴有进展为重症高风险因素的轻至中度新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者。
奥司他韦(Oseltamivir)是一种作用于神经氨酸酶的特异性抑制剂，其抑制神经氨酸酶的作用，可以抑制成熟的流感病毒脱离宿主细胞，从而抑制流感病毒在人体内的传播，并在世界范围内广泛用于预防和治疗甲型及乙型流行性感冒。其分子式为C16H28N2O4，分子量为312.4，CAS编号为196618-13-0，结构式如下：
如图1所示，本申请实施例提供了一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法，方法包括：
对待测样品进行前处理，包括：用研钵或研磨机将新冠药片研磨至粉末状，在5mL80％甲醇溶液中加入100mg药物样本进行提取，震荡，离心取上清液，上清液稀释后即得待测样品；震荡时间为3-5min；离心条件为13000r/min，4℃，5-10min；稀释倍数1000-10000倍。
富集：将处理后的样品用流动相送至色谱柱进行富集；
分离及洗脱：分离和洗脱：采用梯度洗脱的模式改变流动相比例，将富集后的样品进行分离、依次洗脱至三重四级杆质谱进行检测。本申请的实施例中，色谱柱应选用长链反相色谱柱，具体选择为C18(50×2.0mm，3μm)，在这种色谱柱条件下，奈玛特韦和利托那韦在非极性色谱柱的保留更强、峰型良好，3μm的粒径和50mm的柱长使待测物在较短时间内出峰，即使在高流速下，柱压更低，与杂质的分离度良好，使检测方法具有高通量和抗干扰的特点。在本申请中，流动相中加入一定甲酸有助于提高药物分子在离子源的电离效率，但酸浓度过高会抑制分子电离。因此本申请的实施例中，流动相：A相为含0.05-0.3％甲酸的甲醇，B相为含0.05-0.3％甲酸的水。并且流速为0.2-0.6mL/min能获得良好的待测物色谱图。色谱柱应选用长链反相色谱柱，如C18色谱柱；奈玛特韦和利托那韦在非极性色谱柱的保留更强、峰型良好。3um的粒径和50mm的柱长使待测物在较短时间内出峰，即使在高流速下，柱压更低，与杂质的分离度良好，使检测方法具有高通量和抗干扰的特点。流动相中加入一定甲酸有助于提高药物分子在离子源的电离效率，但酸浓度过高会抑制分子电离，0.05-0.3％的甲酸浓度较为适宜。该检测方法在流速0.2-0.6mL/min的范围内能获得良好的待测物色谱图。
本申请的一些实施例中，液相色谱的进样量为1～30μL，柱温为35-50℃。
本申请的一些实施例中，液相色谱流动相采用梯度洗脱的方式，能显著改善峰型并缩短检测时间。较高有机相的起始比例使待测物的保留时间提前，在1.1min时提高有机相比例到85％，能使三个药物成分在1.5-2.5min内流动相掺混窗口时出峰，峰宽更窄、峰型良好，分离度高。提高到适宜的有机相比例有助于提高待测物的质谱响应，提高方法灵敏度。流动相比例的改变方式包括：
0-1.0min，流动相中A相与B相的体积比为68:32；
1.0-1.1min，A相与B相体积比由68:32线性变化为85:15；
1.1-3.5min，A相与B体积比为85:15；
3.5-3.6min，A相与B相体积比由85:15线性变化为68:32；
3.6-5.0min，A相与B相体积比为68:32。
本申请的一些实施例中，将富集后的样品进行分离过程中的离心为低温高速离心，它能避免药物成分在高速离心产生的热量中分解，较高的离心速度能使药物成分被有机溶剂快速萃取，并与固体杂质分离。离心条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间5-10min。
本申请的一些实施例中，三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的质谱条件包括正离子模式，三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的扫描方式为多反应监测离子扫描MRM。
进一步的，在本申请的一些实施例中，所述检测方法还包括：
根据待测样品，设置正离子模式中的目标定量/定性离子对。
具体的，目标定量/定性离子对包括奈玛特韦定量/定性离子对、利托那韦定量/定性离子对、奥司他韦的定量离子对。
进一步的，在本申请的一些实施例中，所述检测还包括：
根据待测样品，设置目标定量/定性离子的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件。具体的，目标定量/定性离子的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件包括：奈玛特韦的母离子的质荷比为500.0-500.4，对应的定量离子对的质荷比为319.0-319.4，定性离子对的质荷比为109.1-109.5；利托那韦的母离子的质荷比为721.1-721.5，对应的定量离子对的质荷比为171.0-171.5，定性离子对的质荷比为296.0-296.5；奥司他韦的母离子的质荷比为312.9-313.3，对应的子离子对的质荷比为165.8-166.2。
随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得总离子流图(TIC图)，参照图5所示。
在本申请的一些实施例中，三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的质谱条件包括正离子模式还包括离子源参数。离子源参数应根据流动相比例与样品电离难易程度、热稳定性来设置。该检测方法的起始流动相中有机相比例较高，且奈玛特韦和利托那韦的热稳定性较强，可采用以下电离源条件，使样品达到较高的电离效率的同时，保证结果较高的重复性。0.2-0.4mL/min的碰撞气可以在适宜碰撞能量下，高效产生碎片离子并聚集离子，达到准确的定性定量目的。因此，在本申请中，离子源参数包括：电离源为电喷雾电离(ESI)源，反吹气流速为2.5-5.0L/min，干燥气流速为10-15L/min，雾化气流速为1.0-1.5L/min，碰撞气为氮气，其流速为0.20-0.4mL/min，喷雾电压为4500-5500V，干燥气温度450-550℃。
进一步的，在本申请的一些实施例中，所述检测方法还包括：
根据待测样品，设置待测样品所对应定量离子对的去簇电压、入口电压、碰撞电压以及出口电压；
根据待测样品，设置待测样品所对应定性离子对的去簇电压、入口电压、碰撞电压以及出口电压。
具体的，奈玛特韦定量离子对的去簇电压为45-55V，入口电压为45-50V，碰撞电压为20-25V，出口电压为1-3V；奈玛特韦定性离子对的去簇电压为55-65V，入口电压为35-45V，碰撞电压为25-30V，出口电压为1-3V；
利托那韦定量离子对的去簇电压为65-75V，入口电压为30-35V，碰撞电压为40-50V，出口电压为2-4V；定性离子对的去簇电压为80-90V，入口电压为15-20V，碰撞电压为20-30V，出口电压为1-3V；
奥司他韦定量离子对的去簇电压为20-30V，入口电压为35-40V，碰撞电压为25-30V，出口电压为5-9V。
实施例1
本实施例的鉴定新冠药物中有效成分的检测方法，包括以下步骤：
一、样品前处理：用研钵或研磨机将新冠药片研磨至粉末状，在5mL 80％甲醇溶液中加入100mg药物样本进行提取，震荡5min，于离心机13000r/min，4℃离心分离5min，将上层清液稀释1000倍，将稀释液转移棕色进样瓶中，即得待测样品，将其加载至液相色谱自动进样器中。
二、富集、分离和检测
自动进样器自动将10μl待测样品加载到液相色谱系统中，对所述待测样品采用液相色谱串联四级杆质谱仪LC-MS/MS进行富集、分离与检测。
其中，色谱柱为C18(50×2.0mm，3μm)；流动相：A相为含0.1％甲酸的甲醇，B相为含0.1％甲酸的水，流速为0.4ml/min。
柱温为40℃，液相色谱的进样量为10μL。
流动相采用梯度洗脱的模式：0-1.0min，流动相中A相与B相的体积比为68:32，1.0-1.1minA相与B相体积比由68:32线性变化为85:15，1.1-3.5minA相与B体积比为85：15，3.5-3.6minA相与B相体积比由85:15线性变化为68:32，3.6-5.0minA相与B相体积比为68:32。
上述梯度下，奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的保留时间分别为2.33min、2.67min和2.02min。
本实施例采用广州禾信仪器股份有限公司的具有电喷雾电离源(ESI)的液相色谱串联三重四极杆质谱分析仪LC-TQ 5200作为检测器进行分析。其中反吹气流速为2.0L/min，干燥气流速为13L/min，雾化气流速为1.1L/min，碰撞气为氮气，其流速为0.35mL/min，喷雾电压为5500V，干燥气温度520℃。
其它质谱条件：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM，其条件参见表1。
表1.多反应监测离子扫描MRM条件
待测物随流动相流出分析柱后，在压力的作用下进入质谱仪离子源。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子，带电分子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3为质量过滤器，只允许根据奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞单元，母离子在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。质谱仪的第一个四极杆(Q1)选择具有奈玛特韦和利托那韦和奥司他韦的特定质荷比m/z的母离子，具有这些m/z比的母离子被允许进入Q2，Q2产生的碎片离子进入到Q3，其中奈玛特韦和利托那韦和奥司他韦的碎片离子(子离子)被选择通过，而其它离子被除去。参见表2，示出了被用于鉴别和定量的奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的离子对的质荷比m/z。
表2.奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的质量转变表
| 被分析物 | Q1母离子(m/z) | Q3子离子(m/z) |
| 奈玛特韦定量离子对 | 500.1 | 319.1 |
| 奈玛特韦定性离子对 | 500.1 | 109.5 |
| 利托那韦定量离子对 | 721.3 | 171.1 |
| 利托那韦定性离子对 | 721.3 | 296.2 |
| 奥司他韦定量离子对 | 313.0 | 166.0 |
随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得总离子流图(TIC图)(如图1所示)。
实施例1中依据奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断奈玛特韦、利托那韦、奥司他韦的存在。
在相同试验条件下，检测样品中被测目标物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致；检测样品的色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差(即表3中的最大允许误差)不超过表3规定的范围，则可以判断样品中存在对应的目标物质。
表3定性判断相对丰度的最大允许误差
| 相对丰度(K) | K≥50％ | 20％≤K≤50％ | 10％≤K≤20％ | K≤10％ |
| 最大允许误差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
采用外标标准曲线法定量，以标准曲线中奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的峰面积与浓度的拟合方程计算样品中的奈玛特韦、利托那韦、奥司他韦的含量。
配置系列浓度的含有奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的标准样品，用本实施例的上述方法进行样品前处理以及分离检测，以标准样品中奈玛特韦和利托那韦和奥司他韦的峰面积构建标准曲线，奈玛特韦的标准曲线的方程Y＝5102.617X+112947.922，R＝0.9991，加权1/X；利托那韦的标准曲线的方程为Y＝1479.990X+1308.791，R＝0.9972，加权1/X；奥司他韦的标准曲线的方程为Y＝1571.078X+5135.205，R＝0.9996，加权1/X；然后利用该标准曲线计算待测样品或质量控制物中的奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的浓度。
本实施例中，新冠药A为含奈玛特韦的药品，B为含利托那韦的药片，A中奈玛特韦的峰面积为64977090.00，利托那韦无检出，奥司他韦的峰面积为34900.00；B中利托那韦的峰面积为21475389.50，奥司他韦和奈玛特韦无检出；计算得到本实施例的药物样品中，A的奈玛特韦的浓度为12402.00ug/L，奥司他韦的浓度为22.05ug/L；B的利托那韦的浓度为14497.23ug/L。根据以上浓度算出药片中各成分的含量，A中奈玛特韦含量为62.01％，奥司他韦含量为0.11％；B中利托那韦含量为72.49％。
上述实施例中，根据对奈玛特韦和利托那韦的回收率，以及前处理流程的操作难易和耗时优化前处理参数、待测物与杂质的分离程度以及在色谱柱的保留情况优化色谱条件、待测物在质谱仪的响应、样本在离子源的雾化、药物成分在碰撞室的质量转变以及结果重现性来优化离子源参数和质谱参数等条件对前处理的参数、色谱条件、质谱参数进行了大量实验研究优化后得到最佳的检测方法，可以有效去除杂质干扰，特异性、抗干扰能力强，定量限低，灵敏度高，精密度RSD小于10％，可以准确的定性或定量检测出药物中的奈玛特韦、利托那韦和奥司他韦的含量，鉴定新冠药物中有效成分，因此本申请的检测方法检测灵敏度高、精密度高、特异性强。
上述所有可选技术方案，可以采用任意结合形成本申请的可选实施例，在此不再一一赘述。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鉴定新冠药物中有效成分的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
对待测样品进行前处理：用研钵或研磨机将新冠药片研磨至粉末状，在甲醇溶液中加入药物样本进行提取，震荡，离心取上清液，上清液稀释后即得待测样品；
富集：将处理后的样品用流动相送至色谱柱进行富集；
分离和洗脱：采用梯度洗脱的模式改变流动相比例将富集后的样品进行分离、依次洗脱至三重四级杆质谱进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为C18；流动相：A相为含0.05-0.3％甲酸的甲醇，B相为含0.05-0.3％甲酸的水，流速为0.2-0.6mL/min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的进样量为1～30μL，柱温为35-50℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的模式中，所述流动相比例的改变方式包括：
0-1.0min，流动相中A相与B相的体积比为68:32；
1.0-1.1min，A相与B相体积比由68:32线性变化为85:15；
1.1-3.5min，A相与B体积比为85：15；
3.5-3.6min，A相与B相体积比由85:15线性变化为68:32；
3.6-5.0minA相与B相体积比为68:32。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，样品进行分离过程中的离心的条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间5-10min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的质谱条件包括正离子模式，所述三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的扫描方式为多反应监测离子扫描MRM。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
根据待测样品，设置所述正离子模式中的目标定量/定性离子对。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
根据待测样品，设置所述目标定量/定性离子的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述三重四级杆质谱进行检测中的四级杆质谱的质谱条件包括正离子模式还包括离子源参数，所述离子源参数包括：
电离源为电喷雾电离(ESI)源，反吹气流速为2.5-5.0L/min，干燥气流速为10-15L/min，雾化气流速为1.0-1.5L/min，碰撞气为氮气，其流速为0.20-0.4mL/min，喷雾电压为4500-5500V，干燥气温度450-550℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
根据所述待测样品，设置所述待测样品所对应定量离子对的去簇电压、入口电压、碰撞电压以及出口电压；
根据所述待测样品，设置所述待测样品所对应定性离子对的去簇电压、入口电压、碰撞电压以及出口电压。
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