CN118161648A - 酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种酵母β‑葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵及其制备和应用。本发明的酵母β‑葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵，是由酵母β‑葡聚糖和胶原蛋白通过自组装工艺制备而成，制备步骤为：制备胶原蛋白溶液，S2制备酵母β‑葡聚糖溶液，4℃下，将胶原蛋白溶液与酵母β‑葡聚糖溶液混匀，调节pH值，充分搅拌混匀后，置于水浴锅孵育，两者自组装成凝胶后，透析除盐，预冷，冷冻干燥。本发明未使用交联剂，避免了交联剂的残留，采用本发明方法所得复合止血海绵可有效防止吸收液体后材料坍塌，具有优良的吸液性能、可控的降解速度以及优良的止血性能和促进创面修复的能力。
Description
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵及其制备和应用。
背景技术
出血是创伤发生后最常见的临床表现之一，据统计，重大交通事故后，死亡的主要原因是胸腹部创伤引起内脏破损大出血，导致失血性休克，若能在发生交通意外后30分钟内进行有效止血，减少血液流失，存活率能够提高40%以上。因此，开发具有快速止血能力并促进伤口修复的止血材料，对于临床治疗具有至关重要的意义。
胶原蛋白作为动物体内含量丰富的功能性蛋白质，因其具有良好的生物相容性、低免疫原性和生物可降解性，也能参与内源性止血途径，能够增强血小板凝集、活化，激活生长因子促进创面修复等优势，逐渐成为新型止血材料开发的热点。但在实际的应用中发现，商用纯胶原蛋白海绵面临不可控的降解速度、力学性能差和吸收液体后易坍塌等缺陷。目前主要的解决方案是对胶原蛋白改性或者使用交联剂来改善胶原蛋白的性能，例如中国专利申请CN101695581A公开了一种规模制备类人胶原蛋白止血海绵的方法，该发明将含有胶原蛋白的混合液冷冻干燥后使用0.1％～1.0％的戊二醛溶液交联，然后Co-60灭菌后得到类人胶原蛋白止血海绵成品。中国专利申请CN116102669A公开了一种胶原蛋白的新型交联剂、交联胶原纤维的方法和应用，该发明以由壳聚糖季铵盐与1,4-丁二醇缩水甘油醚室温避光反应，透析后冻干得到的产物作为交联剂，交联胶原蛋白纤维，制备得到交联胶原蛋白纤维。但难以避免会造成交联剂的残留和胶原蛋白结构的破坏。因此，如何在不使用交联剂和破环胶原蛋白的结构的情况下改善其不可控的降解速度和力学性能成为一个亟待解决的技术难题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵及其制备和应用。本发明未使用交联剂，避免了交联剂的残留，采用本发明方法所得复合止血海绵保持了酵母β-葡聚糖和胶原蛋白自身原有的三螺旋结构，可有效防止吸收液体后材料坍塌，具有优良的力学性能、吸液性能、可控的降解速度以及优良的止血性能和促进创面修复的能力。
本发明的技术方案是：
一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵，所述的复合止血海绵是由酵母β-葡聚糖和胶原蛋白通过自组装工艺制备而成。
进一步地，所述的复合止血海绵具有多孔的纤维网状结构。
本发明的另一目的在于提供所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法。
所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
S1制备胶原蛋白溶液：称取胶原蛋白，加入酸性溶液，持续搅拌至溶解，制备成胶原蛋白溶液；
S2制备酵母β-葡聚糖溶液：称取酵母β-葡聚糖，加入碱性溶液，持续搅拌至溶解，制备成酵母β-葡聚糖溶液；
S3制备酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵：将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与步骤S2制备的酵母β-葡聚糖溶液混匀，调节pH值，充分搅拌混匀后，置于水浴锅孵育，两者自组装成凝胶后，透析除盐，预冷，冷冻干燥，得到酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵。
进一步地，所述步骤S1中所述酸性溶液为浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液。
进一步地，所述步骤S2中所述碱性溶液为浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠水溶液。
进一步地，所述步骤S2中所述酵母β-葡聚糖溶液的浓度为14-70 mg/mL。
进一步地，所述步骤S3中胶原蛋白溶液与酵母β-葡聚糖溶液的体积比为7：1。
进一步地，所述步骤S3中调节pH至6-8。
进一步地，所述步骤S3中孵育的温度为33℃-37℃，孵育时间为1-3h。
进一步地，所述步骤S3中透析除盐的时间为24-48h。
进一步地，所述步骤S3中预冷时间为12-36h，冷冻干燥时间为24-48h。
本发明的另一目的在于提供所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵或所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法制得的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵在制备可吸收性止血材料、创面修复材料及生物医用材料中的应用。
为了解决纯胶原蛋白海绵存在的不可控的降解速度、力学性能差和吸收液体后易坍塌等技术难题，本发明采用酵母β-葡聚糖和胶原蛋白自组装工艺制备的复合止血海绵，酵母β-葡聚糖是从酵母中分离出来的多糖，具有抗氧化、抗感染、抗病毒、激活巨噬细胞的Dectin-1受体，加速巨噬细胞由M1表型向M2表型分化，促进伤口愈合的作用。由于其具有独特的三螺旋构象，能够通过氢氧化钠溶液使其结构破坏，可通过调节pH至中性使其重新自组装成三螺旋结构。本发明通过乙酸水溶液溶解胶原蛋白，氢氧化钠溶液溶解酵母β-葡聚糖，通过两者酸碱中和，胶原蛋白分子和酵母β-葡聚糖分子各自自组装形成三螺旋结构，并相互缠绕，最终制备的酵母β-葡聚糖-胶原蛋白复合止血海绵，具有可控的降解速度、良好的力学性能，解决了传统胶原蛋白海绵存在的降解速度不可控、力学性能差和吸收液体后易坍塌等技术难题。
本发明不使用交联剂，反应条件温和，能够保持酵母β-葡聚糖和胶原蛋白结构完整，将两者复合制备得到的复合止血海绵，具有可控的降解速度、良好的机械性能和优异的止血性能，可广泛应用于创面修复、创伤、伤口止血等领域，具有广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
（1）通过本发明方法制备出的酵母β-葡聚糖-胶原蛋白复合止血海绵具有可控的降解速度、良好的机械性能和优异的止血性能。
（2）本发明所制备的复合止血海绵，通过自组装工艺制备，操作简单，未使用交联剂，避免了交联剂的残留，符合工业规模化生产。
（3）本发明所制备的复合止血海绵通过调节酵母β-葡聚糖含量，可以达到调控复合止血海绵的降解周期的目的。
（4）本发明所制备的复合止血海绵的多孔结构，赋予其快速吸水能力，良好的血液相容性，对血小板和血细胞具有强烈的黏附能力，有利于血小板的活化和血细胞的激活凝血过程，实现快速的凝血；该复合止血海绵能够加速细胞的增殖和伤口的愈合，减少疤痕的产生，并促进血管和毛囊的再生。
（5）本发明所制备的复合止血海绵可作为可吸收性止血材料，而且可作为创面修复材料及生物医用材料使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为牛Ⅰ型胶原蛋白与本发明制备的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳试验凝胶照片；
图2为本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵的扫描电子显微镜图；
图3为本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵的溶胀率测试结果图；
图4为对比例1制备的纯胶原蛋白海绵的60%压缩循环检测结果图；
图5为本发明实施例1制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图；
图6为本发明实施例2制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图；
图7为本发明实施例3制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图；
图8为本发明实施例4制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图；
图9为本发明实施例5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图；
图10为本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵体外降解实验结果图；
图11为本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵对NIH-3T3细胞的细胞毒性检测结果图；
图12为本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵体外溶血试验结果图；
图13为各组小鼠肝脏圆柱形缺损模型的出血量对比图；
图14为各组小鼠肝脏圆柱形缺损模型的出血时间对比图；
图15为各组小鼠肝脏切口模型的出血量对比图；
图16为各组小鼠肝脏切口模型的出血时间对比图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明中所用原料如无特殊说明均为市售。如酵母β-葡聚糖可购自珠海天香苑生物科技发展股份有限公司，规格G-80；胃蛋白酶可购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的制备方法
（1）选取罗非鱼鱼鳞为原料，进行清洗烘干后粉碎；
（2）将经过步骤（1）处理的原料进行碱处理除去杂蛋白后水洗；
（3）将经过步骤（2）处理的原料使用0.3 moL/L EDTA缓冲液1：20（m:v）置于4℃处理24 h后水洗脱水；
（4）将步骤（3）处理的原料使用含有2%胃蛋白酶（1:10000）的0.5% moL/L醋酸缓冲液1：30（w:v）提取48h，经离心、盐析、透析、冷冻干燥得到所述胶原蛋白，属于Ⅰ型胶原蛋白。
实施例1、一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法
所述酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
S1制备胶原蛋白溶液：称取0.1 g罗非鱼鱼鳞胶原蛋白于烧杯中，加入10 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为10 mg/mL的胶原蛋白溶液，4℃备用；
S2制备酵母β-葡聚糖溶液：称取0.14 g酵母β-葡聚糖，加入10 mL 浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为14 mg/mL的酵母β-葡聚糖溶液，4℃备用；
S3制备酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵：4℃下，将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与步骤S2制备的酵母β-葡聚糖溶液以7：1的体积比混匀，使用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至6，充分搅拌混匀后，置于33℃恒温水浴锅孵育1 h，两者自组装成凝胶后，将制备的复合水凝胶，置于蒸馏水中透析24 h，将水凝胶于-80℃预冷12 h，后冷冻干燥24 h，即得到酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵COL/YG-20%。
实施例2、一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法
所述酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
S1制备胶原蛋白溶液：称取0.1 g罗非鱼鱼鳞胶原蛋白于烧杯中，加入10 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为10 mg/mL的胶原蛋白溶液，4℃备用；
S2制备酵母β-葡聚糖溶液：称取0.28 g酵母β-葡聚糖，加入10 mL 浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为28 mg/mL的酵母β-葡聚糖溶液，4℃备用；
S3制备酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵：4℃下，将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与步骤S2制备的酵母β-葡聚糖溶液以7：1的体积比混匀，使用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至6.5，充分搅拌混匀后，置于34℃恒温水浴锅孵育1.5 h，两者自组装成凝胶后，将制备的复合水凝胶，置于蒸馏水中透析30 h，将水凝胶于-80℃预冷18 h，后冷冻干燥24 h，即得到酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵COL/YG-40%。
实施例3、一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法
所述酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
S1制备胶原蛋白溶液：称取0.1 g罗非鱼鱼鳞胶原蛋白于烧杯中，加入10 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为10 mg/mL的胶原蛋白溶液，4℃备用；
S2制备酵母β-葡聚糖溶液：称取0.42 g酵母β-葡聚糖，加入10 mL 浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为42mg/mL的酵母β-葡聚糖溶液，4℃备用；
S3制备酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵：4℃下，将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与步骤S2制备的酵母β-葡聚糖溶液以7：1的体积比混匀，使用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至7，充分搅拌混匀后，置于35℃恒温水浴锅孵育2 h，两者自组装成凝胶后，将制备的复合水凝胶，置于蒸馏水中透析36 h，将水凝胶于-80℃预冷24 h，后冷冻干燥24 h，即得到酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵COL/YG-60%。
实施例4、一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法
所述酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
S1制备胶原蛋白溶液：称取0.1 g罗非鱼鱼鳞胶原蛋白于烧杯中，加入10 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为10 mg/mL的胶原蛋白溶液，4℃备用；
S2制备酵母β-葡聚糖溶液：称取0.56 g酵母β-葡聚糖，加入10 mL 浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为56mg/mL的酵母β-葡聚糖溶液，4℃备用；
S3制备酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵：4℃下，将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与步骤S2制备的酵母β-葡聚糖溶液以7：1的体积比混匀，使用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至7.5，充分搅拌混匀后，置于36℃恒温水浴锅孵育2.5 h，两者自组装成凝胶后，将制备的复合水凝胶，置于蒸馏水中透析42 h，将水凝胶于-80℃预冷30 h，后冷冻干燥24 h，即得到酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵COL/YG-80%。
实施例5、一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法
所述酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
S1制备胶原蛋白溶液：称取0.1 g罗非鱼鱼鳞胶原蛋白于烧杯中，加入10 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为10 mg/mL的胶原蛋白溶液，4℃备用；
S2制备酵母β-葡聚糖溶液：称取0.70g酵母β-葡聚糖，加入10 mL 浓度为0.2mol/L的氢氧化钠水溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为70mg/mL的酵母β-葡聚糖溶液，4℃备用；
S3制备酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵：4℃下，将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与步骤S2制备的酵母β-葡聚糖溶液以7：1的体积比混匀，使用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至8，充分搅拌混匀后，置于37℃恒温水浴锅孵育3h，两者自组装成凝胶后，将制备的复合水凝胶，置于蒸馏水中透析48h，将水凝胶于-80℃预冷36 h，后冷冻干燥24 h，即得到酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵COL/YG-100%。
对比例1、纯胶原蛋白海绵的制备方法
S1制备胶原蛋白溶液：称取0.1 g罗非鱼鱼鳞胶原蛋白于烧杯中，加入10 mL浓度为0.5 mol/L的乙酸溶液，4℃条件下充分搅拌溶解12h后，制备成浓度为10 mg/mL的胶原蛋白溶液，4℃备用；
S2制备纯胶原蛋白海绵：4℃条件下，将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与蒸馏水以7：1的体积比混匀，使用浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至8，充分搅拌混匀后，置于37℃恒温水浴锅自组装交联1 h，将制备的水凝胶，置于蒸馏水中透析24h。将水凝胶于-80℃预冷12h，后冷冻干燥24h，即得到纯胶原蛋白海绵COL/YG-0%。
试验例一、 罗非鱼鱼鳞胶原蛋白SDS-PAGE电泳分析
取适量胶原蛋白样品，按照国标GB/T 38482-2021 的方法稍加修改，用SDS-PAGE技术对胶原样品进行蛋白质图谱分析。将提取的胶原蛋白和购买的牛Ⅰ型胶原蛋白对照品溶解在3% 的乙酸中，制备成浓度为 1 mg/mL。进行SDS-PAGE凝胶电泳试验分析胶原蛋白结构。最后用凝胶成像系统拍摄凝胶照片，牛Ⅰ型胶原蛋白与本发明制备的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳试验凝胶照片如图1所示，其中：条带M：预染蛋白maker（35-245kDa）；条带1：牛Ⅰ型胶原蛋白；条带2：罗非鱼鱼鳞胶原蛋白。由图1可以看出，本发明制备的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白具有完整Ⅰ型胶原蛋白特征条带，属于Ⅰ型胶原蛋白。
试验例二、复合止血海绵扫描电镜分析
分别将本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵进行喷金处理后，置于扫描电子显微镜下扫描，本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵的扫描电子显微镜图如图2所示。由图2可以看出，本发明实施例1-5制备的复合止血海绵具有多孔的纤维网状结构，该结构有利于复合止血海绵对液体的快速吸收，并保持创面环境湿润，有利于伤口愈合。而对比例1制备的纯胶原蛋白海绵没有多孔结构，与对比例1制备的纯胶原蛋白海绵相比，本发明复合止血海绵具有多孔结构能够迅速吸收液体，聚集血小板，并启动体外凝血途径，从而达到快速的止血。
试验例三、溶胀率测试
分别称取本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵，重量记录为M0，将其完全浸没于PBS溶液中，每隔一段时间取出海绵，吸去表面水分后称重记为M1，计算溶胀率：溶胀率（%）=（M1-M0）/M0×100%，本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵的溶胀率测试结果图如图3所示。由图3可以看出，与对比例1制备的纯胶原蛋白海绵相比，本发明实施例1-5制备的复合止血海绵能在5 min完成快速吸水，且具有较好的平衡溶胀性能，明显增强纯胶原蛋白海绵的吸水能力，从而达到快速止血的目的。
试验例四、力学性能测试
分别将本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵置于万能力学试验机，以0.2 mm/s的应变速度对海绵进行60%压缩，并以恒定的速率释放至0%，循环5次。对比例1制备的纯胶原蛋白海绵的60%压缩循环检测结果图如图4所示；本发明实施例1制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图如图5所示；本发明实施例2制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图如图6所示；本发明实施例3制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图如图7所示；本发明实施例4制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图如图8所示；本发明实施例5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的60%压缩循环检测结果图如图9所示。由图4-9可以看出，通过添加不同比例的酵母β-葡聚糖能够有效的改善海绵的力学性能。
试验例五、体外降解实验
分别将本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵称重，浸没含有104U/mL溶菌酶的PBS缓冲液中，置于37℃的恒温条件下降解，每隔一段时间取出，干燥并称重，计算，/>=（W0-W1）/W0×100%，其中，W0为海绵初始重量，W1为海绵降解一段时间后的重量。本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵体外降解实验结果图如图10所示。由图10可知，本发明制备的实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵和比例1制备的纯胶原蛋白海绵比较发现，纯胶原蛋白海绵的抗降解性能较差，在第九天完全降解，而本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵具有更好的生物抗降解性能，在第九天，实施例1-5复合止血海绵的质量保留率分别为15.29%、28.37%、39.40%、47.48%和55.53%。这说明本发明通过将酵母β-葡聚糖与酵母β-葡聚糖复合，可减缓并控制海绵的降解速度。
试验例六、细胞活性实验
分别称取本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵，使用完全培养基浸泡24h，制备成浓度为5mg/mL的浸提液。将NIH-3T3细胞以1×103个/孔接种于96孔板中，加入浸提液培养，每隔一段时间，加入CCK-8溶液，37℃孵育1.5 h后使用酶标仪在450 nm处测试各个孔的光密度值，并进行统计学分析(n=3)，计算细胞活力（%）：细胞活力=（A样品-A空白）/（A对照-A空白）×100%，其中，A样品为具有细胞、CCK-8溶液和浸提液的孔的光密度值，A空白为没有细胞的孔的光密度值，A对照为具有细胞、CCK-8溶液而没有浸提液的孔的光密度值，本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵对NIH-3T3细胞的细胞毒性检测结果图如图11所示。由图11可以看出，通过CCK-8检测发现本发明实施例1-2制备的复合止血海绵的细胞活力均高于100%，这表明其具有促进细胞增殖的作用，而其他实施例、对比例的细胞活力均高于80 %，表明海绵具有良好的细胞相容性。
试验例七、体外溶血试验
分别称取本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵各10 mg，放入试管中并置于恒温水浴锅37℃下水浴5min。将200ul含有抗凝血剂(0.1mol/L，柠檬酸钠)新鲜Balb/c小鼠血液，加入试管中，水浴孵育1h，离心取上清，使用酶标仪在545nm处测试吸光度值。生理盐水和Triton X-100分别作为阴性对照和阳性对照。计算溶血率：溶血率=（A样品-A阴性）/(A阳性-A阴性)×100%。其中A样品为实验组的吸光度值，A阴性为阴性对照组的吸光度值，A阳性为阳性对照组的吸光度值。本发明实施例1-5制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵、对比例1制备的纯胶原蛋白海绵体外溶血试验结果图如图12所示。由图12可以看出，本发明实施例1-5制备的复合止血海绵和对比例1制备的纯胶原蛋白海绵比较发现，所有组的溶血率均低于5%，表明海绵具有良好的血液相容性。
试验例八、体外止血试验
将7-8周龄的Balb/c小鼠麻醉后，用手术剪刀暴露腹腔，轻轻找出肝脏，用纱布擦拭表面液体，用10 mL注射器针头造圆柱形缺损，厚度为4 mm，立即将紫外灭菌的实施例2制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵8×8×5mm放置在损伤处，与对比例1制备的纯胶原蛋白海绵、商用明胶海绵（快康止血海绵，粤食药监械生产许20040982号）和商用纱布（安其生医用脱脂纱布，苏械注准20172140234）对比，记录出血量和出血时间。出血量=M1-M2。其中M1为预先称重海绵的重量，M2为止血完毕后海绵的重量。
将7-8周龄的Balb/c小鼠麻醉后，用手术剪刀暴露腹腔，轻轻找出肝脏，用纱布擦拭表面液体，用手术刀沿肝脏制造4-5mm伤口，立即将紫外灭菌的实施例2制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵8×8×5mm放置在损伤处，与对比例1制备的纯胶原蛋白海绵、商用明胶海绵（快康止血海绵，粤食药监械生产许20040982号）和商用纱布（安其生医用脱脂纱布，苏械注准20172140234）对比，记录出血量和出血时间。出血量=M1-M2。其中M1为预先称重海绵的重量，M2为止血完毕后海绵的重量。
以上试验，同时设置未处理组。止血试验结果如图13、图14、图15、图16所示，其中图13为各组小鼠肝脏圆柱形缺损模型的出血量对比图；图14为各组小鼠肝脏圆柱形缺损模型的出血时间对比图；图15为各组小鼠肝脏切口模型的出血量对比图；图16为各组小鼠肝脏切口模型的出血时间对比图。由图13、图14可知，小鼠肝脏圆柱形缺损模型试验中，出血量中未处理组（251.20mg）、商用纱布组（202.48mg）、商用明胶海绵组（178.22 mg）、对比例1组（118.44 mg）和实施例2组（88.52 mg），出血时间中未处理组（225 s）、商用纱布组（170s）、商用明胶海绵组（137.5 s）、对比例1组（102.5 s）和实施例2组（70 s）。由图15、图16可知，小鼠肝脏切口模型试验中，未处理组（187 mg）、商用纱布组（140.25 mg）、商用明胶海绵组（121.5 mg）、对比例1组（100 mg）和实施例2组（69.25 mg），出血时间中未处理组（210s）、商用纱布组（157.5 s）、商用明胶海绵组（147.5 s）、对比例1组（97.5 s）和实施例2组（67.5 s）。由上述结果可知，在两种出血模型中，本发明实施例2制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的止血效果均明显优于对比例1制备的纯胶原蛋白海绵、商用明胶海绵和商用纱布，本发明实施例2制备的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵能快速有效的止血，这说明本发明将酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合形成均匀多孔的海绵结构，能够显著增强海绵的止血性能。
Claims (10)
1.一种酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵，其特征在于，所述的复合止血海绵是由酵母β-葡聚糖和胶原蛋白通过自组装工艺制备而成。
2.根据权利要求1所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵，其特征在于，所述的复合止血海绵具有多孔的纤维网状结构。
3.根据权利要求1或2所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1制备胶原蛋白溶液：称取胶原蛋白，加入酸性溶液，持续搅拌至溶解，制备成胶原蛋白溶液；
S2制备酵母β-葡聚糖溶液：称取酵母β-葡聚糖，加入碱性溶液，持续搅拌至溶解，制备成酵母β-葡聚糖溶液；
S3制备酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵：将步骤S1制备的胶原蛋白溶液与步骤S2制备的酵母β-葡聚糖溶液混匀，调节pH值，充分搅拌混匀后，置于水浴锅孵育，两者自组装成凝胶后，透析除盐，预冷，冷冻干燥，得到酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵。
4.根据权利要求3所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述酵母β-葡聚糖溶液的浓度为14-70 mg/mL。
5.根据权利要求3所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中胶原蛋白溶液与酵母β-葡聚糖溶液的体积比为7：1。
6.根据权利要求3所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中调节pH至6-8。
7.根据权利要求3所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中孵育的温度为33℃-37℃，孵育时间为1-3h。
8.根据权利要求3所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中透析除盐的时间为24-48h。
9.根据权利要求3所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中预冷时间为12-36h，冷冻干燥时间为24-48h。
10.根据权利要求1或2所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵或根据权利要求3-9任一项所述的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵的制备方法制得的酵母β-葡聚糖与胶原蛋白复合止血海绵在制备可吸收性止血材料、创面修复材料及生物医用材料中的应用。
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