JP2024081144A - 荷電粒子顕微鏡法を使用して試料を評価する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】荷電粒子顕微鏡法を使用して試料を評価する方法であって、試料が対象の一次粒子を含むステップを含む方法を提供する。【解決手段】一次粒子の少なくとも１つの画像を得るために荷電粒子顕微鏡を使用して試料を撮像するステップと、少なくとも１つの画像を使用して一次粒子Ｐ１の濃度を決定するステップとを含む。試料は、一次粒子から独立し、少なくとも１つの画像内に存在する二次粒子を更に含む。二次粒子の既知の濃度を提供するステップと、一次粒子の濃度を決定するステップにおいて二次粒子の既知の濃度を使用するステップとをさらに含む。【選択図】図４

Description

本発明は、荷電粒子顕微鏡法を使用して試料を評価する方法に関する。

生物学は、生命及び生体の物理的構造、化学的プロセス、分子相互作用、生理学的メカニズム、発現、及び進化を含む、生命及び生体を研究する自然科学である。

細胞生物学は、生命の基本単位である細胞の構造及び機能を研究する生物学の分野である。細胞生物学は、生理学的な特性、代謝プロセス、信号移送経路、ライフサイクル、化学組成、及び細胞とそれらの環境との相互作用を主題としている。細胞生物学では、巨大分子間の分子認識が、細胞の中で最も洗練されたプロセスの全てを支配する。最も一般的な巨大分子には、生体高分子（核酸、タンパク質、炭水化物、及び脂質）、並びに大型非高分子（脂質及び大環状分子など）が含まれる。

多くの研究者が、巨大分子複合体の構造的な力学及び相互作用を明らかにするために、巨大分子複合体をそれらの自然環境の中で高解像度で研究することに関心を持っている。他の対象領域には、薬物－細胞相互作用、又はウイルス生物学が含まれる。ここで、産生された試料の粒子特徴付けは、遺伝子治療におけるＤＮＡ又はワクチンにおけるＲＮＡのための送達系として使用されるウイルスベクター及びリポソームを含む、新しい治療剤、生物製剤、及び抗原のプロセス開発の鍵である。この現象を研究するために、荷電粒子顕微鏡法を使用してもよい。

荷電粒子顕微鏡法は、特に電子顕微鏡法（electron microscopy、ＥＭ）の形態において、微視的な物体を画像化するための、周知の、かつ益々重要となる技術である。歴史的に、電子顕微鏡の基本的な属は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope、ＳＥＭ）、及び走査透過電子顕微鏡（Scanning Transmission Electron Microscope、ＳＴＥＭ）のような、複数のよく知られた装置種に進化し、又、例えば、イオンビームミリング又はイオンビーム誘起堆積（Ion-Beam-Induced Deposition、ＩＢＩＤ）などの補助としての「機械」集束イオンビーム（Focused Ion Beam、ＦＩＢ）を採用するいわゆる「デュアルビーム」ツール（例えば、ＦＩＢ－ＳＥＭ）などの様々な亜種にも使用される。

ＥＭは、生体試料を研究するための複数の方法を提供するものであり、従来のＴＥＭは、生体試料の全体の形態を研究するために使用されている。電子結晶学及び単一粒子分析は、タンパク質及び高分子複合体の研究専用であり、硝子体切片の（低温）電子断層撮影及び低温ＥＭ（ＣＥＭＯＶＩＳ）は、細胞小器官及び分子構造を対象とする。低温ＥＭ及びＣＥＭＯＶＩＳにおいて、試料は、ガラス化技術を使用した急速凍結により保存され、低温ＴＥＭで観察される。ＣＥＭＯＶＩＳは、試料の凍結切片（低温セクショニング）が追加され、これは、低温ＦＩＢ技術を使用して実行することができる。

これらの研究における課題の１つは、ウイルスベクター又は他の薬物送達系などの溶液中の対象となる粒子のモル濃度及び物理的力価を高レベルの精度で決定することである。

従来の方法は、ＴＥＭでのネガティブ染色によるウイルス力価の決定のためにラテックスビーズを使用することを含み、例えば、Ｍｏｎｒｏｅ，Ｊ．Ｈらによって記述された方法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９７０，２０：２５９）、及び、Ｍａｌｅｎｏｖｓｋａ，Ｈ．によって記述された方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３，１９１：１３６）がある。

モル濃度を決定する他の方法としては、Ｚｕｂｅｒ，Ａ．らによって記述された方法（Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ，２０１６，２２７：１１７）のように、金ナノ粒子を決定するための吸光度技術が挙げられる。

しかしながら、これらの方法は煩雑であり、これらの既知の方法の精度及び使用の容易さを改善することができる。

したがって、本発明の目的は、試料を評価する方法であって、対象粒子の濃度を、改善された精度で、及び／又はより容易かつ信頼できる方法で決定することができる方法を提供することである。

この目的のために、本開示は、請求項１に定義されるように、荷電粒子顕微鏡法を使用して試料を評価する方法を提供する。

本方法は、対象となる一次粒子を含む試料を提供するステップと、当該一次粒子の少なくとも１つの画像を得るために荷電粒子顕微鏡を使用して当該試料を撮像するステップとを含む。試料は、低温ＥＭグリッドなどの試料ホルダ上に配置されてもよく、次いで、低温ＥＭなどの荷電粒子顕微鏡内に配置されてもよい。対象の一次粒子はウイルス粒子であってもよいが、本開示はこれらの粒子に限定されない。

本明細書で定義されるように、本方法は、当該少なくとも１つの画像を使用して当該一次粒子の濃度を決定するステップを含む。したがって、画像は、一次粒子の濃度を決定するために使用される。これは、当該画像内の一次粒子の数に基づいて、例えば、画像内の粒子の計数ステップに基づいて、一次粒子の濃度を決定することと、次いで、計数された粒子に基づいて計算ステップとを含んでもよい。これらのステップは両方とも、画像処理技術など（従来の人工知能又はハイブリッド手法など）を使用して自動的に、又は手動で行うことができる。低温ＥＭなどの撮像技術を使用することは、試料中の全ての粒子及び材料の直接可視化、天然試料条件、並びに分子詳細の分解など、他の生物物理学的方法に勝るいくつかの固有の利点を有する。

したがって、本明細書で定義される方法は、一次粒子の濃度の決定を可能にし、濃度を決定するために画像が使用される。したがって、本明細書で定義されるような目的が達成される。

有利な実施形態について以下に説明する。

第１の態様によれば、当該一次粒子の濃度は、当該画像の体積データを使用して決定される。画像中の一次粒子の濃度は、画像中の粒子数が既知である場合、及び画像中に示される体積が既知である場合に決定することができる。画像中の粒子数を計数し、次いで画像中に示される体積で割ることができる。

体積は、画像において見ることができる試料の物理的領域に基づいて決定することができる（「領域」で示される図４を参照されたい）。この物理的領域は、画像センサの寸法（例えば、画素数及び画素サイズ）、当該荷電粒子顕微鏡によって使用される倍率設定、及び試料の厚さ（低温ＥＭ試料中の非晶質氷の厚さなど）に大きく依存する。最終的には、単一画素によって収集される試料の物理的サイズ、又はセンサ全体によって収集される試料の全体的な物理的サイズを知りたい。これにより、画像の寸法を物理的領域に変換することができる。各画像の領域を知ることにより、画像当たりの粒子数が試料の物理的力価に関連することが判明した。所与の条件内で、画像当たりの粒子の（平均）数は、グリッドに適用された元の試料の物理的力価に正比例する。

しかしながら、一次粒子の濃度を決定する際に、試料の厚さを更に使用することも考えられる。試料の厚さは、実際の試料厚さ又は試料の撮像された厚さ（すなわち、被写界深度）に関連してもよく、画像内に示される試料の実際の体積（例えば、立方ナノメートル又はピコリットル）を決定するために使用され得る。画像内で視認可能な一次粒子の数、及び既知の体積を用いて、画像内（したがって、試料内）の一次粒子の濃度は、体積単位当たりの粒子数（例えば、マイクロリットル当たりの粒子数）で計算することができる。

実験において、試料グリッド上の粒子の濃度は、試料グリッドに実際に適用された試料の濃度と比較して増加することが見出された。したがって、試料の（知覚される）濃縮が起こり、これは潜在的に、ブロッティングステップが起こる前に試料グリッドが帯電し、一次粒子が表面に結合することによって引き起こされる。この現象については後で詳細に説明する。しかしながら、この効果は、濃縮係数を計算することによって、較正ステップにおいて使用することができる。これは、例えば、既知の試料濃度（すなわち、グリッドに適用された試料濃度）に属する試料厚さを計算することによって行うことができる。計算された試料厚さは、推定又は計算された試料厚さと比較することができ、それによって濃縮係数の尺度が知られている。次いで、この濃縮係数は、グリッドに適用される試料濃度が未知である他の実験において後で使用され得る。

一実施形態では、試料の厚さは、試料の物理的厚さに関連する。特に、当該試料は低温ＥＭ試料であってもよく、試料の厚さは当該低温ＥＭ試料の氷の厚さに関連する。氷の厚さは、１つの調製された試料から次の試料まで比較的一定であり得る。異なるブロッティングパラメータを使用して、氷の厚さを変えることができる。更に、氷の厚さは、例えば荷電粒子顕微鏡又は光ツールを使用して測定することができる。

第２の態様によれば、一次粒子の濃度は、二次粒子を使用して決定される。これらの二次粒子は、当該一次粒子から独立している。二次粒子は、二次粒子が一次粒子と結合又は係合しないという意味で独立している。したがって、二次粒子は、一次粒子に非結合及び／又は非係合である。この実施形態では、二次粒子は、取得される少なくとも１つの画像において可視である。したがって、画像は、一次粒子及び二次粒子を含む。当該試料中の当該二次粒子の濃度は既知である。濃度は、例えば、試料を調製するときに決定又は測定することができ、又は既知の濃度を有する溶液を試料の調製中に使用することができる。既知の濃度を提供する他の方法も考えられる。二次粒子のこの既知の濃度を提供することにより、当該一次粒子の当該濃度のより正確かつ容易な決定が可能になる。したがって、二次粒子は、一次粒子の濃度を決定することができる基準粒子として作用する。

この第２の態様によれば、荷電粒子顕微鏡によって得られる画像には、一次粒子と二次粒子とが含まれる。試料中の二次粒子は既知の濃度を含む。画像中の一次粒子の数及び二次粒子の数を計数することができる。一次粒子の数と二次粒子の数の比は、二次粒子の既知の濃度と共に、一次粒子の未知の濃度を決定することを可能にする。

一次粒子の濃度を決定するためのこれらの２つの態様の利点は、単一の画像（第１の態様による一次粒子を含み、第２の態様による二次粒子を更に含む）が、一次粒子の濃度を決定するために使用され得ることである。一次粒子の濃度を正確に決定するために、更なるステップ又は更なる技術（ネガティブ染色技術又は吸光度技術など）を使用する必要はない。

両方の態様において、本方法は、少なくとも１つの画像において一次粒子を識別するステップを含む。識別は、コンピュータ支援撮像技術を使用して自動的に行われてもよく、又は手動で行われてもよい。識別ステップは、一次粒子を例えば１つ以上のサブカテゴリに分類することを含んでもよい。これは、例えば、ウイルス粒子の計数及び特徴付けに特に有用である。一次粒子が計数されてもよく、計数は特定のサブカテゴリに限定されてもよい。一次粒子は、コンピュータ支援撮像技術を用いて計数されてもよく、又は手動で計数されてもよい。

第１の態様による方法は、原則として、第２の態様による方法と組み合わせることができることに留意されたい。これを使用して、決定された濃度の精度を高めることができる。特に、第１の態様及び／又は第２の態様の使用は、試料調製中に一次粒子に影響を及ぼす任意の交絡因子に関する情報を与えることができることが見出された。例えば、低温ＥＭでは、一次粒子が試料グリッドと一定の親和性を示し、これらの粒子がグリッドに向かって（又は離れて、試料液体の表面に向かって）再分配されることが分かった。これは、表面における濃度と比較して、グリッドにおいてより濃縮された試料をもたらし得るか、又はその逆であり得る。低温ＥＭでは、液体試料のこの外側部分はブロッティングによって除去され、これは、測定された濃度が、試料グリッドに最初に適用された試料濃度とは異なり得ることを意味する。先に説明したように、測定濃度は、例えば、濃縮係数を使用して、元の濃度又は物理的力価に関連付けることができる。これについては、以下でより詳細に説明する。既知の濃度を有する二次粒子の使用は、較正係数が確立されることを可能にする。この較正係数を一次粒子に対して使用して、元の試料液体中の一次粒子の濃度を確立することができる。したがって、体積データを、既知の濃度を有する二次粒子の使用と組み合わせることができ、これを使用して、一次粒子の較正係数を確立することができる。

第２の態様の一実施形態では、方法は、少なくとも１つの画像内の二次粒子を識別するステップを含む。識別及び計数は、一次粒子に関して記載したのと同様の方法で行ってもよい。

二次粒子は、原則として、コンピュータ支援撮像技術によって、又は人間のオペレータによって手動で容易に識別され得る任意の粒子であってもよい。例としては、ラテックスビーズ、量子ドット、及び金ナノ粒子が挙げられる。各タイプの粒子がグリッドに引き付けられるグリッドからの距離は、（その材料特性、サイズ、又は他のパラメータに起因して）粒子タイプごとに異なり得ることに留意されたい。これは、前述のように較正ステップを使用して説明することができる。

一実施形態では、当該二次粒子は、金ナノ粒子又は量子ドットなどの荷電粒子高密度材料を含む。これは、粒子が少なくとも１つの画像において高度に可視的であることを可能にし、粒子のより容易な計数を可能にする。先に示したように、計数は、コンピュータビジョンベースの方法を使用して、又は手動で行うことができる。

なお、二次粒子の電子密度は、一次粒子の電子密度と一致させることができる。原則として、一次粒子は、それほど電子密度が高くない生物学的材料（ウイルスなど）を含む。その場合、二次粒子が高電子密度である場合に有利であり、その結果、それらは一次粒子から容易に区別できる。しかしながら、一次粒子が高電子密度である他の場合には、二次粒子のために低電子密度材料を使用することが有利である。

二次粒子として金基準マーカが使用される実施形態では、本方法は、試料グリッドの支持体として連続炭素の使用を含んでもよい。連続炭素は、一次粒子の（局所）濃縮が確実に行われ得るように、ＥＭグリッドにわたる金基準マーカの均一分布を確実にする。

二次粒子は、基準マーカとして、特に高電子密度基準マーカとして使用することができる。これらの基準マーカの既知の濃度は、低温ＥＭ画像などの荷電粒子画像から分析試料の濃度を決定するための内部標準のように作用する。

上述したように、二次粒子は、当該試料中に既知の濃度で提供される。これは、基準などの二次粒子のモル濃度が、例えば供給者データシートから既に知られていること、測定された光学密度及び既知の吸光係数などの別の方法によって決定されることのいずれかを含み得る。

この方法は、評価される試料を調製するステップを含み得る。調製ステップは、一次粒子（ウイルスベクターなど）及び二次粒子（基準）の溶液を提供するステップを含んでもよい。溶液は、一次粒子及び二次粒子を一緒に混合することによって提供されてもよい。次に、一次粒子及び二次粒子の溶液を、ＥＭグリッドなどの試料ホルダに適用することができ、その後、ガラス化することができる。したがって、本方法は、一次粒子及び二次粒子を含む溶液をガラス化するステップを含んでもよい。

示されるように、較正係数は、試料調製プロセス及び／又は試料ホルダ親和性の結果としての濃度の変化を説明するために使用され得る。

別の実施形態では、本方法は、一次粒子を含む溶液をＥＭグリッドなどの試料ホルダ上に適用するステップを含み、その後、それをガラス化することができる。溶液は、二次粒子の非存在下で試料ホルダに適用される。二次粒子の適用は別個のステップである。一実施形態では、二次粒子（基準）を試料ホルダ上に適用するステップは、ガラス化ステップの後に実行される。

本方法は、一次粒子の濃度を決定するために二次粒子の既知の濃度を使用する際に少なくとも１つの較正係数を使用するステップを含み得る。計数された二次粒子（例えば、基準）と一次粒子（例えば、ウイルス粒子）との相対比を使用して、二次粒子の既知の濃度を分析試料中の一次粒子の濃度（力価）に変換することができ、較正係数を使用することができる。較正係数は、分析された一次粒子（例えば、ＡＡＶカプシド、ＡＡＶ＝アデノ随伴ウイルス）の分布と二次粒子（例えば、金ナノ粒子）の分布との間の任意の可能な不一致を克服する。較正曲線を使用してもよい。

更に、本方法は、例えば低温ＥＭ画像における二次粒子（例えば基準マーカ）及び一次粒子（ウイルス粒子など）の不規則な分布を調整するための較正ステップを含み得る。

本明細書で使用される場合、一次粒子の濃度は、モル濃度又は単位体積（１ｍＬなど）当たりの粒子数のいずれかで表すことができる。

一実施形態において、本方法は、試料の少なくとも１つの更なるパラメータを決定するステップを含む。得られた画像は、他の試料品質属性を分析するために使用することができる。これらの試料品質属性は、二重粒子、凝集物、破壊粒子などを含み得る。したがって、一例では、単一の低温ＥＭ画像を使用して、同じ低温ＥＭ画像データセットからのいくつかの試料品質属性の多重分析を実行してもよい。

一実施形態では、本方法は、二次粒子を計数するステップの後に少なくとも１つの画像を修正するステップを含み得る。二次粒子は、少なくとも１つの画像において非常に強い強度を提供することができ、これは、後続の画像分析のために顕微鏡写真の平均密度で置き換えることができる。

更なる実施形態は、それぞれの従属請求項に記載されている。

上述したように、当該一次粒子は、ウイルス粒子などの生物学的粒子を含み得る。

一実施形態では、当該一次粒子の当該濃度を決定するステップは、
－当該一次粒子の少なくとも１つの予備濃度を決定するステップと、
－その後、当該二次粒子の当該提供された濃度を使用して、当該一次粒子の最終濃度を決定するステップとを含む。

一実施形態では、当該少なくとも１つの画像内の二次粒子の数と当該画像内の一次粒子の数との間の比が、当該一次粒子の当該濃度を決定するために使用される。

一実施形態において、本方法は、当該試料の調製中の二次粒子の損失を考慮するための較正ステップを含む。較正ステップは、当該試料の調製中の一次粒子の中の一次粒子の濃度の損失又は変化を考慮してもよい。

一態様によれば、本明細書で定義される方法を実行するように構成されたプロセッサユニットを備える荷電粒子顕微鏡が提供される。

一態様によれば、コンピュータによって実行されると、本明細書で定義される荷電粒子顕微鏡に本明細書で定義される方法を実行させる命令を含むコンピュータ可読記憶媒体が提供される。

ここで、本発明は、例示的な実施形態及び添付の概略図を基にして詳細に明らかにされるだろう。
荷電粒子顕微鏡の縦断面図を示す。 本明細書に記載の方法の一実施形態のブロック図を示す。 本明細書に記載の方法の一実施形態のブロック図を示す。 本明細書に記載される方法の更なる実施形態のブロック図を示す。 本明細書に記載の方法の一実施形態の概略図を示す。 本明細書に記載の方法の一実施形態を使用した試験画像及び結果を示す。 本明細書に記載の方法の一実施形態を使用した試験画像及び結果を示す。 本明細書に記載の方法の一実施形態を使用した試験画像及び結果を示す。 図１の荷電粒子顕微鏡で得られた、本方法で使用するための画像を示す。 本明細書に記載の方法の実施形態を示す。 本明細書に記載の方法の実施形態を示す。

図１（縮尺通りではない）は、本発明による方法の一実施形態で使用できる荷電粒子顕微鏡Ｍの一実施形態の非常に概略的な図である。より具体的には、この図は、この場合、ＴＥＭ／ＳＴＥＭである（しかしながら、本発明の背景では、例えば、ＳＥＭ（図２参照）又はイオンベースの顕微鏡であることが同じくらい有効であり得る）透過型顕微鏡Ｍの一実施形態を示す。図１では、真空筐体２内において電子源４は、電子光学軸Ｂ’に沿って伝搬し、電子光学イルミネータ６を横断する電子のビームＢを生成し、試料Ｓ（例えば、（局所的に）薄くされ／平坦化されてもよい）の選択された部分に電子を向ける／集束する働きをする。又、偏向器８が図示されており、これは（とりわけ）、ビームＢの走査運動を行うために使用され得る。

試料Ｓは、一実施形態では、ウイルス粒子などの対象の一次粒子を含む生体試料であり、試料ホルダＨ、この場合はグリッドの形態の支持構造（それ自体は当業者に知られている）上に保持され、この試料ホルダＨは、ホルダＨが（取り外し可能に）固定されるクレードルＡ’を移動させる位置決めデバイス／ステージＡによって複数の自由度で位置決めすることができる。例えば、標本ホルダＨは、ＸＹ平面（図示のデカルト座標系を参照）内で移動可能な（特に）フィンガを備えることができる。典型的には、Ｚに平行な運動及びＸ／Ｙを中心とする傾斜も可能である）。このような動きにより、試料Ｓの異なる部分が、軸Ｂ’（Ｚ方向）に沿って進む電子ビームＢによって照明／撮像／検査されることを可能にする（及び／又は、走査する動きがビーム走査の代替として実行されることを可能にする）。所望に応じて、冷却デバイス（図示されていないが、当業者に知られている）を試料ホルダＨと密接に熱接触させ、例えば、試料ホルダＨ（及びびその上の試料Ｓ）を極低温に保持することができる。

電子ビームＢは、試料Ｓと相互作用して、（例えば）二次電子、後方散乱電子、Ｘ線、及び光学的放射（陰極線発光）を含む様々な種類の「誘導（stimulated）」放射線が試料Ｓから放出されるようになる。所望に応じて、これらの放射線タイプのうちの１つ以上は、例えば、組み合わされたシンチレータ／光電子増倍管又はＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線分光法）モジュールとすることができる分析デバイス２２を用いて検出することができる。このような場合、ＳＥＭと基本的に同じ原理を使用して画像を構築することができる。しかし、試料Ｓを横断（通過）し、試料から放射／放出され軸Ｂ’に沿って（実質的には、一般的に、ある程度偏向／散乱しながら）伝搬し続ける電子を代替的に、又は補足的に調査することができる。このような透過電子束は、撮像システム（投影レンズ）２４に入射し、撮像システム２４は一般的に、多種多様な静電レンズ／磁気レンズ、偏向器、補正器（例えばスティグメータのような）などを備えている。通常の（非走査）ＴＥＭモードでは、この撮像システム２４は、透過電子束を蛍光スクリーン２６に集束させることができ、蛍光スクリーン２６は、所望に応じて、それを軸Ｂ’の邪魔にならないように後退／回収する（矢印２６’で概略に示すように）ことができる。試料Ｓの（一部の）画像（又は、フーリエ変換図形）は、撮像システム２４によりスクリーン２６上に形成され、この画像は、筐体２の壁の好適な部分に設けられた視認ポート２８を介して視認され得る。スクリーン２６の引き込み機構は、例えば本質的に機械的及び／又は電気的な機構であり得、ここには図示されていない。

スクリーン２６上の画像を観察する代わりに、撮像システム２４を出る電子束の焦点深度が概して非常に大きい（例えば、１メートル程度）という事実を利用することができる。その結果、スクリーン２６の下流には、以下のような種々の他のタイプの分析装置を使用することができる。
－ＴＥＭカメラ３０。カメラ３０の位置に、電子束は、静止画像（又は、フーリエ変換図形）を形成することができ、静止画像は、コントローラ／プロセッサ２０により処理することができ、例えばフラットパネルディスプレイのような表示デバイス（図示せず）に表示することができる。必要ではない場合、カメラ３０は、後退／回収（矢印３０’で概略的に示すように）されて、カメラを軸Ｂ’から外れるようにすることができる。
－ＳＴＥＭカメラ３２。カメラ３２からの出力は、試料Ｓ上のビームＢの（Ｘ、Ｙ）走査位置の関数として記録することができ、Ｘ、Ｙの関数としてのカメラ３２からの出力の「マップ（map）」である画像を構築することができる。カメラ３２は、カメラ３０に特徴的に存在する画素行列とは異なり、例えば直径が２０ｍｍの１個の画素を含むことができる。更に、カメラ３２は、一般的に、カメラ３０（例えば、１０^２画像／秒）よりも非常に高い取得速度（例えば、１０^６ポイント／秒）を有することになる。再び、必要とされないとき、カメラ３２は、軸Ｂ’から外れるように、（矢印３２’によって概略的に示されるように）後退／後退され得る（しかしながら、かかる後退は、例えば、ドーナツ形状の環状暗視野カメラ３２の場合、必要ではないであろう。このようなカメラでは、中央の穴は、カメラが使用されていないときに光束の通過を可能にする）。
－カメラ３０又は３２を使用して撮像を行うことの代替として、例えば、ＥＥＬＳモジュールとすることができる分光装置３４を呼び出すこともできる。

部品３０、３２、及び３４の順序／位置は厳密ではなく、多くの可能な変形が考えられることに留意されたい。例えば、分光装置３４は、撮像システム２４と一体化することもできる。

図示の実施形態では、顕微鏡Ｍは、通常参照番号４０で示される、引き込み式Ｘ線コンピュータ断層撮影（Computed Tomography、ＣＴ）モジュールを更に備える。コンピュータ断層撮影（断層撮像とも称される）では、源及び（互いに対向する）検出器が、様々な視点から試料の透過観察を取得するように、異なる視線に沿って試料を調べるために使用される。

コントローラ（コンピュータプロセッサ）２０は、制御ライン（バス）２０’を介して種々の図示された構成要素に接続されていることに留意されたい。このコントローラ２０は、アクションを同期させる、設定値を提供する、信号を処理する、計算を実行する、及びメッセージ／情報を表示デバイス（図示せず）に表示するなどの様々な機能を提供することができる。言うまでもなく、（模式的に描かれる）コントローラ２０は、筐体２の内側又は外側に（部分的に）位置させることができ、所望に応じて、単体構造又は複合構造を有することができる。

当業者は、筐体２の内部が厳密な真空に維持される必要がないことを理解するであろう。例えば、いわゆる「環境ＴＥＭ／ＳＴＥＭ」では、所与のガスのバックグラウンド雰囲気が筐体２内に意図的に導入／維持される。当業者は又、実際には、筐体２の容積を閉じ込めて、可能であれば、筐体２が、軸Ｂ’を本質的に包み込むようになって、採用する電子ビームが小径管内を通過し、しかも広がってソース４、標本ホルダＨ、スクリーン２６、カメラ３０、カメラ３２、分光装置３４などのような構造を収容する小径管（例えば、直径約１ｃｍ）の形態を採ると有利となり得ることを理解するであろう。

図２ａは、第１の態様による、本明細書に記載の方法１００の一実施形態の概略ブロック図を示す。示されるように、方法１００は、以下の後続のステップ１０１～１０４を含む。
－対象となる一次粒子Ｐ１を含む試料Ｓを提供するステップ１０１、
－当該一次粒子Ｐ１の少なくとも１つの画像を得るために、荷電粒子顕微鏡Ｍを使用して当該試料Ｓを撮像するステップ１０２、及び
－当該少なくとも１つの画像を使用して当該一次粒子Ｐ１の濃度を決定するステップ１０４。

図２ａに示される態様によれば、方法は、当該画像の体積データを提供するステップを含むステップ１０３を含む。前に示したように、当該画像の体積データは、画像サイズ、当該荷電粒子顕微鏡の倍率設定、及び当該試料の厚さに基づいて決定することができる。特に、試料は低温ＥＭ試料とすることができ、試料の厚さは当該低温ＥＭ試料の氷の厚さに関連する。試料の体積データを提供することによって、当該一次粒子Ｐ１の濃度は、画像内の粒子の数を画像内に示される体積で割ったものを使用して決定することができる。

図２ｂは、第２の態様による、本明細書で説明される方法２００の一実施形態の概略ブロック図を示す。示されるように、方法２００は、以下の後続のステップ２０１～２０４を含む。
－対象となる一次粒子Ｐ１を含む試料Ｓを提供するステップ２０１、
－当該一次粒子Ｐ１の少なくとも１つの画像を得るために、荷電粒子顕微鏡Ｍを使用して当該試料Ｓを撮像するステップ２０２、及び
－当該少なくとも１つの画像を使用して当該一次粒子Ｐ１の濃度を決定するステップ２０４。

図２ｂに示される態様によれば、方法は、当該試料中に存在する二次粒子Ｐ２の既知の濃度を提供するステップと、当該一次粒子Ｐ１の当該濃度を決定する当該ステップにおいて当該二次粒子Ｐ２の当該既知の濃度を使用するステップ２０３とを含むステップ２０３を含む。このステップは、ステップ２０２と２０４との間に示されているが、原理的には、このステップは、ステップ２０４の前のどこかであり得ることに留意されたい。

したがって、図２ａ及び図２ｂに示される２つの態様は、一次粒子の濃度が画像から決定されることを可能にする。

図３は、本明細書に記載の方法の第２の態様の代替実施形態を示す。この実施形態による方法３００は、以下のステップ３０１～３０４を含む。
－対象となる一次粒子Ｐ１を含み、当該一次粒子Ｐ１から独立した二次粒子Ｐ２を含む試料Ｓを提供するステップ、
－当該一次粒子Ｐ１及び当該二次粒子Ｐ２の少なくとも１つの画像を得るために、荷電粒子顕微鏡Ｍを使用して当該試料Ｓを撮像するステップ３０２、
－当該二次粒子Ｐ２の既知の濃度を提供するステップ３０３、並びに
－当該二次粒子Ｐ２の当該既知の濃度をして、当該少なくとも１つの画像を使用して当該一次粒子Ｐ１の濃度を決定するステップ３０４。

図２ｂと同様に、既知の濃度を提供するステップ３０３は、ステップ２０２と２０４との間に示されているが、原則として、このステップは、ステップ２０４の前の任意の場所であり得る。

図２ｂ及び図３は、非常に類似した実施形態を示し、ここでは、対象となる一次粒子Ｐ１の未知の濃度を決定するために、対象となる一次粒子Ｐ１から独立した二次粒子Ｐ２が、これらの二次粒子Ｐ２の既知の濃度と共に使用される。したがって、これらの実施形態は、一次粒子Ｐ１の濃度を決定するために二次粒子Ｐ２の既知の濃度を提供するステップを含み、当該一次粒子Ｐ１及び二次粒子Ｐ２を含む画像が使用される。

図４は、第１の態様による実施形態を示す。ここでは、荷電粒子ビームＢ、試料Ｓ及び検出器３０の側面図を概略的に示している。試料Ｓは、グリッドＧを備え、一次粒子Ｐ１を含む層ＬｓがグリッドＧの上に設けられている。層Ｌｓは、例えば、低温ＥＭ試料の場合、厚さｔを有するガラス化された液体であり得る。ビームＢは、試料の領域に集束させることができる。試料の下流で、ビームは、拡大され、検出器３０上に集束されることができる（拡大されたビームＢ_Ｍで示される）。

較正の目的のために、以下の方法を使用することができる。既知の粒子力価（例えば、２・１０^１３粒子／ｍｌ）を有する既知の粒子が提供される。撮像された領域（図４において「領域」で示される）は、画素の数及び画素サイズが既知であるときに決定され得る。試料の厚さ（氷の厚さ）は、４０ｎｍで測定（又は近似）することができる。

画像内の粒子の数を計数することができ、これにより較正係数ｆを決定することができる。
Ｃ_ｐ１＝ｆ^＊ｎ／Ｖ （１）
ｆ＝Ｃ_ｐ１ ^＊Ｖ／ｎ （２）
ここで、Ｃ_ｐ１は粒子力価［部／ｍ^３］、ｆは較正係数［－］、ｎは試料中の粒子数［部］、Ｖは撮像された試料の体積［ｍ^３］である。

本発明者らは、いくつかの実験において、一次粒子Ｐ１（ウイルス粒子など）の較正係数が０．０１に等しいことを見出した。これは、試料が実際にグリッド上に１００倍濃縮されたことを示す。

本発明者らは、この濃縮係数が一定であり得るか、又は少なくとも較正され得、二次粒子を使用することなく物理的力価が低温ＥＭによって決定されることを可能にすると考える。低温ＥＭにおけるこの濃度又は較正係数に影響を及ぼすことができる重要なパラメータは、以下を含む。
１．時間（試料の適用からブロッティング開始まで）。グリッドに付着した粒子の数は指数関数的に減衰するので、十分に長いインキュベーション時間（例えば３０秒）は、時間が較正係数に影響を及ぼさないことを保証する。
２．試料緩衝液の粘度及び電荷は、典型的には、実際の適用において一定である。
３．粒子材料特性（重量、サイズ、電荷）。
４．グリッド内の電荷量、例えば、グリッドタイプ／バッチ、グロー放電時間、グロー放電器内の電流及びグリッド位置。
５．グリッドまでの粒子の距離。

特に、この最後のパラメータは重要であり、初期粒子力価：ｆ＝ｆ（Ｃ_ｐ１）によって決定されると考えられる。

図５ａは、本明細書に開示される第１の態様を使用して得られた画像の例を示す。ここでは、３人の異なるオペレータが各々、完全なウイルス粒子を有する１つの試料、及び空のウイルス粒子を有する１つの試料を撮像した。２・１０^１３粒子／ｍｌの濃度を有する試料を調製した。較正係数を考慮すると、これは、所与の画像において３０の粒子数をもたらすはずである。３人のオペレータは、１．３・１０^１３粒子／ｍｍｌ～２．６・１０^１３粒子／ｍｌの範囲の濃度に対応して、２０～４４の範囲の全粒子数を与えることができた。上記パラメータの影響は限定されていることが分かる：計算された物理的力価は、前もって決定された物理的力価から１桁以内である。更に、粒子材料特性は、顕微鏡写真から得られた情報（例えば、サイズ、密度）を使用することによって（部分的に）補償され得ることが予想される。更に、グリッド上の電荷の変動は、例えば、１つのグリッドタイプ／バッチ、１つのグロー放電器／設定、及びグロー放電器内のグリッドの１つの位置決め方法を確実にすることによって、最小限に抑えることができる。

図５ｂ及び図５ｃは、オペレータが異なる画像から一次粒子の濃度を決定した初期実験のフルセットを示す。図５ｂは、個々のオペレータについての要約を示し、図５ｃは、３人全てのオペレータについての個々の力価決定（the individual titer determinations）を示す。図５ｃのｘ軸は実験の数を示し、ｙ軸は決定された力価を示す。明確にするために、ｘ軸は、各オペレータＡ、Ｃ、及びＢについて、それぞれ最高力価から最低力価にソートされていることに留意されたい。オペレータＡ及びＣについて、決定された力価は、９２％の時間について２・１０^１３粒子／ｍｌと７・１０^１３粒子／ｍｌとの間であった（実際の力価は２・１０^１３粒子／ｍｌであった）。現在、これは、一次粒子の力価が３～４時間精度内で示され得ることを意味する。比較のために、ＳＥＣ－ＭＡＬＳのような従来の方法及びＥＬＩＳＡを使用する理論的物理的力価は、十分に２倍の精度内である。

図５ａ～図５ｃに示すように、最初の実験のデータは、以前に取得されたデータに基づくことに留意されたい。力価の決定の結果は、力価を決定するより標準化された方法が達成されるように、上記のような重要なパラメータを考慮することによって改善することができる。これにより、従来の方法によって提供される精度に達することができるはずである。

元の試料における物理的力価を決定するための例示的な方法は、以下のように導出することができる。
１．グロー放電。このステップの間、（低温）ＥＭグリッドは、ステップ２において試料がグリッドに引き付けられるように帯電される。グリッドをグロー放電させるために選択される電流及び時間は、電荷飽和があるように選択されなければならないことに留意することが重要である。実験において、我々は、空気中で３０秒間、負極性で２０ｍＡの電荷を選択した。当業者は、この電荷が少なくとも３０分間保持されることを理解するであろう。
２．試料を適用する。ここで、ナノ粒子を含む試料は、（低温）ＥＭグリッドに適用される（例えば、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（登録商標）に取り付けられる）。
３．インキュベーション時間。このステップの間、ナノ粒子は引き付けられ、グリッドに「付着」する。グリッドに付着したナノ粒子の最終的な数は、上述のパラメータによって決定される。
４．ブロッティング。ここで、吸収性フィルター（ブロッティング）紙を試料に押し込み、グリッドにほぼ／部分的に又は完全に接触させる。ブロッティング紙の吸収力／引力は、粒子に対する荷電グリッドの引力よりもはるかに小さいと考えられる。
５．ガラス化。試料を（例えば）液体エタン中に沈めることによって、試料の実際のガラス化を行う。グリッドに付着したナノ粒子及び残った試料緩衝液を使用して、顕微鏡で顕微鏡写真を取得する。ガラス化ステップは、非低温（例えば、ネガティブ染色）タイプの分析では省略されることに留意されたい。

上記の方法では、炭素の極薄層（膜）を有するＱｕａｎｔｉｆｏｉｌグリッドを使用することができる。この薄層は、グリッド上のナノ粒子の分布を改善することが知られている。

図６は、本明細書に記載の方法の第２の態様を使用して得られた画像の例を示す。この画像は、試料Ｓの一部を示しており、この試料は、この場合、当業者に知られている方法でガラス化を使用して低温ＥＭグリッド（孔の上に薄い連続炭素を有するＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ ＥＭグリッド）上に調製された低温ＥＭ試料である。試料Ｓのグリッドは、第１の部分Ｓ１及び第２の部分Ｓ２を含む。第１の部分は、いわゆる箔孔であり、第２の部分Ｓ２は、この箔孔Ｓ１を取り囲むより厚い支持体炭素膜である。試料Ｓは、第１の部分Ｓ１及び第２の部分Ｓ２の両方に存在するいくつかの一次粒子Ｐ１及びいくつかの二次粒子Ｐ２を含む。図４に示す一次粒子Ｐ１は、ウイルス粒子である。試料の調製には、二次粒子Ｐ２として５～１０ｎｍの金粒子を使用する。二次粒子Ｐ２は、既知の濃度で提供される。この実施形態において、添加される金粒子の濃度は、５２０ｎｍでの吸収技術を使用することによって正確に決定され、その後、それは、一次粒子Ｐ１を含む溶液に混合され得る。

一次粒子Ｐ１の濃度は未知である。一次粒子Ｐ１を画像内で計数することができ、画像内の一次粒子Ｐ１の数が得られる。二次粒子Ｐ２は、試料Ｓの調製中又は調製後に提供されるので、既知の濃度を有する。二次粒子Ｐ２は、画像計数することができ、画像内の二次粒子Ｐ２の数が得られる。ここで、画像内の粒子の数は濃度に相関し、粒子が多いほど濃度が高いことを意味し、逆も又同様である。これは、一次粒子Ｐ１に対する二次粒子Ｐ２の比を、２つの粒子間の相対濃度に関連付けることができることを意味する。そして、二次粒子Ｐ２の濃度が分かれば、画像中の一次粒子Ｐ１の濃度を求めることが可能となる。必要であれば、較正係数（１つ以上の粒子について）を使用することができることに留意されたい。

一次粒子の数ｎ_１及び二次粒子の数ｎ_２を知ることにより、一次粒子の濃度Ｐ１を以下のように（上記式１及び２を使用して）計算することができる。
Ｃ_ｐ１＝ｆ_ｐ１ ^＊ｎ_１／Ｖ （３）
Ｃ_ｐ２＝ｆ_ｐ２ ^＊ｎ_２／Ｖ （４）

式３と式４を組み合わせて体積を除去し、Ｃ_ｐ１について解くと、次式が得られる。
Ｃ_ｐ１＝ｆ_ｐ１ ^＊ｎ_１／ｆ_ｐ２ ^＊ｎ_２ （５）
したがって、（専用の制御された実験において事前に決定することができる）両方の粒子についての較正係数を用いて、既知の濃度の二次粒子が試料に添加される場合に、対象となる一次粒子の未知の濃度を決定することが可能になる。例えば、最終試料を調製する際に、異なる体積の一次粒子及び二次粒子を混合して最終試料を作製する場合、更なる計算を適用し得ることに留意されたい。当業者はこれらの計算に精通しているであろう。

選択された粒子のみを計数することも可能である。例えば、箔孔Ｓ１内に存在する粒子など、試料Ｓの特定の領域内に存在する粒子のみを計数することも可能である。更に、粒子は、サイズ、生存率、又は他の基準を含み得る特定の物理的要件を満たすことに基づいて計数されることが考えられる。

図６において、一次粒子Ｐ１はウイルス粒子（ＡＡＶカプシド、ＡＡＶ＝アデノ随伴ウイルス）であり、二次粒子Ｐ２は金ナノ粒子である。一次粒子が二次粒子よりも大きいことが分かる。これは有利であるが、一次粒子及び二次粒子のサイズが類似していることも可能である。二次粒子は又、一次粒子よりも（わずかに）大きくてもよい。二次粒子及び一次粒子（ＡＡＶカプシド）の両方の分布は、ＥＭグリッドの孔及び厚い支持体炭素にわたって類似しており、画像中の観察された粒子の相対比と溶液中のそれらの濃度との間の較正曲線が確立され得ることを示すことが分かる。

図７ａ及び図７ｂは、第２の態様による方法の更なる実施形態を示すが、第１の態様内で等しく使用することができる。ここで、試料は、単一ウイルス粒子の３つの異なるカテゴリ（空、部分的、及び完全）を含む。示される画像において、ＡＡＶカプシドは、空であるか、部分的に充填されているか、又は完全であるかのいずれかである。図７ａでは、比較的低い濃度が使用されているが、図７ｂでは、粒子の濃度が比較的高い。粒子は、画像認識アルゴリズムを使用して識別されており、粒子は、空７０１（灰色の正方形）、部分的に充填された７０２（黒色の正方形）、又は完全７０３（白色の正方形）として分類される。したがって、粒子数（濃度）だけでなく、単一の画像に基づいて他のパラメータも確立することができる。この多重アプローチは、本明細書に開示される方法の主要な利点の１つである。

図７ａ及び図７ｂでは、本発明の実施形態は、溶液中の粒子力価の決定のための低温ＥＭ画像における内部標準としての基準マーカの使用を可能にする。ここで、ＥＭグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌグリッドなど）の孔の上の連続的な炭素の使用は、ＥＭグリッドの領域全体にわたる基準マーカ（金ナノ粒子などの二次粒子）及び試料粒子（ＡＡＶウイルス粒子など）の分布を改善するのに役立つ。

所望の保護は、添付の特許請求の範囲によって付与される。

Claims (18)

1. 荷電粒子顕微鏡法を使用して試料を評価する方法であって、
   －対象の一次粒子を含む試料を提供するステップと、
   －前記一次粒子の少なくとも１つの画像を得るために、荷電粒子顕微鏡を使用して前記試料を撮像するステップと、
   －前記少なくとも１つの画像を使用して前記一次粒子の濃度を決定するステップとを含む、方法。
2. 前記一次粒子の濃度が、前記画像内の一次粒子の数を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
3. 前記画像の体積データが、前記一次粒子の前記濃度を決定する際に使用され、特に前記荷電粒子顕微鏡の画像サイズ、前記荷電粒子顕微鏡の倍率設定、前記試料の厚さのうちの少なくとも１つ以上に基づく、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記試料が低温ＥＭ試料であり、前記試料の厚さが前記低温ＥＭ試料の氷の厚さに関連する、請求項３に記載の方法。
5. 前記画像が、前記一次粒子から独立しており、既知の濃度を有する二次粒子を更に含み、前記方法が、前記一次粒子の前記濃度を決定する前記ステップにおいて前記二次粒子の前記既知の濃度を使用するステップを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記二次粒子が、金ナノ粒子などの荷電粒子高密度材料を含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記一次粒子がウイルス粒子などの生物学的粒子を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記試料を調製するステップを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記一次粒子及び前記二次粒子を少なくとも１つの溶液中に提供するステップと、試料キャリアを提供するステップと、前記少なくとも１つの溶液を前記試料キャリアに適用するステップとを含む、請求項５に従属する請求項８に記載の方法。
10. 前記一次粒子及び前記二次粒子を混合して単一溶液にするステップを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記試料を調製するために、前記試料キャリア上の前記溶液をガラス化する後続のステップを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記濃度を提供する前記ステップが、供給者データシートなどの前記二次粒子のデータ情報を使用するステップを含む、請求項５又はそれに従属する請求項のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記二次粒子の前記濃度を提供するために吸収技術を使用するステップを含む、請求項５又はそれに従属する請求項のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記一次粒子の前記濃度を決定する前記ステップが、
    －前記一次粒子の少なくとも１つの予備濃度を決定するステップと、
    －その後、前記二次粒子の前記提供された濃度を使用して、前記一次粒子の最終濃度を決定するステップとを含む、請求項５又はそれに従属する請求項に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つの画像における二次粒子の数と前記画像における一次粒子の数との間の比が、前記一次粒子の前記濃度を決定するために使用される、請求項５又はそれに従属する請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記試料の調製中の二次粒子の損失を考慮するための較正ステップを含む、請求項５又はそれに従属する請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記試料の少なくとも１つの更なるパラメータを決定するステップを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 請求項１～１６のうちの１つ以上に記載の方法を実行するように構成されたプロセッサユニットを備える、荷電粒子顕微鏡。

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