CN118166102A - 用于cin2+早期检测和/或术后复发监控的组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的组合物及试剂盒，所述组合物包含针对目标基因PAX1和JAM3的甲基化区域设计的相关引物，还可以包括上述目标基因的检测探针和内参基因检测引物和探针。本发明的组合物能够有效特异性扩增上述目标基因并对其扩增产物进行熔解曲线分析，可以单管、单荧光通道检测上述目标基因，具有高特异性、耗时短、灵敏度高、检测位点覆盖全面等优点，同时由其组成的试剂盒还包括一步法样本前处理核酸裂解和重亚硫酸盐转化试剂，可以显著缩短样本前处理时间，给临床医生提供辅助诊断参考，提早进行治疗以及预后监测，临床应用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及核酸体外诊断技术领域，具体涉及一种用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的组合物及试剂盒。
背景技术
目前，宫颈癌是世界女性第四大易发癌种之一。宫颈癌病因明确，高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持续感染是必要条件，由宫颈癌前病变发展至浸润性宫颈癌的过程可长达十年，因而早期进行宫颈癌筛查可以有效阻断癌前病变的进展。近年来，随着基因检测和基因编辑技术的发展、预防性HPV疫苗的推广以及治疗性疫苗的开发研究，为宫颈癌早期筛查及预防指明了新的方向。
人乳头瘤病毒(HPV，全称为human papillomavirus)被认为是宫颈癌发生的最主要原因，其和宫颈癌的关系最先于在上世纪70年代的时候由德国的科学家Harald zurHausen提出，而后得到了验证。据研究，HPV有多达100多种亚型，目前通常根据它的致癌性与否分为低危型和高危型：低危型的HPV通常不会导致恶性病变，但是高危型的HPV感染可能会最终导致宫颈癌前病变和宫颈癌，例如，最主要的两种高危型HPV病毒HPV-16和HPV-18基本跟90％以上的宫颈癌相关。在通常情况下，绝大多数的HPV感染都是暂时的，约超过90％以上的感染会在2～3年里清除掉，而这被认为归因于人类的细胞调节免疫系统。但值得注意的是，在感染后对HPV-16病毒的抗体似乎只能起到相对普通的效果，没能够自发清除掉该病毒的患者在随后的数年或数十年中有发展成为宫颈上皮内瘤病变CIN(cervicalintraepithelial neoplasia)甚至宫颈癌的危险。
DNA甲基化是表观遗传学的一种修饰方式，研究报告，DNA甲基化能影响正常哺乳动物细胞的基因表达和沉默；同时，在人类肿瘤研究中发现，DNA甲基化通常能导致肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛变化。肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化或者低甲基化都可能导致细胞转化，使得DNA甲基化状态能够成为肿瘤检测的潜在标志物。
DNA甲基化在不改变DNA序列的情况下调节基因转录。肿瘤抑制基因的异常高甲基化和癌基因的低甲基化在早期肿瘤发生过程中至关重要，相关的表观遗传药物已被证明对宫颈癌的治疗有效。DNA甲基化相对稳定，肿瘤类型的普遍修饰与癌症的发病机制和进展有关，并与患者的预后有关，建立宫颈癌DNA甲基化的复发预测模型，对帮助临床医生识别高危患者和实施积极治疗具有临床意义。
目前一些采用DNA甲基化来进行宫颈上皮内瘤病变和宫颈癌检测的方法和相关试剂容易出现假阳性问题，另外为追求检测结果准确性，需要同时检测多种目标基因的相关甲基化位点来综合判断，检测成本高。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的上述问题，提供一种用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的组合物及试剂盒，以解决常规CIN2+早期检测和术后复发监控容易出现假阳性结果的问题。
本发明技术方案详述如下：
第一方面，本发明提供了一种用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的组合物，其特征在于，包括目标基因检测引物，所述引物针对目标基因PAX1和JAM3的甲基化区域设计，核苷酸序列如下：
PAX1基因甲基化正向引物F：GGGAAGGGAGTGTTTTAAGTAG(SEQ ID NO.1)，
PAX1基因甲基化反向引物R：TAACCTATAAATCCCCAAACAACT(SEQ ID NO.2)；
JAM3基因甲基化正向引物F：GTAGTGTTGTGTTTTTTAGAAGGGA(SEQ ID NO.3)，
JAM3基因甲基化反向引物R：CCCAAAAAACTATAACCAAACAAC(SEQ ID NO.4)。
PAX1(paired box gene 1)基因是位于20号染色体的PAX基因家族中的一员，对胎儿发育和细胞增殖有着关键作用。PAX1基因启动子的甲基化在肿瘤的发生和发展中起着重要的表观遗传学调控作用。有研究表明PAX1在宫颈癌和卵巢癌中发生甲基化而沉默，因而PAX1也被当作是肿瘤抑制基因。
JAM3(junctional adhesion molecule 3)是JAM基因家族中的一员，JAM基因家族能直接对上皮细胞和内皮细胞的紧密连接作用产生影响。大量文献研究报告JAM3，通常也被称作JAMC，是连接调节因子。近年来，许多文献报告JAM3在肿瘤发展中对肿瘤有重要的调节作用，如其甲基化在结直肠癌和宫颈癌中均有表现。
本发明所述的CIN2+，是指宫颈高级别上皮内瘤样变(HSIL)CIN2级及以上，包括CIN2、CIN3和宫颈癌。
本发明针对的目标基因PAX1甲基化区域序列如下：
TTTAGGGGGTAGTTGAGTAAGTTTGGGAAGGGAGTGTTTTAAGTAGAC
GCGTTAAAAGTCGCGAAAGGGTACGGAGGGTTATAATGCGTCGCGTTTTAT
TTCGCGGTTTTTTTGCGTTTTTGTTTATTTTAAGTTAGATTTAGGCGGTTTGT
TTTTGGATTTCGAGTTGTTTGGGGATTTATAGGTTATTTTTGGAAGT(SEQ ID NO.10)。
本发明针对的目标基因JAM3甲基化区域序列如下：
TAGTAGTGTTGTGTTTTTTAGAAGGGACGGTGAGCGGGGGACGTAGTT GAGGATCGGCGAGGTAGAGTTTCGAGGTTTGGCGGGTTGTTTGGTTATAGT TTTTTGGGGATTTGTAGTTTATTTGATT(SEQ ID NO.11)。
可选或优选的，上述组合物，还包括目标基因检测探针，所述探针针对目标基因PAX1和JAM3的甲基化区域设计，核苷酸序列如下：
PAX1基因探针：CGT+CGCG+TTTTATTT+CGCG(SEQ ID NO.7)；
JAM3基因探针：CGG+CGAGGTAGAGTTTCG(SEQ ID NO.8)；
所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
可选或优选的，上述组合物，还包括内参基因GAPDH的检测引物和探针，核苷酸序列如下：
内参基因GAPDH正向引物F：TTTAAGTTAGGTTAGTTTGGTAGGG(SEQ ID NO.5)，
内参基因GAPDH反向引物R：AACAACCCTAAACCACCTCC(SEQ ID NO.6)；
内参基因GAPDH探针：TTGGGTTTTTTTGGGG(SEQ ID NO.9)；
所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
第二方面，本发明提供了一种用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的试剂盒，包括以上任一所述的组合物。
可选或优选的，上述试剂盒，每100μmol/L的组合物中：
PAX1基因甲基化正向引物F加入量为0.01-0.05μL，
PAX1基因甲基化反向引物R加入量为0.03-0.15μL；
JAM3基因甲基化正向引物F加入量为0.01-0.05μL，
JAM3基因甲基化反向引物R加入量为0.03-0.15μL；
在有内参基因GAPDH检测引物的情况下，每100μmol/L的组合物中：
内参基因GAPDH正向引物F加入量为0.01-0.05μL，
内参基因GAPDH反向引物R加入量为0.03-0.15μL。
可选或优选的，上述试剂盒，每100μmol/L的组合物中：
FAM基因探针加入量为0.3-0.5μL；
JAM3基因探针加入量为0.3-0.5μL；
在有内参基因GAPDH检测探针的情况下，每100μmol/L的组合物中：
内参基因GAPDH探针加入量为0.3-0.5μL。
可选或优选的，上述试剂盒，还包括：PCR反应液，所述PCR反应液每一人份由浓度1U/μL多重扩增的Taq DNA聚合酶0.5～1μL、浓度10mM的dNTPs1～5μL、浓度10mM的Mg2+2～5μL、10×DNA聚合酶buffer 1-5μL和纯化水补足15μL组成。
可选或优选的，上述试剂盒，还包括：样本核酸裂解液，所述裂解液由1wt％的盐酸胍，0.1wt％的NaOH，1wt％的SDS，0.5wt％的NP-40和余量纯化水组成。
可选或优选的，上述试剂盒，还包括：样本重亚硫酸盐转化试剂，所述转化试剂由1wt％的亚硫酸氢钠，1wt％的硫酸铵，1wt％的NaCl，0.5wt％的NaOH和余量纯化水组成。
与现有技术相比，本发明提供的用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的组合物及试剂盒，具有如下有益效果：
(1)本发明设计的引物特异性好
样本基因组DNA在转化产物中存在多种模板序列，比如有未被转化的基因组DNA、转化后含甲基化位点区域发生甲基化的基因组DNA、转化后含甲基化位点区域未发生甲基化的基因组DNA等等。因此经过重亚硫酸转化之后的转化产物组成比较复杂，仅依靠特异性引物和探针容易受到其他序列模板的干扰，不能很好地识别对应目标基因的甲基化区域。
为了充分将转化后产物中的发生甲基化区域序列模板释放出来，以便特异性的引物和探针能够更好地识别结合。因此在引物探针的设计上，主要分为两步：第一步需要有效区分转化前的目标基因DNA模板和转化后的目标基因DNA模板，这个区分的设计主要在于非CG位点处的胞嘧啶，即转化前的DNA序列为C，而转化后的DNA序列为U。进一步经过引物设计区分转化前和转化后的DNA模板。本发明所设计的引物对应于转化后的目标基因DNA模板，即能够识别转化后DNA序列中CG部分变为UG，而样本中在转化前就已经发生甲基化的CG位点则无法识别扩增，因而能有效区分转化前和转化后的目标基因DNA模板。
第二步引物探针的设计主要在于区分转化后DNA模板中甲基化与非甲基化的序列，即转化后的DNA序列中CG位点是否发生甲基化，若发生甲基化则CG转化之后仍为CG，而未发生甲基化的CG转化之后变为UG，通过上述的不同，设计专门结合发生甲基化区域的CG位置即可将此分子标志物的甲基化区域有效扩增。本发明所设计的引物，针对甲基化区域CG在转化前即发生甲基化的情况，即引物序列对应于甲基化位点的CG设计，进而使得该甲基化位点在转化前没有发生甲基化(此时转化后变为UG)的模板就不会有扩增产物。
通过特异性引物的识别，有效排除转化前序列模板的干扰，提高引物对甲基化区域的特异性精确识别，增加检测灵敏度和特异性。
(2)本发明设计的探针特异性好
为使检测体系为一管三基因多重引物扩增，再经探针熔解曲线分型，并且只需单个荧光通道就能将三个基因区分出来，本发明对于靶基因PAX1和JAM3探针的设计加上了锁核酸(LNA)修饰。这一设计一方面提高探针识别模板序列的特异性，与目标序列具有更好的结合性；另一方面增加探针序列的TM值，能够将三个目标基因通过Tm值进行清晰判读，不相互干扰。以上序列经过批量引物的设计和筛选，最终确定上述探针的具体序列。实验证明，三个基因的扩增效率与其单重扩增效率一致，说明在多重反应体系没有受到抑制影响。
(3)本发明试剂盒检测省时省力
本发明的试剂盒所有探针可单管、单荧光通道对目标基因进行检测，能对CIN2+(包含CIN2、CIN3和宫颈癌)与炎症或CIN1进行有效区分，具有高特异性(94.1％)、耗时短、灵敏度高(85.8％)、检测位点覆盖全面等优点，同时还包括一步法样本前处理核酸裂解和重亚硫酸盐转化试剂，可以显著缩短样本前处理时间。
本发明通过目的基因PAX1和JAM3的组合检测以及合理的阈值(使用准确病理信息的临床样本经过ROC曲线确定合理的阳性判断值)设定来增加宫颈癌早期检测的准确性以及对术后复发的监测，提高了反应体系筛选的准确性和CIN2+早期检测及术后复发监测的可靠性，最大限度地避免了假阳性和假阴性结果的出现，使得整个试剂盒的检测性能得到明显提升，给临床医生提供辅助诊断参考，提早进行治疗以及预后监测，临床应用广泛。
附图说明
图1为实施例中PAX1、JAM3和内参基因(GAPDH)的探针分型熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合实施例及附图，对本申请进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例中所用仪器、试剂，如无特殊说明均来源于商业渠道。
实施例1CIN2+早期检测及术后复发监控的引物探针组合物及试剂盒效果评价
引物探针组合物对应的目标基因为PAX1基因和JAM3基因。由于宫颈癌以及不同级别宫颈病变具有多样性，因此本发明采用PAX1和JAM3多基因多甲基化位点的联合检测以在功能上形成互补，有利于提高高级别病变以及宫颈癌的检测准确率。
针对上述PAX1和JAM3基因中发生高度甲基化的CpG岛区域设计检测引物探针，需要有效区分转化前的DNA模板和转化后的DNA模板，区分设计主要在于非CG位点处的胞嘧啶，即转化前的DNA序列为C，而转化后的DNA序列为U，进一步经过引物设计区分转化前和转化后的DNA模板。通过特异性引物的识别，有效排除转化前序列模板的干扰，提高引物对甲基化区域的特异性精确识别，增加检测灵敏度和特异性。
另外，为实现一管反应检测多基因多甲基化区域的目的，我们对靶基因PAX1和JAM3探针的设计加上锁核酸(LNA)修饰，一方面提高探针识别模板序列的特异性，与目标序列具有更好的结合性；另一方面增加探针序列的TM值，能够将三个目标基因(包括内参基因)通过Tm值进行清晰判读，不相互干扰。利用扩增产物在特异性引物探针熔解曲线分型技术，使甲基化的序列充分释放出来，实现一管反应检测多基因多甲基化区域的目的。
针对三个目标基因的引物探针核苷酸序列如下：
PAX1基因甲基化正向引物F：GGGAAGGGAGTGTTTTAAGTAG，
PAX1基因甲基化反向引物R：TAACCTATAAATCCCCAAACAACT；
JAM3基因甲基化正向引物F：GTAGTGTTGTGTTTTTTAGAAGGGA，
JAM3基因甲基化反向引物R：CCCAAAAAACTATAACCAAACAAC；
内参基因GAPDH正向引物F：TTTAAGTTAGGTTAGTTTGGTAGGG，
内参基因GAPDH反向引物R：AACAACCCTAAACCACCTCC。
PAX1基因的甲基化位点对应的Taqman探针、JAM3基因的甲基化位点对应的Taqman探针、内参基因GAPDH对应的Taqman探针，核苷酸序列如下：
PAX1基因探针：FAM-CGT+CGCG+TTTTATTT+CGCG-BHQ1；
JAM3基因探针：FAM-CGG+CGAGGTAGAGTTTCG-BHQ1；
GAPDH基因探针：FAM-TTGGGTTTTTTTGGGG-BHQ1。
PCR反应液包括DNA Taq聚合酶、dNTPs和Mg2+、10×DNA聚合酶buffer等。DNA聚合酶的筛选以及与dNTPs、Mg2+、10×DNA聚合酶buffer之间的配比直接关系到引物和探针的组合的扩增效率。检测试剂盒组分如表一所示。
表一试剂盒组分表
表二PCR反应液(15ul/人份)组分表
| 组分 | 一人份加入量(μL) |
| Taq DNA聚合酶(1U/μL) | 0.5 |
| dNTPs(25mM) | 3 |
| Mg2+(1.5mM) | 4 |
| 10×DNA聚合酶buffer | 5 |
| 纯化水 | 补足至15μL |
本实施例中PCR反应液能够使体系中每一个基因引物探针的扩增效率与其对应的单重扩增时类似，确保体系中的引物或者探针之间不相互干扰，充分发挥每一组引物探针的扩增效果。
引物探针混合液的配制见表三。
表三引物探针混合液(5μL/人份)组分表
利用上述试剂盒的成分进行CIN2+早期检测及术后复发监控监测，包括以下步骤：
(1)样本来源：选取来自中国医学科学院北京协和医院已知明确病理信息结果的301例年龄不小于18岁女性的宫颈脱落细胞样本：52例鉴定为宫颈鳞癌样本、11例宫颈腺癌样本；40例为低级别上皮内病变(CIN1)样本和78例宫颈炎症样本；120例高级别上皮内病变(CIN2和CIN3)样本。
(2)对上述301例宫颈脱落细胞样本进行细胞基因组DNA的提取，采用样本核酸裂解液(由含量1％的盐酸胍，0.1％的NaOH，1％的SDS，0.5％的NP-40和纯化水组成)对上述样本进行基因组DNA的提取。取1mL宫颈脱落细胞样本离心收集沉淀，加入80μL上述样本核酸裂解液，充分混匀，95℃10min充分释放基因组DNA。
(3)取步骤(2)中得到的细胞基因组DNA 20μL，进行重亚硫酸盐转化，加入重亚硫酸盐转化试剂(由含量1％的亚硫酸氢钠，1％的硫酸铵，1％的NaCl，0.5％的NaOH和纯化水组成)80μL，98℃30min使DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而发生甲基化的5’胞嘧啶(C)不发生改变，最后得到转化后的Bis-DNA。
(4)按照表二和表三配制PCR反应液和引物探针混合液，配制扩增反应体系，按照下述步骤(6)反应条件进行熔解曲线扩增。
(5)加样，如表一所示，向步骤(4)中配制的混合液体系中加入5μL阳性质控品和转化好的Bis-DNA临床样本作为阴性质控品。
(6)扩增程序如下：
step1：95℃预变性3min；
step2：94℃变性15s，60℃退火延伸45s，50个循环；
step3：25℃，1min；
taqman探针熔解曲线条件
step1：95℃预变性3min；
step2：37℃3分钟；
step3：37℃上升到90℃，升温速率为0.1℃/秒(收集荧光)；
step4：25℃，1min；
注：信号收集，收集FAM荧光信号。
(7)检测结果分析
通过选取病理信息明确的临床样本对甲基化检测的试剂盒反应体系通过ROC曲线对阳性判断值进行确定，包含宫颈癌(腺癌、鳞癌等)样本、低级别宫颈病变样本(CIN1)、宫颈高级别病变样本(CIN2和CIN3)以及炎症样本，即所检测PAX1和JAM3基因中至少一个基因发生甲基化，即宫颈癌的发生为高风险。
检测结果如表四。对比临床病理结果，整体特异性为94.1％，CIN2+检测灵敏度为85.8％。其中，对CIN2、CIN3、宫颈鳞癌和宫颈腺癌的检出率分别为62.1％、84.6％、100％和90.9％；对CIN1和炎症的阴性检出率为92.5％和94.9％。从以上结果可以看出，本试剂盒能较好地对宫颈高级别病变以及宫颈癌进行鉴别，实现与低级别病变以及炎症的分流，在一定程度上能减少患者不必要的阴道镜转诊。
表四试剂盒反应体系检测共301例样本的检测结果
注：LSIL指宫颈高级别上皮内瘤样变。
(8)结果判读分析
通过ROC曲线进行靶基因cutoff值的确定，包括Tm值范围及-d(Rn)/dT(熔解峰纵坐标峰值)。
表五PAX1和JAM3的判读
(9)用上述确定的试剂盒进行CIN2+术后复发监控的研究，样本来源于中国医学科学院北京协和医院，分别对CIN2，CIN3，宫颈癌术前(手术之前一个星期内取样)术后(三个月取样)样本进行收集，取自CIN2样本术前术后样本各10例，CIN3样本术前术后样本各17例，宫颈癌术前术后样本各15例。检测结果如下表所示：
表六术后复发监控结果
从上述数据中可以得出，甲基化检测在CIN2+术后检测中的特异性能达到100％，进一步提示甲基化对CIN2+宫颈病变具有术后复发监测的意义。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的组合物，其特征在于，包括目标基因检测引物，所述引物针对目标基因PAX1和JAM3的甲基化区域设计，核苷酸序列如下：
PAX1基因甲基化正向引物F：SEQ ID NO.1，
PAX1基因甲基化反向引物R：SEQ ID NO.2；
JAM3基因甲基化正向引物F：SEQ ID NO.3，
JAM3基因甲基化反向引物R：SEQ ID NO.4。
2.根据权利要求1所述的组合物，还包括目标基因检测探针，所述探针针对目标基因PAX1和JAM3的甲基化区域设计，核苷酸序列如下：
PAX1基因探针：SEQ ID NO.7；
JAM3基因探针：SEQ ID NO.8；
所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，还包括内参基因GAPDH的检测引物和探针，核苷酸序列如下：
内参基因GAPDH正向引物F：SEQ ID NO.5，
内参基因GAPDH反向引物R：SEQ ID NO.6；
内参基因GAPDH探针：SEQ ID NO.9；
所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
4.用于CIN2+早期检测和/或术后复发监控的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，每100μmol/L的组合物中：
PAX1基因甲基化正向引物F加入量为0.01-0.05μL，
PAX1基因甲基化反向引物R加入量为0.03-0.15μL；
JAM3基因甲基化正向引物F加入量为0.01-0.05μL，
JAM3基因甲基化反向引物R加入量为0.03-0.15μL；
在有内参基因GAPDH检测引物的情况下，每100μmol/L的组合物中：
内参基因GAPDH正向引物F加入量为0.01-0.05μL，
内参基因GAPDH反向引物R加入量为0.03-0.15μL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每100μmol/L的组合物中：
FAM基因探针加入量为0.3-0.5μL；
JAM3基因探针加入量为0.3-0.5μL；
在有内参基因GAPDH检测探针的情况下，每100μmol/L的组合物中：
内参基因GAPDH探针加入量为0.3-0.5μL。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR反应液，所述PCR反应液每一人份由浓度1U/μL多重扩增的Taq DNA聚合酶0.5～1μL、浓度10mM的dNTPs 1～5μL、浓度10mM的Mg2+2～5μL、10×DNA聚合酶buffer1-5μL和纯化水补足15μL组成。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括：样本核酸裂解液，所述裂解液由1wt％的盐酸胍，0.1wt％的NaOH，1wt％的SDS，0.5wt％的NP-40和余量纯化水组成。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括：样本重亚硫酸盐转化试剂，所述转化试剂由1wt％的亚硫酸氢钠，1wt％的硫酸铵，1wt％的NaCl，0.5wt％的NaOH和余量纯化水组成。
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