CN118085023A

CN118085023A - 一种短肽的制备方法

Info

Publication number: CN118085023A
Application number: CN202410161795.8A
Authority: CN
Inventors: 刘天齐; 周继; 焦松; 顾文婷
Original assignee: Changzhou Zhishi Shengchuang Technology Co ltd
Current assignee: Changzhou Zhishi Shengchuang Technology Co ltd
Priority date: 2024-02-05
Filing date: 2024-02-05
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2044-02-05
Also published as: CN118085023B

Abstract

本发明涉及一种短肽的制备方法，包括以下步骤：将编码目标蛋白的基因序列与His‑SUMO标签序列融合，并将融合后的序列连接至表达载体上，得到重组表达载体；其中，目标蛋白序列中含有至少两种短肽，且短肽之间通过linker进行连接，所述linker选自DGE序列，或以天冬氨酸为N端第一个氨基酸且以谷氨酸为C端第一个氨基酸的序列；将重组表达载体转入宿主细胞中得到重组细胞，发酵培养重组细胞使其表达融合蛋白；从重组细胞中提取融合蛋白，对融合蛋白进行组合酶切和纯化，得到目标蛋白。本发明的制备方法降低了合成难度，提高了生产效率，减少杂质的产生，降低了纯化难度，生产一种及同时生产多种短肽能实现至少95％以上的纯度，且具有较高的回收率。

Description

一种短肽的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽制备技术领域，尤其涉及一种短肽的制备方法。

背景技术

短肽是一种由少数氨基酸组成的蛋白质片段，也被称为短链肽或低聚肽。肽是介于氨基酸和蛋白质之间的物质，具有精准的蛋白质片段的特点。短肽的分子量小，易被人体吸收，且具有多种生物活性，因此在生物化学与分子生物学领域具有广泛的研究价值。

短肽可以作为局部药物应用于伤口愈合、抗菌和抗炎等领域。在化妆品中，短肽可被用于光促进胶原蛋白合成、提高皮肤弹性和保湿等方面，有助于改善皮肤质量和延缓皮肤衰老。在食品中，短肽可以作为调味剂和添加剂用于食品和饮料中。随着研究的深入，短肽的应用价值在医疗、食品和化妆品等领域得到广泛的应用。

总之，对短肽的研究背景主要是基于其在生物化学与分子生物学中的重要性和应用价值。通过深入研究和开发短肽的应用，可以更好地发挥其生理功能和生物活性，为人类健康和生活质量的提高做出贡献。

目前对于特定序列的短肽合成主要采用固相肽合成技术，主要将带有氨基保护基团的氨基酸羧基端固定到不溶性树脂上，脱去该氨基酸上的氨基保护基团，同下一个氨基酸活化羧基形成酰胺键，从而将氨基酸通过肽键连接在一起形成肽链，再经过切割、纯化等步骤得到目标短肽。然而，短肽的化学合成法通常需要使用大量的有机溶剂和酸碱试剂，这些试剂可能对人体和环境产生负面影响。其次，化学合成法合成的短肽纯度较低，需要经过多次提纯才能得到高纯度的目标短肽。因此，开发一种短肽的绿色合成方法有利于短肽的合成以及应用。

当然，目前也有一些生物合成法制备短肽的方法。如中国专利CN115807050A中公开了一种短肽的制备方法，首先合成编码融合蛋白的基因，将其构建成重组质粒，然后转入宿主菌中，发酵培养诱导蛋白表达，分离蛋白，纯化后得到目标短肽。但以上生物合成方法在微生物内进行表达时，往往会形成包涵体蛋白，影响蛋白的表达；同时在纯化过程中，也需要对得到的包涵体蛋白进行复溶再进行后续纯化操作，增加了操作步骤。而且，现有技术无法在保证纯度足够的前提下实现多种短肽的同时制备。鉴于此，提出本发明。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种短肽的生物合成方法，采用基因工程菌重组表达合成策略，筛选适当的蛋白标签，并将多种短肽通过适当的linker串联，结合富集提取及特定的纯化方法进行短肽的提纯，降低了合成难度，提高了生产效率，同时减少了杂质的产生。

本发明的第一个目的是提供一种短肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、将编码目标蛋白的基因序列与His-SUMO标签序列融合，并将融合后的序列连接至表达载体上，得到重组表达载体；其中，所述编码目标蛋白的基因序列中含有至少两种短肽的编码序列，且短肽之间通过linker进行连接，所述linker选自DGE序列，或以天冬氨酸为N端第一个氨基酸且以谷氨酸为C端第一个氨基酸的序列；

S2、将S1的重组表达载体转入宿主细胞中得到重组细胞，发酵培养重组细胞使其表达融合蛋白；

S3、从重组细胞中提取融合蛋白，将融合蛋白与SUMO蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽蛋白与His-SUMO标签，随后将短肽蛋白与AspN蛋白酶和GluC蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽与linker，得到短肽成品。

进一步地，在步骤S1中，SUMO标签序列如SEQ ID NO.1所示(MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLM EAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIG)。

进一步地，所述目标蛋白含有的短肽包括但不限于KKIIIIKK(SEQ ID NO.2)或RRIIIIRR(SEQ ID NO.3)中的一种或两种。当只需要获得一种短肽时，该融合肽的构建方式为His-SUMO-短肽；当需要同时获得多种短肽时，融合肽的构建方式为两个短肽之间通过linker肽段连接，并在短肽N端连接His-SUMO，即His-SUMO-短肽1-linker-短肽2。

进一步地，在步骤S1中，表达载体可根据宿主细胞的选择来常规确定，包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pTrc系列、pUC系列等载体；所述的pET系列载体包括pET28a、pET29a、pET32a等；所述的Duet系列载体包括pETDuet、pRSFDuet、pCDFDuet等；所述的pTrc系列载体包括pTrc99a等；所述的pUC系列载体包括pUC18和pUC19等。

进一步地，在步骤S2中，宿主细胞包括但不限于微生物细胞。如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、假单胞菌等。

进一步地，在步骤S2中，所述发酵培养为在适当条件下培养适当时间进行重组表达，当宿主细胞为大肠杆菌时，在种子培养基中于15-42℃下培养6-72h，得到种子液，然后将重组细胞种子液转移至发酵培养基中，于30-40℃下发酵培养。

进一步地，在步骤S2中，发酵过程中包括以下步骤：当出现溶氧反弹时，流加补料培养基，补料培养基包含600-800g/L甘油和5-20

g/LMgSO₄·7H₂O。

进一步地，流加速度为8-12g/L/h。

进一步地，种子培养基包括以下组分：酵母粉3-10g/L，蛋白胨5-15g/L，氯化钠5-20g/L。

进一步地，发酵培养基包括以下组分：酵母粉10-15g/L、蛋白胨1-20g/L、甘油5-15g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 6-12g/L、KH₂PO₄ 1-5g/L、NH₄Cl 1-5g/L、Na₂SO₄ 0.5-1.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-1.0g/L，pH6.8-7.0。

进一步地，在步骤S3中，所述提取融合蛋白为破碎重组细胞获得上清液后，采用亲和层析法进行提取。具体地，将所述融合蛋白过镍柱，使镍柱与His标签结合固定融合蛋白，随后利用咪唑溶液进行洗脱，得到融合蛋白。

进一步地，咪唑浓度为20-500mM。

进一步地，在洗脱后还包括对含有融合蛋白的洗脱液进行超滤的步骤，所述超滤为采用超滤膜替换缓冲液为pH7.5-8.5的缓冲液。

进一步地，在步骤S3中，当仅含有一种短肽时，将融合蛋白与SUMO蛋白酶混合，酶切反应完成后分离目标蛋白与His-SUMO标签；当含有多种短肽时，将融合蛋白与SUMO蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽蛋白与His-SUMO标签，随后将短肽蛋白与AspN蛋白酶和GluC蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽与linker。

进一步地，在步骤S3中，两次酶切反应完成后，进一步通过超滤和/或纳滤进行分离和纯化。

优选地，在步骤S3中，酶切反应完成后分离短肽蛋白与His-SUMO标签时，将酶切产物通过镍柱，收集未被镍柱吸附的部分(粗品)，进一步通过超滤对短肽蛋白进行纯化，并替换短肽蛋白的缓冲液。

优选地，在步骤S3中，酶切反应完成后分离短肽与linker时，超滤去除蛋白酶，随后纳滤分离短肽与linker。

进一步地，超滤和纳滤的膜尺寸可根据不同蛋白分子量差异选择。本发明中，超滤膜截留分子量为3-30kD，纳滤膜截留分子量为300-800D。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过SUMO标签蛋白和特定的连接肽linker与目标短肽的结构设计，并配合相应的提取和纯化方法，实现了多种短肽的生物合成，并且可以一次性生成多种短肽，同时纯度达到95％以上，而且采用本发明的方法不但可以增加融合蛋白的表达量，且选用适当的标签可以使融合蛋白抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能，减少了化学合成过程中产生的难除杂质，降低了纯化难度，从而提高了粗肽和成品的纯度和收率。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明质粒pZT-24-003-3图谱；

图2为ZT-24-003-1制备KKIIIIKK短肽液相色谱结果；

图3为ZT-24-003-2制备RRIIIIRR短肽液相色谱结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明采用的技术方案如下：

一种短肽的制备方法，包括以下步骤：

A1、构建一种短肽的融合肽；

A2、构建一种能够表达A1所述融合肽的重组表达载体；

A3、将A2所述表达载体转化入微生物细胞中获得重组微生物；

A4、发酵培养A3所述微生物细胞；

A5、收集A4获得的微生物菌体，并将菌体破碎；

A6、利用A5获得的破碎菌体产物纯化得到A1所述融合肽；

A7、对A6中获得的融合肽酶切，并进一步纯化得到目标短肽。

实施例1不同融合蛋白标签在生产KKIIIIKK和RRIIIIRR短肽方面比较

KKIIIIKK短肽(短肽1)和RRIIIIRR短肽(短肽2)中均存在着4个正点氨基酸，当直接串联后在微生物中表达时，会导致得到的蛋白不可溶，形成包涵体的形式，不利于蛋白的有效表达和分离纯化。因此，在短肽的N端融合一定的蛋白标签，使得短肽以融合蛋白的形式表达，有利于最终融合蛋白的可溶性表达。

在KKIIIIKK和RRIIIIRR短肽的中间加入linker肽段DGE，使得最终KKIIIIKK和RRIIIIRR能够通过酶切割的方式制备，该串联短肽命名为短肽3。分别在短肽3的N端融合Flag、GST、MBP以及SUMO标签，以比较不同蛋白标签对于短肽的可溶性表达的影响。为此，分别构建在短肽3的N端融合不同蛋白标签的重组表达质粒。首先由华大基因合成在短肽3N端添加Flag标签的基因片段，然后通过PCR的方式将该基因片段整合到质粒pET32a上，得到表达Flag-短肽3融合蛋白的重组质粒。以pET-GST质粒为模板克隆GST片段，以pCold-MBP质粒为模板克隆MBP片段，以pET28a-sumo为模板克隆SUMO片段，以合成的含短肽3的基因片段为模板克隆短肽3的片段，分别通过Overlap PCR的方式将短肽3的片段分别与GST片段、MBP片段和SUMO片段融合后克隆至质粒pET32a上，得到表达GST-短肽3、MBP-短肽3以及SUMO-短肽3融合蛋白的重组质粒。将这些质粒分别转化至E.coli BL21(DE3)中，获得表达融合蛋白的重组菌。

进一步将这些菌株接种至LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)中进行培养并诱导融合蛋白表达。测定各菌株融合蛋白的可溶性表达量。经检测，在短肽3的N端融合Flag标签时未检测到蛋白表达；在短肽3的N端融合GST标签时融合蛋白主要是包涵体表达。在短肽3的N端融合MBP标签和SUMO标签时均可以检测到显著的蛋白可溶性表达，表达量分别为0.011mM和0.043mM。根据融合蛋白的可溶性表达量，最终选择SUMO标签用于短肽的制备。

实施例2KKIIIIKK短肽生产菌株的制备

首先构建制备KKIIIIKK八肽的重组表达载体。分别合成引物P1和P2，取等体积的两条引物混合，用PCR仪95摄氏度加热5分钟，再梯度降温，每10秒钟降一度，60个循环，最后降温到25度，得到含KKIIIIKK八肽编码序列的双链DNA；使用引物P3和P4，以pET28a-sumo为模板，进行PCR，扩增并纯化得到质粒骨架；将得到的两条双链DNA利用Gibson试剂进行连接并转化入E.coli DH5α中，使用含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选，得到的阳性克隆进行测序验证。验证正确的质粒命名为pZT-24-003-1。

将pZT-24-003-1转化入E.coli BL21(DE3)中，利用含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选，得到的阳性克隆利用引物P5/P6进行PCR验证，验证正确的菌株命名为ZT-24-003-1。

引物P1：

CTCATCGTGAACAGATTGGTAAAAAGATCATTATCATCAAgAAGT AACAAAGCCCGAAAGGAAG

引物P2：

CTTCCTTTCGGGCTTTGTTACTTcTTGATGATAATGATCTTTTTACC AATCTGTTCACGATGAG

引物P3：ACCAATCTGTTCTCTGTGAG

引物P4：TAACAAAGCCCGAAAGGAAG

引物P5：GAAATGGACTCCTTAAGATTC

引物P6：GCTAGTTATTGCTCAGCGGTG

实施例3RRIIIIRR短肽生产菌株的制备

首先构建制备RRIIIIRR八肽的重组表达载体。分别合成引物P7和P8，取等体积的两条引物混合，用PCR仪95摄氏度加热5分钟，再梯度降温，每10秒钟降一度，60个循环，最后降温到25度，得到含RRIIIIRR八肽编码序列的双链DNA；使用引物P3和P4，以pET28a-sumo为模板，进行PCR，扩增并纯化得到质粒骨架；将得到的两条双链DNA利用Gibson试剂进行连接并转化入E.coli DH5α中，使用含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选，得到的阳性克隆进行测序验证。验证正确的质粒命名为pZT-24-003-2。

将pZT-24-003-2转化入E.coli BL21(DE3)中，利用含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选，得到的阳性克隆利用引物P5/P6进行PCR验证，验证正确的菌株命名为ZT-24-003-2。

引物P7：

CTCATCGTGAACAGATTGGTCGTCGCATCATTATCATCCGTCGCT AACAAAGCCCGAAAGGAAG

引物P8：

CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCGACGGATGATAATGATGCGACGA CCAATCTGTTCACGATGAG

实施例4KKIIIIKK和RRIIIIRR短肽同时生产菌株的制备

首先构建同时制备KKIIIIKK和RRIIIIRR两种短肽的重组表达载体，质粒图谱如图1所示。利用引物9和引物10扩增pET28a-sumo质粒，得到的PCR产物进行纯化。纯化后的质粒利用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化反应，然后利用T4连接酶在常温进行连接反应2h。得到的连接产物转化入E.coli DH5α中，使用含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选，得到的阳性克隆进行测序验证。验证正确的质粒命名为pZT-24-003-3。

引物9：

CTCACAGAGAACAGATTGGTAAAAAGATCATTATCATCAAgAAG GACGGC

引物10：

GAACGTCGCATCATTATCATCCGTCGCTAACAAAGCCCGAAAGG AAG

将pZT-24-003-3转化入E.coli BL21(DE3)中，利用含50μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选，得到的阳性克隆利用引物P5/P6进行PCR验证，验证正确的菌株命名为ZT-24-003-3。

实施例5重组菌株的发酵培养

将实施例1、实施例2、实施例3得到的生产菌株经过平板划线活化，挑取单菌落至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃、摇床转速为200rpm的条件下培养过夜。然后以1％的接种量转接至发酵培养基中。

37℃、200rpm培养5h，添加终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。降温至30℃，继续培养16h左右。在发酵过程中，当出现溶氧反弹时，开始流加补料培养基，流加速度为10g/L/h。所述LB培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。所述发酵培养基的配方为酵母粉12.0g/L、蛋白胨15.0g/L、甘油10g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49g/L，去离子水溶解后，用氨水调pH至6.8-7.0。补料培养基配方为甘油700g/L，MgSO₄·7H₂O 10g/L。

实施例6短肽的液相分析方法

将待测样品稀释一定倍数后，取1.5mL过0.45μm滤膜，使用日本岛津公司生产的LC-16高效液相色谱对样品进行分析。色谱柱为5um shim-pack GIST 4.6x250mm(HSS)。检测器采用紫外检测器，流速为1mL/min，检测波长为210nm，柱温箱为35℃，进样量为10μL。流动相A为含0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B为乙腈。流动相比例为：0-8min，95％流动相A：5％流动相B；8-10min，70％流动相A：30％流动相B；10-13min，5％流动相A：95％流动相B；13-17min，95％流动相A：5％流动相B。

实施例7ZT-24-003-1和ZT-24-003-2分别制备KKIIIIKK和RRIIIIRR

将实施例1和2中ZT-24-003-1和ZT-24-003-2的发酵液离心后，收集离心菌体，并用50mM PB(pH 8.0)溶液清洗两次并重悬。采用高压均质机破碎重悬以后的菌体，破碎的条件为：800-1000bar，破碎3次。采用离心分离的方式去除菌体碎片，收获上清液。

利用镍柱分离分别纯化上清液中含有KKIIIIKK和RRIIIIRR短肽的融合肽，并用含250mM咪唑的缓冲液将融合肽从镍柱上洗脱，并将获得的洗脱液的缓冲液用3kD超滤膜替换为50mM PB(pH 8.0)，从而得到融合肽。进一步利用SUMO蛋白酶将融合肽中的SUMO标签切除，反应条件为16℃，24h，从而得到含有SUMO蛋白和目标短肽的混合溶液。将混合溶液用镍柱分离去除SUMO蛋白，并进一步用3kD超滤膜对目标短肽进行纯化，收集超滤清液即可获得目标短肽。采用液相色谱分析得到的目标短肽。从图2和图3可看出，在获得的短肽中目标短肽纯度高，均大于99％。

实施例8ZT-24-003-3同时制备KKIIIIKK和RRIIIIRR

将实施例4中ZT-24-003-3的发酵液离心后，收集离心菌体，并用50mM PB(pH 8.0)溶液清洗两次并重悬。采用高压均质机破碎重悬以后的菌体，破碎的条件为：800-1000bar，破碎3次。采用离心分离的方式去除菌体碎片，收获上清液。

利用镍柱分离纯化上清液中同时含有KKIIIIKK和RRIIIIRR短肽的融合肽，并用含250mM咪唑的缓冲液将融合肽从镍柱上洗脱，并将获得的洗脱液的缓冲液用3kD超滤膜替换为50mM PB(pH 8.0)，从而得到融合肽。进一步利用SUMO蛋白酶将融合肽中的SUMO标签切除，反应条件为16℃，24h。从而得到含有SUMO蛋白和目标短肽的混合溶液。将混合溶液用镍柱分离去除SUMO蛋白，并用3kD超滤膜进行进一步纯化，收集超滤清液。在超滤清液中加入AspN蛋白酶和GluC蛋白酶，在37℃反应16h，将反应液用3kD超滤膜去除AspN蛋白酶和GluC蛋白酶，收集超滤清液。将得到的超滤清液用500分子量的纳滤膜分离目标短肽和linker肽段，从而获得最终的目的蛋白。通过液相色谱分析KKIIIIKK和RRIIIIRR短肽的含量。根据计算得到，每升发酵液最终可得到0.29g KKIIIIKK八肽和0.35g RRIIIIRR八肽，且纯度≥95％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种短肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3、将融合蛋白与SUMO蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽蛋白与His-SUMO标签，随后将短肽蛋白与AspN蛋白酶和GluC蛋白酶混合，酶切反应完成后分离短肽与linker，得到短肽成品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述目标蛋白含有的短肽包括SEQ ID NO.2-3中的一种或两种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，宿主细胞包括微生物细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述发酵培养为，在种子培养基中培养得到种子液，将重组细胞种子液转移至发酵培养基中进行发酵，发酵过程中包括以下步骤：当出现溶氧反弹时，流加补料培养基，补料培养基包含600-800g/L甘油和5-20g/LMgSO₄·7H₂O。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，流加速度为8-12g/L/h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述提取融合蛋白为破碎重组细胞获得上清液后，采用亲和层析法进行提取。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析法为，将所述上清液过镍柱，使镍柱与His标签结合，然后利用咪唑溶液进行洗脱，得到融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在洗脱后还包括对含有融合蛋白的洗脱液进行超滤的步骤。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，两次酶切反应完成后，进一步通过超滤和/或纳滤进行分离和纯化。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，酶切反应完成后分离短肽蛋白与His-SUMO标签时，将酶切产物通过镍柱，收集未被镍柱吸附的部分，通过超滤对短肽蛋白进行纯化；酶切反应完成后分离短肽与linker时，超滤去除蛋白酶，随后纳滤分离短肽与linker。