CN118121757A - 一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球、其制备方法及应用。所述制备方法包括如下步骤：将可降解激活材料加入二氯甲烷中进行搅拌溶解，然后再加入可降解骨材料进行分散悬浮，得到有机相；将胶原加入乙酸中进行搅拌溶解，得到分散相；或，将聚乙烯醇加入水中进行搅拌溶解，得到分散相；将所述有机相滴加至所述分散相，滴加期间持续搅拌，完成后静置并离心收集沉淀；将所述沉淀依次洗涤、干燥，得到纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球。所述制备方法的工艺步骤简单，成本低廉，易于实现，适合大量制备，利于产业化和工业化生产应用；得到的微球粒径分布均一且分布较窄，形态规整，体系稳定性佳；另外，本发明得到的微球其细胞相容性佳，且均能刺激胶原进行生成，可应用于面部填充，改善褶皱等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球、其制备方法及应用。
背景技术
在人口老龄化加深、居民消费水平不断上升、年轻一代对医美接受度提高以及政府监管层对医美行业整治使得消费者信心提升等综合作用下，“抗衰”成为一项进阶需求，医疗美容需求激增。用于医疗美容的可注射真皮填充物的使用量急剧增加，已成为矫正轮廓缺陷和增强软组织的一种非常流行的方法，因为它们通常比大多数面部美容手术安全、有效、侵入性小、成本低。
中国专利文献CN109010910B公开了一种可注射左旋聚乳酸微球的制备方法，该方法为一步合成乳化法，但未对PLLA微球及其粒径进行质量控制，PLLA微球颗粒密度不均一。
也正基于此，提出本发明技术方案。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明的方案是提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备有机相：将可降解激活材料加入二氯甲烷中进行搅拌溶解，然后再加入可降解骨材料进行分散悬浮，得到有机相；
(2)制备分散相：将胶原加入乙酸中进行搅拌溶解，得到分散相；或，将聚乙烯醇加入水中进行搅拌溶解，得到分散相；
(3)乳化制粒：将所述有机相滴加至所述分散相，滴加期间持续搅拌，完成后静置并离心收集沉淀；将所述沉淀依次洗涤、干燥，得到纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球。
优选地，步骤(1)中：
所述可降解激活材料为PLLA、PLGA中的一种或两种的组合；
和/或，所述可降解骨材料为羟基磷灰石。
为便于理解，对相关材料进行更进一步地解释：
左旋聚乳酸(Po1y-L-1actic Acid，PLLA，CAS号：33135-50-1)和聚乳酸羟基乙酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic Acid，PLGA，CAS号：26780-50-7)是重要的生物可降解高分子材料，特点是无毒、无刺激性、可生物降解吸收、强度高、可塑性好、易加工成型。这种可降解材料注射后在体内分解为左旋乳酸，与人体中天然的乳酸完全相同，能够有效激发皮肤成纤维细胞的活力，刺激肌体自身胶原再生以填补凹陷的部位，并改善面部皱纹及肤质，可实现容积轮廓改变以及抗衰老的全方位面部年轻态。PLLA材料的降解特性较迟缓，降解周期长，为3-24个月；PLGA降解周期短，为1-6个月，降解较PLLA迅速。
羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAp，CAS号：1306-06-5)，是钙磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))的自然矿物化。HAp是无机陶瓷矿物体系中的一类重要矿物，它是人体及其他哺乳动物的骨骼和牙齿的主要矿物成分，也是影响其硬度和强度的主要因素。因其独特的结构和固有的生物相容性、生物可降解性、生物活性、非免疫原性、非炎性、高骨传导性和骨诱导作用，在许多领域引起了广泛的关注。是一种非常有价值的医用材料，可作为骨修复材料及作为高降解率的生物植入材料的生物相容性涂层。
优选地，所述PLLA的分子量为8000～15000Da，所述PLGA的分子量为14000～16000Da。
优选地，步骤(1)中：
可降解激活材料在有机相中的浓度为50g/L；
和/或，可降解骨材料在在有机相中的浓度为1～5g/L。
优选地，步骤(1)中，所述分散悬浮的方式为：先以800r/min的速率磁力搅拌30min，然后再超声分散10min。
优选地，步骤(2)中：
所述胶原或所述聚乙烯醇在分散相中的浓度均为1g/L；
和/或，所述搅拌溶解的速率为200～400r/min，搅拌的时间为4～12h。
其中，胶原(Collagen，CAS号：9064-67-9)是人体和皮肤中最主要的蛋白质，是细胞外基质的主要组成部分，不仅具有重要的结构支撑作用，而且是一种在不同细胞水平上相互作用的功能性蛋白质。胶原蛋白的流失、解体和断裂伴随细胞外基质其他成分的变化，在皮肤衰老中起着关键作用。同时胶原纤维的断裂削弱了它与成纤维细胞的相互作用，诱导细胞形态的改变，从而使面部出现皱纹或凹陷。
优选地，步骤(3)中：
所述有机相和分散相的体积比为1:10～50；
和/或，滴加期间持续搅拌的速率为200～1000r/min，搅拌的时间为4～6h；
和/或，所述静置的时间为12～14h；
和/或，所述离心的转速为8500r/min，离心的时间为10min，离心次数为3次。
基于相同的技术构思，本发明的再一方案是提供一种由上述制备方法得到的纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球。
基于相同的技术构思，本发明的再一方案是提供一种可降解微球在面部填充及改善褶皱领域中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明所述纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法工艺步骤简单，成本低廉，易于实现，适合大量制备，利于产业化和工业化生产应用；得到的微球粒径分布均一且分布较窄，形态规整，体系稳定性佳；另外，本发明得到的微球其细胞相容性佳，且均能刺激胶原进行生成，可应用于面部填充，改善褶皱等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是不同组别的粒径分布图。
图2是实施例1所得微球的扫描电子显微镜图。
图3是实施例2所得微球的扫描电子显微镜图。
图4是对比例1所得微球的扫描电子显微镜图。
图5是对比例2所得微球的扫描电子显微镜图。
图6是实施例1～5的红外图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备有机相：将0.5g分子量为8300Da的PLLA溶于10mL二氯甲烷中，配成50g/L浓度的溶液；再加入羟基磷灰石分散，使其浓度为5g/L；于800r/min条件下磁力搅拌30min，冰水浴超声10min，使PLLA充分溶解，纳米羟基磷灰石颗粒充分分散悬浮，得到有机相；
(2)制备分散相：将0.5g聚乙烯醇PVA(水解度78～81％)溶于500mL去离子水中，于封口状态下200r/min磁力搅拌4h，使其充分溶解，配成浓度为1g/L的溶液，得到分散相；
(3)乳化制粒：在1000r/min条件下，将所述有机相缓慢滴加至所述分散相(有机相与分散相的体积比为1:50)，搅拌期间进行封口并开几个小孔，持续搅拌4h，使二氯甲烷充分挥发干净，静置沉淀12h，8500r/min离心10min收集白色沉淀，去离子水洗涤3次。用冷冻机冷冻干燥，即得纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球(纳米羟基磷灰石质量比为10％)。
实施例2
本实施例提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备有机相：将0.5g分子量为15000Da的PLGA(75：25)溶于10mL二氯甲烷中，配成50g/L浓度的溶液；再加入羟基磷灰石分散，使其浓度为1g/L；于800r/min条件下磁力搅拌30min，冰水浴超声10min，使PLGA充分溶解，纳米羟基磷灰石颗粒充分分散悬浮，得到有机相；
(2)制备分散相：将0.5g聚乙烯醇PVA(水解度78～81％)溶于500mL去离子水中，于封口状态下200r/min磁力搅拌4h，使其充分溶解，配成浓度为1g/L的溶液，得到分散相；
(3)乳化制粒：在200r/min条件下，将所述有机相缓慢滴加至所述分散相(有机相与分散相的体积比为1:50)，搅拌期间进行封口并开几个小孔，持续搅拌4h，使二氯甲烷充分挥发干净，静置沉淀12h，8500r/min离心10min收集白色沉淀，去离子水洗涤3次。用冷冻机冷冻干燥，即得纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球(纳米羟基磷灰石质量比为10％)。
实施例3
本实施例提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备有机相：将0.5g分子量为8300Da的PLLA溶于10mL二氯甲烷中，配成50g/L浓度的溶液；再加入羟基磷灰石分散，使其浓度为1g/L；于800r/min条件下磁力搅拌30min，冰水浴超声10min，使PLLA充分溶解，纳米羟基磷灰石颗粒充分分散悬浮，得到有机相；
(2)制备分散相：将0.01g胶原溶于10mL乙酸中，配成1g/L浓度的溶液。400rpm磁力搅拌12h，使胶原充分溶解，得到分散相；
(3)乳化制粒：在1000r/min条件下，将所述有机相缓慢滴加至所述分散相(有机相与分散相的体积比为1:10)，搅拌期间进行封口并开几个小孔，持续搅拌4h，使二氯甲烷充分挥发干净，静置沉淀12h，8500r/min离心10min收集白色沉淀，去离子水洗涤3次。用冷冻机冷冻干燥，即得纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球。
实施例4
本实施例提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备有机相：将0.5g分子量为15000Da的PLGA溶于10mL二氯甲烷中，配成50g/L浓度的溶液；再加入羟基磷灰石分散，使其浓度为1g/L；于800r/min条件下磁力搅拌30min，冰水浴超声10min，使PLGA充分溶解，纳米羟基磷灰石颗粒充分分散悬浮，得到有机相；
(2)制备分散相：将0.01g胶原溶于10mL乙酸中，配成1g/L浓度的溶液。400rpm磁力搅拌12h，使胶原充分溶解，得到分散相；
(3)乳化制粒：在1000r/min条件下，将所述有机相缓慢滴加至所述分散相(有机相与分散相的体积比为1:10)，搅拌期间进行封口并开几个小孔，持续搅拌4h，使二氯甲烷充分挥发干净，静置沉淀12h，8500r/min离心10min收集白色沉淀，去离子水洗涤3次。用冷冻机冷冻干燥，即得纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球。
实施例5
本实施例提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备有机相：将0.5g分子量为8300Da的PLLA溶于10mL二氯甲烷中，配成50g/L浓度的溶液；将0.5g分子量为15000Da的PLGA溶于另一瓶10mL二氯甲烷中，配成50g/L浓度的溶液；将两者混合后，再加入羟基磷灰石分散，使其浓度为5g/L；800r/min磁力搅拌30min，冰水浴超声10min，使PLLA、PLGA充分溶解，纳米羟基磷灰石颗粒充分分散悬浮，得到有机相；
(2)制备分散相：将0.5g聚乙烯醇PVA(水解度78-81％)溶于500mL去离子水，封口，200r/min磁力搅拌4h，使其充分溶解，配成浓度为1g/L的溶液，得到分散相；
(3)乳化制粒：在1000r/min条件下，将所述有机相缓慢滴加至所述分散相(有机相与分散相的体积比为1:50)，搅拌期间进行封口并开几个小孔，持续搅拌4h，使二氯甲烷充分挥发干净，静置沉淀12h，8500r/min离心10min收集白色沉淀，去离子水洗涤3次。用冷冻机冷冻干燥，即得纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球(纳米羟基磷灰石质量比为10％；PLLA，PLGA质量比为1：1)。
对比例1
本对比例提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(3)乳化制粒过程中，本对比例在1500r/min条件下，将所述有机相缓慢滴加至所述分散相。
其他操作与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，与实施例2的区别在于，步骤(3)乳化制粒过程中，本对比例在100r/min条件下，将所述有机相缓慢滴加至所述分散相。
其他操作与实施例2相同。
对比例3
本对比例提供一种可降解微球的制备方法，与实施例1的区别在于，不添加羟基磷灰石。
其他操作与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供一种可降解微球的制备方法，与实施例2的区别在于，不添加羟基磷灰石。
其他操作与实施例2相同。
对比例5
本对比例提供一种可降解微球的制备方法，与实施例5的区别在于，不添加羟基磷灰石。
其他操作与实施例5相同。
验证例
(一)对实施例1、2和对比例1、2得到的微球进行粒度表征，结果如图1所示，由图1可以看出：
由于实施例1在步骤(3)中的搅拌转速相对较高，达到1000r/min，在快速搅拌的条件下体系剪切强度高，故实施例1得到的微球粒径相对较小，粒径分布的峰值位于60～70μm之间；而实施例2在步骤(3)中的搅拌转速相对较低，为200r/min，在搅拌速率较慢的条件下体系剪切强度低，故实施例2得到的微球粒径相对较大，粒径分布的峰值位于190～200μm之间。
相比于实施例1，对比例1在步骤(3)中的搅拌转速进一步提高至1500r/min，按常理推断对比例1的微球粒径应该同步降低，然而实验结果却显示对比例1得到的微球粒径呈双峰分布：在更小粒径处观测到了微球信号(峰值为10～20μm之间)，同时在较高粒径处也有明显的信号峰(峰值为100～110μm之间)。双峰分布的结果表明体系的微球分布并不均匀，很有可能是当体系搅拌转速过快时，微球的粒度确实会随之减小，但同时过小的粒径也会导致比表面积进一步增加，故体系界面能亦增加，反而使体系失稳，由此造成粒径呈双峰部分现象。
相比于实施例2，对比例2在步骤(3)中的搅拌转速进一步降低至100r/min，搅拌速度低表明体系的剪切强度低，故对比例2得到的微球粒径较高，且由于剪切力小，大粒径处有明显的信号。
为了更直接对微球进行观测，本发明还对实施例1、2和对比例1、2得到的微球进行了扫描电镜表征，图2、图3分别为实施例1、2的微球，微球的形貌规整；图4、图5分比为对比例1、2的微球，微球的形态较差，呈不规则状。
(二)对实施例1～5得到的微球进行粒度表征(使用Zeta电位仪Zetasizer nanozsp检测Zeta电位)，结果如表1所示。
表1
| 组别 | Zeta电位 |
| 实施例1 | -4.16±0.48 |
| 实施例2 | -11.31±2.28 |
| 实施例3 | -8.22±2.72 |
| 实施例4 | 2.15±0.51 |
| 实施例5 | -7.56±1.24 |
由表1可知，制得微球表面电荷较低，在实际应用中有利于与带负电荷的细胞接触。
(三)使用cck-8试剂盒测量细胞毒性，小鼠I型胶原ELISA试剂盒定性定量测量胶原生成量。实施例1(PLLA)、实施例2(PLGA)、实施例5(PLLA/PLGA)微球生物学测试结果如下表2，此处仅展示所测最高浓度(500μg/mL)材料与细胞共培养7天所得数据。
表2
| 组别 | 细胞毒性 | 胶原生成量(ng/mL) |
| 实施例1 | 0级 | 5.54±0.05 |
| 实施例2 | 0级 | 5.20±0.21 |
| 实施例5 | 0级 | 6.51±0.13 |
| 对比例3 | 0级 | 3.71±0.12 |
| 对比例4 | 0级 | 2.03±0.07 |
| 对比例5 | 0级 | 5.42±0.13 |
| 对照组 | 0级 | 0.32±0.04 |
注：对照组为自然条件下繁殖的细胞。
由表2可得，本发明得到的微球其细胞相容性佳，且均能刺激胶原进行生成(实施例的胶原生成量明显优于对应对比例的胶原生成量)，可应用于面部填充，改善褶皱等领域。
(四)使用红外分光光度法(中国药典2020年版四部通则0402)，采用傅立叶红外光谱仪((IS10-澳化钾压片))检测傅立叶变换红外光谱(FTIR)，实施例1～5的检测结果如图6所示，由图片结果可知：实施例1～5中，2999cm-1，2945cm-1，1755cm-1，1080cm-1分别表征了PLLA或者PLGA中聚乳酸片段C＝O、-CH3、-CH3、C-O等键；实施例3和4中，1630cm-1，1550cm-1表征了胶原酰胺键。以上数据表明，实施例1～5成功制备了可降解微球。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备有机相：将可降解激活材料加入二氯甲烷中进行搅拌溶解，然后再加入可降解骨材料进行分散悬浮，得到有机相；
(2)制备分散相：将胶原加入乙酸中进行搅拌溶解，得到分散相；或，将聚乙烯醇加入水中进行搅拌溶解，得到分散相；
(3)乳化制粒：将所述有机相滴加至所述分散相，滴加期间持续搅拌，完成后静置并离心收集沉淀；将所述沉淀依次洗涤、干燥，得到纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球。
2.根据权利要求1所述纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：
所述可降解激活材料为PLLA、PLGA中的一种或两种的组合；
和/或，所述可降解骨材料为羟基磷灰石。
3.根据权利要求2所述纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，其特征在于，所述PLLA的分子量为8000～15000Da，所述PLGA的分子量为14000～16000Da。
4.根据权利要求1所述纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：
可降解激活材料在有机相中的浓度为50g/L；
和/或，可降解骨材料在在有机相中的浓度为1～5g/L。
5.根据权利要求1所述纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述分散悬浮的方式为：先以800r/min的速率磁力搅拌30min，然后再超声分散10min。
6.根据权利要求1所述纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：
所述胶原或所述聚乙烯醇在分散相中的浓度均为1g/L；
和/或，所述搅拌溶解的速率为200～400r/min，搅拌的时间为4～12h。
7.根据权利要求1所述纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中：
所述有机相和分散相的体积比为1:10～50；
和/或，滴加期间持续搅拌的速率为200～1000r/min，搅拌的时间为4～6h；
和/或，所述静置的时间为12～14h；
和/或，所述离心的转速为8500r/min，离心的时间为10min，离心次数为3次。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法得到的纳米羟基磷灰石掺杂的可降解微球。
9.权利要求8所述可降解微球在面部填充及改善褶皱领域中的应用。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118121757A true CN118121757A (zh) | 2024-06-04 |
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|---|---|---|---|
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