CN118207171A - 生物素连接酶突变体及其在生物素生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌生物素连接酶突变体及其在生物素生产中的应用。该突变体在不影响菌株生长的前提下,有效降低对生物素操纵子的反馈抑制,不仅使得生物素的产量得到提高,还保证了生产效率,对推动生物素生物生产的产业化和规模化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种生物素连接酶突变体及其在生物素生产中的应用。
背景技术
生物素(biotin)又称维生素H、维生素B7、辅酶R,在脂肪合成、糖质新生等生化反应途径中扮演重要角色,是参与真核和原核生物中枢代谢(脂质合成、氨基酸代谢、糖代谢)最重要的辅因子之一。生物素属于B族维生素,是动物、植物和微生物生长的必需维生素,在医药、化妆品、食品添加剂和畜牧业等众多领域中应用越来越广泛,市场需求逐年增加。
目前,大部分市售生物素是通过Goldberg和Sternbach开发的多步化学工艺合成的,然而化学合成生物素存在技术能耗高、成本高、环境不友好等问题,因此,绿色且经济高效的生物合成法生产生物素具有极其重要的意义。
并非所有的生物都能自身合成生物素,研究表明,仅有植物、真菌和部分细菌具备合成生物素的能力。由于生物素参与细胞生长、脂肪代谢、氨基酸代谢等多个生长代谢活动,因此其合成受到生物体的精细调控。以大肠杆菌为例,其生物素的合成途径分为庚二酸硫酯的合成和双环合成两个阶段,在众多生物素合成蛋白BioC、BioH、BioF、BioA、BioD、BioB的催化作用下,经过一系列反应最终合成生物素(参见图1A)。该过程包括多步反应,需要多个催化酶的分工协作,因此一直面临耗能高且生物素转化率低的问题,其中BioF、BioA、BioD、BioB的催化效率仅为0.06 s-1、0.013 s-1、0.06 s-1、0.002 s-1,其催化的由庚二酰-ACP到生物素的合成过程,更是成为大肠杆菌生物素合成的限速步骤。可见,想要优化生物素的生物合成,需要对生物素合成酶的表达进行调控,尤其需要对限速步骤的几个催化酶BioF、BioA、BioD、BioB的表达进行调控。
大肠杆菌的生物素合成代谢受到生物素连接酶BirA的调控。BirA由N端的DNA结合结构域、中间催化结构域及C端的生物素羧基载体蛋白(BCCP)结合结构域组成。BirA是一个同时具有催化和转录调控双功能的蛋白质,一方面可作为生物素连接酶,催化介导蛋白质的生物素化反应,将生物素连接到特定的蛋白质上。另一方面BirA还是一种生物素诱导抑制剂,可作为生物素合成调节因子,负调控生物素的合成。当胞内的生物素积累到一定水平时,BirA蛋白会与生物素中间体bioin-5’-AMP结合形成配体,该配体可通过BirA的DNA结合结构域与生物素操纵子结合,抑制生物素合成蛋白BioF、BioA、BioD、BioB的基因表达(参见图1B)。当胞内生物素积累量降低时,BirA则不与bioin-5’-AMP结合,而是识别并靶向结合BCCP,进而激活生物素操纵子的转录。
对BirA的DNA结合域的进行破坏,解除对生物素操纵子的反馈抑制,或者对C端BCCP结合结构域突变增强BirA与BCCP的结合,是提高生物素产量的有效策略之一。Chakravartty V等(Chakravartty V, Cronan JE. Altered regulation of Escherichiacoli biotin biosynthesis in BirA superrepressor mutant strains. J Bacteriol.2012 Mar;194(5):1113-26.)为解除BirA对生物素操纵子的抑制,将BirA N端2-65位敲除,以降低其与生物素操纵子的亲和力。然而现有的研究对BirA突变的同时大多会延缓或抑制微生物自身的生长,严重的甚至导致微生物死亡,不仅难以达到提高生物素产量的目的,还导致生产效率的降低,不利于大规模生产。因此,为了提高生物素的产量,迫切需要找到一种对BirA进行分子改造的方法,在降低或解除其对生物素操纵子的反馈抑制的同时,不影响微生物生长,这对实现生物素的生物生产的产业化和规模化具有重要意义。
发明内容
为了提高生物素的产量和生产效率,本发明提供一种新型的大肠杆菌(Escherichia coli)生物素连接酶突变体及其在生物素生产中的应用,该突变体不仅降低了对生物素操纵子的反馈抑制,同时不影响菌株生长。为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种大肠杆菌生物素连接酶突变体,所述突变体包含选自如下的氨基酸序列或由其组成:
1)来自大肠杆菌生物素连接酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第26位氨基酸由G到S的突变(BirAG26S);
2)来自大肠杆菌生物素连接酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第256位氨基酸由E到K的突变(BirAE256K);
3)来自大肠杆菌生物素连接酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第319位氨基酸由A到V的突变(BirAA319V);
4)来自大肠杆菌生物素连接酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第26位氨基酸由G到S的突变、第256位氨基酸由E到K的突变(BirAG26S, E256K);
5)来自大肠杆菌生物素连接酶如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中第26位氨基酸由G到S的突变、第319位氨基酸由A到V的突变(BirAG26S, A319V)
6)来自大肠杆菌生物素连接酶如SEQIDNO:1所示氨基酸序列中第2-65位氨基酸的缺失突变(BirAΔ2-65);
第二方面,本发明提供编码所述生物素连接酶突变体的核酸分子。
第三方面,本发明提供含有所述核酸分子的生物材料,所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌
第四方面,本发明提供一种重组微生物,所述重组微生物是将编码所述生物素连接酶突变体的核酸分子通过基因工程手段整合到大肠杆菌染色体上构建得到的。
第五方面,本发明提供所述生物素连接酶突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述重组微生物在生物素生产中的应用。
第六方面,本发明提供一种生产生物素的方法,该方法使用所述生物素连接酶突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述重组微生物在生物素生产中的应用。
第七方面,本发明提供一种提高生物素产量的方法,该方法使用所述生物素连接酶突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述重组微生物在生物素生产中的应用。
第八方面,本发明提供一种提高生物素操纵子基因转录水平的方法,该方法使用所述生物素连接酶突变体或所述核酸分子或所述生物材料或所述重组微生物在生物素生产中的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述突变体是在SEQ ID NO:1所示的生物素连接酶的基础上,进行了至少选自如下氨基酸位点的突变:
第26位甘氨酸突变为丝氨酸;
第256位谷氨酸突变为赖氨酸;
第319位丙氨酸突变为缬氨酸;
第26位甘氨酸突变为丝氨酸,并将第256位谷氨酸突变为赖氨酸;
第26位甘氨酸突变为丝氨酸,并将第319位丙氨酸突变为缬氨酸;
第2-65位氨基酸缺失突变。
本发明至少具有下列优点及有益效果:
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
本发明通过对野生型大肠杆菌生物素连接酶BirA进行突变,筛选获得对生物素操纵子抑制降低的突变体BirAG26S、BirAG26S,E256K、BirAG26S,A319V,从而提高生物素的产量。尤其是包含BirAG26S的突变体,不仅减少了对生物素操纵子的抑制,而且突变菌株生长迅速,达到了生物素的产量和生产效率双高的效果,对生物素的大规模生产具有重要意义。
附图说明
图1A 大肠杆菌生物素合成代谢途径
图1B 大肠杆菌生物素操纵子基因排布图
图2 利用ΔbioFbioCbioDbioB平板检测BW25113生物素连接酶BirA突变体及BW25113中生物素的产量结果
图3 突变体菌株BW25113-BirAG26S、BW25113-BirAΔ2-65和野生型菌株BW25113的生长曲线
图4 突变体菌株BW25113-BirAG26S与野生型菌株BW25113的生物素操纵子基因转录水平比
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步详细阐述本发明。凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW ,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)等,或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1:生物素连接酶突变体的构建
1、单位点突变菌株BW25113-BirAG26S、BW25113-BirAE256K、BW25113-BirAA319V的构建
以大肠杆菌BW25113为出发菌株,利用CRISPR/Cas9技术对BirA第26位、256位以及319位氨基酸突变,具体为:
(1)以野生型BW25113基因组序列为模板,利用引物birA-1/birA26-1及birA26-2/birA-2分别扩增birA基因上下游同源臂,再使用引物birA-1/birA-2通过PCR扩增将上、下游同源臂融合为一个片段,获得含有BirAG26S编码序列的修补片段。
(2)以pGRB质粒为模板,利用引物birA26-pGRB-1和birA26-pGRB-2,进行PCR扩增。纯化回收PCR产物,转入DH5α中,涂布在含有氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB平板上,37℃培养12 h后进行阳性克隆鉴定,最终获得BirA第26位氨基酸突变所用sgRNA的载体质粒pGRB-birA26。
(3)将pCas9质粒转入BW25113并制作感受态细胞。然后将步骤(2)所得pGRB-birA26质粒和步骤(1)所得含有BirAG26S编码序列的修补片段共同转化含有pCas9质粒的BW25113感受态细胞。涂布在含有氨苄青霉素(50 μg/mL)和壮观霉素(100 μg/mL)的LB固体平板上进行筛选,使用引物birA-1/birA-4进行测序验证,最终获得表达BirAG26S突变体的突变菌株BW25113-BirAG26S。
(4)利用上述同样方法,使用表1中所列对应突变引物对分别构建表达突变体BirAE256K和BirAA319V的突变菌株BW25113-BirAE256K、BW25113-BirAA319V。
2、组合位点突变菌株BW25113-BirAG26S, E256K、BW25113-BirAG26S, A319V的构建
为了验证组合位点突变是否能够带来更好的效果,在所构建的单位点突变菌株BW25113-BirAG26S的基础上,再次利用CRISPR/Cas9技术分别对256位、319位氨基酸突变,构建得到含有两个突变位点的组合突变菌株BW25113-BirAG26S, E256K、BW25113-BirAG26S, A319V。
3、突变体BW25113-BirAΔ2-65的构建
以大肠杆菌BW25113为出发菌株,利用CRISPR/Cas9技术对BirA第2-65位氨基酸进行缺失突变,所用引物及质粒见表1、表2,获得表达缺失N端第2-65位氨基酸的BirA突变体的突变菌株BW25113-BirAΔ2-65作为对照。
表1 birA基因突变所用引物
表2 本发明所用质粒
表3 本发明所用菌株
实施例2:生物素指示菌(ΔbioFbioCbioDbioB)的构建
以大肠杆菌ER90(ΔbioFbioCbioD)(参见文献Eunjoo,Choi-Rhee,and,et al.Biotin Synthase Is Catalytic In Vivo, but Catalysis Engenders Destruction ofthe Protein[J].Chemistry & Biology, 2005.DOI:10.1016/j.chembiol.2005.02.006.第466页左栏第2段)为出发菌株,利用CRISPR/Cas9技术敲除其bioB基因。
(1)以ER90基因组序列为模板,利用引物bioB-1/bioB-2及bioB-3/bioB-4分别扩增bioB基因上下游同源臂,再使用引物bioB-1/bioB-4将上、下游同源臂融合为一个片段,获得敲除bioB的修补片段。
(2)以质粒pGRB为模板,利用引物bioB-pGRB-1和bioB-pGRB-2扩增构建含有敲除bioB所用sgRNA的质粒pGRB-bioB。
(3)将pGRB-bioB质粒和敲除bioB的修补片段共同转化含有pCas9质粒的ER90感受态细胞,最终获得获得生物素指示菌(ΔbioFbioCbioDbioB),所用引物及质粒见表1、表2。
实施例3:突变体的筛选
(1)将BW25113-BirAG26S、BW25113-BirAE256K、BW25113-BirAA319V、BW25113-BirAG26S , E256K、BW25113-BirAG26S, A319V以及作为对照的BW25113-BirAΔ2-65和野生型BW25113分别接至5 mL种子培养基中,37℃、220 rpm过夜培养,得到种子培养物。
(2)将步骤(1)的种子培养物按1%的接种量转接至50 mL发酵培养基中,37℃、220rpm培养24 h,得到发酵液样品。
(3)分别取发酵液样品经95℃处理5 min、12000 rpm离心5min,再稀释2倍后,滴至生物素检测平板,37℃培养16 h。
种子培养基的配制(L):胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g。
发酵培养基的配制(L):葡萄糖10 g、CoCl2·6H2O 2 mg、KH2PO4 7.5 g、ZnSO4·7H2O 2 mg、酵母粉3 g、CaCl2 4 mg、柠檬酸1.8 g、维生素B1 1.5 mg、MgSO4·7H2O 2 g、CuSO4 0.5 mg、FeSO4·7H2O 70 mg、MnSO4·H2O 10 mg。
M9培养基的配制(L):葡萄糖4 g、Na2HPO4 6 g、KH2PO4 3 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1g、MgSO4·7H2O 0.25 g。
生物素检测平板的制备:
①将生物素指示菌(ΔbioFbioCbioDbioB)接种于添加有1nM生物素的液体M9培养基,37℃培养过夜。
②6000rpm,5min离心收集菌体,用M9液体培养基洗涤三次。
③配制M9固体培养基,倒平板前控制温度不超过40℃时,加入步骤②洗涤后的菌体至终OD为0.1以及2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)至终浓度0.1%(w/v),混合均匀后倒平板,即得到生物素检测平板。
生物素检测平板含有生物素指示菌(ΔbioFbioCbioDbioB)与氧化还原指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)。生物素指示菌由于删除了生物素合成的必需基因bioF、bioC、bioD、bioB,存在生物素合成缺陷,因而无法在未添加生物素的生物素检测平板上生长。若在检测平板上滴加的发酵液样品中含有生物素,则外源生物素可促使指示菌生长,TTC会被还原并形成红色的不溶性沉积物,形成红色生长圈。红色生长圈的面积与生物素浓度正相关,可根据生长圈直径的大小间接确定被检测样品中的生物素含量。
生物素检测平板结果显示(参见图2),滴加突变体菌株BW25113-BirAG26S、BW25113-BirAG26S, E256K、BW25113-BirAG26S, A319V以及BW25113-BirAΔ2-65的发酵液样品的检测平板均出现明显生长圈,滴加突变体菌株BW25113-BirAE256K、BW25113-BirAA319V和野生型菌株BW25113发酵液样品的检测平板均未观察到生长圈。上述结果表明,无论是野生型菌株BW25113,还是突变体菌株BW25113-BirAE256K、BW25113-BirAA319V,其均无法合成足以达到检测量的生物素,而突变体菌株BW25113-BirAG26S、BW25113-BirAG26S,E256K、BW25113-BirAG26S ,A319V以及作为对照的BW25113-BirAΔ2-65的生物素合成量均得到了显著提高。通过测量可知,图2中突变体BW25113-BirAG26S的生长圈直径(1.25 cm)略大于作为BW25113-BirAΔ2-65对照的生长圈直径(1.05 cm),这也表明突变体BW25113-BirAG26S具有更高的生物素合成能力。
实施例4:生物素产量的定量测定
分别取实施例3中得到的BW25113、BW25113-BirAΔ2-65、BW25113-BirAG26S的发酵液样品,经95℃处理5 min后,再于12000 rpm离心10 min,取上清于新的离心管中,使用HPLC-MS进一步定量测定发酵液中的生物素含量。
仪器设备及参数:高效液相色谱(Agilent LC-40D);色谱柱:YMC-Triart(4.6250 mm,5 μm);流动相A:0.1% FA(色谱级);流动相B:100%乙腈(色谱级);检测波长:200 μm;流速:0.8 mL/min;进样体积:20 μL。
HPLC-MS的结果显示(参见表4), BW25113-BirAG26S和BW25113-BirAΔ2-65的生物素产量均远远高于BW25113,而表达单位点突变体的BW25113-BirAG26S较对照BW25113-BirAΔ2-65的生物素产量提高了21%。这一结果表明,对BirA进行第26位氨基酸的单位点突变所获得的突变体,比删除了N端第2-65位的64个氨基酸的突变体具有更强的生物素生产能力。
表4 HPLC-MS法测定生物素含量
实施例5:突变体BW25113-BirAG26S的生长测定
分别取BW25113-BirAG26S、BW25113-BirAΔ2-65和野生型BW25113的活化的菌种,按1%接种量转接至1 mL发酵培养基中混合均匀,吸取100 μL接至浅孔板,使用微生物生长曲线分析仪,在37℃、800 rpm条件下培养24 h,监测各菌株生长情况。
从生长曲线的结果可以看出(参见图3):突变体BW25113-BirAG26S的和野生型BW25113在生长到2小时时即进入对数生长期,生长8小时左右OD即可达到最大值;而BW25113-BirAΔ2-65,在生长到约 10小时,才缓慢进入对数生长期,生长至约17小时OD才能达到最大值。突变体BW25113-BirAG26S的对数生长期的比生长速率是BW25113-BirAΔ2-65的1.97倍,与野生型BW25113无显著差异。上述结果表明,删除了BirA的N端2-65位氨基酸后,对大肠杆菌细胞的发育和生长带来了较大的负面影响,导致其生长缓慢;而对BirA的26位甘氨酸进行突变不仅提高了其生物素的生产能力,还有效避免了菌株生长受限的问题。
实施例6:突变体BW25113-BirAG26S生物素操纵子基因转录水平检测
挑取突变体BW25113-BirAG26S和野生型BW25113分别接至5 mL种子培养基中,37℃、220 rpm过夜培养,按1%的接种量转接至50 mL发酵培养基中,37℃、220 rpm培养OD=1,吸取5 mL发酵液,12000 rpm离心10 min,收集菌体,液氮速冻。然后通过转录组测序检测BW25113-BirAG26S相对于BW25113的生物素操纵子基因转录水平。
结果显示,相较于野生型BW25113,突变体BW25113-BirAG26S的生物素操纵子基因bioF、bioD、bioC、bioB、bioA的转录水平均达到了4倍以上的显著上调(图4),这充分说明BirA第26位甘氨酸发生突变后解除了BirA对生物素操纵子的抑制,进而激活并提高了生物素生产能力。
本发明有效解决了由于生物素连接酶对生物素合成的反馈抑制而导致的生物素产量低的问题,同时还解决了对生物素连接酶突变带来的菌株生长受限等问题,得到了生物素产量高、生产效率高的生物素连接酶突变体,对生物素的高产生产具有重要意义。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种生物素连接酶突变体,其特征在于,该突变体是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为基础,进行如下位点的突变:第26位氨基酸由G突变为S。
2.如权利要求1所述的突变体,其特征在于,该突变体进一步包括选自如下位点的突变:第256位由E突变为K或第319位由A突变为V。
3.编码如权利要求1-2任一项所述生物素连接酶突变体的核酸分子。
4.含有如权利要求3所述核酸分子的生物材料,其特征在于,生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
5.重组微生物,其特征在于,所述重组微生物包含权利要求1-2任一项所述的生物素连接酶突变体。
6.一种如权利要求1-2任一项所述的生物素连接酶突变体、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求4所述的生物材料或如权利要求5所述的重组微生物在生物素生产中的应用。
7.一种生产生物素的方法,其特征在于,使用如权利要求1-2任一项所述的生物素连接酶突变体、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求4所述的生物材料或如权利要求5所述的重组微生物。
8.一种提高生物素产量的方法,其特征在于,使用如权利要求1-2任一项所述的生物素连接酶突变体、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求4所述的生物材料或如权利要求5所述的重组微生物。
9.一种提高生物素操纵子基因转录水平的方法,使用如权利要求1-2任一项所述的生物素连接酶突变体、如权利要求3所述的核酸分子、如权利要求4所述的生物材料或如权利要求5所述的重组微生物。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,生物素操纵子基因包括bioF、bioD、bioC、 bioB、bioA。
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