CN118165124A - 一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc的融合蛋白及其应用 - Google Patents
一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc的融合蛋白及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc的融合蛋白及其应用。所述融合蛋白由猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc相互之间通过Linker连接而成。本发明的融合蛋白的ED50值和EC50值低，药效更高，安全性更好，并且本发明的融合蛋白具有广谱抗病毒功能，可以迅速激活猪体内免疫系统活力，激活抗病毒反应，抑制病毒在猪体内的复制，可以破坏病毒结构，安全高效地防治猪病毒性疫病。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc的融合蛋白及其应用。
背景技术
我国的猪病毒性疫病呈现出种类繁多，常见有非洲猪瘟、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病和猪圆环等。目前对于这类疫病主要通过生物安全措施和疫苗接种进行预防。然而由于基础研究不足、病毒变异、依赖于自身免疫系统状态等原因，许多疫病的疫苗效果并不理想。
猪流行性腹泻病毒（PEDV）疫苗面临三个难题。首先，PEDV是一种变异非常快的RNA冠状病毒，尤其是S蛋白（中和抗体的主要靶标），变异最高，因此疫苗易失效。其次，PEDV感染的仔猪死亡病程非常短，基本在出生7日内全部死亡，而疫苗注射后10天才开始产生抗体，因此对仔猪注射PEDV疫苗没有效果。再次，怀孕母猪注射的PEDV疫苗需要对通过胎盘和初乳将母源抗体传给仔猪，然而仔猪获得的母源抗体量有限，且个体间获得的母源抗体水平差异较大，所以效果很不稳定。
猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）也面临相似问题。PRRSV是一种变异快、重组频繁的RNA病毒。灭活疫苗对预防PRRSV没有效果，减毒活疫苗也经常引起反强毒株的出现，导致原本对阴性猪场变成阳性猪场，引起PRRSV传染病的爆发。此外，现已发现很多种PRRSV病毒谱系，同一猪场可能同时存在多种毒株，难以选择适当的免疫方案。商业化的PRRSV疫苗种类很多，但交叉保护有限，部分养殖户缺乏专业知识，导致疫苗的滥用和过度使用，猪群长期处于亚健康状态。
干扰素是细胞免疫系统中一类重要的细胞因子，主要分为干扰素ɑ，干扰素β，干扰素γ和干扰素λ。它们能够干扰病毒在感染宿主细胞过程中的复制和传播，从而对抗病毒感染。但天然干扰素的半衰期较短，血浆半衰期大约为2-6小时。融合蛋白技术可将具有生物活性的功能蛋白分子与Fc或白蛋白等分子融合产生新型蛋白分子。融合后的蛋白分子，半衰期延长，可以减少给药频率，方便操作人员使用的同时减少对仔猪的刺激，提高产品的适用性。
发明内容
为了解决上述的技术问题，对猪病毒性疫病进行高效的防治，本发明提供以下的技术方案。
第一方面，本发明提供一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc的融合蛋白，其由猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc连接而成。
优选地，猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc相互之间通过Linker连接或直接连接。
进一步地，所述Linker是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala、Thr中的至少一种；优选地，所述Linker为（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n，其中n为2-5之间的整数，更优选n为3。
优选地，猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc相互之间包括下列3种方式：
①猪干扰素λ1的C端、猪干扰素γ的N端、猪干扰素γ的C端、猪Fc的N端依次连接。
②猪干扰素λ1的C端、猪Fc的N端、猪Fc的C端、猪干扰素γ的N端依次连接。
③猪干扰素γ的C端、猪Fc的N端、猪Fc的C端、猪干扰素λ1的N端依次连接。
进一步优选地，猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc相互之间采用方式②连接。
优选地，所述融合蛋白为SEQ ID No:1、SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质，进一步优选为SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
优选地，所述融合蛋白为与SEQ ID No:1、SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同功能的蛋白质，进一步优选为与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述的同一性是指氨基酸序列同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。
优选地，所述的80%以上同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
第二方面，本发明提供一种核苷酸分子，其编码第一方面所述的融合蛋白。
优选地，所述核苷酸分子包括DNA和/或RNA，例如重组DNA，或mRNA。
进一步优选地，所述核苷酸分子包括：
①SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示的碱基序列。
②SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:6的互补、简并或转录序列；
③与①或②限定的DNA分子或mRNA具有75%以上的同一性且编码所述融合蛋白中的相应蛋白的DNA分子或mRNA。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述融合蛋白的核苷酸序列75%或更高同一性的核苷酸，只要编码上述融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述同一性是指与比较的核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQID No：4-6所示的核苷酸序列具有75%或更高，具有80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
优选地，所述75%以上的同一性可以为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
第三方面，本发明提供一种载体，其包含第二方面所述的核苷酸分子。
所述载体是指能够把外源DNA、mRNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、Ti质粒、病毒载体（如逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒等）。在本发明的一个具体实施方案中，所述载体为质粒pcDNA3.4。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含第二方面所述的核苷酸分子或第三方面所述的载体。
优选地，所述宿主细胞（也称为受体细胞）为真核细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。
进一步优选地，所述宿主细胞可为植物细胞或动物细胞。合适的宿主细胞为本领域已知的。所述植物细胞可为拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotianatabacum）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）等植物细胞但不限于此。所述动物细胞可为哺乳动物细胞，例如：中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）、幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）、小鼠乳腺癌细胞（C127细胞）、人胚胎肾细胞（HEK293细胞）、人HeLa细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、T细胞、NK细胞、猪肾细胞（PK15细胞）、猪肺泡巨噬细胞（PAM细胞）、猪小肠上皮细胞（IPEC-1细胞）、猪睾丸细胞（ST细胞）、禽类细胞（例如鸡或鸭细胞）、两栖类细胞（例如非洲爪蟾（Xenopus laevis）细胞或大鲵（Andrias davidianus）细胞）、鱼类细胞（例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞）、昆虫细胞（例如Sf21细胞或Sf-9细胞）等，但不限于此。在本发明的一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为CHO-K1细胞。
第五方面，本发明提供第一方面所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括将第二方面所述的核苷酸分子或第三方面所述的载体导入到宿主细胞，并从细胞或细胞培养物中回收第一方面所述的融合蛋白。
优选的，所述制备方法包括筛选表达量高且稳定的单克隆细胞株。
第六方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的融合蛋白，或第二方面所述的核苷酸分子，或第三方面所述的载体，或第四方面所述的宿主细胞。
任选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料和赋形剂。
第七方面，本发明提供上述任一融合蛋白、核苷酸分子、载体或宿主细胞的应用，所述应用包括以下任一种：
（1）在制备用于预防和/或治疗猪病毒性疫病产品中的应用；
（2）在用于诱导猪病毒抗原免疫反应的产品中的应用；
（3）在预防和/或治疗猪病毒疫病的应用；
（4）在用于诱导猪病毒抗原免疫反应中的应用；
优选地，所述猪病毒性为PEDV或PRRSV。
本发明的有益效果：
一、本发明的融合蛋白可以迅速激活猪体内免疫系统活力，激活抗病毒反应，有效对抗外来病毒入侵，预防猪病毒性疫病的发生。
二、本发明的融合蛋白可抑制病毒在猪体内的复制，可以破坏病毒结构，治疗猪病毒性疫病。
三、相较于现有的融合蛋白，本发明的融合蛋白的ED50值和EC50值低，药效更高，安全性更好，并且本发明的融合蛋白具有广谱抗病功能，可以安全高效地防控猪病毒性疫病。
附图说明
图1所示为三种猪IFN-λ1、猪IFN-γ和猪Fc融合蛋白的结构示意图；
图2所示为猪IFN-λ1、猪IFN-γ和猪Fc融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图3所示为猪IFN-λ1、猪IFN-γ和猪Fc融合蛋白的剂量效应曲线；
图4所示为不同浓度rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ处理组PAM中PRRSV病毒滴度的测定结果；
图5所示为不同浓度rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ处理组PK1中PEDV病毒滴度的测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。
需要说明的是，下述实施例中所用实验方法如无特别说明，均为本领域常规方法。除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1. 猪IFN-λ1、猪IFN-γ和猪Fc融合蛋白的表达及纯化
分别检索猪IFN-λ1（Unpriot ID：A0A287A6Q8)、猪IFN-γ（Unpriot ID：P17803）和猪IgG1 Fc（基因编号：BAM66306.1）的氨基酸序列，使用甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的GSlinker链接，分别设计出上述3种双融合蛋白分子，蛋白的结构示意图见图1。具体氨基酸和核苷酸序列如下：
rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc 氨基酸序列（SEQ ID No:1）：
GPVPTFKPTTTRKGCHMGQFQSLSPQELKGFKKAKDALEESLSLKNWSCSSPLFPRTRDLRQLQVWERLVALEAELDLTLKVLRAAADSSLGVTLDQPLRTLHHIHVELQACIRAQPTAGSRLQGRLNHWLHRLQEATKKESQGCLEASVTFNLFHLLVRDLRSVTSGDLHIGGGGSGGGGSGGGGSQAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQRSMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRSQTMFQGQRASKGGGGSGGGGSGGGGSGTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVVVDVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGK
rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc 核苷酸序列（SEQ ID No:4）：
GGCCCTGTGCCCACATTCAAGCCCACCACCACCCGCAAGGGATGTCACATGGGCCAGTTTCAGTCTCTGTCTCCTCAGGAGCTCAAAGGCTTCAAGAAAGCAAAGGACGCCCTGGAAGAGTCCCTGTCCCTGAAAAACTGGTCCTGCAGCAGCCCTCTGTTCCCAAGAACAAGAGATCTGCGCCAGCTGCAGGTGTGGGAGAGACTGGTGGCCCTGGAAGCCGAGCTGGACCTGACCCTGAAGGTGCTGCGGGCCGCCGCTGATAGCAGCCTGGGCGTCACACTGGACCAGCCACTGAGAACCCTGCACCACATCCACGTGGAACTGCAGGCCTGCATCAGAGCCCAGCCCACCGCCGGCAGCAGACTGCAGGGCAGACTGAACCACTGGCTGCATAGACTGCAGGAGGCTACAAAGAAAGAGAGCCAGGGCTGCCTGGAAGCCTCTGTGACCTTCAATCTCTTCCACCTGCTGGTGCGGGACCTGAGGTCTGTGACATCTGGAGATCTGCATATCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGGTGGCGGCAGTGGTGGCGGAGGCAGCCAAGCCCCTTTCTTTAAGGAGATCACAATCCTGAAAGACTACTTCAACGCCAGCACCAGCGATGTGCCTAACGGCGGACCTCTGTTTCTGGAAATCCTGAAGAACTGGAAGGAAGAAAGCGATAAGAAGATCATCCAAAGCCAGATTGTGTCCTTCTACTTCAAGTTCTTCGAGATTTTCAAGGACAATCAGGCCATTCAGCGGAGCATGGACGTGATCAAGCAGGACATGTTCCAGAGATTCCTGAACGGCAGCTCTGGGAAGCTGAATGACTTCGAGAAGCTGATCAAAATCCCCGTGGATAATCTGCAAATCCAGCGGAAGGCCATCTCCGAGCTGATCAAGGTTATGAACGACCTGAGCCCCAGAAGCAACCTGAGAAAAAGAAAGCGGAGCCAAACCATGTTCCAGGGCCAGAGAGCCAGCAAGGGCGGCGGCGGAAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGCGGAGGCGGCTCTGGCACAAAGACCAAGCCTCCTTGCCCCATCTGCCCTGGCTGCGAGGTCGCCGGCCCCAGCGTCTTTATCTTCCCCCCCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCTCAGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCAAGGAGCACGCCGAGGTGCAGTTCAGCTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACACCGCCGAAACCAGACCTAAGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTCAGCGTGCTGCCTATCCAGCACCAGGACTGGCTGAAAGGCAAAGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACGTGGACCTGCCTGCTCCTATCACCAGAACAATCAGCAAAGCCATCGGCCAGAGCAGAGAGCCCCAGGTGTATACCCTGCCACCTCCAGCCGAGGAGCTGAGCCGGAGCAAGGTGACAGTGACCTGTCTGGTCATCGGCTTTTACCCCCCCGACATCCACGTGGAATGGAAGAGCAACGGCCAACCAGAGCCTGAGGGCAACTACCGGACAACACCTCCTCAGCAGGACGTGGACGGTACCTTCTTTCTGTACAGCAAGCTGGCCGTGGACAAGGCCAGATGGGACCACGGTGAGACATTCGAGTGCGCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAGTCCATCAGCAAGACCCAGGGAAAA
rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ 氨基酸序列（SEQ ID No:2）：
GPVPTFKPTTTRKGCHMGQFQSLSPQELKGFKKAKDALEESLSLKNWSCSSPLFPRTRDLRQLQVWERLVALEAELDLTLKVLRAAADSSLGVTLDQPLRTLHHIHVELQACIRAQPTAGSRLQGRLNHWLHRLQEATKKESQGCLEASVTFNLFHLLVRDLRSVTSGDLHIGGGGSGGGGSGGGGSGTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVVVDVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGKGGGGSGGGGSGGGGSQAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQRSMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRSQTMFQGQRASK
rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ核苷酸序列（SEQ ID No:5）：
GGCCCTGTGCCCACATTCAAGCCCACCACCACCCGCAAGGGATGTCACATGGGCCAGTTTCAGTCTCTGTCTCCTCAGGAGCTCAAAGGCTTCAAGAAAGCAAAGGACGCCCTGGAAGAGTCCCTGTCCCTGAAAAACTGGTCCTGCAGCAGCCCTCTGTTCCCAAGAACAAGAGATCTGCGCCAGCTGCAGGTGTGGGAGAGACTGGTGGCCCTGGAAGCCGAGCTGGACCTGACCCTGAAGGTGCTGCGGGCCGCCGCTGATAGCAGCCTGGGCGTCACACTGGACCAGCCACTGAGAACCCTGCACCACATCCACGTGGAACTGCAGGCCTGCATCAGAGCCCAGCCCACCGCCGGCAGCAGACTGCAGGGCAGACTGAACCACTGGCTGCATAGACTGCAGGAGGCTACAAAGAAAGAGAGCCAGGGCTGCCTGGAAGCCTCTGTGACCTTCAATCTCTTCCACCTGCTGGTGCGGGACCTGAGGTCTGTGACATCTGGAGATCTGCATATCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGGTGGCGGCAGTGGTGGCGGAGGCAGCGGCACAAAGACCAAGCCTCCTTGCCCCATCTGCCCTGGCTGCGAGGTCGCCGGCCCCAGCGTCTTTATCTTCCCCCCCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCTCAGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCAAGGAGCACGCCGAGGTGCAGTTCAGCTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACACCGCCGAAACCAGACCTAAGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTCAGCGTGCTGCCTATCCAGCACCAGGACTGGCTGAAAGGCAAAGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACGTGGACCTGCCTGCTCCTATCACCAGAACAATCAGCAAAGCCATCGGCCAGAGCAGAGAGCCCCAGGTGTATACCCTGCCACCTCCAGCCGAGGAGCTGAGCCGGAGCAAGGTGACAGTGACCTGTCTGGTCATCGGCTTTTACCCCCCCGACATCCACGTGGAATGGAAGAGCAACGGCCAACCAGAGCCTGAGGGCAACTACCGGACAACACCTCCTCAGCAGGACGTGGACGGTACCTTCTTTCTGTACAGCAAGCTGGCCGTGGACAAGGCCAGATGGGACCACGGTGAGACATTCGAGTGCGCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAGTCCATCAGCAAGACCCAGGGAAAAGGCGGCGGCGGAAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGCGGAGGCGGCTCTCAAGCCCCTTTCTTTAAGGAGATCACAATCCTGAAAGACTACTTCAACGCCAGCACCAGCGATGTGCCTAACGGCGGACCTCTGTTTCTGGAAATCCTGAAGAACTGGAAGGAAGAAAGCGATAAGAAGATCATCCAAAGCCAGATTGTGTCCTTCTACTTCAAGTTCTTCGAGATTTTCAAGGACAATCAGGCCATTCAGCGGAGCATGGACGTGATCAAGCAGGACATGTTCCAGAGATTCCTGAACGGCAGCTCTGGGAAGCTGAATGACTTCGAGAAGCTGATCAAAATCCCCGTGGATAATCTGCAAATCCAGCGGAAGGCCATCTCCGAGCTGATCAAGGTTATGAACGACCTGAGCCCCAGAAGCAACCTGAGAAAAAGAAAGCGGAGCCAAACCATGTTCCAGGGCCAGAGAGCCAGCAAG
rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1 氨基酸序列（SEQ ID No:3）：
QAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQRSMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRSQTMFQGQRASKGGGGSGGGGSGGGGSGTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVVVDVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGKGGGGSGGGGSGGGGSGPVPTFKPTTTRKGCHMGQFQSLSPQELKGFKKAKDALEESLSLKNWSCSSPLFPRTRDLRQLQVWERLVALEAELDLTLKVLRAAADSSLGVTLDQPLRTLHHIHVELQACIRAQPTAGSRLQGRLNHWLHRLQEATKKESQGCLEASVTFNLFHLLVRDLRSVTSGDLHI
rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1 核苷酸序列（SEQ ID No:6）：
CAAGCCCCTTTCTTTAAGGAGATCACAATCCTGAAAGACTACTTCAACGCCAGCACCAGCGATGTGCCTAACGGCGGACCTCTGTTTCTGGAAATCCTGAAGAACTGGAAGGAAGAAAGCGATAAGAAGATCATCCAAAGCCAGATTGTGTCCTTCTACTTCAAGTTCTTCGAGATTTTCAAGGACAATCAGGCCATTCAGCGGAGCATGGACGTGATCAAGCAGGACATGTTCCAGAGATTCCTGAACGGCAGCTCTGGGAAGCTGAATGACTTCGAGAAGCTGATCAAAATCCCCGTGGATAATCTGCAAATCCAGCGGAAGGCCATCTCCGAGCTGATCAAGGTTATGAACGACCTGAGCCCCAGAAGCAACCTGAGAAAAAGAAAGCGGAGCCAAACCATGTTCCAGGGCCAGAGAGCCAGCAAGGGCGGAGGCGGCAGCGGAGGTGGCGGCAGTGGTGGCGGAGGCAGCGGCACAAAGACCAAGCCTCCTTGCCCCATCTGCCCTGGCTGCGAGGTCGCCGGCCCCAGCGTCTTTATCTTCCCCCCCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCTCAGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCAAGGAGCACGCCGAGGTGCAGTTCAGCTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACACCGCCGAAACCAGACCTAAGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTCAGCGTGCTGCCTATCCAGCACCAGGACTGGCTGAAAGGCAAAGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACGTGGACCTGCCTGCTCCTATCACCAGAACAATCAGCAAAGCCATCGGCCAGAGCAGAGAGCCCCAGGTGTATACCCTGCCACCTCCAGCCGAGGAGCTGAGCCGGAGCAAGGTGACAGTGACCTGTCTGGTCATCGGCTTTTACCCCCCCGACATCCACGTGGAATGGAAGAGCAACGGCCAACCAGAGCCTGAGGGCAACTACCGGACAACACCTCCTCAGCAGGACGTGGACGGTACCTTCTTTCTGTACAGCAAGCTGGCCGTGGACAAGGCCAGATGGGACCACGGTGAGACATTCGAGTGCGCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAGTCCATCAGCAAGACCCAGGGAAAAGGCGGCGGCGGAAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGCGGAGGCGGCTCTGGCCCTGTGCCCACATTCAAGCCCACCACCACCCGCAAGGGATGTCACATGGGCCAGTTTCAGTCTCTGTCTCCTCAGGAGCTCAAAGGCTTCAAGAAAGCAAAGGACGCCCTGGAAGAGTCCCTGTCCCTGAAAAACTGGTCCTGCAGCAGCCCTCTGTTCCCAAGAACAAGAGATCTGCGCCAGCTGCAGGTGTGGGAGAGACTGGTGGCCCTGGAAGCCGAGCTGGACCTGACCCTGAAGGTGCTGCGGGCCGCCGCTGATAGCAGCCTGGGCGTCACACTGGACCAGCCACTGAGAACCCTGCACCACATCCACGTGGAACTGCAGGCCTGCATCAGAGCCCAGCCCACCGCCGGCAGCAGACTGCAGGGCAGACTGAACCACTGGCTGCATAGACTGCAGGAGGCTACAAAGAAAGAGAGCCAGGGCTGCCTGGAAGCCTCTGTGACCTTCAATCTCTTCCACCTGCTGGTGCGGGACCTGAGGTCTGTGACATCTGGAGATCTGCATATC
猪IFN-λ1氨基酸序列（SEQ ID No:7）：
GPVPTFKPTTTRKGCHMGQFQSLSPQELKGFKKAKDALEESLSLKNWSCSSPLFPRTRDLRQLQVWERLVALEAELDLTLKVLRAAADSSLGVTLDQPLRTLHHIHVELQACIRAQPTAGSRLQGRLNHWLHRLQEATKKESQGCLEASVTFNLFHLLVRDLRSVTSGDLHI
猪IFN-λ1核苷酸序列（SEQ ID No:8）：
GGCCCTGTGCCCACATTCAAGCCCACCACCACCCGCAAGGGATGTCACATGGGCCAGTTTCAGTCTCTGTCTCCTCAGGAGCTCAAAGGCTTCAAGAAAGCAAAGGACGCCCTGGAAGAGTCCCTGTCCCTGAAAAACTGGTCCTGCAGCAGCCCTCTGTTCCCAAGAACAAGAGATCTGCGCCAGCTGCAGGTGTGGGAGAGACTGGTGGCCCTGGAAGCCGAGCTGGACCTGACCCTGAAGGTGCTGCGGGCCGCCGCTGATAGCAGCCTGGGCGTCACACTGGACCAGCCACTGAGAACCCTGCACCACATCCACGTGGAACTGCAGGCCTGCATCAGAGCCCAGCCCACCGCCGGCAGCAGACTGCAGGGCAGACTGAACCACTGGCTGCATAGACTGCAGGAGGCTACAAAGAAAGAGAGCCAGGGCTGCCTGGAAGCCTCTGTGACCTTCAATCTCTTCCACCTGCTGGTGCGGGACCTGAGGTCTGTGACATCTGGAGATCTGCATATC
猪IFN-γ 氨基酸序列（SEQ ID No:9）：
QAPFFKEITILKDYFNASTSDVPNGGPLFLEILKNWKEESDKKIIQSQIVSFYFKFFEIFKDNQAIQRSMDVIKQDMFQRFLNGSSGKLNDFEKLIKIPVDNLQIQRKAISELIKVMNDLSPRSNLRKRKRSQTMFQGQRASK
猪IFN-γ核苷酸序列（SEQ ID No:10）：
CAAGCCCCTTTCTTTAAGGAGATCACAATCCTGAAAGACTACTTCAACGCCAGCACCAGCGATGTGCCTAACGGCGGACCTCTGTTTCTGGAAATCCTGAAGAACTGGAAGGAAGAAAGCGATAAGAAGATCATCCAAAGCCAGATTGTGTCCTTCTACTTCAAGTTCTTCGAGATTTTCAAGGACAATCAGGCCATTCAGCGGAGCATGGACGTGATCAAGCAGGACATGTTCCAGAGATTCCTGAACGGCAGCTCTGGGAAGCTGAATGACTTCGAGAAGCTGATCAAAATCCCCGTGGATAATCTGCAAATCCAGCGGAAGGCCATCTCCGAGCTGATCAAGGTTATGAACGACCTGAGCCCCAGAAGCAACCTGAGAAAAAGAAAGCGGAGCCAAACCATGTTCCAGGGCCAGAGAGCCAGCAAG
猪Fc 氨基酸序列（SEQ ID No:11）：
GTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVVVDVSKEHAEVQFSWYVDGVEVHTAETRPKEEQFNSTYRVVSVLPIQHQDWLKGKEFKCKVNNVDLPAPITRTISKAIGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQQDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGK
猪Fc核苷酸序列（SEQ ID No:12）：
GGCACAAAGACCAAGCCTCCTTGCCCCATCTGCCCTGGCTGCGAGGTCGCCGGCCCCAGCGTCTTTATCTTCCCCCCCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCTCAGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCAAGGAGCACGCCGAGGTGCAGTTCAGCTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACACCGCCGAAACCAGACCTAAGGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTACAGGGTGGTCAGCGTGCTGCCTATCCAGCACCAGGACTGGCTGAAAGGCAAAGAGTTCAAGTGCAAGGTGAACAACGTGGACCTGCCTGCTCCTATCACCAGAACAATCAGCAAAGCCATCGGCCAGAGCAGAGAGCCCCAGGTGTATACCCTGCCACCTCCAGCCGAGGAGCTGAGCCGGAGCAAGGTGACAGTGACCTGTCTGGTCATCGGCTTTTACCCCCCCGACATCCACGTGGAATGGAAGAGCAACGGCCAACCAGAGCCTGAGGGCAACTACCGGACAACACCTCCTCAGCAGGACGTGGACGGTACCTTCTTTCTGTACAGCAAGCTGGCCGTGGACAAGGCCAGATGGGACCACGGTGAGACATTCGAGTGCGCCGTGATGCACGAGGCCCTCCACAACCACTACACCCAGAAGTCCATCAGCAAGACCCAGGGAAAA
Linker 1氨基酸序列（SEQ ID No:13）：
GGGGSGGGGSGGGGS
Linker 1核苷酸序列（SEQ ID No:14）：
GGCGGAGGCGGCAGCGGAGGTGGCGGCAGTGGTGGCGGAGGCAGC
Linker 2氨基酸序列（SEQ ID No:13）：
GGGGSGGGGSGGGGS
Linker 2核苷酸序列（SEQ ID No:15）：
GGCGGCGGCGGAAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGCGGAGGCGGCTCT
将rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc 核苷酸序列（SEQ ID No:4）、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ核苷酸序列（SEQ ID No:5）和rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1 核苷酸序列（SEQ ID No:6）进行基因合成，并在合成片段的5’端和3’端分别引入XbaI和AgeI酶切位点，对合成片段和pcDNA3.4载体进行XbaI和AgeI双酶切，回收酶切产物后使用T4连接酶将基因合成片段分别插入到pcDNA3.4载体中，构建了rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc pcDNA3.4重组表达质粒、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γpcDNA3.4重组表达质粒和rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1 pcDNA3.4重组表达质粒。
使用PvuI酶对上述重组表达质粒进行单酶切，回收酶切产物获得线性化质粒。参考Bio-Rad电转仪说明书将线性化质粒转染至CHO-K1细胞中，转染24小时后，在培养基中加入50 μM GS抑制剂L-氨基亚砜蛋氨酸（MSX）。在MSX筛选压力下继续培养细胞20天，然后对存活的细胞进行计数，并挑选单克隆细胞至96孔板中。继续培养细胞20天，然后重复进行细胞计数和单克隆细胞转移至96孔板。经过上述两轮单克隆细胞筛选，基本保证了最终的细胞株是单克隆来源的细胞株。
在生物反应器中，通过流加培养得到细胞培养表达液，经深层过滤膜包过滤，除去细胞及细胞碎片得到细胞培养上清液。细胞培养上清液经阴离子交换层析、疏水层析、复合模式阴离子交换层析三步纯化可得到符合要求的目的蛋白。对纯化后的猪IFN-λ1、猪IFN-γ和猪Fc融合蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，检测电泳纯度。结果见图2。
由图2可以看出，Lane 1，2，3分别为rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc，rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ和rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1的非还原电泳条带。Lane 4为maker。Lane 5，6，7分别为rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc，rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ和rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1的还原电泳条带。结果显示，rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ蛋白纯度在95%以上，rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc的蛋白纯度为72%，rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1蛋白纯度为40%。
实施例2. 猪IFN-λ1、猪IFN-γ和猪Fc融合蛋白生物学活性检测（抑制细胞病变法）
采用细胞病变抑制法测定rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1的抗病毒活性。将PK-15细胞铺于96孔细胞培养板，每孔1万个细胞，至单层后。分别加入4倍梯度稀释的rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1（100 ng/mL、25 ng/mL、6.25 ng/mL、1.56 ng/mL、0.39 ng/mL、0.098 ng/mL、0.024ng/mL、0.0061 ng/mL）和重组猪干扰素λ1/猪血清白蛋白融合蛋白（rPoIFN-λ1/PSA；蛋白分子序列见专利CN111848814A中的序列3；1600 ng/mL、400 ng/mL、100 ng/mL、25 ng/mL、6.25 ng/mL、1.56 ng/mL、0.39 ng/mL、0.098 ng/mL），每一稀释度8个重复，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h。之后，弃细胞上清，每孔加入 100 TCID50VSV病毒（水疱性口炎病毒）。设置空白对照组（不加样品和病毒）和阳性对照（只加病毒），每个处理，8个重复。病毒接种后24 h，观察细胞病变情况，按照Reed-Muench法计算样品的抗病毒活性（ED50值）。
结果显示，rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1和rPoIFN-λ/PSA的ED50值（半数有效量）分别为3.67 ng/mL、0.89 ng/mL、11.12 ng/mL和32ng/mL。表明，产生同等药效时所需要rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ远低于其他分子，具有最优抗病毒活性。
实施例3. 猪IFN-λ1、猪IFN-γ和猪Fc融合蛋白生物学活性检测（报告基因法）
采用报告基因法检测rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1的生物学活性。将含有干扰素刺激反应元件和分泌型碱性磷酸酶基因的质粒转染到 HEK293构建细胞系，构建稳转的报告基因细胞系。向96孔细胞培养板内接种HEK293重组细胞，每孔5万个细胞。同时分别加入10倍梯度稀释的rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1（2000 ng/mL、200 ng/mL、20 ng/mL、2 ng/mL、0.2 ng/mL、0.02 ng/mL、0.002 ng/mL、0.0002 ng/mL和0.00002 ng/mL）和rPoIFN-λ1/PSA（2000ng/mL、200 ng/mL、20 ng/mL、2 ng/mL、0.2 ng/mL和0.02 ng/mL），置于 37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24h。之后收集细胞上清加入碱性磷酸酶检测试剂（QUANTI-Blue™，Invivogen, rep-qbs），用酶标仪在630 nm读取吸光值，根据四参数曲线方程拟合曲线，并计算EC50值。结果见图3。
由图3可以看出，rPoIFN-λ1/IFN-γ/Fc、rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、rPoIFN-γ/Fc/IFN-λ1和rPoIFN-λ/PSA均有生物学活性，EC50值分别为1.743ng/mL、0.1341ng/mL、4.074ng/mL和15.88ng/mL。rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ的生物学活性最高。
综合纯度和活性（实施例1-3）结果，以rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ（结构B）作为候选分子进行抗PRRSV和PEDV实验。
实施例4. rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ抑制猪原代肺泡巨噬细胞中PRRSV增殖
从猪场采集新鲜猪肺，采集猪原代肺泡巨噬细胞（PAM细胞）。在96孔细胞板中加入RMPI1640培养基，然后接种PAM细胞，待长满后将培养基分别更换为含1 µg/mL、10 µg/mL、100 µg/mL rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、100 µg/mL rPoIFN-λ/PSA或阴性对照（PBS）的RMPI1640培养基（含2%FBS），每组3个重复，置于 37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24h。之后，每孔加入PRRSV JXwn06病毒（MOI=0.01）。继续孵育24小时后，反复冻融3次（-80℃冰箱冷冻，冰上缓慢融化），收集细胞孔中的病毒液，检测PRRSV的TCID50。
在单层非洲绿猴胚胎肾细胞（Marc-145细胞）中加入100 μL 10倍比稀释的上述PRRSV病毒液，每个稀释度做8个重复，培养48 h，然后加入-20℃预冷的无水乙醇，作用15分钟以固定细胞；弃去无水乙醇（沪试，10009218），用 PBS溶液清洗细胞3次后，每孔再加入2mL PRRSV N蛋白鼠单抗（中国农业大学农业农村部动物流行病学重点实验室制备，用PBS按1:1000稀释），温箱孵育1 h；弃去N蛋白单抗稀释液，用PBS清洗3遍，每孔加入2 mL FITC标记山羊抗鼠 IgG（Jackson ImmunoResearch，#115-295-003，用 PBS按1:200稀释），放入37 ℃温箱孵育1 h；弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，用荧光显微镜488nm激发光下观察，拍照分析，按照Reed-Muench方法计算样品的TCID50。结果见图4。
由图4可以看出，rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ可抑制PRRSV病毒增殖，并随剂量增加，抑制效果增加。1 µg/mL rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ即可显著抑制PRRSV在靶细胞PAM中的增殖，当浓度达到100 µg/mL时降低4个滴度以上，说明 rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ具有抗PRRSV病毒活性，且效果明显优于rPoIFN-λ1/PSA。
实施例5. IFN-λ1/Fc/IFN-γ抑制猪肾细胞中PEDV增殖
将猪肾细胞（PK1细胞）复苏后接种于6孔细胞板内。待长满后，将培养基分别更换为含1 µg/mL、10 µg/mL、100 µg/mL rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ、100 µg/mL rPoIFN-λ1/PSA或阴性对照（PBS）的DMEM培养基（不含FBS），每组3个重复，置于 37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育36h。之后，在每孔加入PEDV BJ2011C病毒（MOI=0.01）。继续孵育24小时后，反复冻融3次（-80℃ 冰箱冷冻，冰上缓慢融化），收集3组细胞孔中的病毒液，检测病毒液中PEDV的TCID50。
在单层非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中加入100 μL 10倍比稀释的上述PEDV病毒液，每个稀释度做8个重复，培养48 h。然后加入-20℃预冷的无水乙醇，作用15分钟以固定细胞；弃去无水乙醇（沪试，10009218），用PBS清洗细胞3次，每孔再加入2 mL PEDV N蛋白鼠单抗（中国农业大学农业农村部动物流行病学重点实验室制备，用PBS 按1:1000稀释），温箱孵育1 h；弃去N 蛋白单抗稀释液，用 PBS 清洗3遍，每孔加入2 mL FITC 标记山羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZF-0312，用PBS按1:200稀释），放入37 ℃温箱孵育1h；弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，用荧光显微镜488nm激发光下观察，拍照分析，按照Reed-Muench方法计算样品的 TCID50。结果见图5。
由图5可以看出，rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ可抑制PEDV病毒增殖，抑制效果随剂量增加而增加。10 µg/mL rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ预处理可显著抑制PEDV在PK1中的增殖，浓度达到100 µg/mL时，PEDV病毒降低1个滴度。说明rPoIFN-λ1/Fc/IFN-γ具有显著的抗PEDV病毒活性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc连接而成。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：猪干扰素λ1的C端、猪干扰素γ的N端、猪干扰素γ的C端、猪Fc的N端依次连接，或
猪干扰素λ1的C端、猪Fc的N端、猪Fc的C端、猪干扰素γ的N端依次连接，或
猪干扰素γ的C端、猪Fc的N端、猪Fc的C端、猪干扰素λ1的N端依次连接；
其中，猪干扰素λ1、猪干扰素γ和猪Fc相互之间通过Linker连接或直接连接。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为SEQ ID No:1、SEQ IDNo:2或SEQ ID No:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
所述融合蛋白为与SEQ ID No:1、SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示的氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
4.一种核苷酸分子，其特征在于：所述核苷酸分子编码权利要求1-3任一所述的融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于：所述核苷酸分子包括：
SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示的碱基序列；
SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:6的互补、简并或转录序列；
与SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:6的互补、简并或转录序列限定的DNA分子或mRNA具有75%以上的同一性且编码所述融合蛋白中的相应蛋白的DNA分子或mRNA。
6.一种载体，其特征在于：所述载体包含权利要求4-5任一所述的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包含权利要求4-5任一所述的核苷酸分子或权利要求6所述的载体。
8.权利要求1-3任一所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求4-5任一所述的核苷酸分子或权利要求6所述的载体导入到宿主细胞，并从细胞或细胞培养物中回收权利要求1-3任一所述的融合蛋白。
9.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含权利要求1-3任一所述的融合蛋白，或权利要求4-5任一所述的核苷酸分子，或权利要求6所述的载体。
10.一种权利要求1-3任一所述的融合蛋白、权利要求4-5任一所述的核苷酸分子、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞的应用，所述应用包括以下任一种：
（1）在制备用于预防和/或治疗猪病毒性疫病的产品中的应用；
（2）在制备用于诱导猪病毒抗原免疫反应的产品中的应用。
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