CN118146308A - 用于治疗胃癌的环肽及其药物组合物 - Google Patents

用于治疗胃癌的环肽及其药物组合物 Download PDF

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CN118146308A CN202410422749.9A CN202410422749A CN118146308A CN 118146308 A CN118146308 A CN 118146308A CN 202410422749 A CN202410422749 A CN 202410422749A CN 118146308 A CN118146308 A CN 118146308A
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焦石
汤扬
方葛敏
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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及用于胃癌治疗的大环多肽及其药物组合物。具体是指，在蛋白磷酸酶2A(PP2A)A亚基的B″′调节亚基Striatin3(STRN3)的核心序列(VRRIKMLEY)基础上，通过体外化学改造的方法而获得的一类大环多肽分子，更具体地涉及这种环状多肽的拓扑结构及其具体的制备方法。同时，本发明也囊括该环多肽的突变体和衍生物。本发明中涉及的大环多肽可用于进一步深度开发抑制肿瘤细胞生长和抗肿瘤的药物，因而为癌症的治疗提供了极具商业价值的生物活性先导分子。

Description

用于治疗胃癌的环肽及其药物组合物
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种治疗胃癌的环肽以及药物组合物。
背景技术
胃癌是一种常见的消化系统肿瘤，是仅次于肺癌的发生率全球性癌症。胃癌存在预后较差，死亡率很高，早期诊断困难的特点。新增的胃癌病例超过70％以上是发生在发展中国家，尤其高发于在东南亚地区，包括中国、日本和韩国地区。早期胃癌一般不会发生转移，直接的手术切除病灶有希望治愈。研究数据表明，早期胃癌的5年生存率可以达到71％，但是最晚期胃癌的5年生存率不到4％。由于缺乏早期诊断，在中国超过80％的患者已经处于晚期阶段。因此，在中国，胃癌已经成为癌症死亡的第二号杀手。
胃癌具有很强的器官特异性和高度的异质性，造成不同患者的肿瘤的浸润和转移能力的较大差异，也进而导致预后方面的差异性。胃癌的致病原因极为复杂，与多种因素相关，例如饮食习惯、基因遗传、职业特征、工作压力和幽门螺杆菌感染等。非常遗憾的是，胃癌的分子水平的发病机制目前仍然研究的不够深入，导致针对不同类型的胃癌疾病的诊疗手段也极为匮乏。在胃癌高发地区的中国，发展能够有效正对胃癌诊疗的技术和药物分子是当前的迫切需求。
环肽，例如大环类多肽分子是多肽药物研发领域十分看好的骨架结构。环状骨架的大环多肽能够提高多肽各个方面的生化性质，包括水溶解度的提高、对蛋白酶的稳定性提高、细胞膜通透性的增强和与靶标蛋白结合能力与特异性的提高。目前，全球的多肽药物公司投入大量资源用于开发大环类多肽活性分子，并且有大量环肽药物分子处于临床前或临床测试阶段。相对于传统小分子药物，多肽药物具有安全性高、疗效显著，并且适应性广的特征，因此越来越多地受到广大生物制药公司的青睐。FDA批准的新药中多肽药物增长率是显著高于小分子药物。因此，可以预期多肽类药物的市场需求将愈发强劲。
发明内容
本发明第一方面提供一种氨基酸序列如下式I所示的多肽或其具有抑制癌细胞增殖活性的突变体：
Val-Arg-Arg-X1-Lys-X2-X3-X4-X5
(I)
其中X1选自Cys、Ile、Glu，
X2选自Met和Nle，
X3选自Leu和Val，
X4选自Gly、Cys或无，
X5选自Tyr或无；
其中，所述突变体为在式I所示氨基酸序列中添加一个或几个氨基酸，和/或在除X1到X5位置以外的其它一个或多个位置上发生氨基酸取代或缺失。
在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如下式II所示：
Val-Arg-Arg-X1-Lys-Nle-Leu-X4-X5 (II)。
在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列选自：Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu-Gly，Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu，Val-Arg-Arg-Glu-Lys-Nle-Leu-Gly，Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Cys-Tyr，Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu，Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Gly，Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Cys，或Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu-Cys。
本发明第二方面提供一种修饰的多肽或其突变体，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如本文第一方面所示，所述修饰为在所述多肽或其突变体间隔2个氨基酸残基以上的任意两个氨基酸残基之间具有环化结构；优选地，所述任意两个氨基酸残基之间通过接头基团以-S-和/或酰胺键的方式彼此连接。
在一个或多个实施方案中，所述接头基团为-CO-R-，其中，R不存在，或者选自：-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-、-R1-苯基-亚烷基-、杂环基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-S-R2-NH-；其中苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，R1和R2各自独立是键或任选由1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在第二方面的一些实施方案中，X1和X4至少一个为Cys，并且N端氨基酸的氨基与X1或X4的硫基通过取代或未取代的-CO-R-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，或
X1为Glu，并且N端氨基酸的氨基与X1的α碳原子通过取代或未取代的-CO-R-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，和
-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-、-R1-苯基-亚烷基-、杂环基，其中苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2各自独立是键或任选由1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-、-R1-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-1,4-亚苯基-CH2-、杂环基，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，R1和R2分别是键或任选由1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在一个或多个实施方案中，杂环基是取代或未取代的呋喃、吡格、噻吩、吡唑、咪唑、噻唑、恶唑、三氮唑、吡啶、吡喃、嘧啶、吡嗪、哌嗪、喹啉、吩嗪、萘、蒽，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自C1-C2亚烷基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-、-R1-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-1,4-亚苯基-CH2-，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1是键或任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自亚乙基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-、-R1-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-1,4-亚苯基-CH2-，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1是键或任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的亚乙基。优选地，-R-选自-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-或-R1-1,4-亚苯基-CH2-。
在一个或多个实施方案中，-R-选自亚乙基、
在一个或多个实施方案中，所述多肽C端具有疏水性修饰。所述修饰包括酰胺化修饰和异戊二醇化修饰。优选地，多肽C端的羟基未被取代或被氨基或N-甲基胺基取代。
在一个或多个实施方案中，Arg的侧链胍基具有修饰；所述修饰优选甲基化或酰基化。
在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列是Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu-Gly或Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Cys-Tyr。
在一个或多个实施方案中，所述多肽具有图1和图2的肽1-11、12-14、22-24中任一的结构。
在一个或多个实施方案中，所述多肽具有图1和图2的肽1-3、7-9、10、12-14中任一的结构。
在第二方面的一些实施方案中，X1是Ile，X4选自Gly或无，N端氨基酸的氨基与C端氨基酸通过-CO-R-NH-连接，其中的-NH-取代C端氨基酸的羟基，所述-CO-R-NH-未被取代或被独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基取代，
-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-S-R2、杂环基，其中苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2分别是键或任选被1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2、杂环基，其中亚苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，R1和R2分别是键或任选被1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在一个或多个实施方案中，杂环基是取代或未取代的呋喃、吡格、噻吩、吡唑、咪唑、噻唑、恶唑、三氮唑、吡啶、吡喃、嘧啶、吡嗪、哌嗪、喹啉、吩嗪、萘、蒽，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中
R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的亚乙基。优选地，-R-是-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2。
在一个或多个实施方案中，-R-选自
在一个或多个实施方案中，Arg的侧链胍基具有修饰；所述修饰优选甲基化或酰基化。
在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列是Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Gly或Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Gly。
在一个或多个实施方案中，所述多肽具有图2的肽16-21中任一的结构。
在第二方面的一些实施方案中，X1是Cys，X4是Cys，N端氨基酸的氨基与C端氨基酸通过-CO-R-NH-连接，其中的-NH-取代C端氨基酸的羟基，所述-CO-R-NH-未被取代或被独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基取代，X1的硫基和X4的硫基通过取代或未取代的-R’-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，
-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-S-R2、杂环基，其中亚苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
-R’-是-R1-苯基-R2-，其中苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2分别是键或任选被1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2、杂环基，其中亚苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，-R’-选自-R1-1,2-亚苯基-R2-、-R1-1,3-亚苯基-R2-、-R1-1,4-亚苯基-R2-，其中亚苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，R1和R2分别是键或任选被1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在一个或多个实施方案中，杂环基是取代或未取代的呋喃、吡格、噻吩、吡唑、咪唑、噻唑、恶唑、三氮唑、吡啶、吡喃、嘧啶、吡嗪、哌嗪、喹啉、吩嗪、萘、蒽，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，-R’-选自-R1-1,2-亚苯基-R2-、-R1-1,3-亚苯基-R2-、-R1-1,4-亚苯基-R2-，其中
R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基。
在一个或多个实施方案中，-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，-R’-选自-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-CH2-1,4-亚苯基-CH2-，其中R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的亚乙基。优选地，-R-选自-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2或-CH2-1,4-亚苯基-CH2-。
在一个或多个实施方案中，-R-选自 -R’-选自-CH2-1,3-亚苯基-CH2-。
在一个或多个实施方案中，Arg的侧链胍基具有修饰；所述修饰优选甲基化或酰基化。
在一个或多个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列是Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu-Cys。
在一个或多个实施方案中，所述多肽具有图2的肽25的结构。
本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本文任一实施方案所述的多肽或其突变体，或修饰的多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，本文所述多肽其突变体，或修饰的多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，与其他抑制癌细胞增殖或治疗癌症的试剂联用。所述试剂包括抗微生物疗法、抗病毒疗法、免疫调节性疗法所用试剂、疫苗或癌症化学治疗剂。
本发明还提供本文所述多肽或其突变体，或修饰的多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，的制备方法。
本发明还提供本文所述多肽或其突变体，或修饰的多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，在制备用于抑制癌细胞增殖或治疗或预防癌症的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述癌细胞是胃癌细胞。优选地，所述癌细胞是胃癌细胞HGC-27。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是胃癌。
本发明还提供本文任一实施方案所述多肽或其突变体或药物组合物在抑制胃癌细胞增殖或治疗或预防胃癌中的应用。在一个或多个实施方案中，所述多肽或其突变体或药物组合物与其他抑制癌细胞增殖或治疗癌症的试剂联用。所述试剂包括抗微生物疗法、抗病毒疗法、免疫调节性疗法所用试剂、疫苗或癌症化学治疗剂。
本发明还提供抑制癌细胞增殖或预防、改善或治疗癌症的方法，包括给予有需要的对象治疗有效量的一种或多种本发明任一实施方案所述多肽或其突变体或药物组合物。优选地，所述给予通过注射、口服、透皮吸收的方式给予。在一个或多个实施方案中，所述方法与其他方法联用，所述其他方法包括抗微生物疗法、抗病毒疗法、免疫调节性疗法、疫苗接种或癌症化学治疗。
本发明另一方面提供抑制癌细胞增殖或预防、改善或治疗癌症的试剂盒，该试剂盒包含本发明任一实施方案所述多肽或其突变体或药物组合物以及任选的将所述多肽或其突变体或药物组合物给予对象所需的其他试剂。
本发明也涉及组合，其包含选自本申请所述大环肽的序列，及另一种药剂，诸如抗微生物疗法、抗病毒疗法、另一种免疫调节性疗法、疫苗或癌症化学治疗剂。
附图说明
图1：1,4位环合大环多肽的结构示意图。
图2：1,8位和1,7位环合大环多肽的结构示意图。
图3：示例性线性多肽及其细胞膜透膜结果图。(A)绿色荧光检测多肽在细胞内的分布；(B)可见光检测细胞形态；(C)AB的叠加显示；(D)多肽的结构示意图。
图4：示例性环状多肽及其细胞膜透膜结果图。(A)绿色荧光检测多肽在细胞内的分布；(B)可见光检测细胞形态；(C)AB的叠加显示；(D)多肽的结构示意图。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明涉及能抑制癌细胞增殖活性的多肽，其具有式I所示氨基酸序列Val-Arg-Arg-X1-Lys-X2-X3-X4-X5(II)，其中X1选自Cys、Ile、Glu，X2选自Met和Nle，X3选自Leu和Val，X4选自Gly、Cys或无，X5选自Tyr或无。本文所述多肽可具有环化结构修饰，例如在所述多肽间隔2个氨基酸残基以上的任意两个氨基酸残基之间具有环化结构，形成环肽。所述任意两个氨基酸残基之间通过接头基团以-S-和/或酰胺键的方式彼此连接。所述任意两个氨基酸残基可以是Val与任何一个Cys、与任何一个Glu，或与C末端的氨基酸。在一个优选实施方案中，本文所述多肽或环肽的氨基酸序列如下式II所示：Val-Arg-Arg-X1-Lys-Nle-Leu-X4-X5(II)。本文所述多肽或环肽可以具有突变，例如上式所示氨基酸序列中添加一个或几个氨基酸，还可以是在除X1到X5位置以外的其它一个或多个位置上发生氨基酸取代或缺失。
本文中，“大环多肽”、“环肽”或“环化结构”中的“接头基团”指多肽的氨基酸残基以外的部分，即接头基团的原子不是多肽的氨基酸残基上的原子。例如，所述接头基团可以是-CO-R-，其中，R不存在，或者选自：-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-、-R1-苯基-亚烷基-、杂环基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-S-R2-NH-。R1和R2各自独立是键或任选由1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。本发明的大环多肽具有对胃癌细胞的增殖显著的抑制作用，而且比线性多肽更加容易透过细胞膜。发明提供的多肽的基础结构如Val-Arg-Arg-X1-Lys-X2-X3-X4-X5(式I)所示。式I所示的氨基酸序列中存在一些保守位点，包括第1位置的Val，第2位置的Arg，第3位置的Arg，第5位置的Lys，第6位置(X2)的Met，第7位置(X3)的Leu。这些保守氨基酸可以存在修饰或者结构的类似替代的氨基酸，例如第2位置和第3位置的Arg的侧链官能团可以存在修饰形式(甲基化或者酰基化)，第6位置的Met可以被正亮氨酸Nle替代，第7位点的Leu可以被结构相似的Val替代。本发明还包括在第1、2、3、5、6、7、8位以外的一个或者多个位置发生氨基酸突变的多肽。这种突变形式可以是氨基酸的插入、缺失或者取代。
本发明中涉及具有上述基础结构并含半胱氨酸的环七肽、环八肽和环九肽，其第4位或者第8位点的氨基酸是半胱氨酸，该位点的半胱氨酸与多肽的N端被共价键相连形成大环骨架结构。本发明涉及的骨架多肽的N端和C端的巯基通过S-苯环-S共价相连，连接臂苯环上可以存在不同取代基，例如氟原子、氯原子等。同时，该化学连接臂S-苯环-S还可以被其它方式替代，包括不同链长的二硫键、不同链长和形式的碳碳键、不同链长和形式的硫醚键、不同链长和形式的氧醚键，以及不同链长和形式的杂环结构如三氮唑结构的杂环等。
本发明中还涉及具有上述基础结构并且不含半胱氨酸的环七肽和环八肽，在该结构中，多肽的N端和C端被共价键相连形成大环骨架结构。本发明中的环八肽的第8位甘氨酸可以被不同的氨基酸所替代，这种氨基酸可以是天然的氨基酸，也可以是其它形式的非天然氨基酸。氨基酸可以分为四种类型：(1)酸性的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(3)疏水性氨基酸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；(4)不带电荷的极性氨基酸如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。这里的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都含有苯环，因此也可以归为芳香族的氨酸。在多肽发生突变时，氨基酸发生同一类型的取代通常认为不会对母体多肽的生物学性质发生大的影响。这种突变可以是，如异亮氨酸被亮氨酸或者缬氨酸取代，谷氨酸被天冬氨酸取代，丝氨酸被苏氨酸取代，当然其它结构类似的非天然氨酸取代也不会导致母体多肽的生物活性上大的变化。
本发明的多肽的C端可经修饰形式。例如，多肽的C端可被带有疏水性的分子所修饰，这种修饰包括但并不限制于酰胺化修饰(即为各种有机碱的修饰)和异戊二醇化修饰。
环肽
本发明提供一种包含半胱氨酸的多肽或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐，所述多肽具有式I的氨基酸序列或在所述序列中添加一个或几个氨基酸或除Cys之外的氨基酸经过取代或缺失且能抑制癌细胞增殖的序列，Val-Arg-Arg-X1-Lys-X2-X3-X4-X5(I)，其中
X1选自Cys、Ile，
X2选自Met和Nle，
X3选自Leu和Val，
X4选自Gly、Cys或无，
X5选自Tyr或无，
X1和X4至少一个为Cys，并且N端氨基酸的氨基与X1或X4的硫基通过取代或未取代的-CO-R-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，或者X1为Glu，并且N端氨基酸的氨基与X1的α碳原子通过取代或未取代的-CO-R-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，其中-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-、-R1-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-1,4-亚苯基-CH2-、杂环基，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2分别是键或任选由1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在多肽包含Cys的实施方案中，-R-选自C1-C2亚烷基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-、-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-1,4-亚苯基-CH2-，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基。优选地，-R-选自亚乙基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-、-1,2-亚苯基-CH2-S-R2-、-R1-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-1,4-亚苯基-CH2-，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的亚乙基。更优选地，-R-选自
在多肽包含Cys的实施方案中，多肽的氨基酸序列是Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu-Gly或Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Cys-Tyr。优选地，所述多肽具有图1和图2的肽1-11、12-14、22-24中任一的结构。更优选地，所述多肽具有图1和图2的肽1-3、7-9、10、12-14中任一的结构。
本发明还提供一种不含Cys的多肽或其立体异构体、对映异构体、互变异构体、溶剂合物或药学可接受的盐，所述多肽具有式I的氨基酸序列或在所述序列中取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且能抑制癌细胞增殖的序列，Val-Arg-Arg-X1-Lys-X2-X3-X4(I)，其中
X1是Ile，
X2选自Met和Nle，
X3选自Leu和Val，
X4选自Gly或无，
N端氨基酸的氨基与C端氨基酸通过-CO-R-NH-连接，其中的-NH-取代C端氨基酸的羟基，所述-CO-R-NH-未被取代或被独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基取代，其中，-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2、杂环基，其中亚苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2分别是键或任选被1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
在多肽不包含Cys的实施方案中，-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基。优选地，-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的亚乙基。更优选地，-R-选自
在多肽不包含Cys的实施方案中，所述多肽的氨基酸序列是Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Gly或Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Gly。优选地，所述多肽具有图2的肽16-21中任一的结构。
如本文所用，术语“烷基”单独或与其它术语组合使用，是指饱和脂肪族烷基，包括1-20个碳原子的直链或支链烷基。优选地，烷基是指含有1-10个碳原子的中等烷基，如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基及类似烷基。更优选地，是指含有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基及类似烷基。烷基可以被取代也可不被取代。当被取代时，取代基个数为1个或多个，优选1-3个，更优选1个或2个，取代基团独立地选自包括卤素、羟基、低级烷氧基、芳基。
如本文所用，术语“芳”、“芳基”单独或与其它术语组合使用，是指含有6-14个碳原子的芳香环基团(例如六元单环、十元双环或十四元三环体系)，示例性的芳基包括苯基、萘基、联苯基、茚基及蒽基。本文所述“亚苯基”指具有两个取代基的苯基。芳基可选地被一个或多个取代基取代，取代基独立地选自卤素、烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-氨基、单或二烷基胺基、羧基或N-磺酰胺基。具体地，苯基或亚苯基可任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代。
如本文所用，术语“烷氧基”是指-O-(无取代烷基)和-O-(无取代环烷基)。代表性例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基以及类似结构。
如本文所用，术语“环烷基”是指三到八元全碳单环、全碳五元并六元或六元并六元双环或多并环(“并”环体系是指体系中每两个环共用相邻的一对碳原子)，其中一个或多个环可能含有一个或多个双键，但任一环都不具有完整的耦合pi电子体系。
如本文所用，术语“杂环基”是指三到八元由碳原子及非碳杂原子构成的环状结构，常见的杂原子有氮、氧和硫等。示例的杂环基包括呋喃、吡格、噻吩、吡唑、咪唑、噻唑、恶唑、三氮唑、吡啶、吡喃、嘧啶、吡嗪、哌嗪、喹啉、吩嗪、萘、蒽等。
如本文所用，术语“取代”，是指一个化合物具有取代基，该取代基至少包含一个带有一个或多个氢原子的碳原子、氮原子、氧原子或硫原子。如果一个取代基被描述为被“取代”，是指一个非氢取代基占据了一个碳、氮、氧、或硫上的一个氢的位置。举例来说，一个取代的烷基取代基是指其中至少有一个非氢取代基占据了烷基上一个氢的位置。进一步说明，单氟烷基是指被一个氟取代的烷基，二氟烷基是指被两个氟取代的烷基。
本发明公开的化合物或其药学上可接受的盐可以包括一个或多个非对称中心，因此会存在对映异构体、非对映异构体以及其它可以被定义的立体异构体形式，根据立体化学可分为(R)-或(S)-、用于氨基酸的(D)-或(L)-。本发明意为包括所有这些可能的异构体，以及外消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以通过手性合成子或手性试剂制备，或用通常的技术如使用手性柱的高效液相来分离制备。当本发明所述的化合物含有烯族双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，则其意为该化合物包括E和Z几何异构体。同样地，所有的互变异构体也包括在内。
本文所述“药学上可接受的盐”包括酸式盐和碱式盐。
“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fiimaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、2-萘磺酸、1-萘酚-2-甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。
“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、N,N'-双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
通常结晶会产生所公开化合物的溶剂化产物。当在本文中使用时，术语“溶剂化物”是指一种包含了一种或多种本专利公开的化合物分子与一种或多种溶剂分子的聚合物。溶剂可能是水，此时溶剂化物可能是水合物。可选地，溶剂还可能是有机溶剂。因此，本专利公开的化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构，还可作为相应的溶剂化产物存在。本发明公开的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明公开的化合物也可以是仅保有一部分水，或者是保有水与一些溶剂的混合物。
药用组合物
本文还提供一种药物组合物，该药物组合物中含有本文所述的多肽以及药学上可接受的辅料。本文中，“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体、稀释剂和/或赋形剂，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于植物提取成分或核酸给药的辅料。
通常，药物组合物中含有治疗有效量的本文所述试剂。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。
本发明中所涉及的药物组合中可以包含有药学上能够使用的载体。这种载体主要包括治疗剂给药所用的载体，例如赋形剂和稀释剂。这种载体通常并不是活性成份的必要组成部分，并且对于人体或者动物没有严重的毒性作用。这种载体是药剂学普通技术人员所熟悉的常用载体，并且载体也包括液体，如水、盐水、缓冲盐。当然，载体还可能包含其它辅助性的物质，例如pH缓冲剂、填充剂、助流剂、润滑剂、润湿剂等。
本文所述多肽或药物组合物可与其他治疗胃癌的试剂联用。本领域技术人员可确定其他治疗胃癌的试剂的给药剂量。
制备方法
本发明的氨基酸序列可以是通过化学合成而获得的大环多肽。化学合成多肽可以是通过多肽化学方法获得的氨基酸序列，例如常用的固相和液相多肽合成。固相合成主要指但是并不限制于Fmoc和tBoc两种方法。固相合成中使用的树脂一般为不溶解的固相载体，氨基酸的拼接方式是从C端(羧酸端)向N端(氨基端)逐个将氨基酸进行拼接。每个氨基酸的拼接过程包括三个基本的反应步骤：1)脱保护：氨基酸的N端保护基被脱保护试剂去除；2)活化：拼接的氨基酸的羧酸端被转化为一种活化酯或者活化酰胺的形态；和3)偶联：活化的氨基酸与树脂表面的多肽的N端胺基发生成酰胺键反应。该过程反复循环直至多肽链延升完成。最后，线性的多肽载体从树脂上通过酸性的切割液被解离，获得所需的线性多肽。线性多肽经过高效液相色谱进行纯化。纯化的线性多肽在液相中经过化学修饰获得目标环状的多肽分子。示例性的具体合成方法例如实施例1-5中所示。这种多肽的合成可以是手动合成和机器的自动合成，多肽的机器固相合成可以但是并不限制于CS Bio公司的UVOnline Monitor系统、Protein Technologies公司推出的Tribute双通道多肽合成仪，和Aapptec公司推出的FocusXC三通道合成仪等。
方法和用途
本发明包括多肽或药物组合物在治疗或预防胃癌中的用途。本发明还涉及治疗或预防胃癌的方法。该方法包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的本文所述的多肽或药物组合物。本发明还涉及治疗或预防胃癌的试剂盒，该试剂盒包含本文所述的多肽或药物组合物。本发明还涉及本文所述的多肽或药物组合物在制备用于治疗或预防胃癌的试剂盒中的应用。
具体而言，“有效量”指的是对人或者动物能够产生治疗功能的，并且能够被动物和人所接受的注射量。例如，在液体的组合药物中，多肽的浓度可以是20ng/mL以上、50ng/mL、100ng/mL以上等。
本发明中药物的给药方式可以包括但是并不限制于皮下注射、经皮注射、植入、局部给药、肌肉注射、缓释给药和口服等。本领域技术人员知晓在不同给药方式、剂量、给药部位等情况下将药物给予对象所需的其他试剂。例如敷料、溶剂(如水)等。
本发明中，胃癌可以是现有技术所分类的不同形式的胃癌，如形态上的早期胃癌和进展期胃癌；组织病理上的腺癌、鳞癌、类癌和腺鳞癌等绝大多数胃癌；发病部位上的胃底贲门癌、胃窦癌和胃体癌等；分子分型上的EBV感染型、基因组稳定型、微卫星不稳定性和染色体不稳定型；致病原因上的幽门螺杆菌感染引发性质胃癌等。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
实施例1，N端第4位为半胱氨酸的一系列大环多肽
1.1、以多肽序列VRRCKMLG为起点(在这里，将Met换成Nle，N末端Val被巯基丙酸修饰)，多肽的第4位Cys残基侧链巯基与N端的巯基丙酸的巯基通过不同的小分子反应共价相连，这里展示小分子的但是不局限于1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯。通过侧链巯基的修饰，形成三种不同特征结构的大环多肽分子，具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
(1)溶胀树脂：称量91mg Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。(3)氨基酸的偶联：称量40mgFmoc-Gly-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。重复(2)-(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(2)。接着称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)环化：将线性多肽与3种不同的小分子进行环化，得到3种不同的结构的环状多肽。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中。其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其分别溶于0.1mL DMF中。然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组混合液。在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，每组反应液中加入10uL0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀。3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化。制备方法与上述线性多肽制备方法相同。这里，我们得到了纯度大于96％的三种不同结构的环状多肽，分别命名为肽1、肽2、肽3。
1.2、以多肽序列VRRCKML为起点(在这里，将Met换成Nle，N末端Val被巯基丙酸修饰)，多肽的第4位Cys残基侧链巯基与N端的巯基丙酸的巯基通过不同的小分子反应共价相连，这里展示小分子的但是不局限于1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯。通过侧链巯基的修饰，形成三种不同特征结构的大环多肽分子，具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
(1)溶胀树脂：称量91mg Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。(3)氨基酸的偶联：称量48mgFmoc-Leu-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。重复(2)-(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(2)。接着称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)环化：将线性多肽与3种不同的小分子进行环化，得到3种不同的结构的环状多肽。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中。其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其分别溶于0.1mL DMF中。然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组混合液。在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，每组反应液中加入10uL0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀。3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化。制备方法与上述线性多肽制备方法相同。这里，我们得到了纯度大于96％的三种不同结构的环状多肽，分别命名为肽4、肽5、肽6。
1.3、以多肽序列VRRCKMLG为起点(在这里，我们将Met换成Nle，其中N末端Val分别被4-(溴甲基)苯甲酸、4-(溴甲基)苯乙酸、3-(溴甲基)苯甲酸、2-(氯甲基)苯甲酸但不限于这些分子修饰)，多肽的第4位的Cys残基侧链巯基与N末端连接的小分子苯环上的溴原子或氯原子进行分子内自取代反应，从而形成四种不同结构的环状多肽，具体实验方法如下：
线性多肽的固相合成
(1)溶胀树脂：称量4组91mg Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30umol)加入到4个固相合成管中，分别加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。(3)氨基酸的偶联：称量40mg Fmoc-Gly-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。重复(2)(3)(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(2)。然后，称取29mg 4-(溴甲基)苯甲酸(4.5eq)，19mg Oxyma(4.5eq)，21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中；称取31mg 4-(溴甲基)苯乙酸(4.5eq)，19mg Oxyma(4.5eq)，21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中；称取29mg 3-(溴甲基)苯乙酸(4.5eq)，19mg Oxyma(4.5eq)，21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中；称取23mg 2-(氯甲基)苯乙酸(4.5eq)，19mg Oxyma(4.5eq)，21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中。将含有4种不同小分子的反应液分别加入到4个固相合成管中，金属浴37℃，反应2次，每次反应1h。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂肽依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)将上述所得到的4种结构不同的线性多肽用相同的环化方法对其进行环化。首先，称取2.5mg N末端Val被4-(溴甲基)苯甲酸修饰的线性多肽，溶解在含有2mL DMF和1mLH2O的混合溶液中，用1M的NH4CO3调节pH至8.0。然后，在室温下振荡反应，HPLC跟踪反应进程。1h后反应结束，反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，制备方法与上述线性多肽制备方法相同，得到纯度大于96％的环状多肽，命名为肽7。接着我们用相同的环化方法对其他3种线性多肽进行环化，经过分离纯化后得到纯度大于96％的3种环状多肽，分别命名为肽8、肽9、肽10。
实施例2，N端第4位为Glu的大环多肽
以多肽序列VRRIKMLG为起点，(在这里，Met换成Nle,I换成Fmoc-Glu(OAll)-OH，其侧链氨基为OAll所保护)，选择性脱除Alloc后，Glu的侧链羧酸可与N末端Val的氨基进行分子内酰胺化环化。
线性多肽的固相合成
(1)溶胀树脂：称量91mg Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。(3)氨基酸的偶联：称量40mgFmoc-Gly-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。重复(2)(3)(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。接到最后一个Val时，需要脱去保护基Fmoc后，用DMF清洗3次。
线性多肽OAll的脱除及分子内环化
称取36mg pd(pph3)4(1.1eq)溶解在1.2ml四氢呋喃中，再加入90uLN-甲基苯胺(27eq)，混合均匀，吸入到树脂中去，常温避光反应2h。反应结束后，依次用DMF清洗3次，DMF配制的0.5％NaS2CN(C2H5)溶液清洗6-8次，DCM清洗2次，DMF清洗2次，洗涤树脂至棕色消失。称取78.2mg PyAOP(5eq),21mg HOAT(5eq),溶解在1.5ml DMF中，再加入34uL NMM(10eq),常温反应4h，反应结束后用DMF清洗3次。
环状多肽的切割与纯化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂肽依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到纯度大于96％的环状肽。这里我们命名为肽11。
实施例3，N端第8位为半胱氨酸的大环多肽
以多肽序列VRRIKMLCY为起点(在这里，我们将Met换成Nle，其中N末端Val被巯基丙酸修饰)，多肽的Cys残基侧链巯基与N端的巯基通过不同的小分子反应共价相连，这里展示小分子的但是不局限于1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯。通过侧链巯基的修饰，形成三种不同特征结构的大环多肽分子，具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
(1)溶胀树脂：称量91mg Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。(3)氨基酸的偶联：称量62Fmoc-Tyr(tbu)-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。重复(2)(3)(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(2)。接着称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)环化：将线性多肽与3种不同的小分子进行环化，得到3种不同的结构的环状多肽。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中。其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其分别溶于0.1mL DMF中。然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组混合液。在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，每组反应液中加入10uL0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀。3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化。制备方法与上述线性多肽制备方法相同。这里，我们得到了纯度大于96％的三种不同结构的环状多肽，分别命名为肽12、肽13、肽14。
实施例4，N端和C端共价相连的一系列大环多肽
5.1、以多肽序列VRRILML为起点，(在这里，我们将Met换成Nle，其中N末端Val被巯基丙酸修饰，C末端被2-氨基乙硫醇修饰)，多肽C末端的巯基与N端的巯基通过不同的小分子共价相连。这里展示小分子的但是不局限于1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯。通过侧链巯基的修饰，形成三种不同特征结构的大环多肽分子，具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
(1)修饰2Cl(Trt)-Cl树脂：称量75mg 2-Cl-Trt-Cl Resin(载量0.4mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL含有30％TFA的DCM溶液。常温振荡反应5min，用DCM洗涤树脂3次，树脂变成深红色或黑色。再将2.75mg的2-氨基乙硫醇溶于DCM后与树脂混合，振荡反应2次，每次反应5min，树脂变为正常的黄色，表明2-氨基乙硫醇已经接上。用DCM洗涤树脂，然后加入2mL封闭试剂(DCM:MeOH:DIEA＝17:2:1)，振荡反应20min，最后用DMF洗涤树脂3次。 (2)溶胀树脂：向第一步处理的树脂中加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(3)氨基酸的偶联：称量48Fmoc-Leu-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。(5)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。重复(3)(4)(5)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(5)。接着称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂肽依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)环化：将线性多肽与3种不同的小分子进行环化，得到3种不同的环状多肽。线性多肽分别与1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯3种小分子进行环化。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中。其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其分别溶于0.1mL DMF中。然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组混合液，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，每组反应液中加入10uL0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀。3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，制备方法与上述线性多肽制备方法相同。这里，我们得到了纯度大于96％三种不同结构的环状多肽，分别命名为肽16、肽17、肽18。
5.2、以多肽序列VRRILMLG为起点，(在这里，我们将Met换成Nle，其中N末端Val被巯基丙酸修饰，C末端被2-氨基乙硫醇修饰)，多肽C末端的巯基与N端的巯基通过不同的小分子共价相连。这里展示小分子的但是不局限于1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯。通过侧链巯基的修饰，形成三种不同特征结构的大环多肽分子，具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
(1)修饰2Cl(Trt)-Cl树脂：称量75mg 2-Cl-Trt-Cl Resin(载量0.4mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL含有30％TFA的DCM溶液。常温振荡反应5min，用DCM洗涤树脂3次，树脂变成深红色或黑色。再将2.75mg的2-氨基乙硫醇溶于DCM后与树脂混合，振荡反应2次，每次反应5min，树脂变为正常的黄色，表明2-氨基乙硫醇已经接上。用DCM洗涤树脂，然后加入2mL封闭试剂(DCM:MeOH:DIEA＝17:2:1)，振荡反应20min，最后用DMF洗涤树脂3次。 (2)溶胀树脂：向第一步处理的树脂中加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(3)氨基酸的偶联：称量40Fmoc-Gly-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。(5)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。重复(3)(4)(5)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(5)。接着称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂肽依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)环化：将线性多肽与3种不同的小分子进行环化，得到3种不同的环状多肽。线性多肽分别与1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯3种小分子进行环化。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中。其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其分别溶于0.1mL DMF中。然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组混合液，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，每组反应液中加入10uL0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀。3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，制备方法与上述线性多肽制备方法相同。这里，我们得到了纯度大于96％三种不同结构的环状多肽，分别命名为肽19、肽20、肽21。
5.3、以多肽序列VRRILMLC为起点(在这里，我们将Met换成Nle，其中N末端Val被巯基丙酸修饰)，多肽C末端Cys残基侧链巯基与N端的巯基通过不同的小分子共价相连。这里展示小分子的但是不局限于1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯。通过侧链巯基的修饰，形成三种不同特征结构的大环多肽分子，具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
(1)溶胀树脂：称量91mg Rink Amide-AM Resin(载量0.33mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(2)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。(3)氨基酸的偶联：称量56mgFmoc-Cys(Trt)-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。重复(2)(3)(4)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(2)。接着称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂肽依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)环化：将线性多肽与3种不同的小分子进行环化，得到3种不同的环状多肽。线性多肽分别与1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯三种小分子进行环化。首先，称取3组2.5mg的线性多肽，将其分别溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中。其次，称取6.3mg的1,2-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,3-二(溴甲基)苯、6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其分别溶于0.1mL DMF中。然后，将3组含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与三种含有不同小分子的DMF溶液混合，得到3组混合液，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，每组反应液中加入10uL0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀。3组反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，制备方法与上述线性多肽制备方法相同。在这里，我们得到了纯度大于96％的三种不同结构的环状多肽，分别命名为肽22、肽23、肽24。
5.4、以多肽序列VRRCKMLC为起点，(在这里，我们将Met换成Nle，其中N末端Val被巯基丙酸修饰，C末端被2-氨基乙硫醇修饰)，多肽C末端的巯基与N端的巯基通过不同的小分子共价相连。这里展示小分子的但是不局限于1,2-二(溴甲基)苯、1,3-二(溴甲基)苯、1,4-二(溴甲基)苯。具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
(1)修饰2Cl(Trt)-Cl树脂：称量75mg 2-Cl-Trt-Cl Resin(载量0.4mmol/g,30umol)加入到固相合成管中，加入2mL含有30％TFA的DCM溶液。常温振荡反应5min，用DCM洗涤树脂3次，树脂变成深红色或黑色。再将2.75mg的2-氨基乙硫醇溶于DCM后与树脂混合，振荡反应2次，每次反应5min，树脂变为正常的黄色，表明2-氨基乙硫醇已经接上。用DCM洗涤树脂，然后加入2mL封闭试剂(DCM:MeOH:DIEA＝17:2:1)，振荡反应20min，最后用DMF洗涤树脂3次。(2)溶胀树脂：向第一步处理的树脂中加入2mL的DMF溶液，常温振荡反应15min。(3)氨基酸的偶联：称量40Fmoc-Cys(Acm)-OH(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤3次。(4)封闭：未反应的氨基被含有乙酸酐/2,4-二甲基吡啶/DMF(5:6:89)的封闭试剂封闭。常温反应2min后，用DMF彻底洗涤树脂。(5)Fmoc去保护：在合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液，常温反应10min，弃去溶液，再向合成管中加入1mL 20％哌啶/DMF混合溶液常温反应10min,最后将树脂用DMF洗涤5次。重复(3)(4)(5)的步骤，逐一依次将相应氨基酸进行缩合，序列中两个Cys采用Fmoc-Cys(Acm)-OH进行拼接。值得注意的是，当多肽序列中最后一个氨基酸Val反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，进行步骤(4)(5)。接着称取47mg巯基丙酸(4.5eq)、19mg Oxyma(4.5eq)、21uL DIC(4.5eq)溶解在1mL的DMF中，混匀后加入到固相合成管中，金属浴55℃，反应40min。反应结束后用DMF洗涤树脂3次。
线性多肽的切割、纯化与头尾环化
(1)切割：将上一步实验所得到的树脂转移至玻璃合成管中，把多肽从树脂上切割下来。树脂肽依次用DMF,DCM分别洗涤2次后，自然干燥15min。将2mL的切割试剂(TFA:苯酚:水:TIPS＝88:5:5:2(v/v))加入玻璃合成管中，常温反应2h。收集切割液，用冰乙醚沉淀3次，得到粗肽。(2)纯化：将得到的粗肽溶于水中，过滤，滤液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，流动相为A:90％水+10％乙腈+0.1％TFA，B:90％乙腈+10％水+0.1％TFA，体积比；流速为3mL/min；检测波长为：210nm.以流动相B/％(2→2→90→90→90),Time/min(0→2→30→35→40)的梯度收集样品峰，样品峰经冷冻干燥后得到线性肽的纯肽。(3)环化：将线性多肽与1,4-二(溴甲基)苯进行环化，得到头尾环状多肽。首先，称取2.5mg的线性多肽，将其溶解在1mL的Tris-HCl(100mM,pH 8.0)中。其次，称取6.3mg的1,4-二(溴甲基)苯，将其分别溶于0.1mL DMF中。然后，将含有线性多肽的Tris-HCl溶液分别与含有小分子的DMF溶液混合，在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，反应液中加入10uL 0.6M的HCl淬灭反应，离心去除固体沉淀。反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，制备方法与上述线性多肽制备方法相同。这里，我们得到了纯度大于96％头尾环状多肽(序列内两个Cys侧链巯基被Acm保护)。
Cys侧链Acm脱除
首先，称取10mg上一步头尾线性多肽，将其溶解在3mL的乙酸/水(1:1,体积比)中，加入30mg AgOAc。常温反应10小时后，加入18mL 1M DTT溶液(1MDTT，0.2M Na2HPO4，6MGn·HCl)。常温反应30分钟后，离心去除沉淀。上层清液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，冷冻干燥后获得4mg Acm脱除的头尾环化肽，产率大约4％。
Cys侧链环化
首先，将上一步获得的4mg多肽溶解于1mL的DMF/H2O(2：1，体积比)中。其次，取0.4mg 1,3-二(溴甲基)苯，溶于0.1mL DMF中。然后，将含有多肽的DMF/H2O溶液与含有小分子的DMF溶液混合，pH调节至8.0(用1MNH4HCO3调节)。在室温下振荡反应2h，HPLC跟踪反应。反应结束后，反应液经HPLC反相C18柱进行分离纯化，制备方法与上述线性多肽制备方法相同。这里，我们得到了1mg纯度大于96％双环肽25，产率为25％。命名为肽25。
实施例5，大环多肽对胃癌细胞增殖的影响
细胞培养实验：HGC-27细胞(从市售途径获得)培养于RPMI1640(Invitrogen)培养液中，培养液中添加10％血清，100ug/ml盘尼西林，100μg/ml链霉素。细胞于37℃培养，二氧化碳浓度为5％。
细胞增殖实验：使用ATP细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖(碧云天公司CellTiter-LumiTMPlus发光法细胞活力检测试剂盒)。在一块壁不透明的96孔板上准备好带培养基的细胞，100μl/孔，细胞数3000/孔，待第二天贴壁后加不同浓度的TB(0，1，2，4μM),同时准备只含培养基不含细胞的对照孔，以得到背景发光值。48h后用碧云天的CellTitter试剂测定细胞活力。将平板及其内容物平衡到室温，大约需要30分钟。向每孔中加入与细胞培养基体积相等的CellTiter-LumiTM试剂100μl。在一个定轨振荡器上混合内容物2分钟，诱导细胞裂解，然后将平板室温孵育10分钟，使萤光信号值稳定，记录发光信号。利用Graphpad Prism软件处理数据，获得IC50数值。
由以上结果可知，大环多肽对于胃癌细胞HGC-27具有杀伤效果。
实施例6，大环多肽的细胞膜渗透性实验
我们选取了一组在胃癌细胞中活性表现较好的一个环肽肽3，来探讨线性肽与环肽在细胞中的细胞膜渗透性。这里选取Hela细胞来探究二者细胞膜渗透性的差异。首先需要合成两条多肽：一条被FAM修饰的肽3的线性肽，一条被FAM修饰的肽3的环肽。肽的结构如图3和图4所示。然后将合成的多肽与Hela细胞共孵育，再用激光共聚焦显微镜来观察多肽的细胞膜渗透性，具体实验过程如下：
线性多肽的固相合成
根据实施例1肽3的合成方法合成多肽，其中C末端的K被OAll所保护，目的是为了在其侧链上加荧光素FAM。(2)当氨基酸逐个偶联之后，需要将C末端的Lys上侧链的保护基脱掉：称取36mg pd(pph3)4(1.1eq)溶解在1.2ml四氢呋喃中，再加入90uLN-甲基苯胺(27eq)，混合均匀，吸入到树脂中去，常温避光反应2h。反应结束后，依次用DMF清洗3次，DMF配制的0.5％NaS2CN(C2H5)溶液清洗6-8次，DCM清洗2次，DMF清洗2次，洗涤树脂至棕色消失。(3)接荧光素：称取56mg(5eq)的5-(6)羧酸荧光素、78mg PyBop(5eq)、33uL NMM(5eq)溶于2mL的DMF中，混合加入树脂中，避光常温过夜反应。反应结束后，用DMF洗涤树脂，再向合成管中加入20％哌啶/DMF溶液反应2次，每次10min。
线性多肽的切割、纯化与环化
线性肽的切割、纯化与环化也均与肽3的实验方法相同，我们只选择了1,4-二(溴甲基)苯这一种小分子与线性肽进行环化。在这里我们得到了两条多肽，一条是被FAM修饰的线性肽，一条是被FAM修饰的与1,4-二(溴甲基)苯小分子进行环化的环肽3。
细胞膜渗透性实验
将HeLa细胞培养于DMEM(Hyclone)培养液中，培养液中添加10％血清,1‰双抗。共分为两皿细胞，细胞于37℃培养，二氧化碳浓度为5％。在细胞培养箱中过夜培养后，向其中一皿细胞中加入1％培养液体积的10uM的线性多肽溶液，向另外一皿细胞中加入1％培养液体积的10uM的环肽溶液，线性多肽与环肽均用DMSO溶解。然后再在37℃，二氧化碳浓度为5％的细胞培养箱中培养2h。最后利用激光共聚焦显微镜观察线性肽与环肽在细胞里的分布情况，即细胞膜渗透性。结果如图3和图4所示。通过结果可以得出，环状多肽比线性多肽更加容易透过细胞膜。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种氨基酸序列如下式I所示的多肽或其具有抑制癌细胞增殖活性的突变体：
Val-Arg-Arg-X1-Lys-X2-X3-X4-X5 (I)
其中X1选自Cys、Ile、Glu，
X2选自Met和Nle，
X3选自Leu和Val，
X4选自Gly、Cys或无，
X5选自Tyr或无；
其中，所述突变体为在式I所示氨基酸序列中添加一个或几个氨基酸，和/或在除X1到X5位置以外的其它一个或多个位置上发生氨基酸取代或缺失。
2.如权利要求1所述的多肽或其突变体，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如下式II所示：
Val-Arg-Arg-X1-Lys-Nle-Leu-X4-X5 (II)。
3.如权利要求1所述的多肽或其突变体，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自：
Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu-Gly，
Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu，
Val-Arg-Arg-Glu-Lys-Nle-Leu-Gly，
Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Cys-Tyr，
Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu，
Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Gly，
Val-Arg-Arg-Ile-Lys-Nle-Leu-Cys，或
Val-Arg-Arg-Cys-Lys-Nle-Leu-Cys。
4.一种修饰的多肽或其突变体，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如权利要求1-3中任一项所示，所述修饰为在所述多肽或其突变体间隔2个氨基酸残基以上的任意两个氨基酸残基之间具有环化结构；优选地，所述任意两个氨基酸残基之间通过接头基团以-S-和/或酰胺键的方式彼此连接。
5.如权利要求4所述的修饰的多肽或其突变体，其特征在于，所述接头基团为-CO-R-，其中，R不存在，或者选自：-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-、-R1-苯基-亚烷基-、杂环基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-S-R2-NH-；
其中苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2各自独立是键或任选由1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
6.如权利要求4或5所述的修饰的多肽或其突变体，其特征在于，
(1)X1和X4至少一个为Cys，并且N端氨基酸的氨基与X1或X4的硫基通过取代或未取代的-CO-R-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，或
X1为Glu，并且N端氨基酸的氨基与X1的α碳原子通过取代或未取代的-CO-R-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，和
-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-、-R1-苯基-亚烷基-、杂环基，其中苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2各自独立是键或任选由1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基，
优选地，所述多肽C端具有疏水性修饰；
(2)X1是Ile，
X4选自Gly或无，
N端氨基酸的氨基与C端氨基酸通过-CO-R-NH-连接，其中的-NH-取代C端氨基酸的羟基，所述-CO-R-NH-未被取代或被独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基取代，
-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-S-R2、杂环基，其中苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2分别是键或任选被1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基，
或
(3)X1是Cys，
X4是Cys，
N端氨基酸的氨基与C端氨基酸通过-CO-R-NH-连接，其中的-NH-取代C端氨基酸的羟基，所述-CO-R-NH-未被取代或被独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基取代，
X1的硫基和X4的硫基通过取代或未取代的-R’-连接，取代基独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基，
-R-选自-R1-O-R2-、-R1-S-R2-、-R1-S-、C1-C3亚烷基、C2-C3亚烯基、C2-C3亚炔基、-R1-S-亚烷基-苯基-亚烷基-S-R2、杂环基，其中苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
-R’-是-R1-苯基-R2-，其中苯基任选被1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，
R1和R2分别是键或任选被1-6个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C3亚烷基。
7.如权利要求4或5所述的修饰的多肽或其突变体，其特征在于，
(1)-R-选自C1-C2亚烷基、-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-、-R1-1,2-亚苯基-CH2-、-R1-1,3-亚苯基-CH2-、-R1-1,4-亚苯基-CH2-，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1是键或任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基，或
(2)-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，其中R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基，或
(3)-R-选自-R1-S-CH2-1,2-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,3-亚苯基-CH2-S-R2、-R1-S-CH2-1,4-亚苯基-CH2-S-R2，其中亚苯基任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代，-R’-选自-R1-1,2-亚苯基-R2-、-R1-1,3-亚苯基-R2-、-R1-1,4-亚苯基-R2-，其中R1和R2分别是任选由1-4个独立选自C1-C3烷基、卤素和羟基的基团取代的C1-C2亚烷基。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-7中任一项所述的多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的辅料。
9.权利要求1-7中任一项所述的多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，在制备用于抑制癌细胞增殖或治疗或预防癌症的药物中的应用，优选地，所述癌细胞是胃癌细胞，所述癌症是胃癌。
10.一种抑制癌细胞增殖或预防、改善或治疗癌症的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-7中任一项所述的多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，和任选的将所述多肽或其突变体，或其药学上可接受的盐，给予对象所需的试剂。
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