CN118165109A - 包含新颖pd-1结合域之多特异性结合部分 - Google Patents
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Abstract
本发明系关于包含新颖PD‑1结合域之多特异性结合部分，该等新颖PD‑1结合域具有比参考PD‑1结合域更高的对人类PD‑1之结合亲和力。此多特异性结合部分在阻断配位体与人类PD‑1结合方面进一步提供相比于参考PD‑1抗体相当(comparable)或相同或更高的效能。本发明尤其关于包含新颖PD‑1结合域及LAG‑3结合域之多特异性结合部分。亦提供一种用本发明之多特异性结合部分治疗疾病，尤其与经抑制之免疫系统相关之疾病，诸如癌症的方法。本发明进一步关于一种载体及细胞，其包含编码新颖PD‑1结合域及LAG‑3结合域之核酸。
Description
本申请是优先权日为2021年3月31日、申请号为2022800265541、发明创造名称为“包含新颖PD-1结合域之多特异性结合部分”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明系关于抗体领域。特定言之，其系关于治疗涉及异常细胞之疾病的治疗抗体之领域。更特定言之，其系关于包含结合人类PD-1之新颖结合域之多特异性结合部分。
背景技术
尽管在疾病治疗中已取得许多进展且对导致癌症之分子事件的认识得到提高，但癌症仍为全球范围内主要的死亡原因。传统上，大部分癌症药物发现聚焦于阻断基本细胞功能且杀死分裂细胞的药剂。然而，在晚期癌症之情况下，不管如何激进施用化学疗法，即使到了患者遭受危及生命的治疗副作用的程度，亦很少引起完全治愈。在大多数情况下，患者中之肿瘤停止生长或暂时缩小(称作缓解)，结果却再次开始增殖，有时变得更快(称作再发)，且变得愈来愈难以治疗。在过去几年内，癌症药物开发之焦点已自在广泛范围具细胞毒性的化学疗法转移至具有较少毒性之靶向细胞生长抑制疗法。用靶向疗法治疗晚期癌症已在白血病及一些其他癌症中得到临床验证。然而，在大部分癌瘤中，靶向方法仍然证明不够有效以完全消除大部分患者中之癌症。
已使用多种不同方法达成癌症之靶向，该等方法包括例如：针对癌症存活及/或生长所依赖之信号传导蛋白质的小分子；利用肿瘤特异性蛋白质之疫苗；利用主动杀死肿瘤细胞之免疫细胞的细胞疗法；及将细胞毒性分子靶向至肿瘤之抗体；干扰信号传导及/或将宿主之免疫系统(重新)引导至肿瘤细胞。
一类正在研发的治疗性抗体为双特异性抗体，其包含结合不同抗原或同一抗原上之不同抗原决定基的两个不同结合位点。双特异性抗体可针对若干应用加以设计。首先，双特异性抗体可提供比单特异性抗体更大的组织特异性。若干肿瘤相关抗原不仅由肿瘤细胞(过度)表现且亦表现于正常的健康细胞上。针对特定类型之癌症所涉及之两种不同肿瘤相关抗原的双特异性抗体可特异性地将抗体靶向至肿瘤位点，在此处该抗体诱导肿瘤细胞杀灭，由此防止与仅表现抗原中之一者的非肿瘤细胞之结合，且因此减少脱靶毒性。其他作用机制包括例如免疫细胞与肿瘤细胞的接合及肿瘤生长所需之两个信号传导路径的破坏。
免疫检查点蛋白质，如例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3及TIM-3为抗体疗法之受关注的目标。迄今为止，已描述多种靶向PD-1之单特异性抗体，以及某些包含靶向PD-1之结合域的双特异性抗体。然而，此等双特异性抗体中之每一者在产生有效治疗药物方面皆具有其自身的问题。因此仍需要开发新颖有效的PD-1×LAG-3双特异性抗体。
发明内容
本发明之目标之一为提供一种用于治疗人类疾病，尤其用于治疗癌症之新医药剂。此目标藉由提供包含新颖抗人类PD-1结合域之多特异性结合部分，且尤其包含新颖抗人类PD-1结合域及抗人类LAG-3结合域之双特异性抗体来实现。
在某些实施例中，本发明提供一种多特异性结合部分，其包含对人类PD-1之结合亲和力高于参考抗人类PD-1结合域的抗人类PD-1结合域，其中该参考抗人类PD-1结合域包含具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明亦提供一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，其中该抗人类PD-1结合域在阻断配位体与PD-1之结合方面提供相较于参考抗人类PD-1抗体至少相当或相同或更高的效能，其中该参考抗人类PD-1抗体包含两个具有如SEQ IDNO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及两个具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明进一步提供一种多特异性抗体，其包含如本文所述之PD-1结合域及结合至人类LAG-3之结合域。
在某些实施例中，本发明进一步提供一种医药组合物，其包含有效量之如本文所述之多特异性结合部分。
在某些实施例中，本发明亦提供如本文所述之多特异性结合部分及如本文所述之医药组合物，其用于治疗疾病，例如与经抑制之免疫系统相关之疾病或癌症。
在某些实施例中，本发明提供一种用于治疗疾病之方法，其包含向有需要之个体投与有效量之如本文所述之多特异性结合部分或医药组合物。
在某些实施例中，本发明提供一种用于治疗癌症之方法，其包含向有需要之个体投与有效量之如本文所述之多特异性结合部分或医药组合物。
在某些实施例中，本发明进一步提供一种载体，其包含编码如本文所述之抗人类PD-1结合域之重链可变区的核酸序列及编码如本文所述之抗人类LAG-3结合域之重链可变区的核酸序列。
在某些实施例中，本发明进一步提供一种细胞，其包含编码如本文所述之抗人类PD-1结合域之重链可变区的核酸序列及编码如本文所述之抗人类LAG-3结合域之重链可变区的核酸序列。
本发明进一步提供产生如本文所述之多特异性结合部分的细胞。
在某些实施例中，本发明提供一种用于产生如本文所描述之多特异性结合部分之方法，以及产生其变异体之方法。
附图说明
在图式中，二价单特异性抗体以SEQ ID NO:A形式表示，其中SEQ ID NO:A系指两个结合域之重链可变序列。单特异性抗体之各结合域包含轻链。在用于说明本发明但不意欲以任何方式限制本发明之实例中，单特异性抗体之各结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列的轻链可变区及具有如SEQ ID NO:71中所示之胺基酸序列的轻链恒定区。单特异性抗体较佳为包含CH1、铰链、CH2及CH3之IgG1抗体。在用于说明本发明但不意欲以任何方式限制本发明之实例中，以IgG1形式筛选单特异性抗体，其中PD-1结合重链包含具有如SEQ ID NO:29中所示之胺基酸序列的CH1、具有如SEQ ID NO:72中所示之胺基酸序列的CH2及具有如SEQ ID NO:73中所示之胺基酸序列的CH3。
二价双特异性抗体以SEQ ID NO:A×SEQ ID NO:B形式表示，其中SEQ ID NO:A及B均指重链可变序列。双特异性抗体之各结合域包含轻链。在用于说明本发明但不意欲以任何方式限制本发明之实例中，单特异性抗体之各结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列的轻链可变区及具有如SEQ ID NO:71中所示之胺基酸序列的轻链恒定区。双特异性抗体较佳为包含CH1、铰链、CH2及CH3之IgG1抗体。在用于说明本发明但不意欲以任何方式限制本发明之实例中，以IgG1形式筛选双特异性抗体，其中PD-1结合重链包含具有如SEQ ID NO:29中所示之胺基酸序列之CH1、具有如SEQ ID NO:30中所示之胺基酸序列之CH2及具有如SEQ ID NO:31中所示之胺基酸序列之CH3；且LAG-3结合重链包含具有如SEQ IDNO:29中所示之胺基酸序列的CH1、具有如SEQ ID NO:32中所示之胺基酸序列的CH2及具有如SEQ ID NO:33中所示之胺基酸序列的CH3。
二价单特异性纳武单抗(nivolumab)及瑞拉利单抗(relatlimab)类似物抗体系以SEQ ID NO:A/SEQ ID NO:B形式指示，其中SEQ ID NO:A系指各别重链序列且SEQ ID NO:B系指各别轻链序列。二价单特异性纳武单抗类似物抗体包含两个PD-1结合域。二价单特异性瑞拉利单抗类似物抗体包含两个LAG-3结合域。纳武单抗及瑞拉利单抗类似物之组合以SEQ ID NO:A/SEQ ID NO:B+SEQ ID NO:C/SEQ ID NO:D之形式指示，其中SEQ ID NO:A系指纳武单抗或瑞拉利单抗类似物之重链序列且SEQ ID NO:B系指其轻链序列，且SEQ ID NO:C系指另一者之重链序列且SEQ ID NO:D系指其轻链序列。纳武单抗类似物抗体以IgG1或IgG4形式使用，且各结合域包含轻链。瑞拉利单抗类似物抗体以IgG1形式使用，且各结合域包含轻链。
图1展示在PD-1/PD-L1报导子分析中筛选亲和力成熟变异体之结果。A)将包含具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之亲和力成熟重链可变区的IgG与包含具有如SEQ ID NO:9中所示之胺基酸序列之重链可变区的亲本抗体、作为阳性对照物的纳武单抗类似物(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:22)，及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。B)将包含具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列之亲和力成熟重链可变区的IgG与包含具有如SEQ ID NO:10中所示之胺基酸序列之重链可变区的亲本抗体、作为阳性对照物的纳武单抗类似物(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:22)，及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。
图2展示在PD-1/PD-L1报导子分析中双特异性抗体之筛选结果。A)将包含具有如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:12以及SEQ ID NO:5及SEQ IDNO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与作为阳性对照物的纳武单抗类似物(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22)，及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。B)将包含具有如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:5及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:14以及SEQID NO:5及SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与作为阳性对照物的纳武单抗类似物(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22)及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQID NO:24)进行比较。C)将包含具有如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:6及SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:6及SEQ IDNO:16以及SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与作为阳性对照物的纳武单抗类似物(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22)，及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。
图3展示在PD-1/PD-L1报导子分析中双特异性抗体之筛选结果。A)包含具有如SEQID NO:1、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体相较于纳武单抗类似物3(纳武单抗*)之效能比较。B)包含具有如SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体相较于纳武单抗类似物4(纳武单抗*)之平均EC50值。
图4展示呈二价单特异性形式的包含具有如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:5中所示之胺基酸序列之重链可变区的PD-1结合域相较于二价单特异性纳武单抗类似物1(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:22；一式四份)，及作为二价双特异性抗体之部分的纳武单抗类似物1的PD-1结合域(SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:22x SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)的结合亲和力。
图5展示双特异性抗体在PD-1/LAG-3报导子分析中筛选之结果。A)将包含具有如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:1及SEQ IDNO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与作为阳性对照物的纳武单抗类似物(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22)、纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ IDNO:20/SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)，及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQID NO:24)进行比较。B)将包含具有如SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6及SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6及SEQ IDNO:15以及SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22+SEQ IDNO:27/SEQ ID NO:28)，及包含SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24的二价单特异性抗体，及作为阴性对照物的莫维珠单抗(motavizumab)类似物(SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26)进行比较。C)将包含具有如SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:15以及SEQ IDNO:5及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。
图6展示在SEB分析中双特异性抗体筛选之结果。A)将包含具有如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。B)将包含具有如SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。C)将包含具有如SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:15以及SEQ IDNO:5及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。
图7展示在抗原回忆分析中双特异性抗体筛选之结果。A)将包含具有如SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)及阴性对照物(SEQ IDNO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。B)将包含具有如SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:6及SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:6及SEQ ID NO:15以及SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ IDNO:22+SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。C)将包含具有如SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:5及SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:15以及SEQID NO:5及SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的双特异性抗体与纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物之组合(SEQ ID NO:20/SEQ ID NO:22+SEQ ID NO:27/SEQ IDNO:28)及阴性对照物(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)进行比较。
图8展示双特异性抗体在活体内小鼠研究中之功效。A)双特异性抗体1(10mg/kg)、双特异性抗体2(10mg/kg)及双特异性抗体3(10mg/kg)(图8A)及双特异性抗体4(10mg/kg)及双特异性抗体5(10mg/kg)(图8B)相较于IgG1对照抗体(10mg/kg)、IgG4对照抗体(10mg/kg)、派立珠单抗(pembrolizumab)(10mg/kg)、瑞拉利单抗类似物(10mg/kg)及派立珠单抗(10mg/kg)及瑞拉利单抗类似物(10mg/kg)之组合的减少肿瘤体积的功效。C)相较于IgG1对照抗体、IgG4对照抗体、派立珠单抗、瑞拉利单抗类似物及派立珠单抗及瑞拉利单抗类似物之组合，获自经双特异性抗体1、双特异性抗体2或双特异性抗体3处理之小鼠之肿瘤中量测的调节T细胞(Treg)之百分比。D)相较于IgG1对照抗体、IgG4对照抗体、派立珠单抗、瑞拉利单抗类似物及派立珠单抗及瑞拉利单抗类似物之组合，获自经双特异性抗体1、双特异性抗体2或双特异性抗体3处理之小鼠之肿瘤中量测的CD8+T细胞的百分比(左图)及此CD8+T细胞群体内之调节T细胞之比率(右图)。
图9展示包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:17以及SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:17的双特异性抗体相较于纳武单抗类似物(SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22)及瑞拉利单抗类似物(SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)与人类及食蟹猕猴PD-1及LAG-3的结合亲和力。
具体实施方式
本发明描述若干抗人类PD-1结合域，具有如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列的重链可变区，及包含此类抗人类PD-1结合域的多特异性结合部分。
计划性细胞死亡1蛋白质(PD-1)为属于CD28受体家族之细胞表面受体且表现于T细胞及前B细胞上。目前已知PD-1结合两种配位体，PD-L1及PD-L2。充当免疫检查点之PD-1藉由抑制T细胞活化而在下调免疫系统中起重要作用，这继而降低自体免疫性且促进自身耐受性。PD-1之抑制作用被认为系经由双重机制实现，该双重机制促进淋巴结中抗原特异性T细胞之细胞凋亡(计划性细胞死亡)，同时减少调节T细胞(抑制T细胞)之细胞凋亡。PD-1亦以许多不同别名已知，诸如PDCD1；计划性细胞死亡1；全身性红斑性狼疮症敏感性2；蛋白质PD-1；HPD-1；PD1；计划性细胞死亡1蛋白质；CD279抗原；CD279；HPD-L；HSLE1；SLEB2；及PD-1。PD-1的外部Id为HGNC：8760；Entrez Gene：5133；Ensembl：ENSG00000188389；OMIM：600244；及UniProtKB：Q15116。阻断PD-1活性之新类药物，亦即PD-1抑制剂活化免疫系统以攻击肿瘤且因此在一定程度之成功下用于治疗一些类型之癌症。
LAG-3以多种不同名称已知，诸如淋巴球活化3；淋巴球活化基因3；CD223抗原；蛋白质FDC；CD223；LAG-3；或FDC。LAG3之外部Id为：HGNC：6476；Entrez Gene：3902；Ensembl：ENSG00000089692；OMIM：153337；及UniProtKB：P18627。LAG-3与CD4密切相关。LAG-3位于邻近于CD4基因之人类染色体12(12p13.32)上，且其序列与CD4大约20％一致。LAG-3蛋白以比CD4更大的亲和力结合主要组织兼容复合体2(MHC II类)之非全纯(nonholomorphic)区域。LAG-3为在调节T细胞(Treg)及无反应性T细胞上协同上调之各种免疫检查点受体中之一者。LAG-3可负调节T细胞增殖、活化及恒定性。
在某些实施例中，多特异性结合部分之抗人类PD-1结合域包含至少重链可变区及轻链可变区。轻链可变区可系如本文中进一步描述之任何适合的轻链可变区。在某些实施例中，轻链可变区较佳为能够与具有不同抗原决定基特异性之多个重链配对的轻链之轻链可变区。此类轻链在此项技术中亦称为”共同轻链”。
在某些实施例中，本发明提供一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，其中该抗人类PD-1结合域对人类PD-1之结合亲和力高于参考抗人类PD-1结合域，其中该参考抗人类PD-1结合域包含具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明提供一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，尤其单一抗人类PD-1结合域，其中该多特异性结合部分对人类PD-1之结合亲和力高于参考抗人类PD-1抗体，其中该参考抗人类PD-1抗体包含两个具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及两个具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
确定抗人类PD-1结合域对人类PD-1之结合亲和力是否高于参考抗人类PD-1结合域，可藉由使用相同分析条件在相同类型之分析中量测两种抗人类PD-1结合域之结合亲和力来进行。因此，在某些实施例中，使用相同分析条件，在相同类型之分析中量测抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分之结合亲和力，及参考抗人类PD-1结合域或参考抗人类PD-1抗体之结合亲和力。在某些实施例中，该分析系使用表面电浆子共振(SPR)量测结合亲和力之分析，诸如之生物传感器系统，或溶液平衡滴定(SET)(参见Friguet B等人(1985)J.Immunol Methods；77(2):305-319及Hanel C等人(2005)Anal Biochem；339(1):182-184)。如本文所提供之PD-1结合域或多特异性结合部分之结合亲和力值藉由实例4中所述之方法获得。
简言之，实例4描述在25℃下使用Biacore 8K仪器进行SPR。抗人类Fc抗体经由胺偶合以约9000RU的固定化水平固定于S系列传感器芯片CM5之流槽上。抗PD-1抗体之所要捕捉水平(100至150RU)藉由使预定浓度之抗PD-1抗体以10μL/min流动速率流动穿过各信道之活动流槽60秒来达成。以45μL/min之流动速率，将PD-1三倍连续稀释浓度系列(总计7种浓度，最高300nM)及操作缓冲液注射240秒(缔合时间)，紧接着操作缓冲液注射480秒(解离时间)。表面藉由30μL/min流动速率3M MgCl2之30秒注射再生。自将数据整体拟合至1:1结合模型获得结合动力学及亲和力参数。
较佳地，SPR系使用呈IgG形式之抗人类PD-1结合域进行，量测其与PD-1之单价相互作用的结合亲和力。
在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR，例如如实例4中所述所量测，抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分对人类PD-1之结合亲和力比参考抗人类PD-1结合域或参考抗人类PD-1抗体高至少十倍。在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR，例如如实例4中所述所量测，抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分对人类PD-1之结合亲和力比参考抗人类PD-1结合域或参考抗人类PD-1抗体高十倍至五十倍、十倍至四十倍、十倍至三十倍或十倍至二十倍。在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR，例如如实例4中所述所量测，抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分对人类PD-1之结合亲和力比参考抗人类PD-1结合域或参考抗人类PD-1抗体高十倍。
在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR，例如如实例4中所述所量测，抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分对人类PD-1之结合亲和力在约0.1至1.0nM范围内，尤其在约0.3至0.8nM范围内，更尤其在约0.38至0.78nM范围内。在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR，例如如实例4中所述所量测，抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分对人类PD-1之结合亲和力在0.1至1.0nM范围内，尤其在0.3至0.8nM范围内，更尤其在0.38至0.78nM范围内。在某些实施例中，结合亲和力为与PD-1之单价相互作用的结合亲和力。
在某些实施例中，结合亲和力用呈二价单特异性IgG形式之本发明之抗人类PD-1结合域及参考抗人类PD-1结合域来量测。在某些实施例中，结合亲和力用呈二价双特异性IgG形式之本发明之抗人类PD-1结合域及参考抗人类PD-1结合域来量测。在某些实施例中，结合亲和力用呈二价双特异性IgG形式之本发明之抗人类PD-1结合域及呈二价单特异性IgG形式之参考抗人类PD-1结合域量测。二价双特异性IgG形式可例如包含本发明之PD-1结合域、或参考抗人类PD-1结合域及结合不相关目标之结合域。
在某些实施例中，本发明亦提供一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，尤其单一抗人类PD-1结合域，其中该抗人类PD-1结合域在阻断配位体与PD-1之结合方面提供相较于参考抗人类PD-1抗体至少相当或相同或更高的效能，其中该参考抗人类PD-1抗体包含两个具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及两个具有如SEQID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
在某些实施例中，本发明亦提供一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，尤其单一抗人类PD-1结合域，其中该多特异性结合部分在阻断配位体与PD-1之结合方面具有相较于参考抗人类PD-1抗体至少相当或相同或更高的效能，其中该参考抗人类PD-1抗体包含两个具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及两个具有如SEQID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
确定抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分是否在阻断配位体与PD-1之结合方面提供相较于参考抗人类PD-1抗体相当或相同或更高的效能，可藉由使用相同分析条件在相同类型之分析中量测抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分及参考抗体之效能来进行。因此，在某些实施例中，使用相同分析条件，在相同类型之分析中量测多特异性结合部分之抗人类PD-1结合域或多特异性结合部分之阻断配位体与PD-1之结合的效能，及参考抗人类PD-1结合抗体之阻断配位体与PD-1之结合的效能。在某些实施例中，分析为PD-1/PD-L1报导子分析或PD-1/LAG-3报导子分析。使用如实例2中所描述之PD-1/PD-L1报导子分析及如实例5中所描述之PD-1/LAG-3报导子分析，获得本文提供之PD-1结合域或多特异性结合部分之效能数据。
简言之，实例2中所描述之PD-1/PD-L1报导子分析使用为表现人类PD-L1及经设计而以抗原非依赖性方式活化同源TCR之工程改造细胞表面蛋白质之CHO-K1细胞的PD-L1aAPC/CHO-K1细胞，及表现人类PD-1及由NFAT反应组件(NFAT-RE)驱动之荧光素酶报导子之Jurkat T细胞进行。包含PD-L1细胞或PBS之分析盘在37℃、5％ CO2及95％相对湿度下培育隔夜。在培育之后，清空孔且以连续稀释液形式添加测试及对照IgG，以10μg/ml开始且进行6步4倍滴定。亦制备作为无IgG之对照物的基础对照物。将需要直接比较活性之IgG在同一盘上培育。添加Jurkat T细胞，且分析盘在37℃、5％ CO2及95％相对湿度下培育6小时。培育6小时后，将盘保持在室温下10分钟，且量测荧光素酶活性。
简言之，实例5中所述之PD-1/LAG-3报导子分析使用PD-L1 Raji细胞及JurkatPD-1及LAG-3效应细胞进行。呈稀释因子在2与10之间的始于6至300μg/ml之间的6倍连续稀释液的25μl测试及对照IgG(最终分析浓度始于20至100μg/ml之间)被添加至含有25μlJurkat PD-1及LAG-3效应细胞或PBS之分析盘中。将需要直接比较活性之IgG在同一分析盘上培育。将等体积之PD-L1 Raji细胞悬浮液与相同体积之SED溶液(100ng/ml之葡萄球菌肠毒素D)混合，且将25μl Raji/SED混合物添加至分析盘中。分析盘在37℃、5％ CO2及95％相对湿度下培育6小时。培育6小时后，将分析盘保持于室温下10分钟，且量测荧光素酶活性。
较佳地，本发明之抗人类PD-1结合域及参考抗人类PD-1结合域以相同浓度使用，两者较佳均呈二价单特异性IgG形式。
在某些实施例中，PD-1-配位体阻断活性的相当效能为在参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1之结合的效能之5倍范围内的效能，且包括与参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1之结合的效能的5倍、4倍、3倍及2倍，较佳3倍偏差。
在某些实施例中，PD-1-配位体阻断活性的较高效能为比参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1之结合的效能高5、4、3或2倍，较佳3倍的效能。在某些实施例中，PD-1-配位体阻断活性的至少相当或相同或更高效能为比参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1之结合的效能高1.1倍至2.0倍、较佳1.2倍至1.8倍或1.2倍至1.6倍、更佳1.2倍至1.4倍的效能。
参考抗人类PD-1结合域为纳武单抗类似物抗体之PD-1结合域，较佳使用与进行比较之多特异性结合部分之抗人类PD-1结合域相同的生产方法产生。参考抗人类PD-1结合抗体为纳武单抗类似物抗体，较佳使用与进行比较之多特异性结合部分相同的生产方法产生。纳武单抗类似物抗体与纳武单抗具有相同重链可变区序列(SEQ ID NO:20)。纳武单抗类似物抗体与纳武单抗具有相同轻链可变区序列(SEQ ID NO:21)。
在某些实施例中，多特异性结合部分之抗人类PD-1结合域包含重链可变区，其中该重链可变区包含具有如SEQ ID NO:1至8中所示之胺基酸序列之重链可变区中之一者的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)。
CDR序列可使用不同方法定义，包括但不限于根据Kabat编号方案(Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；及/或Kabat等人，美国卫生与人群服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services),“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991))，Chothia编号方案(Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等人，Nature 342:877-883,1989；及/或Al-Lazikani B.等人，J.Mol.Biol.,273:927-948(1997))，Honegger及Plukthun编号系统(Honegger及Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001))，MacCallum编号系统(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；及/或Abhinandan及Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008))，Lefranc编号系统(Lefranc M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；及/或Honegger及Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001))，或根据IMGT(Giudicelli等人，Nucleic Acids Res.25:206-21 1(1997)中论述)。
此等编号方案中之每一者的CDR定义系基于重链或轻链可变区中胺基酸残基对抗原结合之预测贡献。因此，鉴别CDR之各方法可用于鉴别本发明之结合域之CDR。在某些实施例中，本发明之结合域之重链CDR系根据Kabat、Chothia或IMGT。在某些实施例中，本发明之结合域之重链CDR系根据Kabat。在某些实施例中，本发明之结合域之重链CDR系根据Chothia。在某些实施例中，本发明之结合域之重链CDR系根据IMGT。
在某些实施例中，抗人类PD-1结合域包含重链可变区，其中该重链可变区包含：来自具有来自由SEQ ID NO:1至8组成之群之胺基酸序列的重链可变区之重链CDR1(HCDR1)、来自具有来自由SEQ ID NO:1至8组成之群之胺基酸序列的重链可变区之重链CDR2(HCDR2)及来自具有来自由SEQ ID NO:1至8组成之群之胺基酸序列的重链可变区之重链CDR3(HCDR3)。
根据Kabat之HCDR在本文所提供之序列清单中以粗体指示且加下划线。
在某些实施例中，多特异性结合部分之抗人类PD-1结合域之重链可变区包含：
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:38中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:44中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:47中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56中所示之胺基酸序列；或
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示之胺基酸序列；
其中该等HCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。
在某些实施例中，多特异性结合部分之抗人类PD-1结合域之重链可变区包含：
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:38中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:44中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:47中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53中所示之胺基酸序列；
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56中所示之胺基酸序列；或
-重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示之胺基酸序列。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之PD-1结合域亦包括PD-1结合域变异体，其中该等HCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。在某些实施例中，仅一或两个HCDR可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。
举例而言，适用于引入胺基酸变异之位置包括但不限于HCDR1之第一、第二及/或第四胺基酸；HCDR2之第三、第七、第八、第九、第十、第十一、第十三、第十四及/或第十六胺基酸；及/或HCDR3之第六及/或第十三胺基酸。根据Kabat之CDR序列在本文所提供之序列清单中以粗体指示且加下划线。
在某些实施例中，本发明因此亦提供一种抗人类PD-1结合域，其包含：
-HCDR1，其具有胺基酸序列X1X2FX3S，其中
X1可为F、Y、T或H；
X2可为Y、Q、E、H或D；
X3可为W或Y；及/或
-HCDR2，其具有胺基酸序列YIX1YSGX2X3X4X5X6PX7X8KX9，其中
X1可为Y、V或I；
X2可为S或G；
X3可为T、Y、S、H、N、W、L或Q；
X4可为S或N；
X5可为F、V或L；
X6可为N或S；
X7可为S或A；
X8可为F或L；
X9可为S、T、G、D、R或N；及/或
-HCDR3，其具有胺基酸序列GGYTGX1GGDWFDX2，其中
X1可为Y、H、V或A；
X2可为P、V、Y、W、F、T、Q、H或S。
引入胺基酸变异之其他适合位置包括但不限于HCDR1之第二、第三、第四及/或第五胺基酸；HCDR2之第三、第四、第五、第六、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六及/或第十七胺基酸；及/或HCDR3之第一、第二、第六、第七、第九、第十、第十四、第十五、第十六及/或第十八胺基酸。根据Kabat之CDR序列在本文所提供之序列清单中以粗体指示且加下划线。
在某些实施例中，本发明因此亦提供一种抗人类PD-1结合域，其包含：
-HCDR1，其具有胺基酸序列RX1X2X3X4，其中
X1可为F或Y；
X2可为T、A或V；
X3可为M、L或V；
X4可为S、H、N、V或T；及/或
-HCDR2，其具有胺基酸序列WIX1X2X3X4GX5X6X7X8X9X10X11X12X13X14，其中
X1可为N或D；
X2可为P、S或T；
X3可为N或Q；
X4可为T或D；
X5可为N、S、T、K、L或E；
X6可为P、Y、A、H或F；
X7可为T或S；
X8可为Y、F或H；
X9可为A、G、V或F；
X10可为Q、R、N、L、T或S；
X11可为D、A、G或S；
X12可为F、V或A；
X13可为T、K、H、G；
X14可为G、N、E或D；及/或
-HCDR3，其具有胺基酸序列X1X2GYCX3X4DX5CYPNX6X7X8DX9，其中
X1可为I、S或V；
X2可为L、Q或N；
X3可为N、G、S或D；
X4可为T、S、P、N或E；
X5可为N或I；
X6可为W、G、Q、H、W、A或L；
X7可为I、V或L；
X8可为F、L或I；
X9可为Y、S、N、I、R、H、V、T、K、A或L。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之抗人类PD-1结合域包含重链可变区，其具有如SEQ ID NO:1至8中之任一者中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之PD-1结合域亦包括PD-1结合域变异体，该等变异体除了上文提及之HCDR中之变异之外，亦包含构架区中之一或多种变异。在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之PD-1结合域变异体在CDR区中不含变异，但在构架区中包含一或多种变异。此类变异体与本文所揭示之序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性，且预期保留PD-1结合特异性。因此，在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之PD-1结合域包含：
-与如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:36中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:37中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:38中所示之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:2中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:39中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:40中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:41中所示之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:3中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:42中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:43中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:44中所示之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:4中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:45中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:46中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:47中所示之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:48中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:49中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:50中所示之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:51中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:52中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:53中所示之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:54中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:55中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:56中所示之HCDR3胺基酸序列；或
-与如SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:57中所示之HCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:58中所示之HCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:59中所示之HCDR3胺基酸序列。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之PD-1结合域包含轻链可变区。适合轻链可变区之实例为包含分别具有如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)之轻链可变区，其中LCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。在某些实施例中，适合轻链可变区为包含分别具有如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)之轻链可变区。在某些实施例中，此类轻链可变区可包含具有如SEQ ID NO:24中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列的轻链可变区。包含此等LCDR及/或轻链可变区之轻链或轻链可变区为此项技术中称为VK1-39/JK1之轻链。此为共同轻链。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之PD-1结合域包含与如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之轻链可变区，该轻链可变区包含如SEQ ID NO:60中所示之LCDR1胺基酸序列；如SEQ ID NO:61中所示之LCDR2胺基酸序列；及如SEQ ID NO:62中所示之LCDR3胺基酸序列。
根据本发明之术语『共同轻链』系指能够与多个不同重链，亦即具有不同抗原或抗原决定基结合特异性之重链配对之轻链。共同轻链尤其可用于产生例如双特异性抗体，其中抗体生产在两个结合域包含相同轻链时更高效。术语”共同轻链”涵盖一致，或具有一些胺基酸序列差异但全长抗体之结合特异性不受影响的轻链。举例而言，在如本文所用之共同轻链之定义范畴内，有可能制备或探索不一致但仍功能上等效之轻链，例如藉由引入及测试保守胺基酸变化、不促成或仅部分促成与重链配对时的结合特异性之区域中的胺基酸变化，及其类似者。
除包含上文所提及之LCDR及/或轻链可变区的共同轻链之外，亦可使用此项技术中已知之其他共同轻链。此类共同轻链之实例包括但不限于：VK1-39/JK5，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有如SEQ ID NO:63中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)。根据IMGT之LCDR在其中以粗体指示且加下划线。在某些实施例中，轻链包含轻链可变区，其包含具有如SEQ ID NO:63中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)，其中LCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。在某些实施例中，轻链包含具有如SEQID NO:63中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列的轻链可变区；VK3-15/JK1，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有如SEQ IDNO:64中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)。根据IMGT之LCDR在其中以粗体指示且加下划线。在某些实施例中，轻链包含轻链可变区，其包含具有如SEQ ID NO:64中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)，其中LCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。在某些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:64中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列的轻链可变区；VK3-20/JK1，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有如SEQ ID NO:65中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)。根据IMGT之LCDR在其中以粗体指示且加下划线。在某些实施例中，轻链包含轻链可变区，其包含具有如SEQID NO:65中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)，其中LCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。在某些实施例中，轻链包含具有如SEQ ID NO:65中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列的轻链可变区；及VL3-21/JL3，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含具有如SEQ ID NO:66中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)。根据IMGT之LCDR在其中以粗体指示且加下划线。在某些实施例中，轻链包含轻链可变区，其包含具有如SEQ ID NO:66中所示之胺基酸序列的轻链可变区之轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)及轻链CDR3(LCDR3)，其中LCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。在某些实施例中，轻链包含具有如SEQID NO:66中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列的轻链可变区。
VK1-39系免疫球蛋白可变κ1-39基因之简写。该基因亦称为免疫球蛋白κ可变1-39；IGKV139；IGKV1-39；IgVκ1-39。该基因外部Id为HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。VK1-39之较佳胺基酸序列以SEQ ID NO:67给出。此序列为V区之序列。该V区可与五个J区之一组合。两个较佳接合序列指示为VK1-39/JK1及VK1-39/JK5；替代名称为IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根据imgt.org之IMGT数据库全球信息网命名)。此等名称为例示性的且涵盖基因区段之对偶基因变异体。
VK3-15系免疫球蛋白可变κ3-15基因之简写。该基因亦称为免疫球蛋白κ可变3-15；IGKV315；IGKV3-15；IgVκ3-15。该基因外部Id为HGNC：5816；Entrez Gene：28913；Ensembl：ENSG00000244437。VK3-15之较佳胺基酸序列以SEQ ID NO:68给出。此序列为V区之序列。该V区可与五个J区之一组合。较佳接合序列指示为VK3-15/JK1；替代名称为Vκ3-15*01/IGJκ1*01(根据imgt.org之IMGT数据库全球信息网命名)。此名称为例示性的且涵盖基因区段之对偶基因变异体。
VK3-20系免疫球蛋白可变κ3-20基因之简写。该基因亦称为免疫球蛋白κ可变3-20；IGKV320；IGKV3-20；IgVκ3-20。该基因外部Id为HGNC：5817；Entrez Gene：28912；Ensembl：ENSG00000239951。VK3-20之较佳胺基酸序列以SEQ ID NO:69给出。此序列为V区之序列。该V区可与五个J区之一组合。较佳接合序列指示为VK3-20/JK1；替代名称为IgVκ3-20*01/IGJκ1*01(根据imgt.org之IMGT数据库全球信息网命名)。此名称为例示性的且涵盖基因区段之对偶基因变异体。
VL3-21系免疫球蛋白可变λ3-21基因之简写。该基因亦称为免疫球蛋白λ可变3-21；IGLV321；IGLV3-21；IgVλ3-21。该基因外部Id为HGNC：5905；Entrez Gene：28796；Ensembl：ENSG00000211662.2。VL3-21之较佳胺基酸序列以SEQ ID NO:70给出。此序列为V区之序列。该V区可与五个J区之一组合。较佳接合序列指示为VL3-21/JL3；替代名称为IgVλ3-21/IGJλ3(根据imgt.org之IMGT数据库全球信息网命名)。此名称为例示性的且涵盖基因区段之对偶基因变异体。
此外，可使用此项技术中可获得之PD-1抗体之任何轻链可变区，或可容易获得之任何其他轻链可变区，诸如藉由在与本发明之PD-1结合域配对时展示抗原结合活性，获自例如抗体呈现库。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分之PD-1结合域可进一步包含CH1及CL区。可使用任何CH1域，尤其人类CH1域。适合CH1域之一实例由提供为SEQ ID NO:29之胺基酸序列提供。可使用任何CL域，尤其人类CL。适合CL域之一实例由提供为SEQ ID NO:71之胺基酸序列提供。
“结合部分”系指蛋白质分子且包括例如此项技术中可用之所有抗体形式，诸如全长IgG抗体、免疫结合物、双功能抗体、BiTE、Fab片段、scFv、串联scFv、单域抗体(如VHH及VH)、微型抗体、scFab、scFv-拉链(zipper)、奈米抗体、DART分子、TandAb、Fab-scFv、F(ab)'2、F(ab)'2-scFv2及胞内抗体。
在一个实施例中，多特异性结合部分为多特异性抗体。根据本发明之多特异性抗体系呈任何抗体形式之抗体，其包含对至少两个不同目标或抗原决定基具有特异性之至少两个结合域。在某些实施例中，本发明之多特异性抗体为双特异性抗体。在某些实施例中，本发明之多特异性抗体可进一步包含Fc区或其部分。在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分系IgG1抗体。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分进一步包含结合于在免疫效应细胞上表现之细胞表面部分的结合域。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分包含如本文所述之PD-1结合域及抗人类LAG-3结合域。适合的抗人类LAG-3结合域包含重链可变区，其包含：
-具有如SEQ ID NO:11中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；及
-具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，
其中该等HCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。HCDR在本文提供之序列清单中在参考SEQ ID NO中以粗体指示且加下划线。
在某些实施例中，抗人类LAG-3结合域包含重链可变区，其包含：
-具有如SEQ ID NO:11中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
-具有如SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；及
-具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)。
在某些实施例中，本发明之LAG-3结合域包括LAG-3结合域变异体，其中该等HCDR中之每一者可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。预期此类变异体保留LAG-3结合特异性。
举例而言，适用于引入胺基酸变异之位置包括但不限于HCDR1之第二及/或第三胺基酸；HCDR2之第三、第七、第十、第十三及/或第十六胺基酸；及/或HCDR3之第一胺基酸。根据Kabat之HCDR序列在本文所提供之序列清单中以粗体指示且加下划线。
在某些实施例中，抗人类LAG-3结合域包含：
-HCDR1，其具有胺基酸序列SX1X2WS，其中
X1可为Y或F；
X2可为Y或S；及/或
-HCDR2，其具有胺基酸序列YIX1YSGX2TNX3NPX4LKX5，其中
X1可为Y或D；
X2可为S或T；
X3可为Y或F；
X4可为S或F；
X5可为S或I；及/或
-HCDR3，其具有胺基酸序列X1LLYKWNYVEGFDI，其中
X1可为D或H。
举例而言，适用于引入胺基酸变异之位置包括但不限于HCDR1之第一、第三及/或第四胺基酸；HCDR2之第七、第十及/或第十二胺基酸；及/或HCDR3之第三胺基酸。根据Kabat之HCDR序列在本文所提供之序列清单中以粗体指示且加下划线。
在某些实施例中，抗人类LAG-3结合域包含：
-HCDR1，其具有胺基酸序列X1YX2X3H，其中
X1可为S、N或R；
X2可为G或D；
X3可为M、T或I；及/或
-HCDR2，其具有胺基酸序列VISYDGX1NKX2YX3DSVKG，其中
X1可为S或N；
X2可为Y、F或H；
X3可为A、E或V；及/或
-HCDR3，其具有胺基酸序列ERX1WDVFDI，其中
X1可为G或D。
举例而言，适用于引入胺基酸变异之位置包括但不限于HCDR1之第一及/或第三胺基酸；HCDR2之第五及/或第八胺基酸；及/或HCDR3之第三胺基酸。根据Kabat之HCDR序列在本文所提供之序列清单中以粗体指示且加下划线。
在某些实施例中，抗人类LAG-3结合域包含：
-HCDR1，其具有胺基酸序列X1YX2MH，其中
X1可为S或N；
X2可为G或A；及/或
-HCDR2，其具有胺基酸序列VISYX1GSX2KYYADSVKG，其中
X1可为D或H；
X2可为N或D；及/或
-HCDR3，其具有胺基酸序列DGDNWDX1FDI，其中
X1可为V或A。
在某些实施例中，本发明之抗人类LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:11至17中之任一者中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列的重链可变区。
在某些实施例中，本发明之LAG-3结合域亦包括LAG-3结合域变异体，该等变异体除HCDR中之变异以外，亦包含构架区中之一或多种变异。在某些实施例中，本发明之LAG-3结合域变异体在CDR区中不含变异，但在构架区中包含一或多种变异。此类变异体与本文所揭示之序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性，且预期保留LAG-3结合特异性。因此，在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分的LAG-3结合域包含：
-与如SEQ ID NO:11中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:74中所示之HCDR1胺基酸序列、如SEQ ID NO:75中所示之HCDR2胺基酸序列及如SEQ ID NO:76中所示之胺基酸序列之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:77中所示之HCDR1胺基酸序列、如SEQ ID NO:78中所示之HCDR2胺基酸序列及如SEQ ID NO:79中所示之胺基酸序列之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:80中所示之HCDR1胺基酸序列、如SEQ ID NO:81中所示之HCDR2胺基酸序列及如SEQ ID NO:82中所示之胺基酸序列之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:83中所示之HCDR1胺基酸序列、如SEQ ID NO:84中所示之HCDR2胺基酸序列及如SEQ ID NO:85中所示之胺基酸序列之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:86中所示之HCDR1胺基酸序列、如SEQ ID NO:87中所示之HCDR2胺基酸序列及如SEQ ID NO:88中所示之胺基酸序列之HCDR3胺基酸序列；
-与如SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:89中所示之HCDR1胺基酸序列、如SEQ ID NO:90中所示之HCDR2胺基酸序列及如SEQ ID NO:91中所示之胺基酸序列之HCDR3胺基酸序列；或
-与如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之重链可变区，该重链可变区包含如SEQ ID NO:92中所示之HCDR1胺基酸序列、如SEQ ID NO:93中所示之HCDR2胺基酸序列及如SEQ ID NO:94中所示之胺基酸序列之HCDR3胺基酸序列。
在某些实施例中，本发明LAG-3结合域进一步包含轻链可变区。适合轻链可变区之实例为如本文所述之轻链可变区，例如如本文所述之本发明之PD-1结合域之轻链可变区。可使用此项技术中可获得的LAG-3抗体之轻链可变区，或可容易获得之任何其他轻链可变区，诸如藉由在与本发明之LAG-3结合域配对时展示抗原结合活性，获自例如抗体呈现库。较佳地，本发明之LAG-3结合域包含VK1-39/JK1、VK1-39/JK5、VK3-15/JK1、VK3-20/JK1或VL3-21/JL3轻链可变区。
在某些实施例中，本发明之抗人类LAG-3结合域可进一步包含CH1及CL区。可使用任何CH1域，尤其人类CH1域。适合CH1域之一实例由提供为SEQ ID NO:29之胺基酸序列提供。可使用任何CL域，尤其人类CL。适合CL域之一实例由提供为SEQ ID NO:71之胺基酸序列提供。
在某些实施例中，本文所揭示之PD-1结合域可与本文所揭示之任何LAG-3结合域组合以产生本发明之多特异性结合部分。本发明因此亦提供多特异性结合部分PB1至PB35，如表1中所呈现。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域；及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域。
表1.包含对PD-1具有特异性之重链可变区及对LAG-3具有特异性之重链可变区之组合的结合部分。PB1至PB35中之每一者均可与本文所揭示之轻链组合。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:60中所示之胺基酸序列之轻链CDR1(LCDR1)、具有如SEQ ID NO:61中所示之胺基酸序列之轻链CDR2(LCDR2)及具有如SEQ ID NO:62中所示之胺基酸序列之轻链CDR3(LCDR3)。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:1中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域；
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在一个实施例中，本发明之多特异性结合部分包含：
-包含具有如SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之PD-1结合域，及
-包含具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的本发明之LAG-3结合域，
其中PD-1结合域及LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:24中所示之胺基酸序列之轻链可变区。
在某些实施例中，本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类PD-1之结合亲和力高于参考抗人类PD-1抗体，该参考抗人类PD-1抗体包含两个具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及两个具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
确定PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类PD-1之结合亲和力是否高于参考抗人类PD-1抗体，可藉由使用相同分析条件在相同类型之分析中量测两种抗体之结合亲和力来进行。因此，在某些实施例中，PD-1×LAG-3多特异性抗体之结合亲和力及参考抗人类PD-1抗体之结合亲和力使用相同分析条件，在相同类型之分析中量测。在某些实施例中，该分析系使用表面电浆子共振(SPR)量测结合亲和力之分析，诸如之生物传感器系统，或溶液平衡滴定(SET)(参见Friguet B等人(1985)J.Immunol Methods；77(2):305-319及HanelC等人(2005)Anal Biochem；339(1):182-184)。如本文所提供之PD-1×LAG-3多特异性抗体之结合亲和力值藉由实例12中所述之方法获得。
简言之，实例12描述使用SPR在BIAcore-T200仪器上使用固定于CM5系列S传感器芯片上之抗huIgG抗体测定双特异性IgG形式之结合亲和力。所用单体重组抗原为：huLAG-3(huLAG-3-His，Sino Biological，目录号16498-H08H)、cyLAG-3(cyLAG-3-His，SinoBiological，目录号90841-C08H)、huPD-1(huPD-1-His，Sino Biological，目录号10377-H08H)及cyPD-1(cyPD-1-His，R&D Systems，目录号8509-PD)。山羊抗huIgG Fc在CM5传感器芯片之四个流道上之固定化系藉由胺偶合，使用稀释于10mM乙酸盐pH 5.0中之40μg/ml抗体进行。使用以下条件：420秒之活化时间，420秒之失活时间，失活缓冲液：1M乙醇胺pH8.5。固定化密度在9158至9428RU范围内。测试及对照抗体藉由固定于CM5传感器芯片上之抗huIgG抗体以30μl/min之流动速率捕获60秒。捕获抗体浓度对于PD-1亲和力测定为20nM且对于LAG-3亲和力测定为10nM。此随后为以30μl/min之流动速率的缓冲液之60秒稳定化阶段。以30μl/min，在具有捕获抗体之流槽及参考流槽(无捕获抗体)两者中注射抗原之五步两倍连续稀释液持续60秒。抗原浓度对于huPD-1及cyPD-1为80nM降至2.5nM，且对于hu-LAG-3及cy-LAG-3为40至1.25nM。针对缓冲效应之背景校正藉由单独缓冲液注射进行且将参考流槽用于背景减除。在抗体-抗原相互作用之后，300秒之解离速率洗涤(off-ratewash)以30μl/min进行。在30μl/min下使用两次15μl 10mM甘胺酸pH 1.5注射进行循环之间的再生，接着为90μl/min之90秒稳定化步骤。将HBS-EP+缓冲液用于PD-1亲和力测定，而对于LAG-3，HBS-EP+补充有NaCl直至500mM NaCl之最终浓度。在Biacore T200评价软件中分析结果。对原始RU信号进行空白减除(无捕获抗体之通道)及针对缓冲效应的背景校正(减去利用捕获抗体但第二注射利用缓冲液而非抗原之操作)。将1:1结合朗缪尔(Langmuir)拟合应用于样品曲线集合，使用Biacore T200评价软件之同时拟合选项以计算缔合速率(ka)、解离速率(kd)及亲和力(KD)。
在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR所量测，例如如实例12中所述，与参考抗人类PD-1抗体相比，PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类PD-1之结合亲和力高至少十倍。在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR所量测，与参考抗人类PD-1结合域相比，PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类PD-1之结合亲和力高十倍至五十倍，较佳十倍至四十倍、十倍至三十倍或十倍至二十倍。在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR所量测，例如如实例12中所述，与参考抗人类PD-1结合域相比，PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类PD-1之结合亲和力高十倍。
参考抗人类PD-1抗体为纳武单抗类似物抗体，较佳使用与进行比较之PD-1×LAG-3多特异性抗体相同的生产方法产生。纳武单抗类似物抗体与纳武单抗具有相同重链可变区序列(SEQ ID NO:20)。纳武单抗类似物抗体与纳武单抗具有相同轻链可变区序列(SEQID NO:21)。
在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR所量测，例如如实例12中所述，PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类PD-1之结合亲和力在约0.1至1.0nM范围内，尤其在约0.2至0.4nM范围内，更尤其在约0.32至0.34nM范围内。
在某些实施例中，如藉由如本文所述之SPR所量测，例如如实例12中所述，PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类PD-1之结合亲和力在0.1至1.0nM范围内，尤其在0.2至0.4nM范围内，更尤其在0.32至0.34nM范围内。
在某些实施例中，用呈二价双特异性形式之本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体及呈二价单特异性IgG形式之参考抗人类PD-1抗体量测结合亲和力。
因此，对人类PD-1之结合亲和力代表二价双特异性PD-1×LAG-3抗体之单价结合亲和力。
在某些实施例中，如藉由如本文所描述的表面电浆子共振(SPR)所量测，例如如实例12中所描述，在二价双特异性抗体形式中，本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体对于食蟹猕猴PD-1具有在约0.4至3.0nM范围内之结合亲和力。在某些实施例中，如藉由如本文所描述的表面电浆子共振(SPR)所量测，例如如实例12中所描述，在二价双特异性抗体形式中，本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体对于食蟹猕猴PD-1具有在0.4至3.0nM范围内之结合亲和力。因此，对于食蟹猕猴PD-1之结合亲和力代表双特异性PD-1×LAG-3二价抗体之单价结合亲和力。
在某些实施例中，如藉由如本文所描述的表面电浆子共振(SPR)所量测，例如如实例12中所描述，在二价双特异性抗体形式中，本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类LAG-3具有在约1至2nM范围内的结合亲和力。在某些实施例中，如藉由如本文所描述的表面电浆子共振(SPR)所量测，例如如实例12中所描述，在二价双特异性抗体形式中，本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体对人类LAG-3具有1至2nM范围内的结合亲和力。因此，对人类LAG-3之结合亲和力代表二价双特异性PD-1×LAG-3抗体之单价结合亲和力。
在某些实施例中，如藉由如本文所描述的表面电浆子共振(SPR)所量测，例如如实例12中所描述，在二价双特异性抗体形式中，本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体对食蟹猕猴LAG-3具有在约0.2至0.4nM范围内的结合亲和力。在某些实施例中，如藉由如本文所描述的表面电浆子共振(SPR)所量测，例如如实例12中所描述，在二价双特异性抗体形式中，本发明之PD-1×LAG-3多特异性抗体对食蟹猕猴LAG-3具有在0.2至0.4nM范围内的结合亲和力。因此，对于食蟹猕猴PD-1之结合亲和力代表二价双特异性PD-1×LAG-3抗体之单价结合亲和力。
在某些实施例中，本发明之多特异性结合部分对于结合于人类PD-1而言为单价的，意谓多特异性结合部分仅包含本发明之一个PD-1结合域。在某些实施例中，在等效浓度下，相较于此项技术中所述之对与PD-1结合至少呈二价的二价单特异性结合部分及/或多特异性结合部分，对与PD-1结合呈单价的本发明之多特异性结合部分对PD-1具有相当或相同或更高的结合亲和力。在某些实施例中，此类二价单特异性结合部分为如本文所述之纳武单抗类似物抗体。在某些实施例中，在等效浓度下，对与PD-1结合呈单价的本发明之多特异性结合部分具有比参考多特异性结合部分更高的效能。在某些实施例中，此类参考多特异性结合部分系如本文所述之纳武单抗类似物抗体。
在某些实施例中，本文进一步提供可用于产生本发明之多特异性结合部分的载体。在某些实施例中，此类表现载体包含编码如本文所述之抗人类PD-1结合域之重链可变区的核酸序列及编码如本文所述之抗人类LAG-3结合域之重链可变区的核酸序列。在某些实施例中，本发明之载体可进一步包含编码CH1区，且较佳铰链、CH2及CH3区之核酸序列。在某些实施例中，本发明之载体可进一步包含编码轻链可变区，且较佳CL区之至少一个核酸序列。在某些实施例中，轻链可变区可系如本文所描述之共同轻链可变区。
在某些实施例中，本发明亦提供一种细胞，其包含编码如本文所述之抗人类PD-1结合域之重链可变区的核酸序列及编码如本文所述之抗人类LAG-3结合域之重链可变区的核酸序列。在某些实施例中，本发明之细胞可进一步包含编码CH1区，且较佳铰链、CH2及CH3区之核酸序列。在某些实施例中，本发明之细胞可进一步包含编码轻链可变区，且较佳CL区之至少一个核酸序列。在某些实施例中，轻链可变区可系如本文所描述之共同轻链可变区。
在某些实施例中，本发明亦提供一种产生如本文所述之多特异性结合部分的细胞。在某些实施例中，此类细胞可为重组细胞，其已经本发明之载体转化。
在某些实施例中，本文进一步提供一种用于产生本发明之多特异性结合部分之变异体的方法，其中该方法包含：
-产生如本文所述之PD-1重链可变区及/或LAG-3重链可变区之序列变异体；及
-在细胞中表现如本文所描述之序列变异体及轻链可变区。
产生序列变异体之方法为此项技术中所熟知。可采用产生序列变异体之随机方法，或靶向方法，其中可例如将目标设为引入很可能提高或降低结合亲和力之变异。使抗体结合域亲和力成熟化之常规方法为此项技术中广泛已知，参见例如Tabasinezhad M.等人Immunol Lett.2019；212:106-113。亦可将目标设为引入减小针对结合域或包含此类结合域之部分的大规模生产的可发展性风险之变异。可引入很可能不会造成结合特异性损失及/或影响结合亲和力之变异。CDR及/或构架区内之胺基酸残基是否可经例如保守胺基酸残基取代且无或实质上无结合特异性及/或亲和力损失，可藉由此项技术中熟知之方法确定。实验实例包括但不限于例如丙胺酸扫描(Cunningham BC,Wells JA.Science.1989；244(4908):1081-5)及深度突变扫描(Araya CL,Fowler DM.Trends Biotechnol.2011；29(9):435-42)。亦已研发可预测胺基酸变异之影响的计算方法，诸如Sruthi CK,Prakash M.PLoSOne.2020；15(1):e0227621,Choi Y.等人PLoS One.2012；7(10):e46688，及Munro D,SinghM.Bioinformatics.2020；36(22-23):5322-9中所述。
在某些实施例中，本文进一步提供任何变异多特异性结合部分、包含任何变异多特异性结合部分之医药组合物、编码该等变异多特异性结合部分中之任一者之变异结合域之核酸、包含该等核酸之载体及细胞；及该等变异多特异性结合部分或医药组合物用于治疗癌症之用途。
医药组合物及方法
本发明之多特异性结合部分可与医药学上可接受之载剂一起用于医药组合物中以有效治疗疾病，例如与经抑制之免疫系统相关之疾病，尤其癌症。治疗包括向有需要之受试者投与有效量之多特异性结合部分或医药组合物。
在某些实施例中，本发明提供如本文所描述之多特异性结合部分或医药组合物，其用于疗法。
在某些实施例中，本发明提供如本文所描述之多特异性结合部分或医药组合物，其用于治疗与经抑制之免疫系统相关之疾病，尤其癌症。
在某些实施例中，本发明提供一种用于治疗疾病之方法，其中该方法包含向有需要之个体投与有效量之如本文所述之多特异性结合部分或医药组合物。
在某些实施例中，本发明提供一种用于治疗与经抑制之免疫系统相关之疾病，尤其癌症的方法，其中该方法包含向有需要之个体投与有效量的如本文所述之多特异性结合部分或医药组合物。
如本文所用，术语”个体”、”受试者”及”患者”可互换使用且系指哺乳动物，诸如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔、猫、犬、猴、牛、马、猪及其类似动物(例如患有癌症之患者，诸如人类患者)。
如本文所用，术语”治疗(treat/treating/treatment)”系指以治愈或改良疾病或其症状为目标，对受试者进行任何类型之干预或过程，或投与活性剂或活性剂组合。此包括逆转、缓解、改善、抑制或减缓与疾病相关之症状、并发症、病状或生物化学标志，以及预防与疾病相关之症状、并发症、病状或生物化学标志之发作、进展、发展、严重程度或复发。
如本文所用，”有效治疗”或”积极治疗反应”系指产生有益效果，例如改善疾病或病症，例如癌症之至少一种症状的治疗。有益效果可呈相对于基线之改良的形式，包括相对于根据方法开始疗法之前进行之量测或观测的改良。举例而言，有益效果可呈在任何临床阶段减缓、稳定化、停止或逆转受试者之癌症进展的形式，如疾病之临床或诊断症状或癌症标记物的减少或消除所证明。有效治疗可例如减小肿瘤大小、减少循环肿瘤细胞之存在、减少或预防肿瘤转移、减缓或遏制肿瘤生长及/或预防或延迟肿瘤复发或再发。
术语”治疗量”或”有效量”系指提供所要生物、治疗及/或预防结果之药剂或药剂组合的量。该结果可为疾病之病征、症状或病因中之一或多者的减少、改善、缓和、减轻、延迟及/或缓解，或生物系统之任何其他所要改变。在一些实施例中，治疗量为足以延迟肿瘤发展之量。在一些实施例中，治疗量为足以预防或延迟肿瘤复发之量。
有效量之药剂或组合物可：(i)减少癌细胞之数目；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延迟、减缓且可阻止癌细胞浸润至外周器官中；(iv)抑制肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤发生及/或复发；及/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关之症状中之一或多者。
有效量可根据诸如以下因素而变化：待治疗个体之疾病状态、年龄、性别及体重，及药剂或药剂组合在个体中引发所要反应之能力。
有效量可以一或多次投药投与。
有效量亦包括平衡药剂或药剂组合之任何有毒或有害作用与治疗学上有益作用的量。
在本发明之PD-1结合域、本发明之结合部分(例如包含抗人类PD-1结合域之多特异性结合部分)或本发明之医药组合物之情况下，术语”药剂”系指治疗活性物质。
通用术语
如本文所用，”包含”及其词形变化形式以其非限制性意义使用，意谓包括字组之后的项目，但不排除未具体提及的项目。
冠词”一(a/an)”在本文中用于指一或多个该冠词之文法对象。举例而言，”(一)组件”意谓一或多个组件。
本文中对专利文献或其他事项之参考不被视为承认该文献或事项为已知的或其含有之信息为在技术方案中之任一者的优先权日期之公共常识的一部分。
本说明书中所引用之所有专利及文献参考以全文引用之方式并入本文中。
应注意，在本说明书中，除非另外说明，否则分配至抗体或抗体片段之可变区中CDR及构架之胺基酸位置系根据Kabat编号(参见Sequences of Proteins ofImmunological Interest(美国国立卫生研究院(National Institute of Health),Bethesda,Md.,1987及1991))规定。恒定区中之胺基酸根据EU编号系统指示。
寄存编号主要系为了提供鉴别目标之另一方法而给出，结合之蛋白之实际序列可变化，此例如归因于编码基因突变，诸如在一些癌症或其类似疾病中出现之突变。抗原结合位点结合抗原及其多种变异体，诸如由一些抗原阳性免疫或肿瘤细胞表现者。
当在本文中提及基因、蛋白质时，较佳指基因或蛋白质之人类形式。当在本文中提及基因或蛋白质时，指天然基因或蛋白质，且指基因或蛋白质之变异形式，如可在肿瘤、癌症及其类似者中侦测到，较佳如可在人类肿瘤、癌症及其类似者中侦测到。
HGNC代表HUGO基因命名委员会(HUGO Gene nomenclature committee)。缩写之后的数字为寄存编号，利用该寄存编号，可以自HGNC数据库检出关于基因及由基因编码之蛋白质的信息。Entrez Gene提供寄存编号或基因ID，利用该寄存编号或基因ID，可以自国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库检出关于基因或由基因编码之蛋白质的信息。Ensemble提供寄存编号，利用该寄存编号，可以自Ensemble数据库获得关于基因或由基因编码之蛋白质的信息。Ensembl为EMBL-EBI与惠康信托桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)之间的联合项目，以开发对所选择之真核基因体产生及维持自动批注之软件系统。
以下实例说明本发明但并不意欲以任何方式限制本发明。
实例
实例1-抗人类PD-1结合域的产生
抗人类PD-1结合域可藉由此项技术中已知之方法获得，诸如WO 2019/009728中所描述。藉由用人类PD-1抗原部分对包含共同IGKV1-39轻链之转殖基因小鼠(小鼠)免疫接种，包括使用不同形式之基于DNA、蛋白质及细胞之抗原递送，获得一大组重链可变区。选择SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10之重链可变区以进行亲和力成熟。此产生202种亲和力成熟变异体，从其中选择多者在PD-1/PD-L1报导子分析中进一步表征。
实例2-PD-1IgG之效能及针对双特异性Ab生产之选择
为了确认呈IgG形式之亲和力成熟PD-1重链可变区至少与其亲本IgG一样有效，在PD-1/PD-L1报导子分析中筛选亲和力成熟变异体。分析中亦包括：亲本抗PD-1IgG，包含纳武单抗之重链(SEQ ID NO:18)及轻链(SEQ ID NO:22)之抗PD-1抗体(Fc缄默化IgG1纳武单抗类似物1)及包含纳武单抗之重链(SEQ ID NO:19)及轻链(SEQ ID NO:22)的抗PD-1抗体(IgG4纳武单抗类似物2)作为阳性对照，及包含具有SEQ ID NO:23之重链可变区及具有SEQID NO:24之轻链可变区的抗RSV-G抗体作为阴性对照。此栏中之最后2个孔保持无IgG作为基础水平对照。
根据制造商方案(Promega，目录号J1255)进行PD-1-PD-L1报导子分析，其使用两种细胞株：PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞，其为表现人类PD-L1及经设计以抗原非依赖性方式活化同源TCR之工程改造细胞表面蛋白质之CHO-K1细胞(Promega，目录号J109A)；及PD-1效应细胞：表现人类PD-1及由NFAT反应组件(NFAT-RE)驱动之荧光素酶报导子之Jurkat T细胞(Promega，目录号J115A)。
在第1天，在室温制备PD-L1细胞之细胞回收培养基：10％FBS(Sigma，目录号F2442)于DMEM/F12(Life Technologies，目录号21765)中。自冷冻器移出所需数目之PD-L1细胞小瓶(J109A；1小瓶/32个待测试IgG)，在37℃快速解冻且将细胞转移至50ml管中。将细胞回收培养基缓慢添加至细胞中，14.5ml/小瓶，每分钟体积加倍。1/2面积盘(Corning，目录号3688)的孔以50μl/孔填充此细胞悬浮液或填充50μl PBS(Invitrogen，目录号10010)。分析盘在37℃、5％ CO2及95％相对湿度下培育过夜。
在第二天，在室温制备2×浓缩分析缓冲液：4％FBS(Sigma，目录号F2442)于RPMI1640(Promega套组或Life Technologies，目录号21875)中。在PBS中制备2×浓缩测试及对照IgG溶液。亦在U底盘(Nunc，目录号268152)中在PBS中制备测试及对照IgG之连续稀释液，以10μg/ml开始且进行6步骤4倍滴定。阳性及阴性对照IgG连续稀释液在PBS中在各别深孔盘(Greiner Bio-one，目录号780270)上制备。亦制备无IgG之对照的基础对照。尽可能地使需要直接比较活性之IgG在同一盘上培育，以避免盘间变化。
自培育箱中取出分析盘且弹空孔。将20μl IgG溶液添加至分析盘中，以转移最低IgG浓度开始，接着以相同移液管尖转移更高浓度。
自冷冻器移出所需数目之PD-1效应细胞(J115A：1小瓶/32个待测试IgG)，在37℃下快速解冻且藉由向上及向下吸移而温和地混合。将来自所有小瓶之细胞转移至50ml管中。将2×浓缩分析缓冲液(每细胞小瓶5.9ml)缓慢添加至细胞中，使得每分钟体积加倍。将20μl效应细胞悬浮液添加至分析盘上之孔中。盘在37℃、5％ CO2及95％相对湿度下培育6小时。培育6小时后，盘在室温下预培育10分钟。
使用Bio-GloTM荧光素酶分析系统(Promega，目录号G7941)量测荧光素酶活性。将Bio-GloTM荧光素酶分析缓冲液(避光)平衡至室温隔夜且与Bio-GloTM荧光素酶分析受质充分混合。将40μl Bio-Glo荧光素酶添加至分析盘之各孔中且5至10分钟后在EnVision盘读取器(PerkinElmer，型号2104-0040A发光模式)上量测发光。读数系以相对光单位(RLU)值获得。作为实验活性相对于对照活性之比率的诱导倍数计算为IgG-X之RLU值/无IgG之RLU值。相对于对数IgG浓度及使用GraphPad Prism使用非线性回归及对数(抑制子)相对于反应(log(inhibitor)vs.response)(三参数)方程式拟合的S型曲线标绘诱导倍数。
结果展示于图1中。所有对照组显示预期活性且在不同盘中一致。亲和力成熟变异体至少与其亲本IgG一样有效，且与纳武单抗类似物1一样有效或更有效。亲和力成熟变异体及亲本抗体之EC50值展示于表2中。
表2.亲和力成熟变异体及亲本抗体之EC50值.
选择三种亲和力成熟PD-1变异体用于产生双特异性抗体，其中人类PD-1结合臂与人类LAG-3结合臂组合。此等三种PD-1变异体包含具有如SEQ ID NO:1；5；及6中所示之胺基酸序列的重链可变区，且与六种不同的抗人类LAG-3结合臂组合。六种抗人类LAG-3结合臂包含具有如SEQ ID NO:11、12、13、14、15及16中所示之胺基酸序列的重链可变区。使用FACS测试所得十八种双特异性抗体与人类PD-1及人类LAG-3之结合。
实例3-FACS分析
藉由FACS，使用经人类LAG-3或恒河猴LAG-3稳定转染或用人类PD-1或食蟹猕猴PD-1短暂转染之细胞株分析双特异性抗体之结合。为此目的，293FF细胞经编码人类PD-1及食蟹猕猴PD-1之pVAX表现构筑体短暂转染，且293FF细胞用编码人类LAG-3及恒河猴LAG-3之pVAX表现构筑体稳定转染。IgG特异性结合藉由FACS使用以50μg/ml起始的8步5倍稀释液量测。山羊抗人类PE用作二级侦测抗体。包括无染色之细胞或仅二级侦测抗体作为阴性分析对照物。在此分析中已知分别结合PD-1及LAG-3之包含具有SEQ ID NO:18之重链及具有SEQ ID NO:22之轻链的二价单特异性PD-1抗体(纳武单抗类似物1)及包含具有SEQ ID NO:27之重链及具有SEQ ID NO:28之轻链的二价单特异性LAG-3抗体(25F7/瑞拉利单抗类似物)用作阳性对照物。包含具有SEQ ID NO:23之重链可变区及具有SEQ ID NO:24之轻链可变区的二价单特异性RSV-G抗体(Fc缄默化IgG1同型对照物)用作阴性对照物。
阳性及阴性对照物表现如所预期。所有双特异性抗体均结合至人类LAG-3及恒河猴LAG-3。所有双特异性抗体亦结合于人类PD-1及食蟹猕猴PD-1。
实例4-PD-1/PD-L1报导子分析
遵循如实例2中所述之方案，在PD-1/PD-L1报导子分析中筛选双特异性抗体。
双特异性抗体以100μg/ml最终浓度起始在6步中6倍稀释，且一式两份地测试。在PBS中制备IgG稀释液。作为阳性对照物，包括以100μg/ml(最终浓度)起始，6步6倍滴定的包含具有如SEQ ID NO:20中所示之胺基酸序列之重链及具有SEQ ID NO:22之轻链的二价单特异性PD-1抗体(IgG4纳武单抗类似物3)。作为PD-1×LAG-3双特异性抗体之同型对照物，使用以100μg/ml(最终浓度)起始，4步6倍滴定的包含具有如SEQ ID NO:23中所示之胺基酸序列的重链可变区及具有SEQ ID NO:24之轻链可变区的与RSV-G结合的二价单特异性抗体(Fc缄默化IgG1同型对照物)。同型管柱中之最后两个孔保持无IgG作为基础水平对照组。抗体在37℃、5％ CO2、95％ RH下培育6小时。添加Bio-Glo荧光素酶且在Envision盘读取器(PerkinElmer)上量测发光。相对于不含抗体之孔(基础)计算由各抗体诱导之诱导倍数。
若抗体阻断PD-1/PD-L1轴，则此减轻TCR信号之抑制。TCR信号随后变得活跃，且产生基因转录及荧光素酶活性。荧光素酶活性与抗体结合及轴阻断相关。
结果展示于图2中。阳性及阴性对照物表现如所预期。所有双特异性抗体均展示PD-1/PD-L1轴之阻断。
图3A展示三种双特异性抗体与PD-1参考抗体纳武单抗类似物3之间的荧光素酶报导子分析中之效能比较。包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区之PD-1结合域的双特异性抗体之效能类似于参考PD-1抗体之效能。因此，此双特异性抗体用单一PD-1结合域实现与对结合于PD-1呈二价之参考抗体类似的效能。
亦在PD-1/PD-L1报导子分析中评估两种其他双特异性抗体之效能，且与包含具有如SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列之重链及具有SEQ ID NO:22之轻链的二价单特异性PD-1抗体(纳武单抗类似物4)相比较。用一式三份各样品重复分析两次。平均EC50值提供于图3B中。
藉由SPR以二价单特异性形式测试具有SEQ ID NO:1、5及6之PD-1结合域以确定与PD-1之结合亲和力，且与参考抗体纳武单抗之类似物进行比较。先前研究表明，对呈二价单特异性形式及双特异性形式之此等PD-1结合域，与PD-1之结合亲和力类似。以二价单特异性形式及对PD-1单价之双特异性形式(PD-1×RSV)测定纳武单抗类似物之结合亲和力。
SPR实验在25℃下使用Biacore 8K仪器(GE Healthcare)进行。SPR操作缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA及0.05％v/v界面活性剂P20，pH 7.4)由10X HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)制备。抗人类Fc抗体(GE Healthcare)经由胺偶合固定于S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)之所有十六个流槽上。所有流槽之固定化水平为约9000RU。抗PD-1抗体之所要捕捉水平(100至150RU)藉由使适当浓度之抗PD-1抗体以10μL/min流动速率流动穿过各信道之活动流槽60秒来达成。随后，以45μL/min之流动速率，将由PD-1储备液(R&D 8986-PD)制备之PD-1三倍连续稀释浓度系列(总计7种浓度，最高300nM)及操作缓冲液(0浓度)注射240秒(缔合时间)，紧接着操作缓冲液注射480秒(解离时间)。表面藉由30μL/min流动速率3M MgCl2之30秒注射再生。自将数据整体拟合至1:1结合模型获得结合动力学及亲和力参数。
结果呈现于图4中。三种双特异性抗体之PD-1结合域对PD-1之结合亲和力比两种抗体形式之纳武单抗类似物高至少十倍。
实例5-PD-1/LAG-3报导子分析
PD-L1 Raji细胞(Promega，目录号CS1978B03)藉由将细胞悬浮于分析培养基(在室温下1％hiFBS(Gibco,Gibco/Thermo Fisher，目录号10270106)于RPMI 1640(+25mMHEPES)(Life Technologies，目录号52400)中)中来制备，得到2百万个细胞/毫升。JurkatPD-1及LAG-3效应细胞(Promega，目录号CS1978B02)藉由使细胞悬浮于分析培养基中来制备，得到4百万个细胞/毫升。3×浓缩测试及对照IgG溶液在PBS中制备，亦即藉由稀释因子在2与10之间的始于6至300μg/ml之间的6倍连续稀释(最终分析浓度始于20至100μg/ml之间)。
因为此分析可对所使用之FBS批次极其敏感，所以FBS批次应在进行该分析之前进行验证。
分析盘填充有25μl Jurkat PD-1及LAG-3效应细胞或PBS。添加25μl测试及对照IgG溶液。需要直接比较活性之IgG应尽可能地在同一分析盘上培育，以避免盘间变化(盘效应)之影响。
将等体积之PD-L1 Raji细胞悬浮液与相同体积之SED溶液(于分析培养基中的100ng/ml之葡萄球菌肠毒素D(Toxin Technologies，目录号PD303))混合。将25μl Raji/SED混合物添加至分析盘。
分析盘在37℃、5％ CO2及95％相对湿度下培育6小时。
培育6小时后，将分析盘静置在室温下10分钟。将75μl Steady-Glo荧光素酶(Promega，目录号E2510)添加至孔且5至10分钟后在Envision盘读取器(根据发光方案；PerkinElmer，型号2104-0020A)上量测发光。
相对于不含IgG之孔计算由各抗体诱导之诱导倍数。
将IgG与阳性对照物，且与最高浓度为50μg/ml+50μg/ml的二价单特异性PD-1抗体纳武单抗类似物3及二价单特异性LAG-3抗体25F7/瑞拉利单抗类似物之组合进行比较。所有IgG一式三份地测试。
结果展示于图5中。阳性及阴性对照物表现如所预期。所有双特异性抗体相较于PD-1及LAG-3参考抗体之组合在撤销PD-1及LAG-3路径之抑制活性方面更有效。相对于阳性对照物之曲线下面积(AUC)百分比及EC50值提供于表3中。
实例6-SEB分析
在以50μg/ml(最终浓度)起始的6步7倍稀释滴定中，测试IgG。在分析培养基中以4×最终浓度制备IgG稀释液。作为阳性对照物，包括二价单特异性PD-1抗体纳武单抗类似物3及二价单特异性LAG-3抗体25F7/瑞拉利单抗类似物之组合，其浓度最高为25μg/ml+25μg/ml。所有IgG一式三份地测试。
已知对抗LAG-3及抗PD-1/PD-L1 IgG起反应的约200.000个低温保存之PBMC与双特异性及对照抗体及SEB以2μg/ml之最终浓度一起在37℃、5％ CO2及90％ RH下培育3天。3天之后，收集上清液，稀释4倍，且用流式荧光检测术(Luminex)量测IL-2含量。
用来自两个供体之PBMC进行分析。来自一个供体之资料展示于图6中。阳性及阴性对照物表现如所预期。许多双特异性抗体比PD-1及LAG-3参考抗体之组合更有效地诱导IL-2释放。相对于阳性对照物之曲线下面积(AUC)百分比值提供于表3中。
实例7-抗原回忆分析
在以10μg/ml(最终浓度)起始的6步5倍稀释滴定中，测试IgG。作为阳性对照物，包括二价单特异性PD-1抗体纳武单抗类似物3及二价单特异性LAG-3抗体25F7/瑞拉利单抗类似物之组合，其浓度最高为5μg/ml+5μg/ml。作为阴性对照物，使用以10μg/ml起始的包含具有SEQ ID NO:23之重链可变区及具有SEQ ID NO:24之轻链可变区的针对RSV-G之抗体(Fc缄默化IgG1同型对照物)的4步5倍稀释液。两个孔保持不含肽池作为阴性对照组。所有IgG一式三份地测试。
约300.000个来自所选择供体且静置隔夜之PBMC与IgG及CEFT MHC-IICD4肽以1μg/ml之最终浓度一起在37℃、5％ CO2及90％ RH下培育6天。收集上清液以用流式荧光检测术量测IFN-γ及TNF-α之含量。
结果展示于图7中。阳性及阴性对照物表现如所预期。许多双特异性抗体比PD-1及LAG-3参考抗体之组合更有效地诱导IFN-γ释放。TNF-α读数之结果与IFN-γ之彼等结果类似。相对于阳性对照物之曲线下面积(AUC)百分比值提供于表3中。
表3.在PD-1/LAG-3报导子分析、SEB分析及抗原回忆分析中筛选之双特异性抗体的EC50及AUC值相对于阳性对照物的百分比.
实例8-活体内研究
评价负载MDA-MB-231肿瘤之hu-CD34小鼠中五种双特异性PD-1×LAG-3抗体之功效。
人类化CD34+NSG小鼠(Jackson Laboratories)皮下接种悬浮于100μl等体积无血清培养基及基质胶基质(Corning)中的总共3×106个MDA-MB-231肿瘤细胞。当肿瘤达到大约80至100mm3时，将小鼠随机分为八组，每组十只小鼠且于1×PBS(Life Technologies)中给药：1)IgG1(10mg/kg)；2)IgG4(10mg/kg)；3)派立珠单抗(10mg/kg)；4)瑞拉利单抗类似物(10mg/kg)；5)派立珠单抗(10mg/kg)+瑞拉利单抗类似物(10mg/kg)；6)PD-1×LAG-3双特异性抗体1(10mg/kg)；7)PD-1×LAG-3双特异性抗体2(10mg/kg)；及8)PD-1×LAG-3双特异性抗体3(10mg/kg)，且在不同实验中：9)PD-1×LAG-3双特异性抗体4(10mg/kg)；及10)PD-1×LAG-3双特异性抗体5(10mg/kg)。
PD-1×LAG-3双特异性抗体1包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区(PD-1)及具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区(LAG-3)。
PD-1×LAG-3双特异性抗体2包含具有如SEQ ID NO:6中所示之胺基酸序列之重链可变区(PD-1)及具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区(LAG-3)。
PD-1×LAG-3双特异性抗体3包含具有如SEQ ID NO:5中所示之胺基酸序列之重链可变区(PD-1)及具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区(LAG-3)。
PD-1×LAG-3双特异性抗体4包含具有如SEQ ID NO:7中所示之胺基酸序列之重链可变区(PD-1)及具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区(LAG-3)。
PD-1×LAG-3双特异性抗体5包含具有如SEQ ID NO:8中所示之胺基酸序列之重链可变区(PD-1)及具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区(LAG-3)。
双特异性抗体之结合域可以包含具有如SEQ ID NO:29中所示之胺基酸序列的CH1。双特异性抗体之PD-1结合重链可包含分别具有如SEQ ID NO:30及31中所示之胺基酸序列的CH2及CH3。双特异性抗体之LAG-3结合重链可包含分别具有如SEQ ID NO:32及33中所示之胺基酸序列的CH2及CH3。PD-1和LAG-3结合域可以包含具有如SEQ ID NO:24中所示的胺基酸序列的轻链可变区及具有如SEQ ID NO:60中所示的胺基酸序列的轻链恒定区。
动物每五天腹膜内给药持续20天之时段(图8A)，或每五天给药持续34天之时段(图8B)。使用测径规量测肿瘤，且藉由将肿瘤同化成椭球使用下式来计算肿瘤体积：l(长度)×w2(宽度)×1/2。藉由单向ANOVA确定功效研究中之统计显著性。亦在研究全程监测体重。处理后收集肿瘤，显微解剖且根据制造商指南使用肿瘤解离套组(Miltenyi Biotec)消化，接着进行流式细胞量测分析。
流式细胞量测分析
在活体内阶段结束，开始处理之后29天时，藉由流式细胞量测分析来分析肿瘤细胞。为此目的，收集肿瘤，转移至含有3mL DMEM培养基之15-mL C管(Miltenyi Biotec)中。为获得用于流式细胞量测分析之单细胞悬浮液，将肿瘤显微解剖，且根据制造商说明书使用肿瘤解离套组(Miltenyi Biotec)消化。使用针对活/死细胞的存活检测染料及针对人类CD45之荧光染料结合抗体作为白血球标记物进行肿瘤细胞之分析。用于此研究之流式细胞量测术分组如下：
/>
在添加抗体混合液之前，在室温下针对人类及鼠类Fc受体阻断样品10分钟。在室温下进行活/死细胞染色15分钟，随后添加抗体混合液。在室温下培育混合液30分钟后，充分洗涤样品且用2％ PFA固定。使用BD Symphony流式细胞量测分析仪及FlowJo软件包操作且分析细胞。
结果
结果展示于图8中。所有双特异性抗体均展现比作为单一药剂或作为组合之单特异性抗体更佳的功效(图8A及图8B)。在给药20天之后，一项研究归因于双特异性抗体处理组中移植物抗宿主疾病之病征增加而必须终止(图8A)，其可能归因于在用双特异性抗体处理时增加之免疫活化。然而，在其他组中并未观测到此现象。
在完成(takedown)功效研究之后，解离肿瘤以用于藉由流式细胞量测术进行免疫PD分析。如所提及，14色流式细胞量测术分组(panel)经设计及实施以评价处理后之TIL。评价TIL，所有评价之双特异性抗体均展现肿瘤中作为Treg之人类T细胞的百分比降低(图8C)。此外，所有评价之双特异性抗体均展现肿瘤中CD8+/Treg之比率提高(图8D)。
实例12-结合特征
藉由SPR执行双特异性抗体之结合亲和力及同时结合。
双特异性抗体对人类PD-1、食蟹猕猴PD-1、人类LAG-3及食蟹猕猴LAG-3之结合亲和力系以PD-1×LAG-3双特异性抗体形式测定，且与参考抗体纳武单抗及瑞拉利单抗之类似物相比较。
使用SPR在BIAcore-T200仪器上使用固定于CM5系列S传感器芯片上之抗huIgG抗体，以双特异性IgG形式测定结合亲和力。亦评估两种人类蛋白质是否可被双特异性抗体同时接合。测定包含以下的双特异性抗体之结合亲和力：针对人类PD-1、食蟹猕猴PD-1、人类LAG-3及食蟹猕猴LAG-3之包含具有SEQ ID NO:7之重链可变区之PD-1结合域或包含具有SEQ ID NO:8之重链可变区之PD-1结合域及包含具有SEQ ID NO:17之重链可变区的LAG-3结合域。比较双特异性抗体之结合亲和力与参考抗体纳武单抗之类似物(SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22)及参考抗体瑞拉利单抗之类似物(SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)的结合亲和力。使用针对不相关目标之抗体作为结合之阴性对照物。
所用单体重组抗原为：huLAG-3(huLAG-3-His，Sino Biological，目录号16498-H08H)、cyLAG-3(cyLAG-3-His，Sino Biological，目录号90841-C08H)、huPD-1(huPD-1-His，Sino Biological，目录号10377-H08H)及cyPD-1(cyPD-1-His,R&D Systems，目录号8509-PD)。
固定化：
山羊抗huIgG Fc(JIR，目录号109-005-098)在CM5传感器芯片(GE Healthcare；目录号BR-1005-30)之四个流道上之固定化系藉由胺偶合，使用稀释于10mM乙酸盐pH 5.0中之40μg/ml抗体进行。使用以下条件：420秒之活化时间，420秒之失活时间，失活缓冲液：1M乙醇胺pH 8.5。实现高密度固定化，在9158至9428RU范围内。
亲和力测定：
对于亲和力确定，测试及对照抗体藉由固定于CM5传感器芯片上之抗huIgG抗体在仅一个流槽中以30μl/min之流动速率捕获60秒。捕获抗体浓度对于PD-1亲和力测定为20nM且对于LAG-3亲和力测定为10nM。此随后为以30μl/min之流动速率的缓冲液之60秒稳定化阶段。以30μl/min，在具有捕获抗体之流槽及参考流槽(无捕获抗体)两者中注射抗原之五步两倍连续稀释液持续60秒。抗原浓度对于huPD-1及cyPD-1为80nM降至2.5nM，且对于hu-LAG-3及cy-LAG-3为40至1.25nM。针对缓冲效应之背景校正藉由单独缓冲液注射进行且将参考流槽用于背景减除。
在抗体-抗原相互作用之后，300秒之解离速率洗涤以30μl/min进行。在30μl/min下使用两次15μl 10mM甘胺酸pH 1.5注射进行循环之间的再生，接着为90μl/min之90秒稳定化步骤。为确认总再生及分析一致性，在分析结束时及针对所有测试抗原用所有测试抗原浓度进行参考抗体之重复操作。
将HBS-EP+缓冲液用于PD-1亲和力测定，而对于LAG-3，HBS-EP+补充有NaCl直至500mM NaCl之最终浓度，以避免非特异性结合。
在Biacore T200评价软件中分析结果。对原始RU信号进行空白减除(无捕获抗体之通道)及针对缓冲效应的背景校正(减去利用捕获抗体但第二注射利用缓冲液而非抗原之操作)。将1:1结合朗缪尔拟合应用于样品曲线集合，使用Biacore T200评价软件之同时拟合选项以计算缔合速率(ka)、解离速率(kd)及亲和力(KD)。
所捕获之双特异性及参考抗体展示与各别重组抗原之结合。未观测到抗原与阴性对照抗体之结合。
数据之概述提供于图9中。PD-1×LAG-3双特异性抗体对人类LAG-3之亲和力比瑞拉利单抗类似物低，且对人类及食蟹猕猴PD-1之亲和力比纳武单抗类似物高。PD-1×LAG-3双特异性抗体同时结合至人类PD-1及人类LAG-3。
同时结合：
双特异性抗体与hu-LAG-3及huPD-1之同时结合用与亲和力测定类似之设置分析。使用固定化之抗huIgG捕捉双特异性抗体。包括纳武单抗类似物及瑞拉利单抗类似物参考抗体之混合物作为阳性对照物且包括针对不相关目标之抗体作为阴性对照物。随后，以饱和浓度(huPD-1为80nM且hu-LAG-3为40nM)注射抗原中之一者300秒，以占据所有抗原结合位点。以与注射1中所用相同之浓度依序单独或与第一抗原组合注射第二抗原(以确保所有结合位点保持被占据)。在整个过程期间使用高盐缓冲液，以防止hu-LAG-3非特异性结合。
数据之概述提供于图9中。PD-1×LAG-3双特异性抗体同时结合至人类PD-1及人类LAG-3。
序列
SEQ ID NO:1-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:2-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:3-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:4-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:5-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:6-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:7-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:8-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:9-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:10-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:11-重链可变区-根据Kabat IMGT之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:12-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:13-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:14-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:15-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:16-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:17-重链可变区-根据Kabat之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:18-重链纳武单抗类似物1
SEQ ID NO:19-重链纳武单抗类似物2
SEQ ID NO:20-重链纳武单抗类似物3
SEQ ID NO:21-重链纳武单抗类似物4
SEQ ID NO:22-轻链纳武单抗
SEQ ID NO:23-重链可变区阴性对照物
SEQ ID NO:24-轻链可变区阴性对照物
SEQ ID NO:25-重链莫维珠单抗类似物
SEQ ID NO:26-轻链莫维珠单抗类似物
SEQ ID NO:27-重链瑞拉利单抗类似物
SEQ ID NO:28-轻链瑞拉利单抗类似物
SEQ ID NO:29-CH1
SEQ ID NO:30-CH2
SEQ ID NO:31-CH3
SEQ ID NO:32-CH2
SEQ ID NO:33-CH3
SEQ ID NO:34-纳武单抗类似物重链可变区
SEQ ID NO:35-纳武单抗类似物轻链可变区
SEQ ID NO:36-根据Kabat之HCDR1
/>
SEQ ID NO:37-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:38-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:39-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:40-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:41-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:42-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:43-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:44-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:45-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:46-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:47-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:48-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:49-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:50-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:51-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:52-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:53-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:54-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:55-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:56-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:57-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:58-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:59-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:60根据IMGT之LCDR1
SEQ ID NO:61根据IMGT之LCDR2
SEQ ID NO:62根据IMGT之LCDR3
SEQ ID NO:63轻链可变区-根据IMGT之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:64轻链可变区-根据IMGT之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:65轻链可变区-根据IMGT之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:66轻链可变区-根据IMGT之以粗体指示且加下划线的CDR
SEQ ID NO:67V区
SEQ ID NO:68V区
SEQ ID NO:69V区
SEQ ID NO:70V区
SEQ ID NO:71轻链恒定区
SEQ ID NO:72CH2
SEQ ID NO:73CH3
SEQ ID NO:74-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:75-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:76-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:77-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:78-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:79-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:80-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:81-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:82-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:83-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:84-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:85-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:86-根据Kabat之HCDR1
/>
SEQ ID NO:87-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:88-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:89-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:90-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:91-根据Kabat之HCDR3
SEQ ID NO:92-根据Kabat之HCDR1
SEQ ID NO:93-根据Kabat之HCDR2
SEQ ID NO:94-根据Kabat之HCDR3
/>
Claims (44)
1.一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，其中该抗人类PD-1结合域对人类PD-1之结合亲和力高于参考抗人类PD-1结合域，其中该参考抗人类PD-1结合域包含具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
2.一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，其中该抗人类PD-1结合域在阻断配位体与PD-1之结合方面提供相较于参考抗人类PD-1抗体相当(comparable)或相同或更高的效能，其中该参考抗人类PD-1抗体包含两个具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及两个具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
3.如权利要求1或2之多特异性结合部分，其中该抗人类PD-1结合域包含至少一个重链可变区及轻链可变区，且其中该轻链可变区较佳为能够与具有不同抗原决定基特异性之多个重链配对的轻链之轻链可变区。
4.如权利要求1或3之多特异性结合部分，其中该结合亲和力藉由表面电浆子共振量测。
5.如权利要求1至4中任一项之多特异性结合部分，其中该抗人类PD-1结合域对人类PD-1之结合亲和力比该参考抗人类PD-1结合域高至少十倍。
6.如权利要求1至4中任一项之多特异性结合部分，其中该抗人类PD-1结合域对人类PD-1之结合亲和力比该参考抗人类PD-1结合域高十倍。
7.如权利要求1至6中任一项之多特异性结合部分，其中该抗人类PD-1结合域对人类PD-1之结合亲和力在约0.1至1.0nM范围内，尤其在约0.3至0.8nM范围内，更尤其在约0.38至0.78nM范围内。
8.如权利要求1及3至7中任一项之多特异性结合部分，其中该结合亲和力系用呈二价单特异性IgG形式之该抗人类PD-1结合域及该参考抗人类PD-1结合域来量测。
9.如权利要求1及3至7中任一项之多特异性结合部分，其中该结合亲和力系用呈二价双特异性IgG形式之该抗人类PD-1结合域及呈二价单特异性IgG形式之该参考抗人类PD-1结合域来量测。
10.如权利要求2、3或5至9中任一项之多特异性结合部分，其中阻断配位体与PD-1结合之效能系在PD-1/PD-L1或PD-1/LAG-3报导子分析中量测。
11.如权利要求2、3或5至10中任一项之多特异性结合部分，其中阻断配位体与PD-1结合的相当效能为在该参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1结合的效能之5倍范围内的效能，包括与该参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1结合的效能的5倍、4倍、3倍及2倍偏差。
12.如权利要求1至11中任一项之多特异性结合部分，其中该重链可变区包含：
a)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:38中所示之胺基酸序列；
b)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41中所示之胺基酸序列；
c)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:44中所示之胺基酸序列；
d)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:47中所示之胺基酸序列；
e)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50中所示之胺基酸序列；
f)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53中所示之胺基酸序列；
g)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56中所示之胺基酸序列；或
h)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示之胺基酸序列；
其中各HCDR可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。
13.如权利要求1至12中任一项之多特异性结合部分，其包含重链可变区，具有胺基酸序列如SEQ ID NO:1至8中之任一者中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性。
14.如权利要求3至13中任一项之多特异性结合部分，其中该抗人类PD-1结合域进一步包含CH1及CL区。
15.一种多特异性结合部分，其包含抗人类PD-1结合域，其中该抗人类PD-1结合域包含重链可变区，其中该重链可变区包含：来自具有由SEQ ID NO:1至8组成之群之胺基酸序列的重链可变区之重链CDR1(HCDR1)、来自具有由SEQ ID NO:1至8组成之群之胺基酸序列的重链可变区之重链CDR2(HCDR2)，及来自具有由SEQ ID NO:1至8组成之群之胺基酸序列的重链可变区之重链CDR3(HCDR3)。
16.如权利要求15之多特异性结合部分，其中该重链可变区包含：
a)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:38中所示之胺基酸序列；
b)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41中所示之胺基酸序列；
c)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:44中所示之胺基酸序列；
d)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:47中所示之胺基酸序列；
e)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50中所示之胺基酸序列；
f)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53中所示之胺基酸序列；
g)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55及SEQ ID NO:56中所示之胺基酸序列；或
h)重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，其分别具有如SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59中所示之胺基酸序列；
其中各HCDR可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。
17.如权利要求15或16之多特异性结合部分，其包含重链可变区，该重链可变区具有胺基酸序列如SEQ ID NO:1至8中之任一者中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性。
18.如权利要求15至17中任一项之多特异性结合部分，其中该抗人类PD-1结合域进一步包含CH1及CL区。
19.如权利要求1至18中任一项之多特异性结合部分，其进一步包含结合至免疫效应细胞上表现之细胞表面部分的结合域。
20.如权利要求1至19中任一项之多特异性结合部分，其进一步包含抗人类LAG-3结合域。
21.如权利要求20之多特异性结合部分，其中该抗人类LAG-3结合域包含重链可变区，该重链可变区包含：
a)具有如SEQ ID NO:11中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
b)具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
c)具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
d)具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
e)具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；
f)具有如SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)；或
g)具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列之重链可变区的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)及重链CDR3(HCDR3)，
其中各HCDR可包含至多三个、两个或一个胺基酸取代。
22.如权利要求20或21之多特异性结合部分，其中该抗人类LAG-3结合域包含具有如SEQ ID NO:11至17中之任一者中所示，或与其具有至少80％、较佳85％、更佳90％或最佳95％序列一致性之胺基酸序列的重链可变区。
23.如权利要求20至22中任一项之多特异性结合部分，其中该抗人类LAG-3结合域进一步包含轻链可变区，较佳能够与具有不同抗原决定基特异性之多个重链配对的轻链之轻链可变区，尤其与该抗人类PD-1结合域之轻链可变区相同的轻链可变区。
24.如权利要求20至23中任一项之多特异性结合部分，其中该抗人类LAG-3结合域进一步包含CH1及CL区。
25.如权利要求15至24中任一项之多特异性结合部分，其中该结合部分在阻断配位体与PD-1之结合方面具有相较于二价单特异性抗人类PD-1抗体相当或相同或更高的效能，其中该二价单特异性抗人类PD-1抗体包含两个结合域，该等结合域包含具有如SEQ ID NO:34中所示之胺基酸序列的重链可变区及具有如SEQ ID NO:35中所示之胺基酸序列的轻链可变区。
26.如权利要求25之多特异性结合部分，其中阻断配位体与PD-1结合之效能在PD-1/PD-L1或PD-1/LAG-3报导子分析中量测。
27.如权利要求25或26之多特异性结合部分，其中阻断配位体与PD-1结合的相当效能为在该参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1结合的效能之5倍范围内的效能，包括与该参考抗人类PD-1抗体的阻断配位体与PD-1结合的效能的5至2倍，较佳5、4、3或2倍偏差。
28.如权利要求1至27中任一项之多特异性结合部分，其中该结合部分对于结合至人类PD-1为单价。
29.一种医药组合物，其包含有效量之如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分及医药学上可接受之载剂。
30.如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分或如权利要求29之医药组合物，其用于疗法。
31.如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分或如权利要求29之医药组合物，其用于治疗与经抑制之免疫系统相关之疾病。
32.如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分或如权利要求29之医药组合物，其用于治疗癌症。
33.一种用于治疗疾病之方法，其包含向有需要之个体投与有效量之如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分或如权利要求29之医药组合物。
34.一种用于治疗与经抑制之免疫系统相关之疾病之方法，其包含向有需要之个体投与有效量之如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分或如权利要求29之医药组合物。
35.一种用于治疗癌症之方法，其包含向有需要之个体投与有效量之如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分或如权利要求29之医药组合物。
36.一种载体，其包含编码如权利要求1至28中任一项所定义之抗人类PD-1结合域之重链可变区的核酸序列及编码如权利要求21或22中所定义之抗人类LAG-3结合域之重链可变区的核酸序列。
37.如权利要求36之载体，其中该载体进一步包含编码CH1区及较佳铰链、CH2及CH3区之核酸序列。
38.如权利要求36或37之载体，其中该载体进一步包含至少一个编码轻链可变区，及较佳CL区之核酸序列。
39.如权利要求38之载体，其中该轻链可变区为能够与具有不同抗原决定基特异性之多个重链配对的轻链之轻链可变区。
40.一种细胞，其包含编码如权利要求1至28中任一项所定义之抗人类PD-1结合域之重链可变区的核酸序列及编码如权利要求21或22中所定义之抗人类LAG-3结合域之重链可变区的核酸序列。
41.如权利要求40之细胞，其中该细胞进一步包含编码CH1区及较佳铰链、CH2及CH3区之核酸序列。
42.如权利要求40或41之细胞，其中该细胞进一步包含至少一个编码轻链可变区，及较佳CL区之核酸序列。
43.一种细胞，其产生如权利要求1至28中任一项之多特异性结合部分。
44.如权利要求43之细胞，其中该细胞为重组细胞，其已经如权利要求36至39中任一项之载体转化。
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