CN118165920A - 一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液和使用方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液和使用方法及其应用，Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液由mHTF培养液和性控成分组成；所述性控成分为24e药物和葡萄糖，24e药物浓度为0.1‑0.15 uM；葡萄糖的含量为每1000 ml mHTF培养液添加360.32mg‑720.64mg，使用方法：将新鲜精液与mHTF培养液混合后离心，去除上清液后使用小鼠性控分选液重悬；在37℃下静置孵育，得到分层精液；将分层精液上层分离，得到Y精液；沉淀分离，将药物洗脱后，孵育得到X精液；利用本发明对小鼠精液的X、Y精子进行分选，简单易行，而且花费的时间少，对精子产生的伤害小。
Description
技术领域
本发明涉及动物繁殖领域，特别提供一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液和使用方法及其应用。
背景技术
性控技术（sex control）是指通过人为干预，使动物繁育按照人们所希望的性别繁殖后代的技术；随着现代生物技术的不断发展，人们已经能够通过基因编辑、胚胎操作等手段对生物体进行精确的遗传改造；其中，小鼠作为哺乳动物模型，具有繁殖周期短、遗传背景清晰等优势，因此成为研究性别决定机制和控制技术的理想对象。
然而，目前小鼠性控分选技术仍面临一些挑战和限制，例如，传统的流式细胞仪分选法分选后精子活力和顶体完整精子的百分比明显下降，导致精子的生育能力减弱，人工授精后受胎率较低、对输精技术要求较高，且操作复杂、成本较高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液，由mHTF培养液和性控成分组成；所述性控成分为24e药物和葡萄糖，所述24e药物的浓度为0.1 uM-0.15 uM；所述葡萄糖浓度为2-4 mM；
所述24e药物的分子式为C21H28N6，分子结构式如图5所示。
进一步地，所述mHTF培养液由氯化钠 、氯化钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾 、二水氯化钙 、碳酸氢钠、丙酮酸钠、乳酸钠、青链霉素、酚红、牛血清白蛋白组成；
进一步地，每1000 ml mHTF培养液由氯化钠 5.9375 g，氯化钾 0.3496 g，七水硫酸镁 0.0493 g，磷酸二氢钾 0.054 g，二水氯化钙 0.3 g， 碳酸氢钠 2.1 g，丙酮酸钠0.0365 g，乳酸钠3.42 g，青链霉素10 ml，酚红0.2 ml，牛血清白蛋白4 g和去离子水配制而成；Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液是在mHTF培养液的基础上加入24e药物。
进一步地，每1000 ml mHTF培养液中加入24e药物36.449ug-54.6735ug；
进一步地，每1000 ml mHTF培养液添加葡萄糖360.32mg-720.64mg。
进一步地，所述24e药物为吡啶[3,2-d]嘧啶类TLR7&8双激动剂。
进一步地，采用实时荧光定量PCR验证所述Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液的分选效果所使用的引物，分别为Y染色体特异性基因SRY基因引物对、X染色体特异性基因PLP基因引物对、内参基因GAPDH基因引物对；
所述Y染色体特异性基因SRY基因引物对为SRY-F和SRY-R；
所述SRY-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SRY-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
所述X染色体特异性基因PLP基因引物对为PLP-F和PLP-R；
所述PLP-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PLP-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
所述内参基因GAPDH引物对为GAPDH-F和GAPDH-R；
所述GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述GAPDH-R的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
另一方面，本发明提供了一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液的使用方法，包括如下步骤：
步骤1：将取自小鼠附睾尾的精液离心，去除上清液后使用Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液重悬精子；
步骤2：在37℃温度下静置孵育60 min-90 min，得到分层精液；
步骤3：将步骤2得到的分层精液上层分离，得到含有Y染色体的精液，即Y精液；
步骤4：将步骤2得到的分层精液沉淀分离，得到含有X染色体的精液；
步骤5：将步骤4得到的含有X染色体的精液使用mHTF培养液将药物洗脱后，37℃孵育15-25min，得到X精液。
另一方面，本发明还提供了一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液的应用。
进一步地，用于鉴定小鼠精子种类或制备用于鉴定小鼠精子种类的试剂盒。
进一步地，用于分选、筛选小鼠X、Y精子或制备用于分选、筛选小鼠X、Y精子的试剂盒。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：
1、利用本发明所提供的Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液对小鼠精液的X、Y精子进行分选，简单易行，而且分选过程是在精子所适宜条件下进行且不需要对精子进行复杂的处理，分选所花费的时间少，对精子产生的伤害小。
2、本发明提供的24e药物激活了X精子特异性表达的TLR7&8，从而抑制了X精子的活动性，Y精子不表达TLR7&8，因此24e药物无法作用于Y精子，24e药物是TLR7&8双激动剂的可逆性结合分子，分选过程仅使X精子和Y精子运动活力产生差异，不改变精子的生存能力、顶体完整性及质膜完整性，精子活力的差异使得Y精子和X精子得以分离。
3、实验研究发现，在睾丸中的圆形精子和附睾中的成熟精子中均有约50%的精子表达TLR7&8，并且经过转录组学和蛋白质组学进一步验证了TLR7&8表达发生在X精子上，而在Y精子并不表达，其中，TLR7定位于尾部，TLR8定位于中段，激活TLR7和TLR8不仅抑制了己糖激酶活性，还抑制了精子中的线粒体活性，从而减弱了糖酵解途径以及三羧酸循环，进而减少了ATP的生成，致使X精子活力下降，从而实现性控精子的分选。
4、本发明提供的24e药物的激活选择性地抑制了X精子的活动性，而对Y精子没有作用，但没有改变精子的生存能力或顶体的形成，精子活力的差异使得Y精子和X精子得以分离；而葡萄糖能够促进精子的运动，从而使Y精子更快上浮，分层更加明显，提高了分选效率。
附图说明
图1为实施例1中不同量的24e药物对上层溶液中精子数量的影响；
图2为实施例2中葡萄糖的作用浓度对X精子和Y精子分选效果的影响；
图3（a）为实施例3方法一对照组中X精子和Y精子的占比，图3（b）为实施例3方法一上清中X精子和Y精子的占比；图3（c）为实施例3方法一沉淀中X精子和Y精子的占比；
图4为实施例3方法二的实验结果；
图5为本发明24e药物的分子结构式；
图6为洗脱前后性控精子活力。
具体实施方式
实施例1 24e药物作用浓度影响
通过在补充有本发明提供的Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液中孵育小鼠的精子来检查24e药物对精子的影响。
1、取35 mm培养皿，无菌条件滴两滴mHTF培养液，每滴100 uL，缓慢加入石蜡油3mL，使两滴mHTF培养液完全被覆盖，38℃培养箱平衡2-4 h备用。
2、取12周龄雄鼠两侧附睾尾置于含有两滴mHTF培养液的35 mm培养皿中，剥离脂肪后，再将两个附睾尾分别置于上述平衡好的mHTF培养液中，200倍倒置显微镜下使用10ml注射器针头剥离精子，将附睾尾组织取出，37℃培养箱中上浮20 min-30 min，缓慢吸取两个液滴上层各50 uL至含有900 uL、37℃保温mHTF培养液的离心管中，得到1 mL待分选小鼠精液。
3、检测待分选小鼠精液活力和密度，活力为80.26%，密度为1.7×107个/mL；其中，精子密度仪为AccuCell；精子活力指的是快速运动精子和中速运动精子占总精子数的比率。
4、在37℃的条件下通过将24e药物添加到待分选小鼠精液中孵育精子60 min，使用的24e药物在待分选小鼠精液中的浓度分别为0 uM、0.05 uM、0.1 uM、0.15 uM、0.2 uM，使用精子密度仪检测小鼠精子孵育后上层精子百分比，如图1和表1所示，当在24e药物存在的情况下孵育精子时，与对照组（24e药物的浓度为0 uM）相比，24e药物的浓度为0.05 uM、0.1 uM、0.15 uM、0.2 uM时，上层漂浮的精子的百分比均降低，24e药物使用量为0.1 uM-0.15 uM时，上层精子密度下降到对照组上层精子密度的一半且趋于稳定；由于24e药物能够特异性作用于X精子从而抑制X精子的活性，当24e药物的浓度为0.1 uM-0.15 uM时，精子在37℃孵育之后，X精子被最大程度抑制了活性而沉于下层，而Y精子活性不受影响而趋于上浮，故可知，0.1 uM-0.15 uM为24e药物对小鼠精子分选的最佳作用浓度范围。
表1 上层精子密度变化
实施例2 葡萄糖作用浓度影响
在实施例1探索出0.1 uM-0.15 uM为24e药物在小鼠精子密度为1.7×107个/mL时对小鼠精子分选的最佳作用浓度范围的基础上，通过含有24e药物浓度为0.15 uM的分选液中添加不同量的葡萄糖孵育小鼠精子来检查葡萄糖对精子的影响；将待分选小鼠精子密度调整为1.7×107个/mL，离心去除上清液保留精子沉淀，使用24e药物浓度为0.15 uM的分选液1ml重悬，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为0 mM、2 mM、4 mM、6 mM和8 mM，37℃孵育60 min后，分离上层精液330 ul,使用CASA软件检测精子密度后，统计其占1.7×107个精子的比率，如图2所示，当葡萄糖浓度为2-4 mM时精子上浮率最高，与不含葡萄糖的对照组相比上浮差异显著。
实施例3 分选过程及分选效果验证
1、如实施例1中从成熟雄性小鼠双侧附睾尾获取精液；
2、将精液置于分选瓶中，37℃，1500 rpm，离心5 min，弃上清液后加入37℃保温的Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液，使精子密度达到1.7×107个/mL，分选液中24e药物的最终浓度为0.1 uM，分选后分选瓶中分为三层，上层为Y精液、下层为X精液，中间层含有少量精子；
3、37℃静置保温60 min-90 min后，缓慢将上层Y精液、下层X精液吸出，其中，所吸出的上层、下层精液应分别为总体积的33.3%；
4、37℃、1500 rpm将Y精液、X精液分别离心5 min，弃去上清，保留精子沉淀，使用与Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液等体积的mHTF培养液分别将X精液、Y精液重悬，37℃、1500 rpm离心5 min，弃去上清mHTF培养液和24e药物混合物，保留沉淀；再使用与Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液等体积的mHTF培养液分别将X精液、Y精液重悬，得到小鼠性控X精液、小鼠性控Y精液，图6为洗脱前后性控精子直线运动速度和平均路径速度，从图中可看出，洗脱后X精子活力显著提高，Y精子活力无显著变化，Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液并未影响小鼠Y精子的活力；
5、分选得到的小鼠性控X精液、小鼠性控Y精液直接用于体外受精（也可以用于人工输精）。
方法一：使用流式细胞仪验证分选效果
1、样品准备：使用索莱宝DNA 含量检测试剂盒
（1）、准备上述分选得到的小鼠性控X精液、小鼠性控Y精液和未经分选的小鼠精液（对照组），使用磷酸缓冲液洗涤精子一次，1500 rpm、5 min离心收集精子，调整细胞浓度为1×106个/mL，取1 ml精子悬液；
（2）、将制备的精子悬液离心后，去除上清，在细胞中加入70%、 4℃预冷乙醇 500ul 固定2小时至过夜，4℃保存；
（3）、细胞沉淀中加 100 µl RNase A 溶液，重悬细胞，37℃水浴 30 min；
（4）、再加入 400 µl碘化丙啶混匀(染色前用磷酸缓冲液洗去固定液)，使用 200目细胞筛网过滤一次，得到单精子悬液；
（5）、4℃避光孵育30 min。
2、上机检测：使用Cytoflex流式细胞仪进行检测，结果如图3所示，图3（a）显示对照组中X精子和Y精子分别占49.8%和50.2%，图3（b）上清中X精子和Y精子分别为25.1%和74.9%，图3（c）沉淀中X精子和Y精子分别为74.5%和25.5%。
方法二：使用实时荧光定量PCR技术验证分选效果
1、引物设计
为了验证分选效果，本实施例设计了三对引物，分别为Y染色体特异基因SRY、X染色体特异基因PLP和内参基因GAPDH的引物。
所述Y染色体特异性基因SRY基因引物对为SRY-F和SRY-R；
所述SRY-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SRY-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
所述X染色体特异性基因PLP基因引物对为PLP-F和PLP-R；
所述PLP-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PLP-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
所述内参基因GAPDH引物对为GAPDH-F和GAPDH-R；
所述GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述GAPDH-R的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
2、使用索莱宝DNA提取试剂盒进行精子DNA提取
（1）、取100ul精液至1.5 ml离心管，加入100 ul Buffer GA、20 ul 蛋白激酶、20ul 二硫苏糖醇(浓度为1M)，充分振荡，混匀15秒；
（2）、56℃，裂解5 h，每30 min充分摇匀1次；
（3）、短暂离心10 s后加入200 ul Buffer GB溶液充分震荡混匀15 s，70℃保温10min，短暂离心10 s后加入200 ul无水乙醇，充分震荡混匀15 s，室温放置3 min后短暂离心10 s；
（4）、将上述裂解的精子移入吸附柱，12000 rpm离心1 min，弃掉收集管废液后加入500 ul Buffer GD溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉收集管的废液；
（5）、吸附柱加入600 ul Buffer PW洗脱液后12000 rpm离心1 min；
（6）、重复步骤（5）一次；
（7）、12000 rpm空离2 min，室温静置5 min；
（8）、将吸附柱移入新的离心管，向吸附柱加入30 ul去离子水，室温静置5 min后14000 rpm离心8 min得到提取的牛精子DNA。
3、DNA浓度检测
使用超微分光光度计检测DNA浓度后将其稀释到100 ng/ul作为实时荧光定量PCR的DNA定量模板。
4、实时荧光定量PCR
表2 实时荧光定量PCR反应体系
表3 实时荧光定量PCR反应程序
分析结果见图4，在分选得到的上层精子中，Y精子含有75.8%，X精子含有24.2%；在分选得到的沉淀精子中，Y精子含有22.4%，X精子含有77.6%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液，其特征在于，由mHTF培养液和性控成分组成；所述性控成分为24e药物和葡萄糖，所述24e药物的浓度为0.1 uM-0.15 uM，所述葡萄糖浓度为2-4 mM。
2.如权利要求1所述的一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液，其特征在于，所述mHTF培养液由氯化钠 、氯化钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾 、二水氯化钙 、碳酸氢钠、丙酮酸钠、乳酸钠、青链霉素、酚红、牛血清白蛋白组成。
3.如权利要求2所述的一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液，其特征在于，每1000 mlmHTF培养液由氯化钠 5.9375 g，氯化钾 0.3496 g，七水硫酸镁 0.0493 g，磷酸二氢钾0.054 g，二水氯化钙 0.3 g， 碳酸氢钠 2.1 g，丙酮酸钠0.0365 g，乳酸钠3.42 g，青链霉素10 ml，酚红0.2 ml，牛血清白蛋白4 g和去离子水配制而成。
4.如权利要求3所述的一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液，其特征在于，每1000 mlmHTF培养液中加入24e药物36.449ug-54.6735ug；每1000 ml mHTF培养液添加葡萄糖360.32mg-720.64mg。
5.如权利要求4所述的一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液，其特征在于，所述24e药物为吡啶[3,2-d]嘧啶类TLR7&8双激动剂。
6.如权利要求1-5任一项所述的一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将取自小鼠附睾尾的精液离心，去除上清液后使用Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液重悬精子；
步骤2：在37℃温度下静置孵育60 min-90 min，得到分层精液；
步骤3：将步骤2得到的分层精液上层分离，得到含有Y染色体的精液，即Y精液；
步骤4：将步骤2得到的分层精液沉淀分离，得到含有X染色体的精液；
步骤5：将步骤4得到的含有X染色体的精液使用mHTF培养液将药物洗脱后，37℃孵育15-25min，得到X精液。
7.如权利要求1-5任一项所述的Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液的应用。
8.如权利要求7所述的Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液的应用，其特征在于，用于鉴定小鼠精子种类或制备用于鉴定小鼠精子种类的试剂盒。
9.如权利要求7所述的Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液的应用，其特征在于，用于分选、筛选小鼠X、Y精子或制备用于分选、筛选小鼠X、Y精子的试剂盒。
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