CN118207168A - 一种过表达sv40-lt基因的人胚肺细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供过表达SV40‑LT基因的人胚肺细胞系MU‑SVL1，其保藏编号为CCTCC No:C202374。本发明还提供其构建方法以及在培养病毒中的应用。本发明的MU‑SVL1细胞是利用过表达SV40‑LT的慢病毒感染人胚肺细胞MU‑L1(P24)，经0.6μg/mL的嘌呤霉素筛选出稳转细胞系。本发明的MU‑SVL1细胞按1:4比例传代，在原有代次基础上已培养至P90代，P70代时增殖能力仍较快。本发明的MU‑SVL1细胞染色体数目主要分布为2n＝46，为二倍体核型；随细胞代次的增加，有多倍体发生。本发明的MU‑SVL1细胞均无成瘤性，对脑心肌炎病毒具有敏感性。

Description

一种过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及一种过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系及其应用。

背景技术

人胚肺来源的二倍体细胞是人类病毒性疫苗生产最重要的细胞基质之一。人胚肺细胞增殖能力有限，正常情况下，细胞经过有限代次的分裂后将进入不可逆的生长停滞，最后衰老死亡，例如目前使用的人胚肺二倍体细胞株WI-38、MRC-5、KMB17及2BS细胞的传代寿命分别为48代、48代、63～65代、67代。有限的增殖能力限制了人胚肺细胞在生产过程中大规模应用的潜力。疫苗生产企业引进细胞种子，建好生产用工作细胞库时，细胞代次至少已经达到20代左右，甚至更高。实际使用时从工作库细胞复苏后传代扩大培养至接毒阶段，细胞代次已接近生产终末代次，因此造成了资源紧张、使用规模放大受限等许多问题。而永生化细胞具有无限增殖的能力，如果将人胚肺二倍体细胞通过细胞基因工程技术改造后建成安全性方面符合要求且能连续传代的细胞系，即永生化细胞系，其应用前景将会进一步提升。

Hayflick在体外培养人成纤维细胞时发现体外培养的细胞具有有限的增殖寿命，细胞增长到一定的代次就会表现出不可逆转的生长停滞状态，这种现象被称为Hayflick极限。细胞培养达Hayflick极限时，细胞进入衰老期(M1期)，有丝分裂能力丧失，增殖停滞，形态扩大扁平。在这种状态下，细胞保持活性，对细胞凋亡有一定的抵抗作用。若细胞受到病毒基因、癌基因、肿瘤抑制因子影响，逃脱M1期，即进入危机期(M2期)细胞开始出现凋亡。若细胞从衰老期M1期和危机期M2期逃脱，从而具备无限增殖能力，该过程称为细胞永生化。

SV40病毒是环状DNA病毒，由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。SV40早期mRNA分别编码大T抗原的小t抗原，其T抗原片段是最常用的目的片段。研究表明SV40 LT抗原通过结合转导细胞中抑癌基因(P53和P16)和细胞周期抑制因子(pRB)等抑制其表达，并激活端粒酶的活性，使少部分细胞逃过M1期和M2期，从而达到无限增殖状态。SV40病毒经常用于早期胚胎以及体细胞永生化的建立。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系及其应用。本申请利用过表达SV40-LT基因的慢病毒感染原代人胚肺细胞，构建过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系，建立永生化人胚肺细胞，该细胞系的传代寿命较原代人胚肺细胞延长，以期解决人胚肺细胞生命代次有限，导致生产代次受限、难以满足规模化生产的实际需求问题。

本发明提供过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1，其于2023年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No:C202374。

本发明提供的人胚肺细胞系MU-SVL1，与人胚肺细胞系MU-L1细胞相比，传代寿命明显延长，目前已传至P90代；连续传代至P52和P72代时，增殖能力明显较强，比生长速率较快，倍增时间较短。将不同代次细胞于液氮中保存，细胞冻存前和复苏后细胞活率均较高。

本发明还提供上述过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1的制备方法，利用慢病毒感染方法，将SV40-LT基因导入人胚肺细胞MU-L1，使用嘌呤霉素筛选出稳转细胞系，得到过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1；

作为优选，所述嘌呤霉素浓度为0.6μg/mL；

作为优选，使用含HiTransG P的完全培养基进行感染，感染复数为：MOI＝100。

本发明还提供上述过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1的扩大培养方法，将人胚肺细胞系MU-SVL1加入到含有10％新生牛血清的MEM培养基中进行培养，然后进行传代；所述培养条件为：37℃，5％CO₂；

作为优选，所述人胚肺细胞系MU-SVL1细胞按照1:2～1:8的传代比例进行传代，细胞均生长良好；最优传代比例为1:4。

作为优选，所述培养基中含有8-10％的血清。

作为优选，还包括将扩大培养的细胞进行冻存的步骤，人胚肺细胞系MU-SVL1使用的细胞冻存液由以下体积百分比的各组分组成：70％MEM培养基+20％新生牛血清+10％DMSO；

作为优选，冻存P50或P70代人胚肺细胞系MU-SVL1。

本发明还提供上述的过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1在培养病毒中的应用。

本发明的人胚肺细胞系MU-SVL1能够用于培养多种病毒，比如，所述病毒为脑心肌炎病毒。

作为进一步优选，所述应用具体为：采用直接接种法，在含人胚肺细胞系MU-SVL1的无血清MEM培养基中接种病毒进行培养；

作为优选，所述培养为37℃，5％CO₂。

本发明还提供一种培养病毒的方法，其特征在于：采用直接接种法，在含上述人胚肺细胞系MU-SVL1的无血清MEM培养基中接种病毒进行培养；

作为优选，所述培养为37℃，5％CO₂。

作为优选，所述病毒为脑心肌炎病毒。

本发明提供的过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1 CCTCC No:C202374具有以下生物学特性：

(1)本发明的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞传代寿命明显延长，现已传至P90代。

(2)本发明的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞在P52和P72代时仍保持较高的增殖能力，倍增时间为40.15±0.34h。

(3)本发明的人胚肺细胞经液氮冻存复苏后细胞活率均可保持在80％以上，且生长良好。

(4)本发明的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞已成功过表达SV40-LT基因，稳定性好。

(5)本发明的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞染色体数目主要分布为2n＝46，为二倍体核型；随细胞代次的增加，出现多倍体。

(6)本发明的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞裸鼠成瘤性试验结果为阴性，无成瘤性。

(7)本发明的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞对脑心肌炎病毒敏感，与原代人胚肺细胞MU-L1和标准对照细胞MRC-5接近。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为不同浓度嘌呤霉素处理MU-L1细胞的结果(40×)。

图2为慢病毒以不同感染复数感染MU-L1细胞荧光效果(40×)。

图3为慢病毒转染MU-L1细胞24h荧光观察(40×)。

图4为稳转细胞株MU-SVL1的荧光观察(100×)。

图5为人胚肺细胞系MU-SVL1细胞传代过程中的细胞形态(100×)。

图6为不同代次MU-SVL1细胞的生长曲线(A)、倍增时间(B)和比生长速率(C)。

图7为RT-PCR检测人肺胚细胞系MU-SVL1细胞中SV40-LT基因的表达。

图8为WesternBlot检测人肺胚细胞系MU-SVL1细胞中SV40-LT蛋白的表达。

图9为人肺胚细胞系MU-SVL1细胞染色体中期分裂项。

图10为人肺胚细胞系MU-SVL1细胞成瘤性检查。

图11为人肺胚细胞系MU-SVL1细胞对脑心肌炎病毒敏感性(40×)。

图12为脑心肌炎病毒在人肺胚细胞系MU-SVL1细胞上增殖的TCID50结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1嘌呤霉素浓度及慢病毒MOI值的筛选

1.材料：

细胞：人胚肺细胞系MU-L1，来源于15周龄的胚胎肺组织，由本实验室分离培养，并将其于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No:C2022196，分离培养过程见中国发明专利申请202211272408.5。

MEM培养基(兰州百灵)；

新生牛血清(兰州民海)；

0.25％胰蛋白酶(兰州百灵)；

嘌呤霉素(美仑生物)；

空载慢病毒(吉凯基因)。

2.方法：

2.1嘌呤霉素浓度筛选

取生长状态良好的人胚肺细胞MU-L1，消化，用完全培养基制成细胞悬液，计数后按1×10⁵cells/孔接种至24孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。细胞融合至80％～90％时，弃去原培养基，PBS漂洗2遍，分别加入含嘌呤霉素浓度为1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0μg/mL的筛选培养基，每个浓度作3个复孔，继续于37℃、5％CO₂培养箱培养。每24h于镜下观察细胞状态，每2天更换新的筛选培养基，连续培养一周，以3-5天内杀死所有培养细胞的最低浓度确定为最佳筛选浓度。

所述的完全培养基为10％(V/V)新生牛血清的MEM培养基；

所述的筛选培养基为分别含1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0μg/mL嘌呤霉素的完全培养基。

2.2慢病毒MOI值筛选

为筛选出慢病毒感染人胚肺细胞的最佳感染条件和MOI值，分别设置含空载慢病毒的完全培养基组(M组)、含空载慢病毒和感染增强剂HiTransG P的完全培养基组(P组)和不含慢病毒和感染增强剂的完全培养基组(Control组)，表1。

所述完全培养基为含10％(V/V)新生牛血清的MEM培养基。

取生长状态良好的MU-L1细胞，按1×10⁴cells/孔接种96孔板，37℃培养24h，细胞汇合度达20％～30％进行慢病毒感染。将空载慢病毒置于冰上缓慢融化，按照表1中的条件分别配置MOI为10、50、100和150的感染试剂[病毒量计算公式为：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度]。吸掉各孔中的培养液，向各孔加入不同滴度空载慢病毒、感染增强试剂、完全培养基。在空载慢病毒感染MU-L1细胞12h后更换新的完全培养基继续培养，期间可以根据细胞状态更换培养基。在空载慢病毒感染MU-L1细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞的感染效率和细胞状态。选择感染效率在80％以上、且细胞状态良好的实验条件进行空载慢病毒感染。

表1感染预实验分组

3.实验结果

3.1人胚肺细胞最佳筛选嘌呤霉素浓度

用含不同浓度嘌呤霉素的筛选培养基培养MU-L1细胞，3-5天内可杀死所有MU-L1细胞的最低嘌呤霉素浓度为0.6μg/mL(图1)，因此确定嘌呤霉素抗性筛选的最佳浓度为0.6μg/mL。

图1为不同浓度嘌呤霉素处理MU-L1细胞的结果(40×)。

3.2人胚肺细胞慢病毒最佳感染条件及MOI值

以MOI值为10、50、100和150的空载慢病毒感染MU-L1细胞，感染24h后于荧光显微镜下观察，发现P组(完全培养基+HiTransG P+病毒)细胞感染效率明显高于M组(完全培养基+病毒)。P组中，MOI值为10时，可见少许细胞被感染，带有荧光；MOI值为50时，细胞感染效率达50％；MOI值为100和150时，荧光均明显增强，感染效率高于80％，细胞状态良好(图2)；因此确定慢病毒感染MU-L1细胞的最佳感染条件是在含HiTransG P的完全培养基中进行感染，MOI＝100为最佳感染复数。

图2为慢病毒以不同感染复数感染MU-L1细胞荧光效果(40×)。

实施例2稳定过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系的建立

1.材料

细胞：人胚肺细胞系MU-L1，来源同实施例1。

MEM培养基(兰州百灵)

新生牛血清(兰州民海)

0.25％胰蛋白酶(兰州百灵)

嘌呤霉素(美仑生物)

过表达SV40-LT的慢病毒液(吉凯基因)。

2.方法

2.1过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系的建立

取生长状态良好的人胚肺细胞系MU-L1细胞(P24)，消化并制成细胞悬液，以2×10⁵cells/孔接种12孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养24h，此时细胞融合为70％～80％。

将过表达SV40-LT基因的慢病毒置于冰上缓慢融化，用完全培养基将其稀释为1×10⁸TU/ml。根据实施例1筛选出最佳MOI值为100，用完全培养基配置过表达SV40-LT基因的慢病毒液(即完全培养基280μL，过表达SV40-LT慢病毒液200μL，HiTransG P20μL)，并设置空载对照组(即完全培养基280μL，空载慢病毒液200μL，HiTransG P 20μL)和空白对照组(完全培养基500μL)。

MU-L1细胞融合至70％～80％时，弃培养基，加入PBS轻轻漂洗2次，加入过表达SV40-LT基因的慢病毒液进行感染，并设置空载对照组和空白对照组，置于37℃、5％CO₂培养箱培养。连续12-16h后弃掉上清，加入2ml完全培养基，继续培养至24h于荧光显微镜下观察感染情况。

2.2稳转细胞筛选

由于慢病毒表达载体Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin含有puromycin抗性基因，人胚肺细胞经慢病毒转染过表达的细胞即可在含嘌呤霉素的完全培养基中存活，而未转染成功的细胞则会死亡。

慢病毒感染MU-L1细胞72h后，将完全培养基更换为含0.6μg/mL嘌呤霉素的培养基，每3天更换一次。在显微镜下观察到Control组细胞被嘌呤霉素杀光而实验组无细胞出现死亡时(荧光效率达到100％)，降低嘌呤霉素的浓度至筛选浓度的1/4，继续对感染的细胞进行筛选，连续筛选10代以获得稳定转染的细胞株。

3.实验结果

在含HiTransG P的完全培养基中加入MOI＝100的过表达SV40-LT慢病毒，感染MU-L1细胞，24h后在荧光显微镜下可见细胞生长状态良好，感染效率较高(图3)。感染72h后，用0.6μg/mL的嘌呤霉素筛选10代，成功构建了过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞(图4)，命名为人胚肺细胞系MU-SVL1，并将其于2023年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNo:C202374。

图3为慢病毒转染MU-L1细胞24h的荧光观察(40×)。

图4为稳转细胞株MU-SVL1的荧光观察(100×)。

实施例3人胚肺细胞系MU-SVL1细胞生长特性研究

1.材料

细胞：人胚肺细胞系MU-SVL1 CCTCC No:C202374、人胚肺细胞系MU-L1(对照细胞)

MEM培养基(兰州百灵)

新生牛血清(兰州民海)

0.25％胰蛋白酶(兰州百灵)

DMSO(SIGMA)。

2.方法

2.1人胚肺细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374传代培养

人胚肺细胞系MU-SVL1细胞(P24代)长满单层后，0.25％胰蛋白酶消化后按1：4的比例传代，并补充含10％新生牛血清的MEM培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。形成单层后继续按1：4的比例传代，每传代一次，细胞培养代次增加2代，细胞传代培养过程中观察细胞形态、生长状态及致密程度。

2.2人胚肺细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374生长曲线

取不同代次、生长状态良好的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞，经0.25％胰蛋白酶消化制成细胞悬液，用培养基调整细胞浓度为2×10⁴cells/mL，接种于24孔板，每孔1mL，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，同时制备人胚肺细胞系MU-L1细胞对照组。每24h观察细胞生长状态，分别消化3孔细胞，于细胞计数仪计数至出现最大峰值，绘制细胞生长曲线，并计算群体倍增时间和比生长速率。

2.3人胚肺细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374冻存前和复苏后活率检测

冻存前活率检查：人胚肺细胞系MU-SVL1细胞在连续传代培养过程中，每培养10代在液氮中冻存备用。人胚肺细胞系MU-SVL1细胞长满单层，用0.25％胰酶消化并收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清，加入细胞冻存液(70％MEM+20％新生牛血清+10％DMSO，V/V)重悬细胞，轻轻吹打成分散均匀的细胞悬液，分装至冻存管(1瓶T75细胞瓶子分装4支冻存管)，在冻存管上标明细胞名称、代次和冻存时间等信息。将冻存管于4℃低温平衡2h，-80℃过夜，最终置于液氮中长期保存。分装结束时取少量细胞悬液，用台盼蓝染色法检查细胞冻存前活率。

复苏后活率检查：从液氮中取出冻存的人胚肺细胞系MU-SVL1细胞，于37℃水中摇动使其快速融化，于超净工作台上吹打均匀，取少量细胞悬液用台盼蓝染色法检查细胞活率，剩余细胞悬液接入T75细胞瓶，补充培养液后置于37℃，5％CO₂条件下培养，约6h后观察细胞生长状态，待细胞贴壁后更换新鲜培养液继续培养。

3.实验结果

3.1人胚肺细胞系MU-SVL1CCTCC No:C202374传代寿命

人胚肺细胞系MU-SVL1细胞P24代长满单层后，按1:4传代比例连续传代培养，生长状态见图5。人胚肺细胞系MU-SVL1细胞传至P30、P50和P70代时，细胞状态仍保持良好，呈典型的长梭形，且72h可形成致密单层；P90代时细胞仍可以贴壁生长，但生长速度开始变慢，形态变大，且培养液中有黑色颗粒出现。而人胚肺细胞系MU-L1细胞传至P49代时，细胞增殖速度开始减慢，至P67代时不能细胞不能形成单层，无法继续传代。人胚肺细胞系MU-SVL1细胞较人胚肺细胞系MU-L1细胞传代寿命明显延长。

图5为人胚肺细胞系MU-SVL1细胞传代过程中的细胞形态(100×)。

3.2人胚肺细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374的生长曲线、倍增时间及比生长速率

过表达SV40-LT基因可促进人胚肺细胞增殖，并延长细胞传代寿命(见图6)。与MU-L1细胞相比，MU-SVL1细胞P32代的倍增时间和比生长速率无显著性差异(P＞0.05)，而P52代增殖能力明显增强，比生长速率较快，倍增时间较短，差异具有显著性。MU-SVL1细胞传至P72代时，增殖能力与MU-SVL1 P52代细胞接近，差异不显著(P>0.05)，传至P86代时，比生长速率显著减慢(P<0.001)，倍增时间显著延长(P<0.001)，细胞增殖能力减弱。

图6为不同代次MU-SVL1细胞的生长曲线(A)、倍增时间(B)和比生长速率(C)。3.3人胚肺细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374冻存复苏活率

通过台盼蓝染色法检查细胞冻存前和复苏后的细胞活率，经统计学分析(表2)发现人胚肺细胞系MU-SVL1细胞P28和P86代细胞冻存复苏后，细胞活率极显著降低(P＜0.01)，P50和P70代细胞冻存前和复苏后活率无显著性差异(P＞0.05)，且均保持在90％以上。

表2人胚肺细胞系MU-SVL1细胞冻存前和复苏后活率检测

注：a表示P>0.05差异不显著，*表示P<0.05差异显著。

实施例4SV40-LT基因表达的检测

1.材料

细胞：人胚肺细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374、人胚肺细胞系MU-L1(对照细胞)

TransZol Up强化RNA提取试剂盒(北京全式金生物)

Evo M-MLV反转录试剂预混液(艾科瑞生物)

PrimeScript^TM RTMaster Mix(Perfect Real Time)(Takara)

10X Loading Buffer(Takara)

DL2000 Marker(Takara)

高效RIPA组织/细胞快速裂解液(Solarbio)

PMSF(Solarbio)

蛋白定量试剂盒(Vazyme)

4X蛋白上样缓冲液(Solarbio)

CFASAny KD PAGE蛋白电泳凝胶制备试剂盒I型(中晖赫彩)

彩虹广谱蛋白Marker(Solarbio)

SV40-LT一抗(兔抗)(Cell Signaling)

β-actin一抗(兔抗)(Affbioteh)

二抗(山羊抗兔)(Abcam)

特超敏ECL化学发光即用型底物(博士德生物)。

2.方法

为了检测SV40-LT基因在永生化人胚肺细胞系连续传代培养过程中是否持续表达，利用RT-PCR和Western Blot对传代过程中人胚肺细胞系MU-SVL1细胞进行基因水平和蛋白水平检查。空载细胞和未转染细胞作对照。

2.1RT-PCR

2.1.1引物设计

根据NCBI SV40 LT基因的序列，用Primer 5软件进行引物设计，引物序列如表3，引物合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

表3引物序列

2.1.2RNA提取

使用TransZol Up强化RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，待检细胞于T25瓶长满单层，用PBS轻轻漂洗3次，吸弃PBS，加入1mLTransZol液于冰上彻底裂解细胞，用细胞刮刮下细胞，转移至无菌无酶的1.5mL EP管中。每管中加入适量氯仿(每1mL TransZol加200μL的氯仿)，剧烈震荡15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min。取上层水相，加入500μL异丙醇，混匀，室温静置10min，4℃、12000r/min离心10min。弃上清，加入1mL 75％的乙醇，混匀，4℃、7500r/min离心5min。弃上清，室温干燥5-10min，加入适量DEPC水充分溶解沉淀，用酶标仪检测RNA浓度及A₂₆₀/A₂₈₀值。

2.1.3反转录

参照EvoM-MLV反转录试剂盒说明书，将提取的RNA逆转录为cDNA。反应体系：5×Evo M-MLVRT Master Mix(2μL)，Total RNA(根据RNA浓度计算的加入量)，RNase freewater(Up to 10μL)。反应条件：37℃15min，85℃5s，4℃。

2.1.4RT-PCR反应

反应体系：

表4RT-PCR反应体系

反应条件：Stage 1：预变性(95℃30s，重复1次)，Stage 2：PCR反应(95℃5s，60℃30，重复40次)。

2.1.5琼脂糖凝胶电泳

反应结束，取10μLRT-PCR反应液经1％的琼脂糖凝胶，120V电泳30min。

2.2Western Blot检测

2.2.1细胞总蛋白的提取

细胞于T25瓶长满单层后用PBS轻轻漂洗3次，吸弃PBS，加入1mL含蛋白酶抑制剂(PMSF)的蛋白裂解液(RIPA)(RIPA：PMSF＝100:1)，用细胞刮刮下细胞，将细胞及裂解液轻轻地转移至预冷的1.5mL EP管中，4℃，12000r/min离心10分钟后收集上清至新的EP管。

2.2.2蛋白浓度的测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书要求检测待测蛋白的浓度。

2.2.3SDS－PAGE电泳

蛋白样品加入5×的SDS Loading Buffer，吹打混匀后于100℃水浴10min。按照凝胶试剂盒说明书要求分别配制分离胶和浓缩胶，上样量Marker为5μL，样品蛋白为10μL。电泳时先80V恒温电压20～30min，待蛋白Marker条带分离后，转为120V恒压继续电泳至目的蛋白分离。

2.2.4转膜

电泳结束后采用湿转法将目的蛋白转印至PVDF膜上。将完成电泳的凝胶浓缩胶切掉然后放入转膜缓冲液中，同时裁剪、浸泡滤纸。PVDF膜放入甲醇中进行活化30s，放入转膜缓冲液中进行平衡10min。转膜时方向为：转膜夹(黑色)-海绵-三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-转膜夹(白色)，赶走气泡，夹紧转膜夹。将夹子放入转膜槽槽中于冰上转膜，150mA，恒流转膜2h。

2.2.5免疫反应

封闭：转膜结束后，将带有目的蛋白的PVDF膜置于5％脱脂奶粉中室温封闭2h。

一抗孵育：封闭结束，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5min。加入稀释好的一抗(SV40-LT抗体稀释浓度为1:1000，β-actin抗体稀释浓度为1:2000)，4℃孵育过夜。

二抗孵育：一抗孵育结束，PVDF膜用TBST漂洗3次，每次10min。加入稀释好的二抗(抗兔IgG H&L(HRP)稀释浓度为1:2000)，室温孵育1h，孵育结束，用TBST漂洗3次，每次10min。

2.2.6显色

根据化学发光ECL显色试剂盒说明书要求配置发光液，PVDF膜经发光液作用1min后，于成像仪中曝光拍照。

3.实验结果

为了检测SV40-LT是否在人肺胚细胞系MU-SVL1细胞中稳定表达，本发明利用RT-PCR和Western Blot分别检测不同代次MU-SVL1细胞的SV40-LT基因mRNA和蛋白表达情况。RT-PCR结果显示转染SV40-LT后的人肺胚细胞系MU-SVL1细胞不同代次均能扩增出特异性片段，而原代人胚肺细胞和慢病毒空载细胞均未扩增出特异性片段(图7)；Western Blot结果显示转染SV40-LT后的人肺胚细胞系MU-SVL1细胞不同代次均出现特异性条带，空白对照原代人胚肺细胞和慢病毒空载细胞均无特异性条带(图8)。结果表明SV40-LT基因已成功转入人肺胚细胞系MU-SVL1细胞并能稳定表达。

图7为RT-PCR检测人肺胚细胞系MU-SVL1细胞中SV40-LT基因的表达。其中泳道1-6依次为人肺胚细胞系MU-L1、慢病毒空载对照、人肺胚细胞系MU-SVL1-P35、人肺胚细胞系MU-SVL1-P55、人肺胚细胞系MU-SVL1-P73、人肺胚细胞系MU-SVL1-P83，泳道M：DNAMarker，泳道7-12分别为GAPDH内参。

图8为Western Blot检测人肺胚细胞系MU-SVL1细胞中SV40-LT蛋白的表达。实施例5人肺胚细胞系MU-SVL1细胞遗传特性研究

1.材料

细胞：人肺胚细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374

秋水仙碱(Acmec)

吉姆萨染液(SIGMA)。

2.方法

(1)取对数生长期的人肺胚细胞系MU-SVL1细胞(P38、P54、P76和P88)，向培养基中加入终浓度为0.5μg/mL的秋水仙素，于37℃、5％CO₂培养箱继续培养2～4h。常规方法消化并收集细胞，1500r/min离心10min。

(2)低渗处理：弃上清，加入10mL 37℃预热的0.075mM KCl低渗液，轻轻吹打均匀，37℃水浴30min。

(3)预固定：低渗结束，加入500μL固定液(甲醇：乙酸＝3:1，V/V)轻轻吹打均匀，静置2min，1500r/min离心10min。

(4)再固定：弃上清，加入10mL固定液，轻轻吹打均匀，静置30min，1500r/min离心10min。

(5)第三次固定：按“再固定”步骤重复固定。

(6)制片：弃上清，根据细胞密度，加入适量固定液配置细胞悬液用于滴片。滴片时将细胞悬液从1m高处滴于预冷的载玻片上，自然晾干。

(7)染色：用Giemsa染液染色10min，水洗，晾干。

(8)镜检：用中性树胶封片，在低倍镜下找到分散均匀、染色较好的染色体视野，油镜下观察并拍照，统计50个处于分裂中期的铺展完好的分裂相统计分析染色体数目。

3.结果

对人肺胚细胞系MU-SVL1细胞的染色体中期分裂项进行观察(见图9)，随机挑选50个分散均匀的视野统计染色体数目。经统计，人肺胚细胞系MU-SVL1细胞不同代次染色体数目主要分布为2n＝46，二倍体核型；在P54、P76、P88代均发现多倍体核型，2n＞53，且随细胞代次的增加，多倍体发生率增大(见表5)。

表5人肺胚细胞系MU-SVL1细胞染色体数目统计

图9为人肺胚细胞系MU-SVL1细胞染色体中期分裂项。

实施例6人肺胚细胞系MU-SVL1细胞成瘤性研究

1.材料

细胞：人肺胚细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374、MRC-5细胞(阴性对照细胞)、Hela细胞(阳性对照细胞)。

裸鼠：4～7周龄雌性BALB/c裸鼠。

2.方法

取生长状态良好的人肺胚细胞系MU-SVL1细胞，常规方法消化后收集细胞，1000r/min离心10min，弃上清，加入PBS重悬细胞，稀释为5×10⁷cell/mL，皮下接种与4～7周龄雌性BALB/c裸鼠的左肩胛部，定期观察裸鼠体重变化及注射部位是否有结节形成。Hela细胞和MRC-5细胞分别作阳性对照和阴性对照。

3.实验结果

将生长状态良好的细胞接种裸鼠后，每隔5天观察并测量裸鼠体重，人肺胚细胞系MU-SVL1待测组和MRC-5阴性对照组裸鼠身体健康状态良好，体重无明显异常波动，接种部位均无结节形成；Hela阳性对照组裸鼠在第五天开始体重升高，第10天后降低，连续饲养35±5天，6只裸鼠均在接种部位形成了肿瘤结节(图10)，触摸有波动感，随着饲养时间延长，结节逐渐增大。

经统计，阳性对照Hela细胞成瘤率为100％，人肺胚细胞系MU-SVL1和MRC-5阴性对照组成瘤率均为0(表6)，表明人肺胚细胞系MU-SVL1无成瘤性。

表6裸鼠形成肿瘤数目统计

图10为人肺胚细胞系MU-SVL1细胞成瘤性检查。

实施例7人肺胚细胞系MU-SVL1细胞病毒敏感性研究

1.材料

细胞：人肺胚细胞系MU-SVL1细胞CCTCC No:C202374、人肺胚细胞系MU-L1细胞(对照细胞)、MRC-5细胞(对照细胞)。

病毒：脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)，由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室提供。

2.方法

(1)细胞铺板：人肺胚细胞系MU-SVL1细胞长满单层后，消化、计数，按1×10⁴cells/孔接种至96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。人肺胚细胞系MU-L1和MRC-5细胞做对照。

(2)病毒稀释：取EMCV病毒(滴度为10^6.4TCID₅₀/mL)于冰上解冻，用无血清的MEM培养基将病毒液作连续10倍的稀释(10^-1-10^-9)。

(3)接毒前，观察细胞生长状态，细胞长满单层，弃去孔内的培养基，用PBS漂洗2次，加入100μL不含血清的MEM培养基(四周边孔200μL/孔)。

(4)TCID₅₀的测定：将稀释好的病毒接种到长满单层细胞的待检细胞96孔板中，每一稀释度接种6孔，每孔接种100μL。边缘孔补充200μLMEM培养基。设6孔阴性对照。于37℃，5％CO₂培养箱培养4天，每天于镜下观察细胞病变情况并记录，按Reed-Muench两氏法计算TCID₅₀/mL。

3.结果

人肺胚细胞系MU-SVL1细胞对EMCV病毒具有敏感性(图11)，病毒滴度(TCID₅₀)见表7。脑心肌炎病毒在人肺胚细胞系MU-SVL1细胞上增殖的病毒滴度与MRC-5细胞和人肺胚细胞系MU-L1细胞接近，无显著差异(P＞0.05)(图12)。

表7脑心肌炎病毒在人胚肺细胞上增殖的病毒滴度结果

图11为人肺胚细胞系MU-SVL1细胞对脑心肌炎病毒敏感性(40×)。

图12为脑心肌炎病毒在人肺胚细胞系MU-SVL1细胞上增殖的TCID50结果。

综上所述，本发明提供一种过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1。与原代人胚肺细胞MU-L1相比，人肺胚细胞系MU-SVL1 CCTCC No:C202374的传代寿命明显延长，目前已传至P90代。随着细胞代次的增加，人肺胚细胞系MU-SVL1有多倍体(2n＞53)发生，无成瘤性，对脑心肌炎病毒敏感。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1，其保藏编号为CCTCCNo:C202374。

2.权利要求1所述的过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1的制备方法，其特征在于：利用慢病毒感染方法，将SV40-LT基因导入人胚肺细胞MU-L1，使用嘌呤霉素筛选出稳转细胞系，得到过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1；

作为优选，所述嘌呤霉素浓度为0.6μg/mL；

作为优选，使用含HiTransGP的完全培养基进行感染，感染复数为：MOI＝100。

3.权利要求1所述的过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1的扩大培养方法，其特征在于：将人胚肺细胞系MU-SVL1加入到含有10％新生牛血清的MEM培养基中进行培养，然后进行传代；所述培养条件为：37℃，5％CO₂；

作为优选，所述人胚肺细胞系MU-SVL1细胞按照1:2～1:8的传代比例进行传代，细胞均生长良好；最优传代比例为1:4。

4.根据权利要求3所述的过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1的扩大培养方法，其特征在于：所述培养基中含有8-10％(v/v)的血清。

5.根据权利要求3或4所述的过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1的扩大培养方法，其特征在于：还包括将扩大培养的细胞进行冻存的步骤，人胚肺细胞系MU-SVL1使用的细胞冻存液由以下体积百分比的各组分组成：70％MEM培养基+20％新生牛血清+10％DMSO；

作为优选，冻存P50或P70代人胚肺细胞系MU-SVL1。

6.权利要求1所述的过表达SV40-LT基因的人胚肺细胞系MU-SVL1在培养病毒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述病毒为脑心肌炎病毒。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述应用具体为：采用直接接种法，在含人胚肺细胞系MU-SVL1的无血清MEM培养基中接种病毒进行培养；

作为优选，所述培养为37℃，5％CO₂。

9.一种培养病毒的方法，其特征在于：采用直接接种法，在含权利要求1所述的人胚肺细胞系MU-SVL1的无血清MEM培养基中接种病毒进行培养；

作为优选，所述培养为37℃，5％CO₂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述病毒为脑心肌炎病毒。