CN118178682A - 一种负载Mn2+的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脂质纳米颗粒技术领域，公开了一种负载Mn2+的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明制备的Mn@LNP主要由可电离脂质A4I18R2C18‑2、磷脂、胆固醇、PEG脂质和Mn2+溶液制备得到。所述Mn@LNP的制备方法包括以下步骤：将可电离脂质A4I18R2C18‑2、磷脂、胆固醇和PEG脂质混合均匀后，配制成有机相；在有机相中快速注入双蒸水，搅拌后静置；以双蒸水透析后，得到脂质纳米颗粒溶液；加入Mn2+溶液后搅拌；超滤后离心，得到负载Mn2+的脂质纳米颗粒。本发明制备的Mn@LNP对Mn2+的包封率高达67.7％，且能够靶向肝脏，实现与化疗药物阿霉素共同使用抑制肝脏肿瘤生长。
Description
技术领域
本发明涉及脂质纳米颗粒技术领域，更具体地，涉及一种负载Mn2+的脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
脂质纳米颗粒(LNP)在克服mRNA疗法的递送障碍方面表现出有效性和安全性，针对2019冠状病毒病(COVID-19)，现有两种授权mRNA-LNP疫苗(mRNA-1273和BNT162b)。在过去十年中，人们研究了在配制的LNP的几种成分中，可电离脂质(IL)为其中核心成分。
Ugi四组分反应(Ugi-4CR)在醛、异氰化物、胺和羧酸之间温和发生，并有效生成肽样-α聚酰胺。用Ugi-4CR反应来调节IL结构。Ugi-4CR产生的含双酰胺键的可电离脂质(IL)在提高LNPs颗粒稳定性方面具有优势。
对于人类和动物，全身性Mn状态受稳态机制的调节。适量的Mn是维持生命活动所必须的，Mn的主要毒性作用是针对中枢神经系统，使包括运动和认知功能受损。Mn诱导炎症会对大脑微环境中造成无法弥补的损害。增加的Mn含量通过增加NF-κB介导的促炎细胞因子的产生来激活炎症信号通路。肿瘤坏死因子a(TNF-a)，白细胞介素(IL-1，IL-6，IL-8，IL-18)，干扰素(IFNγ)和趋化因子等炎症因子是导致大脑细胞损伤的主要因素。基于Mn的递送药物没有靶向性，其缺点包括肿瘤靶向效率低以及随机扩散导致不必要的自身免疫毒性。
He等人发现，与商业的IL DLin-MC3-DMA(MC3)相比，A4I18R2C18-2在肝脏中显示出更好的递送效果。A4I18R2C18-2是肝脏靶向mRNA递送的IL候选药物。
现有技术涉及一种脂质纳米颗粒及包含其的药物组合物。所述脂质纳米颗粒包含6元杂环胺和烷基环氧化物结合的可电离脂质；磷脂；胆固醇；和神经酰胺-PEG(聚乙二醇)结合物，所述烷基环氧化物具有C6至C14的碳长度，所述磷脂为DOPE或DSPC，所述神经酰胺-PEG结合物的含量为0.5～3mol％，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比为25～45:10～20:40～55:0.5～3的可电离脂质：磷脂：胆固醇：神经酰胺-PEG结合物。其中脂质纳米颗粒对肝脏组织具有特异性。
现有技术公开了一种可电离脂质纳米颗粒组合物，包括关键脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质、金属螯合物和治疗性药物，所述关键脂质为iBL0104，所述辅助脂质选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和DEPC之一。制备的可电离脂质纳米颗粒组合物可同时实现肿瘤的诊断和治疗。
然而，上述现有技术没有涉及对于非mRNA的其他分子的递送评价，现有技术是否在递送佐剂如锰离子佐剂时也有靶向肝脏的效果，从而起到治疗肝脏肿瘤的作用，也无从得知。
发明内容
为克服现有技术脂质纳米颗粒不能递送非mRNA的其他分子(如Mn2+)的缺陷，提供一种含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒；
本发明的另一目的在于提供一种含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒负载Mn2+；所述可电离脂质A4I18R2C18-2的结构式为：所述可电离脂质A4I18R2C18-2的分子式为C50H98N3O2。
进一步地，所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒主要由可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇、PEG脂质和Mn2+溶液制备得到。
进一步地，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，所述PEG脂质为1,2-二肉豆醇-丙基甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。
优选地，所述脂质纳米颗粒的粒径为70～130nm。
一种所述负载Mn2+的脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1：将可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇和PEG脂质混合均匀后，溶于有机溶液配制成有机相；
S2：在有机相中快速注入双蒸水(ddH2O)；
S3：搅拌后静置；
S4：以ddH2O透析后，得到脂质纳米颗粒溶液；
S5：往脂质纳米颗粒溶液中加入Mn2+溶液，搅拌，负载Mn2+；
S6：超滤后离心，去除游离的Mn2+后，得到负载Mn2+的脂质纳米颗粒(Mn@LNP)。
优选地，S1将可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇和PEG脂质混合均匀后，溶于乙醇中配制成有机相；
优选地，S2中有机相与ddH2O混合体积比为2：3。
优选地，S4所述透析的条件为4℃下透析2h。
优选地，S4所述透析采用1000MWCO透析袋。
优选地，S5所述搅拌为在4℃下搅拌过夜。
优选地，S6所述超滤采用100KDa超滤管。
进一步地，S1所述可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇和PEG脂质的物质的量比为50：10：38.5：1.5。
进一步地，S2所述有机相处于搅拌状态下，搅拌速度为800～1200rpm；
进一步地，S3所述搅拌的速度为800～1200rpm；S3所述继续搅拌的时间为1～10min，静置时间为20～30min。
优选地，S2和S3所述搅拌的速度为1200rpm，S3所述继续搅拌的时间为5min，静置时间为30min。
进一步地，S5所述Mn2+溶液的Mn2+与S1所述可电离脂质A4I18R2C18-2的物质的量比为3：2。
进一步地，S6所述离心的速度为10000～14000g，时间为5～10min。
优选地，S6所述离心为25℃下10000g离心10min。
一种含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的应用，用于制备治疗肝脏肿瘤的药物。
本发明创新采用的可电离脂质A4I18R2C18-2具有酰胺键，可以与Mn2+络合，使得基于A4I18R2C18-2的LNP可以负载Mn2+。Mn2+是一种可以激活cGAS-STING通路的佐剂，负载Mn2+的LNP可以靶向肝脏，脂质纳米颗粒Mn@LNP到达肝脏后通过胞吞作用进入细胞后释放Mn2+，继而激活cGAS-STING通路，促进促炎因子TNF-a和IL-6的产生。因此，以Mn@LNP制备的药物可应用在靶向肝癌的治疗中。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
(1)本发明制备的脂质纳米颗粒可负载Mn2+。基于脂质纳米颗粒中可电离脂质A4I18R2C18-2的酰胺键与Mn2+的配位作用，在Mn2+/A4I18R2C18-2的摩尔比为3/2时，Mn2+的包封率高达67.7％，载药量达11.6％。
(2)本发明制备的Mn@LNP稳定性高。在本发明的制备条件下，制备的Mn@LNP粒径范围在70～130nm。在4℃冰箱里，可以稳定保存16天，PDI小于0.2，颗粒均一性高。
(3)本发明制备的Mn@LNP具有靶向肝脏的特点。使用小动物活体成像仪观察到体内和离体荧光信号主要在小鼠肝脏被检测到，对总辐射度进行量化可看出肝脏的辐射度最高，小鼠肝脏部位有较多的Mn@LNP累积。
(4)本发明制备的Mn@LNP与化疗药物阿霉素(DOX)起到协同作用。Mn@LNP+DOX可抑制肝脏肿瘤生长，防止肿瘤转移的出现，维持肝脏正常组织形态，效果优于单独使用Mn@LNP或DOX。
(5)本发明制备的Mn@LNP具有良好的生物安全性。当Mn@LNP浓度在5μmol/L以下时，细胞存活率高达95％以上。Mn@LNP能更有效激活BMDC产生促炎因子TNF-a和IL-6，继而引发一系列免疫反应和炎症反应，TNF-a和IL-6的平均表达量分别高达185.45pg/mL和55.22pg/mL。
附图说明
图1为配合物Mn-A4I18R2C18-2的紫外-可见光谱，a为UV图、b为在274nm处JobPlot图；
图2为配合物Mn-A4I18R2C18-2的红外光谱，a为A4I18R2C18-2和Mn2+不同物质的量比、b中A4I18R2C18-2和Mn2+物质的量比1：1.5；
图3为A4I18R2C18-2与Mn2+不同物质的量比时的包封率；
图4为可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇和PEG脂质的不同物质的量比时的Mn@LNP粒径；
图5为不同溶液体系制备Mn@LNP的粒径图，a为实施例1、b为对比例1、c为对比例2；
图6为不同溶液体系制备Mn@LNP的颗粒形态TEM图，a为实施例1、b为对比例1、c为对比例2；
图7为Mn@LNP稳定性示意图，a为DLS粒径图、b为PDI粒径分布图；
图8为Mn@LNP的小鼠体内分布图；
图9为Mn@LNP在小鼠主要脏器区域的总辐射度；
图10为Mn@LNP细胞毒性示意图，a为细胞存活率、b为IC50；
图11为Mn@LNP激活促炎因子表达，a为TNF-α表达量、b为IL-6表达量；
图12为小鼠体重检测示意图；
图13为小鼠黑色素瘤细胞活体成像示意图，a为在小鼠的体内分布、b为在小鼠心、肝、脾、肺、肾及肠中的分布；
图14为小鼠的心、肝、脾、肺、肾及肠组织学染色示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
DSPC、DMG-PEG和胆固醇购于A.V.T.(Shanghai,China)；MnSO4·H2O购于广州化学试剂厂，AR。Matrigengel Matrix购于厦门模基生物科技有限公司。ELISA试剂盒购于InvitroGen。可电离脂质A4I18R2C18-2和B16-Luc细胞由中山大学陈永明课题组提供。
实施例1
1、一种负载Mn2+的脂质纳米颗粒的制备
将总量为600μg由可电离脂质A4I18R2C18-2、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000组成的混合物(物质的量比为50：10：38.5：1.5)溶于乙醇中配制成有机相。取300μL ddH2O快速注入200μL有机相中，1200rpm搅拌5min后室温下静置30min。然后通过1000MWCO透析袋在ddH2O中进行透析，4℃透析2h得LNP溶液。将LNP溶液与116.4μL浓度1mg/mL的MnSO4溶液(溶剂：ddH2O)混合，在4℃下搅拌过夜得到。所获得的溶液用100KDa超滤管，25℃10000g离心10min，去除游离的Mn2+后，得到Mn@LNP。
2、验证实验
实施例2
1、一种负载Mn2+的脂质纳米颗粒的制备
将总量为600μg由可电离脂质A4I18R2C18-2、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000组成的混合物(物质的量比为50：10：38.5：1.5)溶于乙醇中配制成有机相。取300μL ddH2O快速注入200μL有机相中，800rpm下搅拌10min后室温下静置30min。然后通过1000MWCO透析袋在ddH2O中进行透析，室温下透析得LNP溶液。将LNP溶液与116.4μL浓度1mg/mL的MnSO4溶液(溶剂为ddH2O)混合，在室温下搅拌过夜得到。所获得的溶液用100KDa超滤管，25℃14000g离心5min，去除游离的Mn2+后，得到Mn@LNP。
2、验证实验
实施例3
1、一种负载Mn2+的脂质纳米颗粒的制备
将总量为600μg由可电离脂质A4I18R2C18-2、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000组成的混合物(物质的量比为50：10：38.5：1.5)溶于乙醇中配制成有机相。取500μL ddH2O快速注入300μL有机相中，1200rpm下搅拌1min后室温下静置20min。然后通过1000MWCO透析袋在ddH2O中进行透析，4℃透析2h得LNP溶液。将LNP溶液与77.6μL浓度1.5mg/mL的MnSO4溶液(溶剂为ddH2O)混合，在4℃下搅拌过夜得到。所获得的溶液用100KDa超滤管，25℃10000g离心10min，去除游离的Mn2+后，得到Mn@LNP。
2、验证实验
对比例1
对比例1的技术方案与实施例1相似，区别在于透析体系和Mn2+的溶剂为PBS(1x)。
对比例2
对比例2的技术方案与实施例1相似，区别在于透析体系和Mn2+的溶剂为HEPES溶液(300mM)。
对比例3～5
对比例3～5的技术方案与实施例1相似，区别在于加入Mn2+溶液的Mn2+与可电离脂质A4I18R2C18-2的物质的量比不同，如表1所示。
表1 Mn2+与可电离脂质A4I18R2C18-2的物质的量比
| 方案 | 物质的量比 |
| 对比例3 | 1：3 |
| 对比例4 | 1：2 |
| 对比例5 | 1：1 |
对比例6～10
对比例6～10的技术方案与实施例1相似，区别在于可电离脂质A4I18R2C18-2、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000的物质的量比不同，如表2所示。
表2可电离脂质A4I18R2C18-2、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000的物质的量比
| 方案 | 物质的量比 |
| 对比例6 | 30：30：38.5：1.5 |
| 对比例7 | 35：25：38.5：1.5 |
| 对比例8 | 45：15：38.5：1.5 |
| 对比例9 | 40：20：38.5：1.5 |
| 对比例10 | 40：20：35：5 |
验证方法
1、A4I18R2C18-2与Mn2+的络合验证
(1)在溶剂为80％乙醇溶液条件下，固定A4I18R2C18-2和Mn2+总浓度为1mM不变，改变A4I18R2C18-2和Mn2+的物质的量比。使用紫外分光光度计分别测量MnSO4溶液、可电离脂质A4I18R2C18-2以及MnSO4溶液和可电离脂质A4I18R2C18-2混合12h后在260～400nm波段的紫外-可见光谱图。
(2)可电离脂质A4I18R2C18-2与Mn2+的不同物质的量比下，将可电离脂质A4I18R2C18-2与MnSO4混合12h后使用紫外分光光度计测量在274nm处的吸光度值。
(3)在溶剂为无水乙醇条件下，固定A4I18R2C18-2浓度为60mM不变，改变A4I18R2C18-2和Mn2+的物质的量比。使用红外光谱仪测可电离脂质A4I18R2C18-2和Mn-A4I18R2C18-2与Mn2+在不同络合比时的吸收曲线。
(4)改变可电离脂质A4I18R2C18-2与Mn2+的摩尔比，做成脂质纳米颗粒后，10000～14000rpm超滤得超滤液，间接法测出Mn2+的包封率。
2、Mn@LNP肝靶向验证
用DIR标记Mn@LNP(1:1000稀释)，将DIR加入由A4I18R2C18-2、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000组成的混合物(摩尔比为50：10：38.5：1.5)溶解的乙醇相中。取300μL ddH2O快速注入200ul脂质溶液中，超声5min后静置30min。ddH2O中透析2h得LNP溶液，与116.4μL MnSO4溶液(溶剂：ddH2O，1mg/mL)混合搅拌过夜得到Mn@LNP(A溶液)。所获得的溶液用100KDa超滤管，25℃10000g离心10min。
尾静脉给药剂量按Mn@LNP 6mg/kg。给药6h后，使用小动物活体成像仪观察颗粒在动物体内的分布。
3、Mn@LNP细胞毒性验证
以浓度2.5、5、10、20、30、40、50μmol/L的Mn@LNP处理24h后对Raw264.7细胞的细胞活力进行验证。
4、TNF-α和IL-6含量检测
将诱导的小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)稀释成5×105个/mL，铺在24孔板中，每孔接种1mL。阴性对照组即PBS组，阳性对照组为浓度为的MnSO4溶液(0.72μg/mL)，实验组为Mn@LNP(6.28μg/mL)。药物刺激24h后，按照InvitroGen官网ELISA说明书进行检测BMDC上清液中TNF-α和IL-6的含量。
5、构建肝脏原位肿瘤模型
使用异氟烷对小鼠进行麻醉后，仰卧位并固定四肢于实验板上，用剪子小心剃去胸腹部毛，酒精消毒后，沿腹白线逐层开腹，暴露小鼠腹腔，轻压小鼠胸腔，肝脏便跳出腹腔，选取最接近体表的肝叶种植肿瘤。注射针头斜行进针，刺入肝脏约1cm左右，回抽确认不在血管后，轻推注射器针芯，缓慢注入与Matrigengel Matrix按1：1体积比混合的细胞悬液20μL，约1×106个B16-Luc细胞。缓慢退针并无菌棉签轻压1min以防出血及肿瘤渗出引起广泛种植转移，轻送肝脏还纳腹腔，逐层关腹并进行消毒缝合。观察小鼠苏醒后的状态。一周后小鼠肝脏原位肿瘤模型构建成功，可用于后续实验。
6、小鼠体重检测
第I组未接受处理(对照)。第II组在第0天、第3天和第6天接受腹腔注射DOX(3mg/kg)。第III组在第0天、第5天和第10天接受尾静脉注射Mn@LNP(6mg/kg)。第IV组在第0天、第3天和第6天接受腹腔注射DOX(3mg/kg)，在第0天、第5天和第10天接受尾静脉注射Mn@LNP(6mg/kg)。每天记录一次体重，持续14天。
7、Mn@LNP和DOX的体内靶向协同
在肝脏原位肿瘤模型进一步评价Mn@LNP和DOX的体内靶向协同效果，首先构建肝脏原位肿瘤模型，模型构建成功后，将小鼠随机分为4组，每组3只。每组分别腹腔注射PBS、游离DOX、Mn@LNP、Mn@LNP+游离DOX。
第I组未接受治疗，腹腔注射PBS(对照)。第II组在第0天、第3天和第6天接受腹腔注射DOX(3mg/kg)。第III组在第0天、第5天和第10天接受尾静脉注射Mn@LNP(6mg/kg)。第IV组在第0天、第3天和第6天接受腹腔注射DOX(3mg/kg)，在第0天、第5天和第10天接受尾静脉注射Mn@LNP(6mg/kg)。在治疗第0天、第4天、第7天、第10天和第13天，使用小动物活体成像仪分析肿瘤生长以及转移情况。治疗结束后，收集小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾、肠)，用小动物活体成像仪进一步分析肿瘤生长以及转移情况。
8、生物安全性HE染色检测
在治疗结束后，实施小鼠安乐死，并解剖收集其肿瘤组织以及主要脏器，包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肠。随后，将小鼠的肿瘤组织和脏器浸泡于10％福尔马林中进行固定处理2天，然后进行包埋处理以制备组织蜡块。利用冷冻切片机将蜡块切割成厚度为2μm的组织切片，随后使用苏木素和伊红(HE染色)分别对细胞核和细胞质进行染色。最后，通过显微镜观察肿瘤组织以及各脏器组织细胞的形态变化。
验证结果
1、与Mn2+的络合验证
通过紫外吸收光谱研究可电离脂质A4I18R2C18-2与Mn2+之间的金属配位作用。根据图1a，随着Mn2+比例的增加，配合物Mn-A4I18R2C18-2在吸收峰(274nm)的吸光度先增大后减小。图1b，以Mn2+在A4I18R2C18-2和Mn2+总浓度中的占比作为横坐标，将274nm处紫外吸收峰吸光度值与Mn2+在A4I18R2C18-2和Mn2+总浓度中的占比的乘积作为纵坐标，作图，得出最佳络合比，即Mn2+：A4I18R2C18-2＝3：2。
通过FT-IR光谱研究了A4I18R2C18-2与Mn2+的相互作用，图2a结果显示，A4I18R2C18-2：Mn2+＝1：0.1至1：0.2时的红外吸收峰与A4I18R2C18-2的红外吸收峰十分接近，说明Mn2+添加量较低时形成的配位键还不足以使吸收峰产生显著的位移。A4I18R2C18-2：Mn2+＝1：1，Mn2+同样是欠量配位，酰胺上的羰基C＝O伸缩振动峰发生红移。
如图2b，当A4I18R2C18-2：Mn2+＝1：1.5时，酰胺上的羰基C＝O由原本1675cm-1迁移到1628cm-1；仲胺的N-H伸缩振动出现蓝移现象，从3327cm-1移动到3409cm-1；1215cm-1处C-N伸缩振动消失，说明A4I18R2C18-2与Mn2+形成了饱和配位。当Mn2+过量配位时，仲胺的N-H伸缩振动吸收峰强度增大，说明N、H原子电负性增加，极性变大，伸缩振动时偶极矩变化增大。
根据图3，对比例3～5的Mn2+与可电离脂质A4I18R2C18-2的物质的量比分别为1：3、1：2和1：1时，测得包封率均小于45％。当添加的A4I18R2C18-2与Mn2+的物质的量比为最佳络合比为2：3时，制备的Mn@LNP包封率最佳，可达67.7％。
2、Mn@LNP颗粒稳定性验证
根据图4和表3，以Intensity(％)为标准，对比例6～10的粒径均大于150nm，且PDI偏大。在向肝细胞递送药物的过程中，从肝窦腔通向肝细胞的窗孔直径在人类中约为100nm。以实施例1中A4I18R2C18-2：DSPC：胆固醇：DMG-PEG2000的比例制备的Mn@LNP，其粒径不大于130nm，具有优异的向肝细胞的药物递送效率。另外，实施例1具有更小的PDI，颗粒更为均一。
表3对比例6～10的Mn@LNP粒径和PDI
| 粒径(nm) | PDI | |
| 实施例1 | 106 | 0.12 |
| 对比例6 | 160 | 0.52 |
| 对比例7 | 215 | 0.50 |
| 对比例8 | 203 | 0.43 |
| 对比例9 | 231 | 0.29 |
| 对比例10 | 284 | 0.56 |
根据图5a，以number(％)为标准，实施例1的Mn@LNP与LNP相比，颗粒直径集中在70～90nm之间，分散系数更小。图5c可看出，对比例2所制备的Mn@LNP分散系数为0.5，体现了颗粒非均一性，说明HEPES溶液不适合作为透析体系。
根据图6可以看出，在ddH2O透析体系下得到的Mn@LNP，其颗粒的粒径均一。另外，对比例1使用PBS溶液透析后加入含锰溶液，静置2h后，发现溶液中有白色沉淀，说明PBS溶液不适合作为透析体系。
由表4可知，当透析体系采用ddH2O时，Mn2+包封率和载药量最高，分别达到67.7％和11.6％。Mn2+包封率和载药量分别比对比例1高出5.9％和0.9％，比对比例2高出27.4％和4.3％。
表4不同透析体系下Mn@LNP的Mn2+包封率和载药量
| 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | |
| Mn2+包封率 | 67.7％ | 61.8％ | 40.5％ |
| 载药量 | 11.6％ | 10.7％ | 7.3％ |
根据图7，若将实施例1制备的Mn@LNP保存在4℃冰箱里，可以稳定保存16天，粒径大致保持在70～80nm之间，PDI小于0.2，颗粒均一性高。
3、Mn@LNP的小鼠体内分布和细胞毒性实验
根据图8，对小鼠活体和体外器脏(心、肝、脾、肺、肾)的活体成像显示，小鼠体内和离体荧光信号主要在肝脏被检测到，表明小鼠肝脏部位有较多的Mn@LNP累积。根据图9，通过主要脏器区域的总辐射度进行量化，可以看出肝脏的辐射度最高，表明小鼠肝脏部位的Mn@LNP累积远大于其他部位的。以上结果证实了Mn@LNP具备靶向肝脏的能力。
图10a表明，当Mn@LNP浓度在5μmol/L以下时，细胞存活率高达95％以上；图10b中，IC50＝11.87μmol/L。以上结果说明Mn@LNP在一定浓度范围内具有生物安全性。
根据图11，促炎因子TNF-a和IL-6的平均表达量分别高达185.45pg/mL和55.22pg/mL，较单独以相同浓度的Mn2+刺激，分别提高了837％和75.97％。故Mn@LNP能更有效激活BMDC产生TNF-a和IL-6，继而引发一系列免疫反应和炎症反应。
4、Mn@LNP与化疗药物阿霉素(DOX)的协同作用
根据图12，在给药期间，DOX组(第Ⅱ组)和佐剂加化药Mn@LNP+DOX组(第Ⅳ组)的小鼠体重均显示出平稳的生长趋势，PBS组(第Ⅰ组)和佐剂Mn@LNP组(第Ⅲ组)由于在过程中肿瘤的生长没有得到有效的抑制，所以小鼠体重增长较快。
根据图13，PBS组和佐剂Mn@LNP组的肿瘤体积逐渐增大，在后期出现肠转移的现象。化药DOX组的3只小鼠中，也有1只出现肠转移。而随着时间的延长，通过小动物活体成像仪中肿瘤体积和辐射强度我们可以看出，佐剂加化药Mn@LNP+DOX组有效地抑制了黑色素瘤的生长，也抑制了黑色素瘤的转移，治疗效果优于PBS组、佐剂Mn@LNP组和化药DOX组。
根据图14，在14天的给药过程中，除Mn@LNP+DOX组的肝脏组织切片是正常的组织形态，其他3组的肝脏组织切片中都有大片的肿瘤区域和坏死区域。对主要器官(心、脾、肺、肾、肠)的HE染色组织学观察显示，对照组或处理组在给药期间对小鼠均无明显生理形态变化或组织损伤，其急性病理毒性和不良反应可忽略不计。Mn@LNP+DOX的处理对小鼠均无明显副作用，具有良好的生物安全性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒，其特征在于，负载Mn2+；所述可电离脂质A4I18R2C18-2的结构式为：
2.根据权利要求1所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒，其特征在于，主要由可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇、PEG脂质和Mn2+溶液制备得到。
3.根据权利要求1所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱，所述PEG脂质为1,2-二肉豆醇-丙基甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
4.一种权利要求1～3任一项所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇和PEG脂质混合均匀后，溶于有机溶液配制成有机相；
S2：在有机相中快速注入双蒸水；
S3：搅拌后静置；
S4：以双蒸水透析后，得到脂质纳米颗粒溶液；
S5：往脂质纳米颗粒溶液中加入Mn2+溶液，搅拌，负载Mn2+；
S6：超滤后离心，去除游离的Mn2+后，得到负载Mn2+的脂质纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S1所述可电离脂质A4I18R2C18-2、磷脂、胆固醇和PEG脂质的物质的量比为50：10：38.5：1.5。
6.根据权利要求4所述所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S2所述有机相处于搅拌状态下，搅拌速度为800～1200rpm。
7.根据权利要求4所述所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S3所述搅拌的速度为800～1200rpm，所述搅拌的时间为1～10min，静置时间为20～30min。
8.根据权利要求4所述所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S5所述Mn2+溶液的Mn2+与S1所述可电离脂质A4I18R2C18-2的物质的量比为3：2。
9.根据权利要求4所述含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，S6所述离心的速度为10000～14000g，时间为5～10min。
10.一种权利要求1～3任一项含可电离脂质A4I18R2C18-2的脂质纳米颗粒的应用，其特征在于，用于制备治疗肝脏肿瘤的药物。
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