CN118147186A - 一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶c端延伸突变体的制备方法及其应用 - Google Patents
一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶c端延伸突变体的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程领域，涉及一种广盐性嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法及其应用；步骤为：以嗜盐古菌的基因组为模板，通过Overlap PCR技术获得HlyAHap与HlyBHap的CTE融合表达蛋白的编码基因hlyAHap‑hlyBHapCTE，记为hlyAHap‑CTE，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。然后将hlyAHap‑CTE连接到载体上构建重组质粒，并将其转化原核宿主，诱导表达后对其进行镍亲和层析纯化和透析复性，孵育后得到嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体，记为HlyAHap‑CTE。本发明得到了稳定性良好的广盐性蛋白酶，可以作为生物催化剂广泛应用于食品、医药、化工等工业领域。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种稳定性良好的广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法及其应用。
背景技术
嗜盐古菌胞外蛋白酶具有耐高温、嗜盐碱、耐有机溶剂等特点，可以作为生物催化剂广泛应用于食品、医药、化工等工业领域。但嗜盐古菌蛋白酶低盐条件下会不可逆的变性失活，限制了其应用范围。挖掘在低盐和高盐环境都具有良好活性和稳定性的广盐性嗜盐古菌蛋白酶十分必要。
目前已确定氨基酸序列的嗜盐古菌胞外蛋白酶都属于类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶S8A家族。该类蛋白酶一般先在细胞内合成前体，包含信号肽、N端前肽、催化结构域和C端延伸区(C-terminal extension，CTE)；前体自催化切割产生成熟酶，成熟酶包含催化结构域和CTE。CTE对于维持蛋白酶的稳定性至关重要。嗜盐古菌(Haladaptatuspaucihalophilus)CGMCC 1.8953的胞外蛋白酶HlyAHap无CTE，具有高催化活性，但是低盐条件下不稳定；然而，HlyBHap有CTE，催化活性低，但是低盐条件下稳定性好。因此，HlyAHap与HlyBHap的CTE融合表达有望获得活性高、稳定性好的广盐性蛋白酶。
受限于高盐环境，胞外蛋白酶多采用乙醇沉淀后，经杆菌肽亲和层析、凝胶过滤层析等方法纯化，纯化效果不理想。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种嗜盐古菌(Haladaptatuspaucihalophilus CGMCC 1.8953)胞外蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，及其在广泛盐浓度、pH和温度等特殊工业条件中的应用。
本发明基于嗜盐古菌(Haladaptatus paucihalophilus)CGMCC 1.8953的基因组获得蛋白酶HlyAHap编码基因(记为hlyAHap)、蛋白酶HlyBHap编码基因(记为hlyBHap)；基于基因hlyAHap和hlyBHap利用Overlap PCR技术获得蛋白酶C端延伸突变体HlyAHap-CTE编码基因，记为hlyAHap-hlyBHapCTE(简称hlyAHap-CTE)，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因大小为1554bp。hlyAHap编码的胞外蛋白酶前体具有信号肽、前肽和催化结构域，无CTE，蛋白酶HlyAHap的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。hlyBHap编码的胞外蛋白酶前体具有信号肽、前肽、催化结构域和CTE，蛋白酶HlyBHap CTE的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。蛋白酶C端延伸突变体HlyAHap-CTE的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，由517个氨基酸残基组成，包括HlyAHap的信号肽、前肽、催化结构域和HlyBHap的CTE。
本发明涉及一种嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)构建pET28a-hlyAHap-CTE重组表达质粒：
首先基于嗜盐古菌(Haladaptatus paucihalophilus)的基因组获得胞外蛋白酶编码基因序列，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，通过Overlap PCR技术获得目的片段，记为hlyAHap-CTE，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；然后利用分子克隆技术将hlyAHap-CTE连接到载体上构建重组质粒，记为pET28a-hlyAHap-CTE；
(2)重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：
将步骤(1)重组质粒pET28a-hlyAHap-CTE，转化原核生物宿主，转化后的宿主细胞在添加IPTG诱导剂的LB培养基中进行一段时间的诱导表达，诱导表达后离心收集菌体；
(3)嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE的纯化与复性：
将步骤(2)收集的菌体于细胞裂解液中进行重悬，超声破碎，然后离心收集上清液，采用镍柱亲和层析纯化，经纯化后再进行透析复性，最后在水浴条件下进行孵育，经孵育后得到嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体，记为HlyAHap-CTE；其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
优选的，步骤(1)中所述载体为原核表达载体，包括pET系列载体、pQE系列载体，本发明载体选择为大肠杆菌表达载体pET28a；所述嗜盐古菌(Haladaptatuspaucihalophilus)的保藏编号为CGMCC 1.8953。
优选的，步骤(2)中所述原核生物宿主为E.coli BL21。
优选的，步骤(2)中所述诱导表达的IPTG诱导剂，在LB培养基中的终浓度为0.5mM。
优选的，步骤(2)中所述诱导表达的时间为4h，温度为37℃。所述离心的温度条件为4℃。
优选的，步骤(3)中所述细胞裂解液成分为：8M尿素，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH 8.0。
优选的，步骤(3)中所述镍柱亲和层析纯化的步骤为：流尽镍柱中的保存液体，然后用10倍柱床体积ddH2O洗柱，再用10倍柱床体积的细胞裂解液平衡柱子；然后将上清液上柱，重复两次；流穿液留样1mL；用25mL的缓冲液I洗杂蛋白，留样1mL；用10mL的缓冲液Ⅱ洗脱目的蛋白，每管收集1mL，获得纯化后的蛋白酶。
优选的，所述缓冲液I的成分为40mM咪唑，8M尿素，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH8.0。
优选的，所述缓冲液II成分为200mM咪唑，8M尿素，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH8.0。
优选的，步骤(3)中所述透析是使用截留分子量为7kDa的透析袋透析；透析液成分为：4M NaCl，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH 8.0。
优选的，步骤(3)中所述水浴的温度为37℃，孵育时间为2h。
本发明制备的嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体应用于催化蛋白类底物水解；所述蛋白类底物包括偶氮酪蛋白、牛血红蛋白、鸡蛋白蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白、鱼胶原蛋白。
性能检测：
(1)嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE的酶学性质表征；
以偶氮酪蛋白为底物测定HlyAHap-CTE的酶活来表征酶学性质，具体包括：酶催化反应的最适温度、最适pH、最适NaCl浓度，不同金属离子对HlyAHap-CTE活性的影响，不同有机溶剂和表面活性剂对HlyAHap-CTE活性的影响，不同蛋白酶抑制剂对HlyAHap-CTE活性的影响以及酶促动力学参数测定；其中所述温度、pH和NaCl浓度的确定范围分别是30～65℃、pH6.0～10.5、NaCl浓度0.5～4M；所述不同的金属离子为：Ni2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Sr2+、Co2+、Zn2+、K+、Fe3+、Mn2+；所述不同的有机溶剂和表面活性剂为：甲醇、乙醇、甘油、丙酮、乙腈、DMSO、DMF、异丙醇、吐温20、吐温80、SDS、Triton X-100和PEG600；所述不同蛋白酶抑制剂为：PMSF、DTT、EDTA；所述酶学性质均是以偶氮酪蛋白为底物测定HlyAHap-CTE的催化活性来表征。
(2)嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE的稳定性表征；
将上述得到的嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE放置在不同的温度、NaCl浓度、pH下孵育一定时间后以偶氮酪蛋白为底物测定残余催化活性；所述不同温度为：30℃、40℃、50℃、60℃，NaCl浓度为：0.25M、2M、4M，pH为：6.0、8.0、10，孵育时间为：30min、60min、90min。
(3)嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE对不同底物的水解活性。
基于步骤(1)酶学性质的表征，进一步以不同的底物测定酶活探究HlyAHap-CTE对其水解活性；其中所述不同底物为：偶氮酪蛋白、牛血红蛋白、鸡白蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白、鱼胶原蛋白。
本发明的优点和技术效果：
(1)本发明提出了一种新型嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，本发明操作简易且可以获得很好的纯度。
(2)嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体具有优良的酶学特性，可以水解多种大分子蛋白质底物；在低盐到高盐范围内均具有良好的稳定性和酶活；在30～65℃下均具有较高酶活，有很好的热稳定性；在中性偏碱性的pH范围内具有很高活性和稳定性；可耐受多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂。具有优良性状的嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体可广泛应用于各种工业环境中。
附图说明
图1为利用引物hlyA-NcoI-F1、hlyA-hlyBCTE-F2、hlyA-hlyBCTE-R1和hlyBCTE-XhoI-R2进行Overlap PCR扩增目的片段的琼脂糖凝胶电泳分析图。
图2为镍柱亲和层析纯化HlyAHap-CTE的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。
图3为透析复性后HlyAHap-CTE热处理的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。
图4为温度对HlyAHap-CTE催化活性的影响图。
图5为pH对HlyAHap-CTE催化活性的影响图。
图6为NaCl浓度对HlyAHap-CTE催化活性的影响图。
图7为HlyAHap-CTE在不同温度下热稳定性图。
图8为HlyAHap-CTE在不同pH条件下稳定性图。
图9为HlyAHap-CTE在不同浓度NaCl下的稳定性图。
图10为不同金属离子对HlyAHap-CTE催化活性的影响图。
图11为不同有机溶剂和表面活性剂对HlyAHap-CTE催化活性的影响图。
图12为不同蛋白酶抑制剂对HlyAHap-CTE催化活性的影响图。PMSF为丝氨酸蛋白酶抑制剂；EDTA为金属蛋白酶抑制剂；DTT为巯基蛋白酶抑制剂。
图13为以偶氮酪蛋白为底物HlyAHap-CTE的动力学曲线图。
图14为HlyAHap-CTE对不同底物的催化活性图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施实例对本发明做进一步说明。
Overlap PCR(重叠延伸PCR技术)是具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这种PCR方法通常用于扩增长片段DNA、构建融合基因、基因定点诱变等实验中，为本领域常规技术。
嗜盐古菌(Haladaptatus paucihalophilus)来自中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.8953。
实施例1：
嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体编码基因hlyAHap-CTE的获取；
基于一株嗜盐古菌(Haladaptatus paucihalophilus)CGMCC 1.8953的全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选疑似胞外蛋白酶基因。通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知嗜盐古菌胞外蛋白酶序列的一致性。利用Overlap PCR技术将hlyAHap与hlyBHap的CTE编码序列融合，获得胞外蛋白酶C端延伸突变体编码基因hlyAHap-CTE，大小为1554bp，编码蛋白含517个氨基酸残基。Overlap PCR由两次PCR过程构成。第一步以菌株Haladaptatus paucihalophilus CGMCC 1.8953基因组为模板，利用引物对hlyA-NcoI-F1(5’-ATAccatggGCAAGGAAAGCCAATGGC-3’，NcoI)、hlyA-hlyBCTE-R1(5’-GCCGCTACCGGGCTGGGTGTTGTCGCTGGAGTCGTA-3’)和hlyA-hlyBCTE-F2(5’-TACGACTCCAGCGACAACACCCAGCCCGGTAGCGGC-3’)、hlyBCTE-XhoI-R2(5’-ATActcgagTTACTGGTATTCCGTGAT-3’，XhoI)分别扩增出hlyAHap和hlyBHapCTE。第二步以第一步PCR产物为模板，利用hlyA-NcoI-F1和hlyBCTE-XhoI-R2扩增出融合片段。如图1所示，图1为Overlap PCR扩增目的片段的琼脂糖凝胶电泳分析图，M：DNA分子量指示Marker；1：hlyAHap；2：hlyBHapCTE；3：hlyAHap-CTE；从图1可以看出利用Overlap PCR可以获得胞外蛋白酶C端延伸突变体编码基因hlyAHap-CTE，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2：
hlyAHap-CTE表达质粒的构建和诱导表达；
将本发明获得的基因hlyAHap-CTE克隆到表达载体上，构建重组表达菌株进行诱导表达。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经NcoI和XhoI双酶切的质粒pET28a连接，得到重组质粒pET28a-hlyAHap-CTE，插入片段的3’端含有6×His tag。CaCl2转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆的质粒，以引物hlyA-NcoI-F1和hlyBCTE-XhoI-R2进行PCR确认阳性质粒,由上海生工完成测序，鉴定为基因hlyAHap-CTE。将重组质粒pET28a-hlyAHap-CTE转化E.coli BL21表达菌株中，构建重组表达菌株。然后将3mL重组表达菌液转接到200mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至生长对数期(OD600在0.6～0.8之间)，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达4h；4℃离心收集菌体。
上述限制性内切酶、T4 DNA连接酶购买自New England Biolabs；pET28a质粒购买自上海生工；上述试剂盒购买自美国Axygen公司。
实施例3：
嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE的纯化：
诱导表达后的菌体悬于30mL细胞裂解液(8M尿素，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH8.0)中，在冰上进行超声破碎，直至菌体透亮，低温离心后收集上清液，上清液经过镍柱亲和层析纯化得到纯化后的蛋白酶，记为HlyAHap-CTE前体；如图2所示，图2为镍柱亲和层析纯化HlyAHap-CTE的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图，其中：P：HlyAHap-CTE前体分子；M：蛋白分子量指示Marker；1：细胞裂解液；2：上样流穿液；3：40mM咪唑洗杂蛋白；4：200mM咪唑洗脱目的蛋白；从图2可以看出200mM咪唑可以将蛋白酶HlyAHap-CTE前体洗脱下来，且可以得到条带较为单一的HlyAHap-CTE前体分子，表观分子量为102kDa。
具体操作如下：
1)流尽镍柱中的保存液体(体积分数20％的乙醇)后用10倍柱床体积(20mL)ddH2O洗柱，再用10倍柱床体积的细胞裂解液平衡柱子；
2)将上清液上柱，重复两次；
3)加入25mL的缓冲液Ⅰ(20mM Tris-HCl，10mM CaCl2，8M尿素，40mM咪唑，pH 8.0)洗杂蛋白，留样1mL；
4)加入10mL的缓冲液Ⅱ(20mM Tris-HCl，10mM CaCl2，8M尿素，200mM咪唑，pH8.0)洗脱目的蛋白，每管收集1mL，获得纯化后的蛋白酶HlyAHap-CTE前体；
5)加入10倍柱床体积(20mL)的缓冲液Ⅲ(20mM Tris-HCl，10mM CaCl2，8M尿素，500mM咪唑，pH 8.0)清洗镍柱；再加入20mL ddH2O清洗镍柱；最后将镍柱充满20％乙醇，于4℃保存；
6)所得目的蛋白进行SDS-PAGE检测。
实施例4：
嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE的复性：
将上述纯化后的10mL HlyAHap-CTE前体样品装入透析袋中，进行透析复性；透析液成分为：4M NaCl，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH 8.0。于1L透析液中4℃搅拌透析，每8h换一次透析液，总透析时间为24h。如图3所示，图3为透析复性后HlyAHap-CTE热处理的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图，M：蛋白分子量指示Marker；1，2：透析复性后在37℃下保温0，2h；P：HlyAHap-CTE前体分子；M：HlyAHap-CTE成熟酶；从图3可以看出经过透析复性后的蛋白酶HlyAHap在未进行37℃孵育(即37℃保温0h)时为前体形式，37℃保温2h可以得到成熟的蛋白酶HlyAHap-CTE(表观分子量为66kDa)；经孵育后得到嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体，记为HlyAHap-CTE；其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
实施例5：
HlyAHap-CTE的酶活检测；
以偶氮酪蛋白为底物测定HlyAHap-CTE的催化活性。具体操作：酶活测定缓冲液为2MNaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0。以酶活测定缓冲液溶解偶氮酪蛋白为反应底物，纯酶添加量为0.3μg，通过蛋白浓度计算所需酶液体积后用酶活测定缓冲液补充到50μL。反应体系包括50μL 0.5％(w/v)偶氮酪蛋白溶液和50μL酶液，放置37℃水浴锅中反应1h；空白对照组偶氮酪蛋白溶液和酶液分开孵育，反应结束后混合。空白对照管与测试管中分别加入100μL10％(w/v)TCA溶液终止反应，测试组和空白对照组均静置30min后离心。所得上清液与1MNaOH以1:1比例混合后，采用紫外可见光分光光度计测定吸光值A440，使用空白对照组调零。一个酶活力单位定义为每分钟吸光值增加0.01所需酶量。
上述底物购买自美国Sigma公司。
实施例6：
HlyAHap-CTE最适反应条件分析；
以偶氮酪蛋白为底物测定HlyAHap-CTE的最适反应条件。
蛋白酶HlyAHap-CTE最适反应温度在30～65℃范围内测定，于30、35、40、45、50、55、60和65℃下测定蛋白酶酶活，测定酶活方法除反应温度不同外，其余同实施例5。以最高酶活为100％计算其他温度相对酶活，每组三次平行试验。图4为温度对HlyAHap-CTE催化活性的影响图，结果表明HlyAHap-CTE在30～55℃范围内均保持最高酶活的76％以上，最适温度为45℃。
最适反应pH在6.0～10.5范围内测定，分别配制含2M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH6～7.5)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.5～9)和CHES-NaOH缓冲液(pH 9～10.5)，于最适温度45℃测定蛋白酶酶活，测定酶活方法除反应温度以及pH不同外，其余同实施例5。以最高酶活为100％计算其他pH相对酶活，每组三次平行试验。图5为pH对HlyAHap-CTE催化活性的影响图，结果表明HlyAHap-CTE在pH值为7.5～9.5范围内均保持最高酶活的76％以上，最适pH为8.0。
最适NaCl浓度在0.5～4M范围内测定，分别配制NaCl浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0M的20mM Tris-HCl、pH 8.0缓冲液，于最适温度45℃测定蛋白酶酶活，测定酶活方法除NaCl浓度及反应温度不同外，其余同实施例5。以最高酶活为100％计算其他盐浓度相对酶活，每组三次平行试验。图6为NaCl浓度对HlyAHap-CTE催化活性的影响图，结果表明HlyAHap-CTE在1.0～2.5M NaCl均保持最高酶活的78％以上，最适NaCl浓度为2.0M。
HlyAHap-CTE最适反应条件为45℃、pH 8.0以及2.0M NaCl。
实施例7：
HlyAHap-CTE稳定性分析；
以偶氮酪蛋白为底物测定蛋白酶HlyAHap-CTE的酶学稳定性。
HlyAHap-CTE的热稳定性分析具体操作为：将蛋白酶HlyAHap-CTE(2M NaCl，20mMTris-HCl，pH 8.0)于30、40、50和60℃放置0、30、60和90min后，最适温度45℃测定各梯度蛋白酶酶活，测定酶活方法除反应温度不同外，其余同实施例5。各温度梯度下以最高酶活为100％计算其他时间下相对酶活，每组三次平行试验。HlyAHap-CTE在30和40℃下90min后均可以保持83％以上的活性，在50和60℃下1h后分别保持73和56％以上的活性，90min后均可以保持59％左右的活性，具有较好的热稳定性(图7)。
HlyAHap-CTE的pH稳定性分析具体操作为：将蛋白酶于含2M NaCl的20mM pH 6.0(磷酸盐缓冲液)、pH 8.0(Tris-HCl缓冲液)和pH 10.0(CHES-NaOH缓冲液)的缓冲液中4℃放置0、30、60和90min后，最适温度45℃测定各梯度蛋白酶酶活，测定酶活方法除反应温度以及pH不同外，其余同实施例5。各pH梯度下以最高酶活为100％计算其他时间下相对酶活，每组三次平行试验。HlyAHap-CTE在pH 6.0和8.0条件下90min后仍具有82％以上的活性，pH10.0条件下90min后仍具有56％以上的活性，具有较好的pH稳定性(图8)。
HlyAHap-CTE的NaCl稳定性分析具体操作为：将蛋白酶于NaCl终浓度为0.25、2和4M的20mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液中4℃放置0、30、60和90min后，最适温度45℃测定各梯度蛋白酶酶活，测定酶活方法除NaCl浓度及反应温度不同外，其余同实施例5。各盐浓度梯度下以最高酶活为100％计算其他时间下相对酶活，每组三次平行试验。HlyAHap-CTE在在0.25和2M NaCl浓度下1h后具有83％以上的活性，90min后仍可以保持71％以上的活性，4M NaCl浓度下90min后依旧保持60％以上的活性，具有较好的NaCl稳定性(图9)。
实施例8：
HlyAHap-CTE环境耐受性分析；
金属离子对HlyAHap-CTE活性影响的测定具体操作为：反应体系中添加10mM不同的金属离子(Ni2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Sr2+、Co2+、Zn2+、K+、Fe3+、Mn2+)，阳性对照体系中以ddH2O代替金属离子。45℃测定酶活，测定酶活方法除反应温度更改为最适条件外，其余同实施例5。以阳性对照结果为100％酶活，比较含金属离子的反应体系的相对酶活，每组三次平行试验。结果表明Co2+可以抑制HlyAHap-CTE几乎所有活性，Fe3+和Cu2+仅可保持20％左右活性，Zn2+可保持31％活性，Ni2+和Mn2+下可以保持60％左右活性，Sr2+和K+下可以保持83％以上活性，而Ca2+和Mg2+对酶活有明显促进作用，可以提高20％活性(图10)。
有机溶剂和表面活性剂对HlyAHap-CTE活性影响的测定具体操作为：反应体系中添加15％的甲醇、乙醇、甘油、丙酮、乙腈、DMSO、DMF、异丙醇、吐温20、吐温80、SDS、Triton X-100和PEG600，阳性对照体系中ddH2O代替有机溶剂和表面活性剂。45℃测定酶活，测定酶活方法除反应温度更改为最适条件外，其余同实施例5。以阳性对照结果为100％酶活，比较含有机溶剂和表面活性剂体系的相对酶活，每组三次平行试验。结果表明吐温20和PEG600对酶活有促进作用。HlyAHap-CTE对SDS最敏感，仅可保持25％活性；异丙醇和Triton X-100中可保持40％以上活性，其他有机溶剂和表面活性剂中均可以保持70％以上活性，说明具有很好的有机溶剂和表面活性剂耐受性(图11)。
不同蛋白酶抑制剂对HlyAHap-CTE活性影响的测定具体操作为：反应体系中添加终浓度为4mM的PMSF、10mM DTT、5mM EDTA，其中PMSF用甲醇溶解，DTT用水溶解，EDTA用20mMTris-HCl，pH 8.0缓冲液溶解，配制10倍浓度储备液。阳性对照体系中用溶解溶剂代替抑制剂。45℃测定酶活，测定酶活方法除反应温度更改为最适条件外，其余同实施例5。以阳性对照结果为100％酶活，比较含有抑制剂的相对酶活，每组三次平行试验。结果表明PMSF使HlyAHap-CTE几乎完全丧失酶活，表明HlyAHap-CTE是丝氨酸蛋白酶。金属蛋白酶抑制剂EDTA使酶活降低了约10％，DTT使酶活降低了约58％(图12)。
实施例9：
HlyAHap-CTE的酶促反应动力学分析；
以偶氮酪蛋白为底物测定HlyAHap-CTE的酶促反应动力学曲线具体操作为：以0.3μg蛋白酶HlyAHap-CTE与终浓度为0.01～2.5mM偶氮酪蛋白底物45℃反应1h，除反应温度更改为最适条件以及设置不同底物浓度外，其余步骤同实施例5。根据米氏方程(Michael-Menten equation)计算HlyAHap-CTE的动力学常数Km和最大反应速率Vmax。HlyAHap-CTE以偶氮酪蛋白为反应底物最大反应速率Vmax为20.75ΔOD440/min/mg，动力学常数Km为0.0975mM(图13)。
实施例10：
HlyAHap-CTE对不同底物的水解活性分析；
HlyAHap-CTE对不同底物的水解活性的测定具体操作为：底物为0.5％的偶氮酪蛋白、牛血红蛋白、鸡蛋白蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白、鱼胶原蛋白，45℃反应，终止反应后测定上清吸光值A280。酶活测定中反应温度更改为最适条件，偶氮酪蛋白换成相应底物，TCA终止反应后静置30分钟，离心后直接测定上清吸光值A280，其余方法同实施例5，每组三次平行试验。结果表明HlyAHap-CTE能够水解多种底物，对不同底物催化活性依次为偶氮酪蛋白>牛血红蛋白>酪蛋白>鸡白蛋白>鱼胶原蛋白>牛血清蛋白(图14)。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
hlyAHap-CTE的核苷酸序列：SEQ ID No.1
atggcaaggaaagccaatggcgtatcacgtcggaacgtactcaaagtaacaggtggctcgctagcggcggccggggcgaccggcctggcgtcggcagcaccgacggacaaggtggaggtcaacgtcggattcaagagcgcacgcggtcgcgcgatggcccggagcagcgcggacgaaatcgtccgtgagttcaactccatcgaggcgatgacgattcgcgtgtccaagcgcgcggtaacggcactcgaaaagaacccgaacatccgctacgtggaggagaacggtacgatggaagcactcggtcagacgctcccgtggggcgtggaccgcgtggacgccgaggtcgcacactcgaacggtgacacgggttcgggtgccgacatcgccatcatcgacaccggtatcgacgacgaccatcccgacctgcaggcgaacatcggtagcggcaaatcatttgtctcctgtgggagcggcggatacaccgggagttgtatcctctacggcaacagtaactcctgtaacgactcgtggtccgacgacaacaaccacggaacccactgtgccggtatcgcgaacgccgtggacaacgggcagggcgtcgtcggcgtctcgacgcaagcgacgctccacgccgtgaaggttctcgactgctccggtagcggttccttctccgacatcgcggccggtgtcgagtacgtcgcggaccagggctgggacgtggcgagcatgagcctcggcggctcttcgggctcgcaagccctgcacgacgcgattcagtacgcctacgacaacggagtcgtcatcgtcgccgcggccggaaacgacggacagtgtaccgactgcgtcggctatccggcggcgtactccgagaccatcacggtcgcgtcctcgaacgacagcgaccagcagtcctcgttctccagtcaaggtcccgaggtgaacatcatcgcacccggtaccgacatctactcgaccgttcccagcggctacgacacgtactcgggcacgtcgatggcgactccgcacgtcgccggtgccgccggtcaactcatcgcacaggggtactcggcccgcgatgccgagagccgactcctgaacacggcaaaggacctcggtctgtcgagcaacgtgcagggaagcggcctcctcgacgtcgccgcggcgctcggctacgactccagcgacaacacccagcccggtagcggcggtggcggtggtggtggcggcggcagcgactccacgaccgattcggtcagcgggtcgctctcggattactccgactacgacgactacacgtggtcgtgggagtacagcagcccgagccaaatcgtcgtggaactcgacggaccgagcagcgccgacttcgacctctacctcaacacggggacgacgagcgccgcgagcccgagcagctacgactactcgtccaccaccacgaacagtcaggaaacggtcaccatcgacagccccgacacgtcgacggatctccaaatcgacgtcgactcctacagcgggtcgggtagctacaccgtgaccatcacggaataccagtaa
HlyAHap核苷酸序列：SEQ ID No.2
atggcagacgacaacacatcgcggtttgacagacgaacattcctcaaagcaactggtgcggtcggtgctgcagcggccctgagtggcgttacggcggcgacgccgggtcgtaatccgggaccgaaagaagacgaaatcttggtcggtgtttcggcgggtcacggtgacatcgagcaggccgtcatgcagaacgcaccgatggacgtcaacgtcgtccacaagaacgaacaccttcgctacgttgcggtcgagcttccgagcgcgatgcccgactccgcgcgacagagtttcatcgacgctatcgagcagcgcgaaggaatcaaatacgcagaggagaactcgacgcacgaagcgcttctcacgccggacgaccccaagttcggccagcagtacgcgccgcagatggtcaactccgactccgcgtgggacacgacgctcggcagttcggacgtcaccatcgccgtcatcgacaccggcgcacagtacgaccaccccgacctggcggcgaactacaaatccaacccgggcaaggacttcgccgacagtgacagcgacccgtacccggacgtgccgcaggacgagtaccacgcgacccacgtttccggcatcgcggccggtgtcatcgacaacggtaccggcgtcgccgggcagggtaactcctcgctcatcaacggccgcgccctcgacgagggcggcagcggttccacgtccgatatcgcggacgccatccgctgggccgcggaccagggtgccgacgtcatcaacatgtccctcggtggcggtggctacacgagcacgatgaagaacgcggtcacctacgcgtccaacaacggcgtctttatcgcctgtgcggcgggtaacgacggctccggcagcgtctcgtacccggcgggctacagcgagtgtctcgccgtctcggccatcgactcgaacggcaacctcgcctccttctcgcagtacggcagcaaggtcgaactctgcgcgcccggtgtggacatcctctcgacgaccaccgagacgcgcggttcctacgagaagctctccggtacctcgatggcgacgcccgtcgtctccggtgtcgccggactgacgctctcgcagtgggacctcaccaactcggaactccgaagccacctcaagaacacggccgtcgatatgggcctgtcctcggacgaacagggcagcggccgcgtcgatgcctacaacgccgtcacttaa
HlyBHapCTE核苷酸序列：SEQ ID No.3
acccagcccggtagcggcggtggcggtggtggtggcggcggcagcgactccacgaccgattcggtcagcgggtcgctctcggattactccgactacgacgactacacgtggtcgtgggagtacagcagcccgagccaaatcgtcgtggaactcgacggaccgagcagcgccgacttcgacctctacctcaacacggggacgacgagcgccgcgagcccgagcagctacgactactcgtccaccaccacgaacagtcaggaaacggtcaccatcgacagccccgacacgtcgacggatctccaaatcgacgtcgactcctacagcgggtcgggtagctacaccgtgaccatcacggaataccagtaa
HlyAHap-CTE氨基酸序列：SEQ ID No.4
MARKANGVSRRNVLKVTGGSLAAAGATGLASAAPTDKVEVNVGFKSARGRAMARSSADEIVREFNSIEAMTIRVSKRAVTALEKNPNIRYVEENGTMEALGQTLPWGVDRVDAEVAHSNGDTGSGADIAIIDTGIDDDHPDLQANIGSGKSFVSCGSGGYTGSCILYGNSNSCNDSWSDDNNHGTHCAGIANAVDNGQGVVGVSTQATLHAVKVLDCSGSGSFSDIAAGVEYVADQGWDVASMSLGGSSGSQALHDAIQYAYDNGVVIVAAAGNDGQCTDCVGYPAAYSETITVASSNDSDQQSSFSSQGPEVNIIAPGTDIYSTVPSGYDTYSGTSMATPHVAGAAGQLIAQGYSARDAESRLLNTAKDLGLSSNVQGSGLLDVAAALGYDSSDNTQPGSGGGGGGGGGSDSTTDSVSGSLSDYSDYDDYTWSWEYSSPSQIVVELDGPSSADFDLYLNTGTTSAASPSSYDYSSTTTNSQETVTIDSPDTSTDLQIDVDSYSGSGSYTVTITEYQ。
Claims (10)
1.一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
首先基于嗜盐古菌(Haladaptatus paucihalophilus)的基因组获得胞外蛋白酶编码基因序列，进一步设计含有酶切位点的目的片段引物，通过Overlap PCR技术获得目的片段，记为hlyAHap-CTE，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；然后利用分子克隆技术将hlyAHap-CTE连接到载体上构建重组质粒，记为pET28a-hlyAHap-CTE；
(2)重组质粒转化原核生物宿主，诱导表达：
将步骤(1)重组质粒pET28a-hlyAHap-CTE，转化原核生物宿主，转化后的宿主细胞在添加IPTG诱导剂的LB培养基中进行一段时间的诱导表达，诱导表达后离心收集菌体；
(3)嗜盐古菌蛋白酶HlyAHap-CTE的纯化与复性：
将步骤(2)收集的菌体于细胞裂解液中进行重悬，超声破碎，然后离心收集上清液，采用镍柱亲和层析纯化，经纯化后再进行透析复性，最后在水浴条件下进行孵育，经孵育后得到嗜盐古菌胞外蛋白酶C端延伸突变体，记为HlyAHap-CTE；其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述载体为大肠杆菌表达载体pET28a；所述嗜盐古菌(Haladaptatuspaucihalophilus)的保藏编号为CGMCC 1.8953。
3.根据权利要求1所述的一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述原核生物宿主为E.coli BL21；所述诱导表达中的IPTG诱导剂，在LB培养基中的终浓度为0.5mM；所述诱导表达的时间为4h，温度为37℃；所述低温条件为4℃。
4.根据权利要求1所述的一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述细胞裂解液成分为8M尿素，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH 8.0。
5.根据权利要求1所述的一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述镍柱亲和层析纯化的步骤为：流尽镍柱中的保存液体，然后用10倍柱床体积ddH2O洗柱，再用10倍柱床体积的细胞裂解液平衡柱子；然后将上清液上柱，重复两次；流穿液留样1mL；用25mL的缓冲液I洗杂蛋白，留样1mL；用10mL的缓冲液Ⅱ洗脱目的蛋白，每管收集1mL，获得纯化后的产物。
6.根据权利要求5所述的一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于，所述缓冲液I的成分为40mM咪唑，8M尿素，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH 8.0；所述缓冲液II成分为200mM咪唑，8M尿素，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH8.0。
7.根据权利要求1所述的一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述透析是使用截留分子量为7kDa的透析袋透析；透析液成分为：4MNaCl，10mM CaCl2，20mM Tris-HCl，pH 8.0。
8.根据权利要求1所述的一种广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述水浴的温度为37℃，孵育的时间为2h。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的方法制备的广盐性的嗜盐古菌蛋白酶C端延伸突变体应用于催化蛋白类底物水解的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述蛋白类底物包括偶氮酪蛋白、牛血红蛋白、鸡蛋白蛋白、牛血清蛋白、酪蛋白、鱼胶原蛋白。
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