CN118150625A - 使用带电粒子显微镜评估样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用带电粒子显微镜评估样品的方法，该方法包括包含所关注的初级粒子的样品的步骤。该方法还包括以下步骤：使用所述带电粒子显微镜对所述样品进行成像，以获得所述初级粒子的至少一个图像；以及使用所述至少一个图像来确定所述初级粒子的浓度。如本文所限定，该样品还包含独立于所述初级粒子的次级粒子，并且所述次级粒子存在于所述至少一个图像中。该方法的特征在于以下步骤：提供所述次级粒子的已知浓度，并且在确定所述初级粒子的所述浓度的所述步骤中使用所述次级粒子的所述已知浓度。
Description
本发明涉及一种使用带电粒子显微镜评估样品的方法。
生物学是研究生命和活生物体(包括其物理结构、化学过程、分子相互作用、生理机制、发育和进化)的自然科学。
细胞生物学是生物学的一个分支，其研究细胞(生命的基本单位)的结构和功能。细胞生物学涉及细胞的生理特性、代谢过程、信号传导路径、生命周期、化学组成以及细胞与其环境的相互作用。在细胞生物学中，大分子之间的分子识别控制着细胞中所有最复杂的过程。最常见的大分子包括生物聚合物(核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质)和大的非聚合分子(诸如脂质和大环化合物)。
许多研究人员对以高分辨率研究其自然环境中的大分子复合物以便揭示其结构动力学和相互作用感兴趣。其他感兴趣的领域包括药物-细胞相互作用或病毒生物学。这里，对所生产样品的粒子表征是新疗法、生物制剂和抗原(包括用作基因治疗中的DNA或疫苗中的RNA的递送系统的病毒载体和脂质体)的过程开发的关键。为了研究这些现象，可以使用带电粒子显微镜。
带电粒子显微镜是一种众所周知且日益重要的微观物体成像技术，特别是呈电子显微镜(EM)的形式。历史上，电子显微镜的基本种类已演变成许多众所周知的设备类别，诸如透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和扫描透射电子显微镜(STEM)，并且还演变成各种子类别，诸如所谓的“双束”工具(例如，FIB-SEM)，该工具另外采用了“机加工”聚焦离子束(FIB)，例如从而允许诸如离子束铣削或离子束诱导沉积(IBID)的支持性活动。
EM提供了许多研究生物样品的方式：常规TEM用于研究生物样品的总体形态；电子晶体学和单粒子分析致力于研究蛋白质和大分子复合物；并且(低温)电子断层扫描术和玻璃切片的低温-EM(CEMOVIS)针对细胞器和分子架构。在低温-EM和CEMOVIS中，使用玻璃化技术通过快速冷冻来保存样品，并通过低温-TEM观察。CEMOVIS还包括对样品进行低温切片，这可以使用低温-FIB技术完成。
这些研究中的挑战之一是以高准确度水平确定溶液中所关注粒子(诸如病毒载体或其他药物递送系统)的摩尔浓度和物理滴度。
传统方法包括使用乳胶珠通过TEM中的负染色来确定病毒滴度，如例如在Monroe,J.H.等人，Applied Microbiol.,1970,20:259和Malenovska,H.J.Virol.Methods,2013,191:136中所描述。
确定摩尔浓度的其他方法包括用于确定金纳米粒子的吸收技术，如在Zuber,A.等人，Sensors and Actuators B,2016,227:117中所描述。
然而，这些方法是很麻烦的，并且这些已知方法的准确性和易用性还有待改进。
因此，本发明的目的是提供一种评估样品的方法，利用该方法能够以提高的准确性和/或以更容易且更可靠的方式确定所关注粒子的浓度。
为此，本公开提供了如权利要求1中所定义的使用带电粒子显微镜评估样品的方法。
该方法包括以下步骤：提供包含所关注的初级粒子的样品；以及使用带电粒子显微镜对所述样品进行成像，以获得所述初级粒子的至少一个图像。该样品可以放置在样品固持器(诸如低温-EM栅格)上，并且然后可以放置在带电粒子显微镜(诸如低温-EM)中。所关注的初级粒子可以是病毒粒子，但本公开不限于这些粒子。
如本文所限定，该方法包括使用所述至少一个图像来确定所述初级粒子的浓度的步骤。因此，该图像用于确定初级粒子的浓度。这可以包括基于所述图像中初级粒子的数量来确定初级粒子的浓度，例如基于对图像中的粒子的计数步骤，并且然后基于经计数粒子的计算步骤。这两个步骤可以使用图像处理技术等(诸如常规方法、人工智能方法或混合方法)自动地完成，或手动完成。使用成像技术(诸如低温-EM)具有优于其他生物物理学方法的若干固有优点，诸如直接显现样品中的所有粒子和材料、天然样品条件和分子细节的分辨率。
因此，如本文所限定的方法允许确定初级粒子的浓度，其中使用图像来确定浓度。由此，实现如本文所限定的目的。
将在下文描述有利实施方案。
根据第一方面，使用所述图像的体积数据来确定所述初级粒子的浓度。当图像中的粒子数量已知时，并且当图像中示出的体积已知时，可以确定图像中初级粒子的浓度。可以对图像中的粒子数量进行计数，并且然后除以图像中示出的体积。
体积可基于可在图像中看到的样品的物理区域(见图4，用“区域”表示)来确定。该物理区域很大程度上取决于图像传感器的尺寸(例如，像素数量和像素大小)、所述带电粒子显微镜使用的放大率设置以及样品的厚度(诸如低温-EM样品中的无定形冰的厚度)。最终，希望知道由单个像素收集的样品的物理大小，或者由整个传感器收集的样品的总物理大小。这允许将图像的尺寸变换成物理区域。已知每个图像的该区域，发现每个图像的粒子数量与样品的物理滴度相关。在给定条件下，每个图像的(平均)粒子数量与施加到栅格的原始样品的物理滴度成正比。
然而，可以想到的是，在确定初级粒子的浓度时另外使用样品的厚度。样品的厚度可用于确定图像中示出的样品的实际体积(例如，以立方纳米或皮升计)，该样品的厚度可以涉及实际样品厚度或样品的成像厚度(即，景深)。利用图像中可见的初级粒子的数量和已知体积，能够以每体积单位的粒子数量(例如，每微升的粒子)来计算图像中(以及因此样品中)初级粒子的浓度。
在实验中发现，与实际施加到样品栅格的样品的浓度相比，样品栅格上的粒子浓度增加。因此，样品发生了(可感知的)浓缩，这可能是由于样品栅格被充电并且在进行印迹步骤之前将初级粒子结合到表面上而引起的。稍后将更详细地讨论这种现象。然而，通过计算浓缩因子，该效果可用于校准步骤中。例如，这可以通过计算属于已知样品浓度(即，施加到栅格的样品浓度)的样品厚度来完成。可以将所计算的样品厚度与所估计或计算的样品厚度进行比较，从而知道浓缩因子的测量值。该浓缩因子随后可用于其他实验中，其中施加到栅格的样品浓度是未知的。
在实施方案中，样品的厚度与样品的物理厚度相关。特别地，所述样品可以是低温-EM样品，其中样品的厚度与所述低温-EM样品的冰厚度相关。从一个所制备的样品到下一个所制备的样品，冰厚度可以是相对恒定的。可以使用不同的印迹参数改变冰厚度。此外，可以使用例如带电粒子显微镜或灯光工具来测量冰厚度。
根据第二方面，使用次级粒子来确定初级粒子的浓度。这些次级粒子独立于所述初级粒子。次级粒子是独立的，即次级粒子不与初级粒子结合或以其他方式接合。因此，次级粒子不与初级粒子结合和/或接合。在该实施方案中，次级粒子在所获得的至少一个图像中是可见的。因此，该图像包含初级粒子和次级粒子。所述样品中所述次级粒子的浓度是已知的。例如，当制备样品时可以确定或测量浓度，或者在制备样品期间可以使用具有已知浓度的溶液。提供已知浓度的其他方法也是可以想到的。提供次级粒子的这种已知浓度允许更准确且更容易地确定所述初级粒子的所述浓度。因此，次级粒子充当基准粒子，可以利用该基准粒子确定初级粒子的浓度。
根据该第二方面，通过带电粒子显微镜获得的图像包含初级粒子和次级粒子。样品中的次级粒子具有已知浓度。可以在图像中对初级粒子的数量和次级粒子的数量进行计数。初级粒子的数量与次级粒子的数量的比率连同次级粒子的已知浓度一起允许确定初级粒子的未知浓度。
用于确定初级粒子的浓度的这两个方面的优点在于，单个图像(包含根据第一方面的初级粒子，并且另外包含根据第二方面的次级粒子)可用于确定初级粒子的浓度。不需要使用另外的步骤或额外的技术(诸如负染色或吸收技术)来准确地确定初级粒子的浓度。
在这两个方面，该方法包括标识至少一个图像中的初级粒子的步骤。标识可以使用计算机辅助成像技术自动完成，或者可以手动完成。标识步骤可以包括将初级粒子例如分类成一个或多个子类。例如，这对于病毒粒子的计数和表征是特别有用的。可以对初级粒子进行计数，其中计数可限于某一子类。可以借助于计算机辅助成像技术对初级粒子进行计数，或者可以手动计数。
应注意，根据第一方面的方法原则上可与根据第二方面的方法组合。这可用于增加所确定的浓度的准确性。特别地，发现使用第一方面和/或第二方面可以给出关于在样品制备期间影响初级粒子的任何混杂因素的信息。例如，在低温-EM中发现，初级粒子表现出与样品栅格的一定亲和性，从而导致这些粒子朝向栅格(或远离，更多地向样品液体的表面)再分布。与表面处的浓度相比，这可导致栅格处更浓缩的样品，或反之亦然。在低温-EM中，液体样品的该外部通过印迹去除，这意味着所测量的浓度可能不同于最初施加到样品栅格的样品浓度。如先前所解释，例如使用浓缩因子，所测量的浓度可与原始浓度或物理滴度相关。这将在下面更详细地解释。使用具有已知浓度的次级粒子允许建立校准因子。可对初级粒子使用该校准因子，以建立初级粒子在原始样品液体中的浓度。因此，体积数据可与具有已知浓度的次级粒子的使用相结合，这可用于建立针对初级粒子的校准因子。
在第二方面的实施方案中，该方法包括标识至少一个图像中的次级粒子的步骤。标识和计数可以以类似于关于初级粒子所描述的方式完成。
次级粒子原则上可以是可通过计算机辅助成像技术或由操作人员手动标识的任何粒子。示例包括乳胶珠、量子点和金纳米粒子。应注意，每种类型的粒子被吸引到栅格的距栅格的距离可能对每种粒子类型不同(由于其材料性质、大小或其他参数)。这可以使用如前所述的校准步骤来解决。
在实施方案中，所述次级粒子包括带电粒子致密材料，诸如金纳米粒子或量子点。这允许粒子在至少一个图像中是高度可见的，这使得能够更容易地对粒子进行计数。如前所述，计数可以使用基于计算机视觉的方法完成，或手动完成。
应注意，次级粒子的电子密度可与初级粒子的电子密度相匹配。原则上，初级粒子包括不太电子致密的生物材料(诸如病毒)。在这种情况下，当次级粒子电子致密时是有利的，使得它们能够容易地与初级粒子区分开。然而，在初级粒子电子致密的其他情况下，对次级粒子使用较少电子致密材料将是有利的。
在实施方案中，其中使用金基准标记作为次级粒子，该方法可包括使用连续碳作为样品栅格的支撑体。连续碳确保了金基准标记在EM栅格上的均匀分布，使得能够可靠地进行对初级粒子的(局部)浓缩。
次级粒子可用作基准标记，特别是用作电子致密的基准标记。这些基准标记的已知浓度充当内标，以根据带电粒子图像(诸如低温-EM图像)确定所分析样品的浓度。
如上所述，在所述样品中提供具有已知浓度的次级粒子。这可以包括次级粒子(诸如基准)的摩尔浓度已例如从供应商数据表已知，或者通过另一种方法确定，诸如所测量的光密度和已知的消光系数。
该方法可包括制备待评估的样品的步骤。制备步骤可包括提供初级粒子(诸如病毒载体)和次级粒子(基准)的溶液的步骤。该溶液可以通过将初级粒子和次级粒子混合在一起来提供。然后可以将初级粒子和次级粒子的溶液施加到样品固持器(诸如EM栅格)，之后可以将其玻璃化。该方法因此可以包括使包含初级粒子和次级粒子的溶液玻璃化的步骤。
如所指出的，可以使用校准因子来解决由于样品制备过程和/或样品固持器亲和性而导致的浓度变化。
在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤：将包含初级粒子的溶液施加到样品固持器(诸如EM栅格)上，之后可以将其玻璃化。在不存在次级粒子的情况下将溶液施加到样品固持器。次级粒子的施加是单独的步骤。在实施方案中，在玻璃化步骤之后执行将次级粒子(基准)施加到样品固持器上的步骤。
该方法可包括在使用次级粒子的已知浓度确定初级粒子的浓度时使用至少一个校准因子的步骤。经计数的次级粒子(例如基准)与初级粒子(例如病毒粒子)的相对比率可用于将次级粒子的已知浓度转化为所分析样品中初级粒子的浓度(滴度)，其中可以使用校准因子。校准因子克服了所分析的初级粒子(例如AAV衣壳，AAV＝腺相关病毒)和次级粒子(例如金纳米粒子)的分布之间的任何可能的差异。可以使用校准曲线。
另外，该方法可包括校准步骤以针对次级粒子(例如基准标记)和初级粒子(诸如病毒粒子)例如在低温-EM图像中的不规则分布进行调整。
如本文所用，初级粒子的浓度可以摩尔浓度或每单位体积(诸如1mL)的粒子数量表示。
在实施方案中，该方法包括确定样品的至少一个另外的参数的步骤。所获得的图像可用于分析其他样品质量属性。这些样品质量属性可包括双粒子、附聚物、破碎粒子等。因此，在示例中，单个低温-EM图像可用于执行对来自同一低温-EM图像数据集的若干样品质量属性的多重分析。
在实施方案中，该方法可包括在对次级粒子进行计数的步骤之后修改至少一个图像的步骤。次级粒子可以在至少一个图像中提供非常强的强度，并且这可以用显微照片的平均密度代替以用于随后的图像分析。
另外的实施方案在从属权利要求中描述。
如所讨论的，所述初级粒子可包括生物粒子，诸如病毒粒子。
在实施方案中，确定所述初级粒子的所述浓度的步骤包括以下步骤：
-确定所述初级粒子的至少一个初步浓度；并且
-随后使用所述次级粒子的所述提供的浓度来确定所述初级粒子的最终浓度。
在实施方案中，所述至少一个图像中次级粒子的数量与所述图像中初级粒子的数量之间的比率用于确定所述初级粒子的所述浓度。
在实施方案中，该方法包括校准步骤，以解决在所述样品的制备期间次级粒子的损失。或者另选地，该校准步骤还可以解决在所述样品的制备期间初级粒子的损失或浓度变化。
根据一方面，提供了一种带电粒子显微镜，其包括被布置用于执行如本文所限定的方法的处理器单元。
根据一方面，提供了一种计算机可读存储介质，其包括指令，该指令当由计算机执行时使得如本文所限定的带电粒子显微镜执行如本文所限定的方法。
现将基于示例性实施方案和所附示意图更详细地阐明本发明，在所附示意图中：
图1示出了带电粒子显微镜的纵向截面视图；
图2a示出了如本文所描述的方法的实施方案的框图；
图2b示出了如本文所描述的方法的实施方案的框图；
图3示出了如本文所描述的方法的另一实施方案的框图；并且
图4示出了如本文所描述的方法的实施方案的示意性概述；
图5a至图5c示出了使用如本文所描述的方法的实施方案的测试图像和结果；
图6示出了利用图1的带电粒子显微镜获得的并且在该方法中使用的图像；并且
图7a和图7b示出了如本文所描述的方法的实施方案。
图1(未按比例绘制)是带电粒子显微镜M的实施方案的高度示意性描绘，其可在根据本发明的方法的实施方案中使用。更具体地，该图示出了透射型显微镜M的实施方案，在这种情况下，该透射型显微镜为TEM/STEM(尽管，在本发明的上下文中，其可以同样有效地为SEM(见图2)，或例如基于离子的显微镜)。在图1中，在真空外壳2内，电子源4产生电子束B，该电子束沿电子光轴B’传播并穿过电子光照明器6，用于将电子引导/聚焦到样品S(样品例如可以(局部)变薄/平面化)的所选择部分上。还描绘了偏转器8，该偏转器(尤其)可用来实现束B的扫描运动。
样品S(其在实施方案中是包含所关注的初级粒子(诸如病毒粒子)的生物样品)被固持在样品固持器H上，在这种情况下该样品固持器是栅格形式的支撑结构(其本身是本领域技术人员已知的)，并且该样品固持器H可以通过定位装置/平台A以多个自由度定位，该定位装置/平台移动托架A’，固持器H(可移除地)固定到该托架中；例如，试样固持器H可包括可以(尤其)在XY平面中移动的指状物(参见所描绘的笛卡尔坐标系；通常，平行于Z的运动和围绕X/Y倾斜也将是可能的)。这种移动允许样品S的不同部分被(在Z方向上)沿着B’轴行进的电子束B照明/成像/检查(并且/或者允许扫描运动作为光束扫描的替代方案而被执行)。如果需要，可以使冷却装置(未示出，但是对于本领域技术人员是已知的)与样品固持器H紧密热接触，以将样品固持器(及其上的样品S)保持在例如低温下。
电子束B将与样品S相互作用，从而使得从样品S发出各种类型的“受激”辐射，包括(例如)次级电子、反向散射电子、X射线和光学辐射(阴极发光)。如果需要，这些辐射类型中的一种或多种类型可借助检测器装置22来检测，例如，该检测器装置可以是组合的闪烁器/光电倍增管或EDX(能量色散X射线光谱法)模块。在这种情况下，可使用与SEM中的基本相同的原理来构造图像。然而，可另选地或作为补充，可以研究穿过(通过)样品S、从样品离开/发射出并继续沿轴线B’传播(大体上，但通常有一些偏转/散射)的电子。此类透射电子通量进入成像系统(投影透镜)24，该成像系统将通常包括各种静电/磁透镜、偏转器、校正器(诸如消象散器)等。在正常(非扫描)TEM模式下，此成像系统24可将透射电子通量聚焦到荧光屏26上，如果需要，该荧光屏可缩回/撤回(如由箭头26’示意性地指示)，以便使其避开轴线B’。通过屏幕26上的成像系统24将形成样品S(的一部分)的图像(或衍射图)，并且这可以通过位于外壳2的壁的适当部分中的观察端口28来查看。屏幕26的缩回机构可例如本质上为机械和/或电气的，并且在此处未经描绘。
作为在屏幕26上察看图像的替代方案，可反而利用以下事实：离开成像系统24的电子通量的聚焦深度通常很大(例如，约1米)。因此，可在屏幕26的下游使用各种其他类型的分析设备，诸如：
-TEM相机30。在相机30处，电子通量可形成可由控制器/处理器20处理并且例如显示在显示装置(未描绘)(诸如平板显示器)
上的静态图像(或衍射图)。当不需要时，相机30可缩回/撤回(如箭头30’示意性地指示)，以使其避开轴线B’。
-STEM相机32。相机32的输出可以记录为射束B在样品S上的(X,Y)扫描位置的函数，并且可以构造图像，该图像是作为X,Y的函数的相机32输出的“映射”。相机32可包含直径为例如20mm的单个像素，与相机30中特征性地存在的像素矩阵相反。此外，相机32将通常具有比相机30(例如，每秒102个图像)高得多的获取速率(例如，每秒106个点)。再次，当不需要时，相机32可缩回/撤回(如箭头32’示意性地指示)，以使其避开轴线B’(但在例如面包圈形环形暗场相机32的情况下此类缩回不是必需的；在此类相机中，当照相机不使用时，中心孔将允许通量通过)。
-作为使用相机30或32成像的替代方案，也可调用分光镜设备34，所述分光镜设备可为例如EELS模块。
应注意，项30、32和34的次序/位置并不严格，并且可设想许多可能的变化。例如，分光镜设备34也可集成到成像系统24中。
在所示的实施方案中，显微镜M进一步包括通常由附图标记40表示的可伸缩X射线计算机断层扫描(CT)模块。在计算机断层扫描(也称为断层扫描成像)中，使用源和(径向相对的)检测器沿不同的视线观察试样，以便从各种角度获得样品的穿透性观察。
应注意，控制器(计算机处理器)20经由控制线(总线)20’连接到各种示出的部件。此控制器20可提供多种功能，诸如同步动作、提供设定点、处理信号、执行计算以及在显示装置(未描绘)上显示消息/信息。更不用说，(示意性地描绘的)控制器20可(部分地)位于外壳2的内部或外部，并且可根据需要具有一体式或复合结构。
技术人员将理解，外壳2的内部不必保持在严格真空下；例如，在所谓的“环境TEM/STEM”中，有意地将给定气体的背景气氛引入/维持在外壳2内。技术人员还将理解，在实践中，可为有利的是，限制外壳2的体积使得在可能的情况下其基本上围绕轴线B’，从而采取所采用的电子束通过其中的(例如，直径为约1cm)小管的形式，但加宽以容纳诸如源4、试样固持器H、屏幕26、相机30、相机32、分光设备34等的结构。
图2a示出了根据第一方面的如本文所描述的方法100的实施方案的示意性框图概述。如图所示，方法100包括以下后续步骤101至104：
-提供101包含所关注的初级粒子P1的样品S；
-使用带电粒子显微镜M对所述样品S进行成像102，以获得所述初级粒子P1的至少一个图像；以及
-使用所述至少一个图像来确定104所述初级粒子P1的浓度。
根据图2a所示的方面，该方法包括步骤103，该步骤包括提供所述图像的体积数据的步骤。如前所述，可以基于图像大小、所述带电粒子显微镜的放大率设置以及所述样品的厚度来确定所述图像的体积数据。特别地，样品可以是低温-EM样品，其中样品的厚度与所述低温-EM样品的冰厚度相关。通过提供样品的体积数据，可以使用图像中的粒子数量除以图像中示出的体积来确定所述初级粒子P1的浓度。
图2b示出了根据第二方面的如本文所描述的方法200的实施方案的示意性框图概述。如图所示，方法200包括以下后续步骤201至204：
-提供201包含所关注的初级粒子P1的样品S；
-使用带电粒子显微镜M对所述样品S进行成像202，以获得所述初级粒子P1的至少一个图像；以及
-使用所述至少一个图像来确定204所述初级粒子P1的浓度。
根据图2b所示的方面，该方法包括步骤203，该步骤包括以下步骤：提供存在于所述样品中的次级粒子P2的已知浓度，并且在确定所述初级粒子P1的所述浓度的所述步骤中使用203所述次级粒子P2的所述已知浓度。应注意，该步骤在步骤202与204之间示出，但是原则上该步骤可以在步骤204之前的任何地方。
因此，图2a和图2b所示的两个方面允许根据图像确定初级粒子的浓度。
图3示出了如本文所描述的方法的第二方面的另选实施方案。根据该实施方案的方法300包括以下步骤301至304：
-提供包含所关注的初级粒子P1以及包含独立于所述初级粒子P1的次级粒子P2的样品S；
-使用带电粒子显微镜M对所述样品S进行成像302，以获得所述初级粒子P1和所述次级粒子P2的至少一个图像；
-提供303所述次级粒子P2的已知浓度；以及
-使用所述次级粒子P2的所述已知浓度，使用所述至少一个图像来确定304所述初级粒子P1的浓度。
类似于图2b，提供已知浓度的步骤303在步骤202与204之间示出，但是原则上该步骤可以在步骤204之前的任何地方。
图2b和图3示出了非常类似的实施方案，其中使用独立于所关注的初级粒子P1的次级粒子P2连同这些次级粒子P2的已知浓度一起，来确定所关注的初级粒子P1的未知浓度。这些实施方案因此包括提供次级粒子P2的已知浓度以确定初级粒子P1的浓度的步骤，其中使用包含所述初级粒子P1和次级粒子P2的图像。
图4示出了根据第一方面的实施方案。此处示意性地示出了带电粒子束B、样品S以及检测器30的侧视图。样品S包括栅格G，其中包含初级粒子P1的层Ls设置在栅格G的顶部。例如，在低温-EM样品的情况下，层Ls可以是具有厚度t的玻璃化液体。射束B可以聚焦在样品的区域上。在样品的下游，射束可以被放大并聚焦在检测器30上(用放大射束BM表示)。
为了校准目的，可使用以下方法。提供具有已知粒子滴度(例如2·1013粒子/ml)的已知粒子。当像素数量和像素大小已知时，可以确定成像区域(在图4中用“区域”表示)。样品的厚度(冰厚度)可被测量(或近似)为40nm。
可以对图像中的粒子数量进行计数，并且由此可以确定校准因子f：
Cp1＝f*n/V (1)
f＝Cp1*V/n (2)
其中Cp1是粒子滴度[份/m3]，f是校准因子[-]，n是样品中的粒子数量[份]，并且V是成像样品的体积[m3]。
发明人发现，在一些实验中，初级粒子P1(诸如病毒粒子)的校准因子等于0.01。这表明样品实际上被浓缩到栅格上100倍。
发明人认为该浓缩因子可以是恒定的，或者至少可以被校准以允许通过不使用次级粒子的低温-EM确定物理滴度。在低温-EM中可影响该浓缩因子或校准因子的关键参数包括：
1.时间(从施加样品到开始印迹)。由于粘附在栅格上的粒子的数量将呈指数衰减，因此足够长的培养时间(例如30秒)确保了时间不影响校准因子；
2.在实际应用中，样品缓冲液的粘度和电荷通常是恒定的；
3.粒子材料性质(重量、大小、电荷)；
4.栅格中的电荷量，例如栅格类型/批次、辉光放电时间、电流和辉光放电器中的栅格位置；
5.粒子到栅格的距离。
据信，特别是该最后一个参数是关键的并且由初始粒子滴度确定：f＝f(Cp1)。
图5a示出了使用如本文所公开的第一方面获得的图像的示例。此处，三个不同的操作者各自对具有满病毒粒子的一个样品和具有空病毒粒子的一个样品进行成像。制备浓度为2·1013粒子/ml的样品。考虑到校准因子，这将导致给定图像中的粒子计数为30。三个操作者能够给出范围在20至44之间的总粒子计数，对应于范围在1.3·1013粒子/mml与2.6·1013粒子/ml之间的浓度。可以看出，上述参数的影响是有限的：所计算的物理滴度与之前确定的物理滴度相差1个数量级以内。此外，预期可通过使用从显微照片获得的信息(例如，大小、密度)来(部分地)补偿粒子材料性质。此外，可例如通过确保1个栅格类型/批次、1个辉光放电器/设置和1种将栅格定位在辉光放电器中的方式，使栅格上的电荷变化最小化。
图5b和图5c示出了一整套初始实验，其中操作者根据不同的图像确定初级粒子的浓度。图5b示出了各个操作者的概要，并且图5c示出了所有三个操作者的各个滴度确定结果。图5c中的x轴表示实验次数，并且y轴表示所确定的滴度。应注意，为了澄清目的，x轴从最高滴度到最低滴度分别对每个操作者A、C和B进行分类。对于操作者A和C，在92％的时间内，所确定的滴度在2·1013粒子/ml与7·1013粒子/ml之间(实际滴度为2·1013粒子/ml)。目前，这意味着可以在3至4时间精度内指示初级粒子的滴度。为了比较，传统方法如SEC-MALS和使用ELISA的理论物理滴度在2x精度内是良好的。
应注意，如图5a至图5c所示，初始实验的数据基于先前获取的数据。通过考虑如上所述的关键参数，可以改善滴度确定的结果，从而实现确定滴度的更标准化的方法。由此，应当能够达到传统方法所提供的准确度。
确定原始样品中的物理滴度的示例性方法可如下导出：
1.辉光放电。在该步骤期间，(低温)EM栅格被充电，使得样品在步骤2中被吸引到栅格。重要的是应注意，经选择用于使栅格辉光放电的电流和时间必须被选择为使得存在电荷饱和。在实验中，在空气中选择具有负极性的20mA的电荷30秒。本领域技术人员将理解，该电荷将保持至少30分钟。
2.施加样品。此处，将包含纳米粒子的样品施加到(例如，安装在VitrobotTM中的)(低温)EM栅格。
3.培养时间。在该步骤期间，纳米粒子被吸引并“粘附”到栅格上。粘附到栅格上的纳米粒子的最终数量由如上所述的参数确定。
4.印迹。此处，将吸收滤纸(印迹纸)推入样品中，几乎/部分或完全接触栅格。印迹纸的吸收力/吸引力被认为比带电栅格对粒子的吸引力小得多。
5.玻璃化。通过将样品浸入(例如)液态乙烷中，执行对样品的实际玻璃化。粘附到栅格上的纳米粒子和剩余的样品缓冲液将用于获取显微镜中的显微照片。注意，对于非低温(例如，负染色)类型的分析，应省略玻璃化步骤。
在上述方法中，可以使用具有超薄碳层(膜)的Quantifoil栅格。已知该薄层改善了纳米粒子在栅格上的分布。
图6示出了使用如本文所描述的方法的第二方面获得的图像的示例。该图像示出了样品S的一部分，在这种情况下，该样品是以本领域技术人员已知的方式使用玻璃化在低温-EM栅格(Quantifoil EM栅格，在孔上具有薄的连续碳)上制备的低温-EM样品。样品S的栅格包含第一部分S1和第二部分S2。第一部分是所谓的箔孔，并且第二部分S2是围绕该箔孔S1的更厚的支撑碳膜。样品S包含数个初级粒子P1和数个次级粒子P2，它们存在于第一部分S1和第二部分S2中。图4所示的初级粒子P1是病毒粒子。为了制备样品，使用5nm-10nm金粒子作为次级粒子P2。以已知浓度提供次级粒子P2。在该实施方案中，待添加的金粒子的浓度通过使用520nm的吸收技术来精确地确定，之后可以将该金粒子混合在包含初级粒子P1的溶液中。
初级粒子P1具有未知浓度。可以在图像中对初级粒子P1进行计数，从而得到图像中初级粒子P1的数量。次级粒子P2具有已知浓度，因为该已知浓度是在样品S的制备期间或之后提供的。也可以在图像中对次级粒子P2进行计数，从而得到图像中次级粒子P2的数量。现在，图像中的粒子数量与浓度相关：更多粒子意味着有更高浓度，反之亦然。这意味着次级粒子P2与初级粒子P1的比率可以与两种粒子之间的相对浓度相关联。并且在次级粒子P2的浓度已知的情况下，可以确定图像中初级粒子P1的浓度。应注意，如果必要的话，可以使用(针对粒子中的一种或多种粒子的)校准因子。
已知初级粒子的数量n1和次级粒子的数量n2，可以(使用上述等式1和2)如下计算初级粒子P1的浓度：
Cp1＝fp1*n1/V (3)
Cp2＝fp2*n2/V (4)
结合等式3和4以去除体积，并求解Cp1，得到：
Cp1＝(fp1*n1)/(fp2*n2) (5)
因此，利用两种粒子的校准因子(其可以在专用受控实验中预先确定)，可以确定所关注的初级粒子的未知浓度，条件是将已知浓度的次级粒子添加到样品中。应注意，例如当在制备最终样品时可以应用进一步计算，将不同体积的初级粒子和次级粒子混合以产生最终样品。本领域技术人员将熟悉这些计算。
可以仅对选定的粒子进行计数。例如，可以仅对存在于样品S的特定区域内的粒子(诸如存在于箔孔S1中的粒子)进行计数。还可以想到的是，基于满足某些物理要求对粒子进行计数，这些物理要求可包括大小、耐久性或其他标准。
在图6中，初级粒子P1是病毒粒子(AAV衣壳，AAV＝腺相关病毒)，并且次级粒子P2是金纳米粒子。可以看出，初级粒子比次级粒子大。虽然这是有利的，但初级粒子和次级粒子的大小也可能相似。次级粒子也可以比初级粒子(稍)大。可以看出，次级粒子和初级粒子(AAV衣壳)两者在EM栅格的孔和厚支撑碳上的分布是类似的，从而表明可以建立图像中观察到的粒子的相对比率与它们在溶液中的浓度之间的校准曲线。
图7a和图7b示出了根据第二方面的方法的另一实施方案，但该实施方案同样可以在第一方面内使用。此处，样品包含三种不同类别的单个病毒粒子：空、部分和满。在所示的图像中，AAV衣壳是空的、部分填充的或满的。在图7a中，使用相对较低的浓度，而在图7b中，粒子的浓度相对较高。已经使用图像识别算法标识了粒子，并且将粒子分类为空701(灰色正方形)、部分填充702(黑色正方形)或满703(白色正方形)。因此，基于单个图像，不仅可以建立粒子计数(浓度)，而且可以建立其他参数。这种多重方法是如本文所公开的方法的主要优点之一。在图7a和图7b中，
本发明的实施方案允许使用基准标记作为低温-EM图像中的内标，以确定溶液中的粒子滴度。此处，在EM栅格(诸如Quantifoil栅格)的孔上使用连续碳有助于改善基准标记(次级粒子，诸如金纳米粒子)和样品粒子(诸如AAV病毒粒子)在EM栅格的整个区域上的分布。
所需保护由所附权利要求书赋予。
Claims (18)
1.一种使用带电粒子显微镜评估样品的方法，包括以下步骤：
-提供包含所关注的初级粒子的样品；
-使用带电粒子显微镜对所述样品进行成像，以获得所述初级粒子的至少一个图像；以及
-使用所述至少一个图像来确定所述初级粒子的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用所述图像中初级粒子的数量来确定所述初级粒子的所述浓度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述图像的体积数据用于确定所述初级粒子的所述浓度，特别是基于以下各项中的至少一项或多项：图像大小、所述带电粒子显微镜的放大率设置和所述样品的厚度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品是低温-EM样品，其中所述样品的所述厚度与所述低温-EM样品的冰厚度相关。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述图像还包含独立于所述初级粒子并且具有已知浓度的次级粒子，其中所述方法包括在确定所述初级粒子的所述浓度的所述步骤中使用所述次级粒子的所述已知浓度的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述次级粒子包括带电粒子致密材料，诸如金纳米粒子。
7.根据权利要求1至6所述的方法，其中所述初级粒子包括生物粒子，诸如病毒粒子。
8.根据权利要求1至7所述的方法，还包括制备所述样品的步骤。
9.根据权利要求5和8所述的方法，包括以下步骤：在至少一种溶液中提供所述初级粒子和所述次级粒子，以及提供样品载体，以及将所述至少一种溶液施加到所述样品载体。
10.根据权利要求9所述的方法，包括将所述初级粒子和所述次级粒子混合成单一溶液的步骤。
11.根据权利要求9或10所述的方法，包括使所述样品载体上的所述溶液玻璃化以制备所述样品的后续步骤。
12.根据权利要求5或其从属权利要求所述的方法，其中提供所述浓度的所述步骤包括使用所述次级粒子的数据信息诸如供应商数据表的步骤。
13.根据权利要求5或其从属权利要求所述的方法，包括使用吸收技术来提供所述次级粒子的所述浓度的步骤。
14.根据权利要求5或其从属权利要求所述的方法，其中确定所述初级粒子的所述浓度的所述步骤包括以下步骤：
-确定所述初级粒子的至少一个初步浓度；以及
-随后使用所述次级粒子的所述提供的浓度来确定所述初级粒子的最终浓度。
15.根据权利要求5或其从属权利要求所述的方法，其中所述至少一个图像中次级粒子的数量与所述图像中初级粒子的数量之间的比率用于确定所述初级粒子的所述浓度。
16.根据权利要求5或其从属权利要求所述的方法，包括校准步骤，以解决在所述样品的制备期间次级粒子的损失。
17.根据权利要求1至16所述的方法，包括确定所述样品的至少一个另外的参数的步骤。
18.一种带电粒子显微镜，包括被布置用于执行根据权利要求1至16中的一项或多项所述的方法的处理器单元。
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| PB01 | Publication |