CN118121679A - 一种草地贪夜蛾SfAMP蛋白在制备抗菌剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了草地贪夜蛾SfAMP蛋白的抗菌应用，SfAMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白进行原核表达和纯化，获得了SfAMP重组蛋白，对SfAMP重组蛋白进行了抗菌功能的研究，结果显示该蛋白具有抗细菌和抗真菌的效果，为抗菌制剂的开发提供了新的蛋白备选。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种草地贪夜蛾SfAMP蛋白在制备抗菌剂中的应用。
背景技术
草地贪夜蛾属于鳞翅目、夜蛾科，原产于美洲，但近年来已经扩散到非洲、亚洲等地。草地贪夜蛾是联合国粮农组织预警的全球重大迁飞性农业害虫，草地贪夜蛾的幼虫有6个龄期，背部有白色条纹和刺状斑点，头部有倒Y字形的白色缝线。幼虫的食性广泛，可取食超过350种植物，造成多种农作物的严重经济损失，尤其是禾本科作物，如玉米、水稻、高粱和甘蔗等。草地贪夜蛾具有食量大、繁殖力强、迁飞距离远、抗药性强和抗病性强的特点，防治难度比较大。昆虫中含有丰富的蛋白资源，其中不乏具有特殊功能的功能蛋白，例如抗冻蛋白、热休克蛋白、抗菌肽、干扰素等。但是，目前对草地贪夜蛾中的功能蛋白的相关研究很少，有待进一步开发。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种草地贪夜蛾SfAMP蛋白在制备抗菌剂中的应用。
本发明提出了一种草地贪夜蛾SfAMP蛋白在制备抗菌剂中的应用，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO：2的序列如下：
Met Ala Lys Ile Leu Phe Ile Ile Cys Val Ala Ile Ala Thr Val Ala LeuAla Thr Glu
Glu Lys Lys Tyr Asn Cys Asp Tyr Gln Phe Gly Asp Pro Ser Trp Asn LeuThr Lys Glu
Tyr Tyr Asn Val Ile His Thr Val Arg Arg Gly Ser Lys His Ala Glu ThrIle Leu Pro Leu
Asp Glu Gly Tyr Met Ile Ser Tyr Val Cys Val Thr Ile Pro Gly Val AspLys Ser Thr Thr
Lys Val Ala Phe Ser Ser Leu Tyr His Lys Val Ser Val Glu Leu Ala AspAsn Ala Pro
Lys Asn Ile Val Tyr Asn Val Val Ala Lys Arg His Gly Tyr
优选地，编码所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO：1的序列如下：
atggcgaagattttgtttataatttgcgtcgctatagcaaccgtggctctagcaacagaagaaaagaagtacaattgt
gattatcaatttggtgacccatcatggaacctcacaaaggaatattataacgtgatccatacagtgcggagaggttcaaagc
acgctgagactatactaccattggatgaaggttacatgataagctacgtgtgtgtcaccatcccaggcgtcgacaagtctac
cactaaagtagcattctcttcgttataccacaaagtatccgttgaattagctgataatgctcctaaaaatatagtttacaatgttgt
agctaaaaggcatgggtattag
优选地，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白为重组蛋白。
优选地，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白为GST融合的重组蛋白。
优选地，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白是将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段连入PGEX-4T-1表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点处，然后在表达菌株BL21(DE3)中诱导表达得到。
优选地，所述诱导表达的条件为：于22～28℃下诱导15～30h。
其中，诱导表达后还可以包括对蛋白进行纯化的步骤。
优选地，所述抗菌为抗细菌和/或抗真菌。
优选地，所述抗菌为抗大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和/或球孢白僵菌。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了草地贪夜蛾SfAMP蛋白的抗菌应用，SfAMP蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，将该蛋白进行原核表达和纯化，获得了SfAMP重组蛋白，对SfAMP重组蛋白进行了抗菌功能的研究，结果显示该蛋白具有抗细菌和抗真菌的效果，为抗菌制剂的开发提供了新的蛋白备选。
附图说明
图1为原核表达载体PGEX-4T-1-SfAMP的构建示意图。
图2为GST-SfAMP重组蛋白分别用考马斯亮蓝染色和Western blot蛋白印迹进行检测的检测结果。
图3为GST-SfAMP重组蛋白对细菌生长抑制作用的测定结果。
图4为GST-SfAMP重组蛋白对球孢白僵菌孢子萌发的抑制作用的测定结果。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1原核表达载体的构建
根据GenBank数据库，SfAMP基因(LOC118281185)表达的成熟蛋白含97个氨基酸，相对分子质量为11.01kD。设计引物扩增SfAMP基因，具体扩增引物序列如下：
SfAMP-F：
5’-gatctggttccgcgtggatccTCGGAAGAAAAGAAGTACAATTGTG-3’；
SfAMP-R：
5’-gtcacgatgcggccgctcgagTTAATACCCATGCCTTTTAGCTACA-3’。
然后以草地贪夜蛾的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL(H2O 32μL，5×SF反应缓冲液10μL，dNTP 1μL，上下游引物各1μL，cDNA 2μL，高保真酶Phanta Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL)。扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒，共扩增35个循环；最后再72℃延伸5分钟，反应完成后离心混匀，将样品加入至琼脂糖凝胶中电泳(120伏，20分钟)，用凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，得到SfAMP片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，用于原核表达载体的构建。
提取PGEX-4T-1质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ核酸内切酶处理，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收酶切的质粒片段。将扩增得到的SfAMP片段和酶切的质粒片段使用单片段同源重组试剂盒(Vazyme ClonExpress IIOne Step Cloning Kit)进行同源重组克隆，构建得到原核表达载体PGEX-4T-1-SfAMP，如图1所示。用PGEX-4T-1-SfAMP转化大肠杆菌BL21细胞，筛选阳性克隆进行测序验证。
实施例2SfAMP蛋白的表达纯化
挑取测序验证正确的BL21单克隆摇菌，37℃200rpm培养过夜。次日按照1:100的比例将过夜菌加到300mL新鲜LB培养基中，加入氨苄抗生素，37℃200rpm继续培养4小时，收取1mL菌体作为未诱导，剩余的菌液放在4℃冰箱预冷，同时将摇床温度降至25℃，加入0.1mMIPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导6小时，收取1mL菌体作为诱导的总蛋白。剩下的菌液离心收集菌体，4℃5000g离心5分钟，并用10mL PBS缓冲液洗一次，10mL PBS重悬，加入溶菌酶和0.1％Triton X-100(100μL)，冰上放置30分钟，破碎15分钟(3秒开,10秒关)。将破碎液分装到2mL灭菌的1.5mL离心管中，12000g 10分钟，4℃离心取上清。将GST珠子(GST-SefinoseResin 4FF)500μL加到层析柱中，并用蛋白结合缓冲液洗三次，每次10mL。将上清倒入层析柱中，室温混匀2-3小时，流出上清，并用蛋白结合缓冲液洗4次，每次10mL。最后用0.5mL洗脱缓冲液洗脱蛋白。纯化的GST-SfAMP重组蛋白分别用考马斯亮蓝染色和Western blot蛋白印迹进行检测，结果如图2所示。图2中，A为考马斯亮蓝染色检测结果，B为Western blot蛋白印迹检测结果(His标签抗体)。
实施例3SfAMP蛋白对细菌生长的抑制作用测定
挑取细菌单克隆在新鲜的LB培养基中进行培养过夜，条件为37℃，200rpm。次日，收集菌体并用PBS缓冲液洗涤三次，每次3分钟，10000g离心。用新鲜的培养液重悬，加到96孔细胞培养板中，在200微升体系中的终浓度为107cfu/mL。每孔加入5μL CCK-8试剂，含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)(CAS:193149-74-5)。CK不加蛋白作为阴性对照，GST重组蛋白和GST-SfAMP重组蛋白分别加到96孔板中，每个重复三次。室温避光孵育30分钟，37℃200rpm培养。每隔0.5小时(具体测量时间根据菌种的不同而定)用酶标仪(Multiskan GO Microplate Spectrophotometer)测量OD450读数。用Graphpad软件作图，进行单因素方差分析(ANOVA)。结果如图3显示，GST-SfAMP重组蛋白能够非常显著地抑制大肠杆菌、粘质沙雷氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长。而加入GST重组蛋白的对照组细菌生长速度与未加任何蛋白的细菌没有显著区别。以上结果表明，GST-SfAMP重组蛋白具有抑菌活性，能够显著抑制多种革兰氏阳性菌和阴性菌的生长。
实施例4SfAMP蛋白对球孢白僵菌生长和萌发的抑制作用测定
球孢白僵菌是一种广泛用于生物防治的昆虫病原真菌。下面测定了SfAMP蛋白对球孢白僵菌的抗菌活性。方法如下：
1.将球孢白僵菌ARSEF 2860接种在PDA培养基上，在25℃恒温箱培养15天左右，用接种针从培养基中刮取分生孢子，在灭菌水(含0.05％ Tween-80)中震荡散开，制成菌丝孢子悬液。
2.取1mL孢子悬浮液，13000g离心5分钟，用PBS洗2次。
3.用灭菌的脱脂棉过滤掉菌丝，得到白僵菌孢子悬浮液。
4.13000g离心5分钟后，用1mL 1/4SDY液体培养基重悬孢子，浓度调整为107孢子/mL。
5.在30μL孢子液中加入GST-SfAMP重组蛋白，用1/4SDY培养基补充体系至60微升，加入96孔板中，设置阴性对照，每组设置三个重复，25℃培养16小时，用倒置荧光显微镜拍照观察菌丝萌发率。
6.1/4SDY液体培养基配方:葡萄糖10g/L、胰蛋白胨2.5g/L、酵母粉5g/L。
结果如图4所示，可以看出，GST-SfAMP重组蛋白能够显著抑制球孢白僵菌孢子的萌发，而对照GST重组蛋白对萌发率没有影响。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种草地贪夜蛾SfAMP蛋白在制备抗菌剂中的应用，其特征在于，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白为重组蛋白。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白为GST融合的重组蛋白。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草地贪夜蛾SfAMP蛋白是将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段连入PGEX-4T-1表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点处，然后在表达菌株BL21(DE3)中诱导表达得到。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诱导表达的条件为：于22～28℃下诱导15～30h。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌为抗细菌和/或抗真菌。
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