CN101437940A

CN101437940A - 超氧化物歧化酶（sod）基因及其鉴定和克隆方法

Info

Publication number: CN101437940A
Application number: CNA2006800545562A
Authority: CN
Inventors: 普拉迪普·库马尔·巴拉德瓦贾; 拉什米塔·萨胡; 桑贾伊·库马尔; 帕拉姆维尔·辛格·阿胡贾
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2006-08-01
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2026-08-01
Also published as: US7888088B2; US20070269811A1; EP2004811A1; BRPI0621501A2; AU2006341292A2; AU2006341292B2; AU2006341292A1; US20100261268A1; WO2007113615A1; CN101437940B

Abstract

本发明提供了喜玛萎陵菜(Potentilla atrosanguinea)的超氧化物歧化酶基因、含编码超氧化物歧化酶的基因的构建体和产生SOD蛋白的转化大肠杆菌。

Description

超氧化物歧化酶（SOD）基因及其鉴定和克隆方法

发明领域

本发明涉及超氧化物歧化酶(SOD)。超氧化物歧化酶(SOD)cDNA(SEQ ID No.2)从喜玛萎陵菜(Potentilla atrosanguinea)获取，其包含编码基因序列(SEQ ID No.3)，所述编码基因序列编码具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽(SEQ ID No.1)。

另外，本发明还涉及一对用于扩增超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA(SEQ ID No.3)的引物，其中正向引物为5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’和反向引物为5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’。

更具体地，本发明涉及鉴定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQID NO.3的方法，该SEQ ID NO.3表达产生具有美国专利号6485950所公开的特征的超氧化物歧化酶酶蛋白(EC 1.15.1.1)。

发明背景和现有技术参考：

SOD是普遍存在于植物、动物和微生物中的一种酶，该酶保护这些生物免受由超氧化物自由基(以下指O₂ ^-)引起的氧化损伤。所述酶按照以下氧化还原反应将超氧化物自由基歧化成过氧化氢和氧：

2O₂ ^-+2H⁺＝H₂O₂+O₂

这样，SOD在所有那些其中O₂ ^-生成量导致细胞损伤的反应中都具有作用。根据美国专利号6485950，我们已经从萎陵菜(Potentilla)中提取了耐高压加热的超氧化物歧化酶，该酶可以进行高压加热并在零度以下显示活性。由于萎陵菜分布在难以接近的高海拔地方，以及我们的美国专利号6485950中提及的SOD的工业意义，因此需要开发一种在大肠杆菌中产生萎陵菜的SOD的系统以便在需要时获取SOD。

以下是涉及各种来源的SOD基因的分离和它们在大肠杆菌中表达以产生可回收数量的SOD的本领域的知识状况。可以参考文献(1)Wang，Z.，He，Z.，Shen，Q.，Gu，Y.，Li，S.and Yuan，Q.(J.of Chromatography B，2005.826：114-121)，其在大肠杆菌中过量表达蛹虫草(Cordyceps militaris)的Cu/ZnSOD基因。

还可以参考文献(2)Liu，W.，Zhu，R.H.，Li，G.P.，and Wang，D.C.(ProteinExpr.Purif.2002.25：379-388)，其在大肠杆菌中实现高产量的重组鸭Cu/ZnSOD的产生。

还可以参考文献(3)Pan，S.M.，Hwang，G.B.，and Liu，H.C.(Bot.Bull.Acad.Sin.1999.40：275-281)，其在大肠杆菌中实现了稻的胞质Cu/Zn SOD的过量表达和表征。

可以参考文献(4)Hartman，J.R.，Geller，T.，Yavin，Z.，Bartfeld，D.，Kanner，D.，Aviv，H.，and Gorecki，M.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1986.83：7142-7146)，其报道了在大肠杆菌中高水平表达具有酶活性的人Cu/Zn SOD。

可以参考文献(5)Ken，C.F.，Lin，C.T.，Shaw，J.F.，and Wu，J.L.(MarineBiotech.2003.5：167-173)，其在大肠杆菌中过量表达了斑马鱼的Cu/Zn SOD并纯化出具有活性的酶。

可以参考文献(6)Kim，T.S.，Jung，Y.，Na，B.K.，Kim，K.S.，and Chung，P.R.(Infect.Immun.2000.68：3941-3948)，其克隆并在大肠杆菌中表达了肝片吸虫(Faciola hepatica)的Cu/Zn SOD基因。

缺点是：

1.没有从萎陵菜分离的SOD基因，萎陵菜是耐高压加热且在零度以下具有功能的Cu/Zn SOD的来源。

2.没有从萎陵菜分离的并在大肠杆菌中表达的SOD基因。

3.没有在大肠杆菌中表达以产生可高压加热的SOD蛋白的SOD基因。

4.没有在大肠杆菌中表达以产生在零度以下具有功能的SOD蛋白的SOD基因。

本SOD和其它已知SOD的比较数据

本发明	现有技术
本发明	现有技术	本文所描述的SOD的最大热稳定温度在80℃	SOD的最大热稳定温度在37℃至50℃。参考Bueno P.，Verla，J.，Gallego，G.G.和Rio del A.L.(Plant Physiol.

	1995.108：11551-1160)，其中显示了从西瓜子叶分离的Cu/Zn SOD的热稳定性，SOD的活性：(a)50℃孵育4小时后降低40％；(b)70℃孵育15分钟后降低50％；(c)80℃孵育60分钟后降低80％；和(d)100℃孵育15分钟后降低100％。可以参考文献Miyata，K.，Maejima，K.，和Tomoda，K.(美国专利号4,563,349；1986年1月7日)，其报道了属于沙雷氏菌属(Serratia)的微生物的SOD，其具有以下热稳定特征：(a)维持37℃达60分钟仍稳定，在50-60℃孵育60分钟时50％失活，在80℃孵育5分钟时100％失活。
		不加外部稳定剂的稳定性(需要加入过氧化氢俘获剂、多羟基化合物和糖等以稳定来自如发芽的植物种子的其它来源的所述酶)	需要外部稳定剂以增强含这种酶的产品的稳定性。所报道的SOD在室温下不稳定，除非加入多羟基化合物、糖或其它任意稳定剂使其稳定(Bresson-Rival；Delphine；Boivin；Patrick；Linden；Guy；Perrier；Erric；Humbert；Gerard；1999；U.S.Pat.No.
从零度以下至50℃以上的宽范围的温度极大地增强所述酶和其产品的实用性，并且用于人类更安全	已经报道SOD活性的温度范围在5至45℃之间(C.Hakam，N.和Simon，J.P.1996，Physiol.Plant.	不加外部稳定剂的稳定性(需要加入过氧化氢俘获剂、多羟基化合物和糖等以稳定来自如发芽的植物种子的其它来源的所述酶)

	97：209-216)。然而，针对同一种酶没有报道同时具有催化O^2-的歧化作用的较低的温度和热稳定性。
	97：209-216)。然而，针对同一种酶没有报道同时具有催化O^2-的歧化作用的较低的温度和热稳定性。	本酶可耐高压加热。当要将SOD注射到体内时，则需要无菌的组合物，因此可耐高压加热的SOD是理想选择。另外，在重输注应用和器官的低温储存中，需要可耐高压加热并在低温下可以高效发挥作用的SOD。除了耐高压加热的SOD在药学和医学领域中的应用，无菌SOD也将是化妆品和食品工业的一个选择。	没有可耐高压加热的SOD的报道。

发明目的

本发明的主要目的是提供超氧化物歧化酶(SOD)cDNA(SEQ ID No.2)，其从喜玛萎陵菜获取，并包含SEQ ID No.3的编码基因序列，所述编码基因序列编码具有超氧化物歧化酶酶活性的SEQ ID No.1的多肽。

本发明的另一个目的是提供一对用于扩增超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA(SEQ ID No.3)的引物，其中正向引物为5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’，反向引物为5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’。

另外，本发明的另一个目的是提供鉴定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQ ID NO.3的方法，该SEQ ID NO.3表达产生具有美国号6485950专利所公开的特征的超氧化物歧化酶酶蛋白(EC 1.15.1.1)。

本发明的另一个目的是提供萎陵菜的可耐高压加热的超氧化物歧化酶的基因。

本发明的另一个目的是提供萎陵菜的可耐高压加热的超氧化物歧化酶的基因，该酶在零度以下的温度也具有功能。

本发明的另一个目的是提供SOD的重组基因，所述SOD高压加热后仍具有活性并且还在低温下具有活性，所述重组基因在质粒载体内从而形成承载合成所述SOD的核苷酸序列的新载体。

本发明的另一个目的是用以上所述的重组质粒载体转化细菌宿主大肠杆菌用于在所述细菌宿主中表达SOD基因。

附图简述：

图1显示温度对SOD活性影响。纯化在大肠杆菌中表达的萎陵菜SOD并在不同温度的高压加热的前后进行分析。

图2显示萎陵菜Cu/Zn SOD的核苷酸序列和其它植物物种的序列的比较。用星号表示完全同源的区域。

图3显示推论出的萎陵菜Cu/Zn SOD的氨基酸序列和其它植物物种的序列的比较。用星号表示完全同源的区域。

图4(A)显示萎陵菜SOD在大肠杆菌中的表达和纯化。C，对照；I，通过IPTG诱导的蛋白；P，纯化的SOD。凝胶是通过银染染色的。(B)体现纯化的SOD活性的凝胶活性染色。P，所纯化的SOD。

图5显示本发明sod基因和其它植物物种的sod基因的比对结果。

图6显示SEQ ID No.1的SOD基因多肽序列的详细信息。

图7显示SEQ ID No.2的SOD基因的全长cDNA的详细信息。

图8显示SEQ ID NO.3的萎陵菜SOD基因的编码序列的详细信息。

表9显示SEQ ID No.4的阳性cDNA克隆的详细信息。

图10显示SEQ ID No.5(a)的引物序列(正向引物)和SEQ ID No.5(b)的引物序列(反向引物)。

图10显示RACE引物的详细信息

(a)SEQ ID No.6(a)的引物序列GSP1：正向引物

(b)SEQ ID No.6(b)的引物序列NES1：反向引物

(c)SEQ ID No.6(c)的引物序列GSP2：正向引物

(d)SEQ ID No.6(d)的引物序列NES2：反向引物

发明概述

本发明提供了喜玛萎陵菜的超氧化物歧化酶基因及其在异源系统中的表达，并且包括携带负责所述SOD合成的编码核苷酸序列(SEQ ID.3)的构建体和产生所述SOD蛋白的转化大肠杆菌。这种SOD蛋白是可耐高压加热的并在零度以下的温度仍具有功能。

发明详述

本发明提供了从喜玛萎陵菜获取的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA(SEQID No.2)，其中所述cDNA含856个核苷酸碱基。

在本发明的一个实施方案中，所述cDNA具有连同编码前序列和编码后序列的完整编码序列。

本发明还提供超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA(SEQ ID No.3)，其中所述编码cDNA含459个核苷酸碱基。

另外，本发明还提供了超氧化物歧化酶(SOD)多肽(SEQ ID No.1)，其中所述多肽含152个氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，所述多肽可耐高压加热。

在本发明的另一个实施方案中，所述多肽在<-10℃至+80℃的温度范围内具有功能。

本发明还提供了一对用于扩增超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA(SEQ ID No.3)的引物，其中正向引物为5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’，反向引物为5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’。

另外，本发明提供了一种鉴定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQID NO.3的方法，所述SEQ ID NO.3编码具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽(SEQ ID No.1)，其中所述方法包含以下步骤：

a)从萎陵菜的叶子中分离mRNA；

b)根据从步骤a)获取的mRNA合成cDNA；

c)构建萎陵菜的DNA的cDNA文库，然后在合适的载体优选细菌噬菌体中克隆从步骤b)获取的cDNA；

d)筛选来自步骤c)的所述文库，然后进行用于鉴定阳性cDNA克隆的初次、第二次和第三次筛选；

e)从步骤d)获取的阳性cDNA克隆中分离DNA；

f)利用引物扩增所述DNA，该引物包括：

正向引物：5’-GTTGTAAAACGACGTGCCAGT-3’，

反向引物：5’-CACAGGAAACAGCTATGACC-3’；

g)利用不同引物对通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)扩增从步骤e)获取的cDNA的末端以得到期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全长DNASEQ ID NO.2，其中所述引物包含：

正向引物：5’-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3’，

反向引物：5’-GTCATC AGGGTCTGC ATGGAC AACAAC-3’，

正向引物：5’-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3’，

反向引物：5’-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3’

正向引物(GSP1)：5’-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3’

反向引物(NES1)：5’-GTCATCAGGGTCTGCATGGACAACAAC-3’

正向引物(GSP2)：5’-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3’

反向引物(NES2)：5’-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3’

SMART II A寡核苷酸：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’

3′-RACE CDS引物A(3’-CDS)：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀N_-1N-3’

5′-RACE CDS引物(5’-CDS)：5’-(T)₂₅N_-1N-3′

通用引物混合物A(UPM)：长链：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTG GTATCAACGCAGAGT-3’

通用引物混合物A(UPM)：短链：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’

巢式通用引物A(NUP)：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

h)利用从期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全长DNA SEQ ID NO.2的起始密码子到中止密码子设计的一对引物扩增超氧化物歧化酶(SOD)的编码序列SEQ ID No.3，其中所述引物具有以下序列：

正向引物：5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’

反向引物：5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’

i)将从步骤g)获取的扩增产物克隆到pQE 30表达载体中，然后将它转化到感受态大肠杆菌细胞中以得到表达构建体；

j)通过常规方法分离质粒DNA，然后通过测序以确认所述SOD基因。

在本发明的一个实施方案中，生产针对纯化的SOD的多克隆抗体并用于根据嫩叶mRNA合成的cDNA文库的筛选。

在本发明的另一个实施方案中，筛选文库，通过聚合酶链式反应(以下称为PCR)扩增阳性cDNA克隆并获得两个PCR产物。对这些产物进行测序并获得大约85％的编码SOD的基因。

另外，在本发明的另一个实施方案中，所述cDNA克隆的序列没有起始密码和中止密码，其长度小了21％。

在本发明的另一个实施方案中，根据阳性cDNA克隆的序列设计引物，并用cDNA末端快速扩增技术(下文称为RACE)扩增SOD全长基因。

在本发明的另一个实施方案中，对含SEQ ID No.2所示的序列的所述SOD基因进行测序和分析。

在本发明的另一个实施方案中，所述全长SOD基因含856个核苷酸碱基。

在本发明的另一个实施方案中，所述全长的SOD基因具有连同编码前序列和编码后序列的完整编码序列。

在本发明的另一个实施方案中，根据全长的SOD基因设计一对引物以扩增SEQ ID No.3的超氧化物歧化酶(SOD)基因编码cDNA。

在本发明的另一个实施方案中，所述编码cDNA含459个核苷酸碱基。

在本发明的另一个实施方案中，所述SOD基因连接到载体上以产生重组质粒，该质粒一旦转化到适合的大肠杆菌宿主中就产生克隆。

在本发明的另一个实施方案中，所述的SEQ ID No.3的SOD基因的编码序列对应于编码超氧化物歧化酶(SOD)的酶蛋白的聚核苷酸。

另外，本发明还提供了含编码可选择标记的序列和中止序列的表达构建体。

在本发明中，收集印度西喜马拉雅(Western Himalaya)的HimachalPradesh的Lahaul和Spiti地区内生长在Kunzum Pass(海拔4517m；32°24′N；077°38′E)的萎陵菜植物的叶子。我们之前在我们的美国专利号6485950中报道了这种植物的叶子具有耐高压加热并在零度以下的温度具有功能的SOD。因此通过本领域熟知的并常规实施的技术，鉴定、分离编码这种SOD的基因并将其克隆到大肠杆菌中。对含SEQ ID No.2所示序列的本发明SOD基因在正义方向进行测序和分析。本文所使用的术语“正义”指RNA碱基的大体延伸(a substantial run of RNA bases)，所述RNA具有与特定RNA序列(如mRNA)基本相同的碱基。本发明还包含编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的聚核苷酸。本发明还提供宿主细胞，其以允许所编码的SOD多肽表达的方式包含本发明的聚核苷酸。用于转化本发明的SOD基因的合适的宿主细胞包括细菌细胞如大肠杆菌。利用通过本领域熟知的并常规实施的将DNA引入到宿主细胞的方法，将本发明的聚核苷酸作为环状质粒的一部分引入到所述宿主细胞中。本发明的宿主细胞是工业规模生产重组SOD的有价值资源。

多克隆抗体，在本发明中指正常免疫系统在响应由一些很接近但由不相同的蛋白构成的抗原时产生的抗体。

载体，在本发明中指能够接受外来DNA的DNA序列，并且采用具有某种抗生素抗性的环状质粒DNA的形式。

将本发明的基因序列与所报道的其它植物的SOD比较以考察所述基因的独特性(图2)。本发明的多肽的独特序列通过与其它已知多肽的序列比较是可以识别的，并且可以通过使用在本领域中常规使用的比对程序例如可在公共序列数据库中得到的那些程序进行鉴定(图3)。这暗示所获取的序列是不完全的。然而，SEQ ID No.3与所报道的其它植物的SOD基因具有至少80％、至少82％、至少83％、至少85％的序列同源性。关于本发明的聚核苷酸的百分比序列“同源性”在本文中定义为在序列比对后，候选序列中与所述SOD编码序列中核苷酸相同的核苷酸碱基的百分数，如果需要以获得最大百分比序列同一性。

对于完全100％氨基酸组合物来说是氨基酸的累积效应/组合，并且在所述组合物中观察到了所述特征。所述组合物给这种蛋白提供了这种蛋白所具有的效果。

以下实施例以示例显示本发明的方式给予，并不被认作是对本发明的范围的限定。

实施例-1

在兔中生产抗SOD的抗体

在一年龄雄兔(New Zealand型)中生产针对所纯化的蛋白的多克隆抗体。将所纯化的SOD蛋白(含100μg SOD蛋白的500μl磷酸钾缓冲液，pH7.0)乳化到1ml弗氏完全佐剂中并利用一次性注射器通过肌肉施予。完全弗氏佐剂从印度的Bangalore Genei获得，其包含石蜡油、作为乳化剂的二缩甘露醇单油酸酯和热灭活结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在初次注射的第7天后，施予加强剂量(1ml，含乳化在1ml不完全佐剂中的60μg纯化蛋白)。使用固定在无菌注射器上的22号针通过快速抽入和排出抗原-佐剂混合物，使佐剂(500μl)和所纯化的酶(500μl，100μg)彻底乳化以得到稳定的抗原-佐剂乳液。通过将一滴所述混合物置于蒸馏水的静止表面来检测完全乳化。所述小滴完整说明完全混合。使用22号针将抗原-佐剂混合物(800μl)注射到兔的大腿肌肉中。收集来自所述兔的心脏的血液并使之在室温下凝结2小时。4℃过夜储存后，用Pasture吸管对凝结块的边缘进行边缘化并以150xg离心5分钟。收集上清并以350xg离心15分钟除去细胞碎片。加入叠氮化钠至浓度为0.025％并把血清储存于4℃。如Kanematsu，S.andAsada，K.(1990)Plant Cell Physiol.31：99-112.中的阐述，在第二次加强剂量之后收集少量的血液以利用Ouchterlony双扩散(下文称为ODD)检测抗体的存在。这样，在85nm皮氏平板中倒入3mm厚度的在0.15M NaCl、20mMpH7.0的磷酸钾和0.02％叠氮化钠中制备的1.5％的琼脂。将抗原(20μl，含4μg蛋白)和抗体装载到用打孔器(cork-borer)切割的直径3mm的孔中。皮氏平板加盖并放于湿润的环境中37℃持续16-24小时并检测免疫沉淀线。

实施例-2

RNA分离，RNA的定量，来自总RNA的poly A⁺ mRNA的纯化和凝胶电泳

利用改良的盐酸胍方法(LaI.L.，Sahoo.R.，Gupta.R.K.，Sharma.P.andkumar.S.Plant Molecular Biology Reporter 19：181a-181f.)从萎陵菜的嫩叶组织中分离核糖核酸(下文称为RNA)。在液氮中把叶组织(500mg)研磨成微细粉末。将粉末转移到含5ml GH缓冲液(8M盐酸胍、20mMEDTA、20mMMES、100mM βME)的新的研钵中并进一步研磨。将所产生的匀浆转移到含等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:10)的旋盖试管(oak-ridge tube)中。各相通过涡旋乳化并通过以10,000rpm离心20min(7℃)进行分离。将上层水相转移到新的旋盖试管中并用等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提。将所产生的上层水相转移到corex试管中，通过加入0.2体积1M醋酸和0.7体积冰乙醇使RNA沉淀。将所述试管置于-72℃持续3h。通过在4℃、10,000rpm离心10分钟使沉淀形成团块。用5ml 3M醋酸钠(pH5.2)洗涤团块三次接着用70％的冰乙醇进行最后洗涤。干燥团块并溶解到最小体积的DEPC处理过的灭菌水中。通过测量在260nm处的吸光度对RNA定量，通过计算在260nm和280nm处所测定的吸光度的比值监测纯度。260/280nm的值>1.8被认为是在本研究中所使用的RNA的理想纯度。计算RNA浓度和产量的公式如下：

RNA浓度(μg/ml)＝A₂₆₀(在260nm处的吸光度)×40×稀释倍数

总产量(μg)＝浓度×储存RNA样本的体积

为了检查RNA的完整性，用15.5μl Ml溶液(2μl 5X MOPS缓冲液、3.5μl甲醛和10μl甲酰胺[5X MOPS缓冲液：300mM醋酸钠、10mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、0.5mM乙二胺四醋酸(EDTA)])稀释含5-6μgRNA的4.5μl DEPC处理过的灭菌水并在65℃孵育15分钟。在加入2μl甲醛凝胶上样缓冲液[50％甘油、1mM EDTA(pH，8.0)、0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯蓝FF]后，将RNA上样至1.0％甲醛琼脂糖凝胶，并在72伏、1×MOPS缓冲液(60mM醋酸钠、2mM MOPS、0.1mM EDTA)中电泳(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，NY)。

利用共价结合至聚苯乙烯-乳胶颗粒(Oligotex^TM，Qiagen Inc)上的dC10T30寡核苷酸纯化Poly-A mRNA。Oligotex选择性结合具有poly-A尾的mRNA使其纯化，留下所有没有poly-A尾的RNA。使用1mg总RNA作为mRNA分离的起始材料，并在过程中按照生产商的说明进行。

实施例-3

定向互补DNA文库(下文称为cDNA文库)的构建

使用TimeSaver^TM cDNA合成试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech.USA)利用Poly- A⁺ mRNA合成cDNA。利用MMLV反转录酶在有双功能引物[5’d(AAC TGG AAG AAT TCG CGG CCG CAG GAA T₁₈)p3’]存在的情况下合成第一链，所述双功能引物在Not I的限制性位点的3’末端具有一段oligo(dT₁₈)。在RNase H切刻RNA：cDNA杂合体中的RNA链后，由DNA聚合酶起始第二条链的合成。所产生的cDNA用苯酚/氯仿抽提并在SepharoseCL-4B旋转柱上纯化。在cDNA的另一端连接上Eco RI接头(5’d[AATTCGGCACGAGG]-3’，[GCCGTGCTCC]p-5’)。用Not I消化cDNA以释放在寡聚(dT₁₈-Not I)引物上的位点。对具有Eco RI和Not I悬端的cDNA进行磷酸化以阻止自连接但可以连接到去磷酸的载体上。

选择噬菌体λ载体(λ ExCeI1 Not I/Eco RI/CIP)用于克隆以上所产生的具有Eco RI和Not I悬端的cDNA。λ ExCell衍生自λ Charon载体，其经过工程改造包含内在的线性化pExCell拷贝。在构建和使用lawn细胞(大肠杆菌菌株NM522)的筛选后，使用含目的克隆的噬菌体感染特定的大肠杆菌菌株(NP66)，该菌株能够在体内释放基于pUC的环状的自主复制的噬菌粒pExCell。由在λ ExCeI1 DNA内的噬菌粒两侧的attL和attR位点之间的位点特异性重组实现pExCell的体内切除。NP66带有切除所需要的、由热诱导启动子控制的辅助蛋白。通过用λ ExCeI1感染NP66然后在能使这些辅助蛋白表达的39℃生长，实现体内切除。

将连接的载体和cDNA片段包装在体外包装系统(Ready to Go Lambda包装试剂盒，Amersham Pharmacia Biotech.USA)中。用于λ DNA的体外包装系统使用单个溶原体，所述溶原体编码所有的必须包装蛋白。用大肠杆菌溶原体制备提取物，其中所述原噬菌体携带一个cos突变。所述cos突变是在抑制内源原噬菌体包装的cos位点的一个缺失；然而外源重组DNA被有效的包装。包装提取物也缺失Eco K和其它识别甲基化DNA的DNA限制系统，这样产生甲基化和未甲基化cDNA的有效包装。

实施例-4

文库的筛选和阳性噬菌体文库的鉴定、扩增和纯化

将针对所纯化的SOD产生的抗体用作探针筛选文库。用基于化学发光的检测方法(ECL^TM蛋白印记分析系统，Amersham Inc.)检测固定的抗体。通过在SM缓冲液(100mM NaCl，8mM MgSO₄，50mM Tris-HCl和0.01％明胶)中制备包装反应物的系列稀释液将文库铺在平板上。使用适合于皮氏平板(82mm)的、耐高压加热并干燥的硝酸纤维素滤膜。将膜浸泡在10mM异丙基-β-D硫代半乳糖苷(下文称为IPTG)中5分钟，空气干燥并用于筛选。在孵育铺在平板中的文库6h后或当噬菌斑开始出现时，用IPTG浸泡过的硝酸纤维素滤膜覆盖平板。轻轻地通过平口镊子夹持对侧边缘覆盖滤膜并将滤膜置于平板的中心，不带入任何气泡。一旦滤膜与平板的接触形成就不再移动滤膜。再次将平板-滤膜(颠倒)在37℃孵育4h。孵育后，用18号针通过不对称的刺孔对平板进行标记用于以后的比对。将滤膜从平板移走并使蛋白侧朝上。利用显色X光、滤膜和平板的正确方向选择阳性嗜菌斑。嗜菌斑在标记之后挖出并放在300μl SM缓冲液中室温孵育。2h后，以13,000xg对其离心10min。将上清收集在新的无菌试管中然后加入30μl氯仿。将扩增的噬菌体重新铺板用于第二次和第三次筛选。在第三次筛选后，挖取阳性嗜菌斑的中心用于体内嗜菌粒释放。对于最初的筛选，采用10⁵噬菌体形成单位(pfu)并转移到膜上。膜与多克隆抗体杂交并按照ECl说明书显色。获取三个强阳性克隆并将其用于第二次筛选，产生70％阳性信号。将一些克隆用于第三次筛选并且在第三次筛选后，这次所有的克隆都产生了100％的阳性信号。使用所有阳性嗜菌斑用于释放含所述克隆片段的载体pExCell。

实施例-5

嗜菌粒pExcell从所选择的克隆中的体内释放

根据大肠杆菌NP66释放菌株在含50μg/ml壮观霉素、30μg/ml氯霉素和0.2％麦芽糖的2X YT培养基(2X YT培养基：终体积为1升的含12g胰蛋白胨、24g酵母提取物和5g甘油的蒸馏/去离子水)制备宿主细胞。培养物在32℃过夜培养。孵育5ml含50μg/ml壮观霉素、30μg/ml氯霉素和0.2％麦芽糖的2X YT与50μl所述过夜培养物。该培养物在32℃摇动培养至A₆₀₀为0.5-0.8，并且通过3000X g离心收集细胞。将团块重悬在含50μg/ml壮观霉素的NZCYM肉汤(NZCYM b肉汤：终体积为1升的含10g酪蛋白水解物、5g酵母提取物、5g NaCl、1g酪蛋白氨基酸和2g MgSO_4·7H₂O的蒸馏/去离子水)中，至最终A₆₀₀为2.0。细胞在1h内使用。为了释放pExCell，将100μl制备的NP66细胞置于15ml无菌玻璃试管中并在39℃孵育20min以允许attL和attR位点之间位点特异性重组所需要的His蛋白的表达。将100μl噬菌体SM溶液加入到所述细胞中并在39℃再次孵育20min。向这种NP66/噬菌体混合物中加入200μl1M柠檬酸钠以终止λ ExCell对NP66的感染，并加入5ml预热(32℃)的含50μg/ml壮观霉素的2X YT肉汤。培养物在32℃适度摇动孵育1.5h以产生“释放的培养物”。为了制备用于随后的pExCell DNA分离的过夜培养物，将50μl释放培养物在37℃、含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB(LB培养液：终体积为1升的含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠的蒸馏/去离子水)培养液中孵育。

实施例-6

所克隆的cDNA的分析和测序

将培养物划线培养并用吸液管头随机挑取菌落。将菌落悬在50μl裂解缓冲液中(菌落裂解缓冲液：TE(Tris-Cl 10mM、1mM EDTA，pH8.0)和0.1％吐温20)，在水浴中煮沸10min接着在冰上瞬间冷却。利用每种0.2μM的“正向”(5’-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3’)和“反向”(5’-CACAGGAAACAGCTATGACC-3’)两侧引物、20μM dNTP和1单位水生栖热菌(Thermus aqueticus)(下文称为Taq)DNA聚合酶(购自M/S.Qiagen，Germany)，在1X PCR缓冲液(20mM Tris-Cl(pH，8.4)、50mM KCl、1.5mM MgCl)中扩增释放在菌落裂解物中的质粒。在本发明中，dNTP指脱氧核苷三磷酸，其包含腺嘌呤脱氧核苷三磷酸(下文称为dATP)、鸟嘌呤脱氧核苷三磷酸(下文称为dGTP)、胞嘧啶脱氧核苷三磷酸(下文称为dCTP)和胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸(下文称为dTTP)。热循环仪程序由94℃持续40sec，52℃持续1min和72℃持续2min的30个循环组成。然后72℃延伸5min。扩增产物在含溴化乙锭(0.5μg/ml的终浓度)的1X TAE缓冲液(TAE缓冲液：0.04M Tris-醋酸盐、0.002M EDTA，pH8.5)中的1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，并通过与标准DNA分子量标记的比较分析插入物的正确大小。用QIAGEN plasmid mini试剂盒(Cat#12125)分离质粒。将它们定量并在1％琼脂糖凝胶上检测，使用BigDye terminator(version 3.1)cyclesequencing mix(Applied Biosystems，USA)在自动DNA测序仪(ABI Prism310，Genetic Analyzer，Applied Biosystems，USA)上进行测序。基本上按照相应生产商的阐述的操作规程进行。所用测序引物为“正向”5’-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3’和“反向”5’-CACAGGAAACAGCTATGACC-3’。

SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征：

(A)长度：365个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：双链

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列说明：SEQ ID NO：4

5’CAAGAGGGAGATGGCCCAACTACTGTGACCGGAAACATTTCTGGCCTCAAGCCTGGGCTTCATGGTTTCCATGTTCATGCTCTTGGGGACACAACCAATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAATCCTGCTGGCAAAGAGCATGGGTCTCCTGAAGATGAGACTCGTCATGCTGGTGATCTTGGAAATATCACTGTTGGGGATGACGGAACTGCTTGCTTCACAATTGTTGACAAACAGATTCCTCTCACTGGACCACACTCTATCATTGGTAGGGCTGTTGTTGTCCATGCAGATCCTGATGACCTTGGCAAGGGTGGACATGAGCTTAGCAAATCCACTGGAAATGCTGGTGGCAGGAT　3’

实施例-7

在URL www.ncbi.nlm.nih.gov.上可获取的基因数据库中利用Basic LocalAlignment Search Tool(下文称为BLAST)查找实施例6中提及的序列的同源性。从结果中可以清楚的看出所述序列与数据库中所提交的SOD序列具有80-90％之间的同源性。

实施例-8

利用cDNA末端的快速扩增(下文称为RACE)克隆全长基因

利用cDNA末端的快速扩增(RACE)从喜玛萎陵菜分离全长的SOD基因。RACE从信使RNA模板的一个确定的内部位点和3’或5’末端的未知序列之间扩增DNA序列(Frohman，M.A.，Dush.M.K.and Martin，G.R.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8998-9002；5962271和美国专利号5962272)。利用一对基因特异性引物分别产生所述基因的5’和3’末端。利用部分cDNA序列(SEQ ID No.1)设计两对引物。这样设计引物以使所扩增的5’和3’末端彼此重叠一小段核苷酸。针对5’RACE，基因特异性引物(下文称为GSP1)5’-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCC A-3’用于初次PCR，巢式基因特异性引物(下文称为NES1)5’-GTCATCAGGGTCTGCATGGACAACAAC-3’用于第二次PCR(RACE)。使用1μl 10μM巢式引物储存液用于第二次PCR。针对3’RACE，设计用于初次PCR的基因特异性引物(以下称为GSP2)5’-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3’和巢式引物(下文称为NES2)5’-TTGC ATGTC AACTGGACC AC ATTTC AA-3’。这样设计引物以使所扩增的5’和3’末端彼此重叠一小段核苷酸。

使用修饰的锁定oligo(dT)引物和SMART II A oligo(dT)引物合成用于5’-RACE的cDNA。所述修饰的oligo(dT)引物，称为5’-RACE CDS引物(5’-CDS)，在3’末端具有两个简并核苷酸位点。

在单个反应中利用称为反转录酶的酶反转录1μg的总RNA以产生为5’和3’RACE准备的cDNA。对于5’cDNA的合成，使用含RNA的反应混合物中的1μM 5’-CDS引物和1μM SMART II oligo(dT)引物进行反应。利用常规的反转录方法合成3’-RACE cDNA，但使用特定的oligo(dT)引物。该3’-RACE CDS引物A(3’-CDS)引物与5’-CDS一样包含锁定核苷酸位点并且在其5’末端还有一个智能序列(smart sequence)部分。加入无菌H₂O至每个反应的终体积为5μl，混合并离心。反应混合物在70℃孵育2h并在冰上冷却2min。向每个反应中加入第一链缓冲液(50mM Tris-Cl(pH，8.3)、75mMKCl和6mM MgCl₂)、1mM dNTP、2mM DTT和反转录酶并在通气孵育箱中于42℃孵育1.5hr。将第一链反应产物用100μl麦黄酮-EDTA缓冲液(10mM麦黄酮-KOH(pH8.5)，1.0mM EDTA)稀释并在72℃加热反应管7min。(反转录系统是SMART RACE cDNA扩增试剂盒的一个组分，其来自BD Biosciences，USA)。

用于RACE的引物序列如下(购自BD Biosciences，USA，是RACE试剂盒的一部分)

引物引物序列

SMART II A寡核苷酸 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACG

CG GG-3’

3’-RACE CDS引物A(3’-CDS) 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

AC(T)₃₀N_-1N-3’

5’-RACE CDS引物(5’-CDS) 5’-(T)₂₅N_-1N-3’

10X通用引物混合物A(UPM)长引物：5‘-TAATACGACTCACTATAGG

GCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

短引物：5‘-CTAATACGACTC ACTATAGGGC-3’

巢式通用引物A(NUP) 5’-AAGCAGTGGTATCAACGC AGAGT-3’

利用0.2μM GSP1、GSP2引物和1X通用引物(UPM)、0.2mM dNTP以及1X BD聚合酶混合物扩增5’和3’RACE cDNA。热循环仪程序由94℃持续30sec、68℃持续30sec和72℃ 3min的30个循环组成。将反应扩大到50μl的规模，并在PCR完成之后，将45μl PCR样本在含溴化乙锭(0.5μg/ml的终浓度)的TAE缓冲液中的1.5％的琼脂糖凝胶上电泳。如果需要，将剩余的扩增产物储存在-20℃用于第二次PCR。将扩增子从凝胶上切除并使用德国M/S Qiagen的QIAEX II凝胶提取试剂盒按照生产商的说明从凝胶中洗脱DNA。将纯化的DNA克隆到pGEM-T easy载体(Promega，USA)中，用Qiagen plasmid mini-isolation试剂盒分离质粒并在自动DNA测序仪(ABI Prism 310，Genetic Analyzer，Applied Biosystems)上利用BigDyeterminator(version 3.1)cycle测序混合物(Applied Biosystems，USA)测序。基本上按照相应生产商所述的方法进行操作规程。通过BLAST分析RACE产物。

(3)SEQ ID NO：2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：856个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：双链

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列说明：SEQ ID NO：2

5’ACGGGGGGGGGACTGAAATAAATAGAGAGGGTCATAGTCACATTTGCATTTAGGTATCTGATTCCATTCACAAACCTCCAACTCCCACCTCTCTCTCTATTTCTCTTCATCTTCATCATCTTAGGGTGCACTGAGATCACTTTGAAACATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTTAGCTCCAGTGAGGGTGTTGCTGGAACTATCCTCTTTACCCAAGAGGGAGATGGCCCAACTACTGTGACCGGAAACATTTCTGGCCTCAAGCCTGGGCTTCATGGTTTCCATGTTCATGCTCTTGGGGACACAACCAATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAATCCTGCTGGCAAAGAGCATGGGTCTCCTGAAGATGAGACTCGTCATGCTGGTGATCTTGGAAATATCACTGTTGGGGATGACGGAACTGCTTGCTTCACAATTGTTGACAAACAGATTCCTCTCACTGGACCACACTCTATCATTGGTAGGGCTGTTGTTGTCCATGCAGATCCTGATGACCTTGGCAAGGGTGGACATGAGCTTAGCAAATCCACTGGAAATGCTGGTGGCAGGATAGCTTGTGGTATTATTGGCCTTCAAGGATGAACTGGACCAGGGAGCGAAACACAGGCATCTTGTTGAATTAAAACTTGAGATATTAGCGAACTCTTCGGAATTGAGTATTGAAACAAGGAATACATTTGTCATTACCAATACGTTTGGCTTAGACCTGTATTCTGTATCTCAATAGTTTTCTGTGTGGTTGTTTGACAGTTATTTGTGCTCAGGCTATTTCAAAGGGATAAACACAGTAACTTTCTTGCTTTGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAA3’

实施例-9

扩增SOD的编码序列(下文称为CDS)并克隆至表达载体

通过PCR利用从起始密码子到终止密码子设计的正向引物5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’和反向引物5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’扩增SOD的CDS。将扩增产物克隆至pQE 30表达载体中并转化至感受态大肠杆菌细胞中。利用标准的质粒分离操作规程(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.1989.MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)分离该质粒并在自动DNA测序仪(ABI Prism 310，Genetic Analyzer，Applied Biosystems)上利用BigDye terminator(version 3.1)cycle测序混合物(Applied Biosystems，USA)进行测序以确认插入物的克隆。基本上按照生产商所述的方法进行操作规程。

(4)SEQ ID NO.3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：459个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：双链

(D)拓扑：环状

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列说明：SEQ ID NO.3

5’ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTTAGCTCCAGTGAGGGTGTTGCTGGAACTATCCTCTTTACCCAAGAGGGAGATGGCCCAACTACTGTGACCGGAAACATTTCTGGCCTCAAGCCTGGGCTTCATGGTTTCCATGTTCATGCTCTTGGGGACACAACCAATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAATCCTGCTGGCAAAGAGCATGGGTCTCCTGAAGATGAGACTCGTCATGCTGGTGATCTTGGAAATATCACTGTTGGGGATGACGGAACTGCTTGCTTCACAATTGTTGACAAACAGATTCCTCTCACTGGACCACACTCTATCATTGGTAGGGCTGTTGTTGTCCATGCAGATCCTGATGACCTTGGCAAGGGTGGACATGAGCTTAGCAAATCCACTGGAAATGCTGGTGGCAGGATAGCTTGTGGTATTATTGGCCTTCAAGGATGA3’

(5)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：152个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列说明：Pro SEQ ID NO.1

MAKGVAVLSSSEGVAGTILFTQEGDGPTTVTGNISGLKPGLHGFHVHALGDTTNGCMSTGPHFNPAGKEHGSPEDETRHAGDLGNITVGDDGTACFTIVDKQIPLTGPHSIIGRAVVVHADPDDLGKGGHELSKSTGNAGGRIACGIIGLQG

实施例10

所表达的蛋白的诱导和纯化

将含萎陵菜的SOD基因的大肠杆菌培养在37℃、含100μg ml^-1和25μgml^-1卡那霉素的100ml LB培养液中。当培养物生长至在600nm处的吸光度为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM。分别加入CuSO₄和ZnSO₄至终浓度为100ppm和2ppm。在37℃诱导SOD蛋白表达5h后，收集细胞、洗涤并重悬到4ml裂解缓冲液(含300mM NaCl和10mM咪唑50mM NaH₂PO₄缓冲液，pH8.0)中。超声处理所述细胞重悬液并通过以12000g、4℃离心20min使裂解物变澄清。然后将上清倒入装载有镍-氮川三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖的柱子上，用洗涤缓冲液(含300mM NaCl和20mM咪唑的50mM NaH₂PO₄缓冲液，pH8.0)洗涤，用洗脱缓冲液(含300mM NaCl和250mM咪唑的50mM NaH₂PO₄缓冲液，pH8.0)洗脱SOD蛋白。通过10％ SDS-PAGE，利用银染可视化所述蛋白对所纯化的SOD进行评估(图4A)。

在高压加热所纯化SOD之前和之后对所述蛋白进行估计，显示有±25％的蛋白损失。由于使用50μl蛋白样本用于检测SOD活性，因此在计算酶活性时计算蛋白的损失。反应基质含0.05mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、5.7X10^-5M氮蓝四唑(下文称为NBT)、9.9 X 10^-3M蛋氨酸、1.17 X 10^-6M核黄素和0.025％ Triton X-100，终体积为3.0ml。通过使用光纤光源(Nikon)用1000μ Einstein/m/秒的光强度照射而起始反应(在30ml玻璃小瓶中进行)。2min后终止所述反应并在560nm处读取吸光度。

始终进行对照反应，其中所有步骤和成分都与上述完全相同，除了将所纯化的酶替换为等体积的均质缓冲液。用与对照反应相比显色的百分抑制来表示SOD的活性(抑制越高，SOD活性越高)。活性数据如图1所示。

实施例-11

所纯化的SOD在不同温度时的SOD活性

在-10至80℃的温度范围内以及实施例10所述的缓冲组合物(另外在反应混合物中加入50％甘油以防止在低温下冻结)中检测所纯化的SOD酶。100ml容量的玻璃烧杯中装满酒精(在-10、-5、0℃的温度下工作)或蒸馏水(在其它温度下工作)以在检测SOD时保持反应媒介的温度。在期望温度下预平衡反应媒介和酶以避免在达到期望温度的过程中的时间滞后。如从图1中可以看出所述酶在0℃显示最高的活性(87.5％的抑制)。甚至在低至-10℃时，所述酶仍具有功能。预计所述酶低于-10℃的温度时，还有功能。如实施例10中所提及，在所有温度下都一直进行对照反应。

实施例-12

通过非变性凝胶的活性染色对SOD定位

如Beauchamp和Fridovich的阐述(Anal.Biochem.1971；44：246-287)，通过活性染色在10％聚丙烯酰胺凝胶上定位所纯化的SOD。电泳后，用蒸馏水漂洗所述凝胶之后在含2.5mMNBT的50ml磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)中，室温避光孵育30min。然后将凝胶浸入1.17 X 10^-6M核黄素中持续20min，然后在光源(Nikon)下曝光。曝光导致O₂ ^-的成像，其将NBT转化成可溶的紫色的甲

(formazan)。如图4B所示紫色在SOD停留的位置以外的整个凝胶上形成。

优点

本发明的主要优点是：

1.已经克隆了萎陵菜的可耐高压加热的、在零度以下温度具有功能的SOD基因。

2.将从萎陵菜分离的SOD基因在大肠杆菌中表达。

3.将来自萎陵菜的基因在大肠杆菌中表达以合成耐高压加热的SOD蛋白。

4.将来自萎陵菜的基因在大肠杆菌中表达可合成耐高压加热且在零度以下温度具有功能的SOD蛋白。

Claims

1.从喜玛萎陵菜获取的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA，其为SEQ ID No.2，其中所述cDNA含856个核苷酸碱基。

2.如权利要求1的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA，其中所述cDNA具有连同编码前序列和编码后序列的完整编码序列。

3.超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA，其为SEQ ID No.3，其中所述编码cDNA含459个核苷酸碱基。

4.超氧化物歧化酶(SOD)多肽，其为SEQ ID No.1，其中所述多肽含152个氨基酸。

5.如权利要求4所述的超氧化物歧化酶(SOD)多肽，其中所述多肽能够耐高压加热。

6.如权利要求4所述的超氧化物歧化酶(SOD)多肽，其中所述多肽在<-10℃至+80℃的温度范围内具有功能。

7.一对用于扩增超氧化物歧化酶(SOD)基因的编码cDNA SEQ ID No.3的引物，其中

正向引物为5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’；

反向引物为5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’。

8.一种鉴定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQ ID NO.3的方法，所述SEQ ID NO.3编码具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽SEQ ID No.1，其中所述方法包含以下步骤：

a)从萎陵菜的叶子中分离mRNA；

b)根据从步骤a)获取的mRNA合成cDNA；

e)从步骤d)获取的阳性cDNA克隆中分离DNA；

f)利用引物扩增所述DNA，该引物包括：

正向引物：5’-GTTGTAAAACGACGTGCCAGT-3’

反向引物：5’-CACAGGAAACAGCTATGACC-3’；

h)利用不同引物对通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)扩增从步骤e)获取的cDNA的末端以得到期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全长DNASEQ ID NO.2，其中所述引物包含：

正向引物(GSP1)：5’-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3’

反向引物(NES1)：5’-GTCATC AGGGTCTGC ATGGAC AACAAC-3’

正向引物(GSP2)：5’-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3’

反向引物(NES2)：5’-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3’

SMART II A寡核苷酸：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’

3’-RACE CDS引物A(3’-CDS)：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀N_-1N-3’

5’-RACE CDS引物(5’-CDS)5’-(T)₂₅N_-1N-3’

通用引物混合物A(UPM)：短链：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’

巢式通用引物A(NUP)：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’

i)利用期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全长DNA SEQ ID NO.2从起始密码子到中止密码子设计的一对引物扩增超氧化物歧化酶(SOD)的编码序列SEQ ID No.3，其中所述引物具有以下序列：

正向引物：5’-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3’

反向引物：5’-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3’

j)将从步骤g)获取的扩增产物克隆到pQE30表达载体中，然后将其转化到感受态大肠杆菌细胞中以得到表达构建体；

k)通过常规方法分离质粒DNA，然后通过测序以确认所述SOD基因。

9.如权利要求9所述的方法，其中针对所纯化的SOD产生所述多克隆抗体并用于根据嫩叶mRNA合成的cDNA文库的筛选。

10.如权利要求9所述的方法，其中采用10⁵噬菌斑形成单位(pfu)用于初次筛选。

11.如权利要求11所述的方法，其中从所述初次克隆中获取了三个强阳性克隆。

12.如权利要求12所述的方法，其中采用所述阳性克隆用于第二次筛选，产生大约70％的阳性克隆。

13.如权利要求13所述的方法，其中随机采用所述阳性克隆用于第三次筛选，在第三次筛选后所述克隆产生100％阳性信号。

14.如权利要求9所述的方法，其中设计所述RACE引物使得所扩增的5’和3’末端彼此重叠一小段核苷酸。

15.如权利要求9所述的方法，其中所述全长SOD基因SEQ ID No.2含856个核苷酸碱基。

16.如权利要求16所述的方法，其中所述全长SOD基因SEQ ID No.2具有连同编码前序列和编码后序列的完整编码序列。

17.如权利要求9所述的方法，其中所述编码cDNA SEQ ID No.3含459个核苷酸碱基。

18.如权利要求18所述的方法，其中所述SOD基因的编码序列SEQ IDNo.3与编码超氧化物歧化酶(SOD)的聚核苷酸对应。

19.一种表达构建体，其包含超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQ ID No.3的核苷酸序列、选择标记和终止子序列，所述核苷酸序列编码具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽SEQ ID No.1。