CN118076350A - 缺氧诱导因子抑制剂 - Google Patents

缺氧诱导因子抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN118076350A
CN118076350A CN202280068123.1A CN202280068123A CN118076350A CN 118076350 A CN118076350 A CN 118076350A CN 202280068123 A CN202280068123 A CN 202280068123A CN 118076350 A CN118076350 A CN 118076350A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ring
hif
group
compound
optionally substituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280068123.1A
Other languages
English (en)
Inventor
格雷格·L·塞门札
阿克里特·索迪
沙伊玛·萨尔曼
大卫·J·迈尔斯
尤桑·黄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Johns Hopkins University
Original Assignee
Johns Hopkins University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johns Hopkins University filed Critical Johns Hopkins University
Publication of CN118076350A publication Critical patent/CN118076350A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/427—Thiazoles not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/433—Thidiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本公开的特征在于用于治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)‑1α和/或HIF‑2α表达增加相关或与这两者相关的病况或疾病的化学实体(例如其化合物或药学上可接受的盐)，所述方法包括向需要这种治疗的对象施用能够抑制HIF介导的转录激活的式(I)化合物。本公开的特征还在于包含其的组合物以及其使用和制备方法。

Description

缺氧诱导因子抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年8月9日提交的美国临时申请第63/231,216号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开的特征在于缺氧诱导因子HIF-1和/或HIF-2的抑制剂及其制备和使用方法。在本文所述的实施方式中，化合物阻断HIF改变基因表达的能力，从而在肝细胞癌(HCC)和致盲眼病中提供治疗益处，例如，有效阻断肿瘤血管形成和免疫逃避所需的HIF依赖性基因的表达，并阻断人HCC肿瘤异种移植物的生长和血管形成。在某些实施方式中，本文所述的化合物当与抗PD1治疗组合施用时，根除小鼠HCC肿瘤。在某些实施方式中，本文描述的化合物有效治疗缺血性视网膜疾病小鼠模型中的视网膜新生血管形成和血管渗透性过高，以及新生血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性小鼠模型中的脉络膜新生血管形成。
背景技术
缺氧诱导因子(HIF)。响应于O2可用性降低(缺氧)时，HIF介导基因表达的变化。HIF匹配O2的供应和需求，以便每个细胞接收足够的O2以满足其代谢需求。然而，对缺氧的适应性生理响应，例如HIF介导的新生血管的产生(血管生成)可能会被疾病过程所利用；因此，HIF会导致癌症和致盲眼病的发病。
肝细胞癌
肝细胞癌(HCC)是全球第三大癌症死亡原因，在过去二十年里，美国的发病率增加了两倍(Bray F,et al.,CA Cancer J Clin.2018；68(6):394-424；Choo SP,et al.,Cancer.2016；122(22):3430-3446；El-Serag HB.,N Engl J Med.2011；365(12):1118-1127)。在诊断时，超过三分之二的HCC患者已处于晚期疾病，现有治疗往往难以治愈，5年存活率低于15％(El-Serag HB.,N Engl J Med.2011；365(12):1118-1127)。第一个批准用于晚期HCC的药物是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)索拉非尼(sorafenib)，仅提供2-3个月的适度生存获益，且缓解率低、毒性高，通常需要减少剂量或中断治疗，并且经常出现耐药性，随后是其他几种TKI(乐伐替尼(lenvatinib)、瑞格拉非尼(regorafenib)、卡博替尼(cabozantinib))以及雷莫芦单抗(ramucirumab，其是一种针对血管内皮生长因子A(VEGFA)受体2的抗体)(Balogh J et al.,J Hepatocell Carcinoma.2016；3:41-53；Llovet JM et al.,N Engl J Med.2008；359:378-390)。
使用针对程序性死亡1(PD1)或PD1配体1(PDL1)的抗体进行免疫检查点阻断彻底改变了晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌的治疗(Brahmer JR et al.,N Engl JMed.2012；366(26):2455-2465；Topalian SL et al.,JAMA Oncol.2019；5(10):1411-1420；Topalian SL et al.,N Engl J Med.2012；366；2443-2454)。PDL1在肿瘤和基质细胞上表达，与T细胞上的PD1结合并引发衰竭或凋亡。纳武单抗(nivolumab)是一种抗PD1抗体，基于II期试验数据，FDA批准其用于治疗HCC，但与索拉非尼比较作为一线治疗的III期试验未达到其总体生存期的主要终点，而另一种抗PD1抗体派姆单抗(pembrolizumab)与安慰剂比较作为二线HCC治疗的III期试验也失败了(Lai E,et al.,Crit Rev OncolHematol.2021；157:103167；Llovet JM et al.,Nat Rev Dis Primers.2021；7(1):6)。阿特珠单抗(atezolizumab，一种抗PDL1抗体)与贝伐珠单抗(bevacizumab，一种抗VEGFA抗体)组合的III期试验与索拉非尼相比，使无进展生存期延长了2.5个月，尽管超过一半的接受组合治疗的患者遭受了3级或4级不良事件(Finn RS et al.,N Engl J Med.2020；382(20):1894-1905)。最近，基于一项涉及49名患者的试验，抗PD1(纳武单抗)和抗CTLA4(伊匹单抗(ipilimumab))抗体组合被批准用于治疗既往接受过索拉非尼治疗的HCC患者，总体缓解率为33％(Wright K,et al.,Oncology.2020；34(4):693606)。许多患者可能无法对免疫检查点抑制剂(例如抗PD1或抗PDL1抗体)产生响应，因为其他免疫逃避机制的并存，例如腺苷的产生，腺苷也与T细胞上的受体结合以触发细胞凋亡(Huang S et al.,Blood.1997；90(4):1600-1610。
瘤内缺氧被认为是癌症进展的主要驱动力(Harris AL et al.,Nat RevCancer.2002；2(1):38-47；Schito L and Semenza GL,Trends Cancer.2016；2(12):758-770；Vaupel P et al.,Antioxid Redox Signal.2007；9(8):1221-1235)。在乳腺癌和其他可直接原位测量的癌症中，中位PO2水平降低至10mmHg(1.4％O2)，死亡率增加与中位PO2<10mmHg相关(Vaupel P et al.,Antioxid Redox Signal.2007；9(8):1221-1235)。在肝癌中，中位PO2为6mmHg，而正常肝组织中为30mmHg(McKeown SR et al.,Br J Radiol.2014；87(1035):20130676)。对原位大鼠HCC肿瘤的分析显示，所有测量的PO2值均在0至10mmHg之间，中位值为0.2-0.8mmHg，而正常大鼠肝脏中的值为45mmHg(Riedl CC et al.,Radiology.2008；248:561-570)。通过动态对比增强磁共振成像对人HCC进行的分析表明，肿瘤内高血流量与总体存活率增加相关(Chen BB et al.,Radiology2016；281:454-464)，这与肿瘤内缺氧和患者死亡率之间的关联一致。
缺氧诱导因子(HIF)可通过激活大量编码在血管生成(也称为肿瘤血管形成)、葡萄糖代谢、侵袭/转移、干细胞分化和肿瘤免疫逃逸中发挥关键作用的蛋白质的基因的转录，从而在癌症进展中发挥关键作用(De Heer EC,et al.,J Clin Invest.2020；130(10):5074-5087；Samanta D and Semenza GL,Biochim Biophys Acta Rev Cancer.2018；1870(1):15-22；Schito L and Semenza GL,Trends Cancer.2016；2(12):758-770.；SemenzaGL,Physiology.2021；36(2):73-83；Xiang L and Semenza GL,Adv Cancer Res.2019；141:175-212)。HIF由O2调节的HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α亚基和组成型表达的HIF-1β亚基组成(Semenza GL.Annu Rev Pharmacol Toxicol.2019；59:379-403)。HIF-α亚基会发生O2依赖性脯氨酰羟基化(引发蛋白质降解)和O2依赖性天冬酰胺酰羟基化(阻止共激活剂募集)。在涉及一系列治疗方式的多项初步研究以及荟萃分析中，肿瘤活检的HIF-1α免疫组织化学显示，>60％的HCC病例中表达增加，并且与无病存活率和总存活率下降(Cao S et al.,Clin Res Hepatol Gastroenterol.2014；38:598-603；Osman NA et al.,TumorBiol.2015；36:4293-4299；Srivastava S et al.,Virchows Arch.2015；466:541-548；Xiao H et al.,BioMed Res Int.2014；516518；Xu W et al.,J Cancer Res ClinOncol.2014；140:1507-1515)以及放射治疗或手术后复发风险增加(Wada H et al.,LiverInt.2006；26:414-23)显著相关。在乳腺癌中，HIF协调激活介导免疫逃避的多种蛋白质的表达，包括：CD73，其是一种产生腺苷的酶；CD47，其编码可阻止巨噬细胞吞噬癌细胞的细胞表面蛋白；PDL1，其与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞表面上的PD1结合，引发无变应性或细胞凋亡(Samanta D et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2018；115(6):E1239-E1248.)。HIF-1α和PDL1也在人HCC中共表达(Dai X et al.,Transl Oncol.2018；11(2):559-566)。
筛选3,140种药物后，发现吖啶黄是一种抑制HIF活性(通过破坏亚基二聚化)并阻断小鼠模型中HCC肿瘤生长和血管形成的药物(Lee K.et al.,Proc Natl Acad Sci U SA.2009；106(42):17910-17915)。然而，吖啶黄因容易造成DNA损伤，因此并不是临床试验的最佳候选药物。最近，一种名为PT2385的化合物被证明选择性阻断HIF-2α与HIF-1β的二聚化(Wallace EM et al.,Cancer Res.2016；76(18):5491-5500)，在取得令人鼓舞的I期结果后，目前正在肾细胞癌患者中进行晚期临床试验(Courtney KD et al.,J ClinOncol.2018；36(9):867-874)。
致盲眼病
致盲眼病包括许多影响视力的疾病。年龄相关性黄斑变性(AMD)是眼功能障碍(包括失明)的主要原因。AMD的一种形式是非渗出性AMD，也称为“干性”AMD，其典型特征是玻璃膜疣在视网膜色素上皮(RPE)内部或外部积聚。在干性AMD晚期，RPE以及上覆的杆状和锥状光感受器发生萎缩。AMD的第二种形式是渗出性或“湿性”或“新生血管”AMD，其特征是脉络膜新生血管形成(CNV)。早期疾病通常是干性AMD，而晚期疾病通常是湿性(新生血管性)AMD或晚期干性(萎缩性)AMD。
新生血管性或“湿性”年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)是美国老年人严重视力丧失的主要原因。这些患者的异常渗漏血管(即CNV)的生长可导致快速且往往不可逆转的视力丧失。最近推出的针对血管内皮生长因子(VEGF)(一种内皮细胞有丝分裂原和通透性因子)的治疗对湿性AMD患者产生了显著的影响，这些患者先前因CNV引起的水肿、出血和疤痕而导致视力丧失。尽管如此，即便每月注射一次，但超过一半接受抗VEGF治疗治疗的湿性AMD患者对治疗的响应仍不充分。此外，人们相信，长期抑制VEGF可导致地图样萎缩和青光眼的发生。总的来说，这些观察结果强调了持续努力识别其他血管生成因子的重要性，所述血管生成因子有助于CNV发展，并且因此可能作为治疗湿性AMD患者的额外(也许更安全的)靶标。
在这方面，假设转录激活剂缺氧诱导因子(HIF)-1在调节多种共同促进眼部新生血管形成的血管生成介质(包括VEGF)的病理表达中发挥重要作用。在AMD中，假设从脉络膜毛细血管到上覆的视网膜色素上皮(RPE)的O2输送中断所致的外层视网膜缺血导致HIF-1α积累。随着年龄的增长，覆盖于黄斑的脉络膜毛细血管会变弱(其功能也会受到损害)。在AMD患者中，称为玻璃膜疣的物质积聚在增厚的RPE基底膜(也称为布鲁赫膜)下方和内部，从而形成O2扩散的物理屏障，并进一步加剧了向上覆的RPE的O2输送的削弱以及HIF-1α的“病理性”诱导。
越来越多的临床前证据表明，HIF-1参与湿性AMD患者中VEGF表达的调节和CNV的发展。据报道，湿性AMD眼的CNV膜中HIF-1α的表达增加。通过药理学或遗传学抑制RPE中的HIF-1，可以减小小鼠模型中CNV病变的大小。
几项多中心随机对照临床试验也证明了每月(或每两月)注射抗VEGF治疗对于治疗缺血性视网膜病变(IR)患者的黄斑水肿的益处，所述缺血性视网膜病变(IR)包括糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变。然而，与湿性AMD类似，尽管每月接受治疗，但只有不到50％的治疗IR患者表现出视力显著改善(即ETDRS视力表上至少增加15个字母)。同样，每月使用抗VEGF治疗可抑制部分(但不是全部)IR患者的新生血管形成(NV)的进展。
对其他HIF调节的血管生成介质在这些不同IR中的作用的这些临床观察得到了强有力的临床前研究的支持。使用动物模型的研究表明，转录因子HIF-1α的组成型活性形式的表达足以在体内促进眼部NV，而VEGF的单独表达不足以介导这种作用。这些结果可能表明额外的HIF调节的血管生成因子可促进眼部病理性NV。
一种小分子抑制剂PT2385选择性地结合HIF-2α(但不结合HIF-1α)以阻止其与HIF-1β结合，这种小分子抑制剂已在临床前研究中显示出前景，目前正在研究用于治疗肾细胞癌患者(Courtney,KD,et al,J Clin Oncol 2018Mar 20；36(9):867-874)。然而，最近的研究表明，在眼部新生血管疾病中，HIF-1α和HIF-2α的表达均增加，并且两种HIF都参与促进IR中VEGF的表达，但单独的HIF-1足以促进小鼠的视网膜NV。因此，仅针对HIF-2的治疗可能不足以预防眼部新生血管形成。
发明内容
本公开的特征在于抑制HIF-1和/或HIF-2的化学实体(例如，化合物或其药学上可接受的盐)(例如，抑制HIF介导的转录激活，从而消除HIF依赖性基因表达和随后的生理响应的化学实体)。所述化学实体是有用的，例如可用于治疗这样的病况、疾病或病症，其中HIF-1和/或HIF-2活性增加(例如过量)促进所述病况、疾病或病症的病理学和/或症状和/或进展。有强有力的科学证据表明HIF在疾病发病机制中发挥重要作用的两大类人类疾病是：癌症，例如肝细胞癌(HCC)；以及致盲眼病，例如湿性或新生血管性AMD、缺血性视网膜病变(IR)(包括糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变)、角膜新生血管形成和新生血管性青光眼。本文公开的化学实体显示出阻断HIF依赖性基因表达并在HCC、AMD和IR的小鼠模型中提供治疗益处。本公开的特征还在于包含其的组合物以及其使用和制备方法。所述方法包括但不限于治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子HIF-1α和/或HIF-2α表达增加相关或与这两者相关的病况、疾病或病症的方法。该方法包括向需要这种治疗的对象施用抑制HIF-1和/或HIF-2的化合物；例如，式(I)的化合物。在实施方式中，抑制HIF-1和/或HIF-2的化合物抑制HIF介导的转录激活。在实施方式中，本文描述的化合物抑制HIF-1和HIF-2。
一方面，本公开的特征在于式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
，其中：
环A是包含8-10个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-4个Xa取代；
环B是包含8-10个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-4个Xb取代；
环C是包含5-6个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-2个Rb取代；
每个Xa和Xb独立地选自由以下组成的组：卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-NO2、氰基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、SO2(C1-6烷基)、杂环基、杂芳基、C3-6环烷基、NR1R2、C(O)R3和C(O)NR1R2；
Ra每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、-C(＝O)R3、-C(＝O)OR3、-C(＝O)NR1R2和-SO2R4；
Rb每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤素和氰基；
R1和R2每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苄基、C(＝O)R5、C(＝O)OR5和C(＝O)NR5R6；或
同一氮原子上的一对R1和R2与连接它们的所述氮原子一起形成包含4-8个环原子的饱和环、部分不饱和环或芳族环，其中0-2个环原子(除了连接R1和R2的氮原子之外)是各自独立地选自由N、N(Ra)、O和S组成的组中的环杂原子；
R3每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基和任选取代的苯基；
R4每次出现时独立地选自由以下组成的组：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基；和任选取代的苄基；和
R5和R6每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基。
另一方面，本公开的特征在于包含一种或多种式(I)化合物和一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
另一方面，本公开的特征在于抑制HIF-1和/或HIF-2活性的方法，其包括使细胞与有效量的式(I)化合物(包括其药学上可接受的盐)接触。细胞可以在体外或体内与式(I)化合物接触。细胞还可以与第二治疗剂接触。
另一方面，本公开的特征在于包括向患有或疑似患有由缺氧介导的病况的对象施用式(I)化合物(包括其药学上可接受的盐)和/或其药物组合物的方法。在某些实施方式中，式(I)化合物抑制HIF介导的转录激活。在某些实施方式中，病况、疾病或病症是癌症，例如肝细胞癌。在其他实施方式中，病况、疾病或病症是致盲眼病，例如湿性或新生血管性AMD、缺血性视网膜病变(IR)(例如糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变)、角膜新生血管形成和新生血管性青光眼。
另一方面，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)-1α和/或HIF-2α表达增加相关或与这两者相关的病况、疾病或病症的用途，该方法包括向需要这种治疗的对象施用能够抑制HIF介导的转录激活的式(I)化合物。预期的用途包括式(I)化合物在制备用于治疗所述病况、疾病或病症的药物中的用途。在某些实施方式中，病况、疾病或病症是癌症，例如肝细胞癌。在其他实施方式中，病况、疾病或病症是致盲眼病，例如湿性或新生血管性AMD、缺血性视网膜病变(IR)(例如糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变)、角膜新生血管形成和新生血管性青光眼。
因此，一方面，本公开提供了治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)-1α和/或HIF-2α表达增加相关的病况、疾病或病症的方法，其包括向对象施用式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方式中，该方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。在某些实施方式中，病况、疾病或病症是癌症，例如肝细胞癌。在其他实施方式中，病况、疾病或病症是致盲眼病，例如湿性或新生血管性AMD、缺血性视网膜病变(IR)(例如糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变)、角膜新生血管形成和新生血管性青光眼。
另一方面，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗对象的过度增殖性疾病(例如，癌症)的用途，其包括向对象施用包含式(I)化合物的药物组合物。在一些实施方式中，该用途包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。在某些实施方式中，过度增殖性疾病(例如，癌症)是肝细胞癌。
另一方面，本公开的特征在于治疗对象的癌症或过度增殖性疾病的方法，其包括向对象施用式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。在这些实施方式中的某些中，该方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。在某些实施方式中，过度增殖性疾病(例如，癌症)是肝细胞癌。
一方面，本公开的特征在于治疗肝细胞癌的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。
另一方面，本公开提供了调节对象的血管生成的方法，其包括向对象施用式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。在这些实施方式中的某些中，该方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。
一方面，本公开的特征在于治疗眼部疾病的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗致盲眼病的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗湿性或新生血管性AMD的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗缺血性视网膜病变(IR)的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在某些实施方式中，IR是糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗角膜新生血管形成的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗新生血管性青光眼的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
另一方面，本公开的特征在于能够通过抑制HIF-1激活来减轻炎症的式(I)化合物及其药物组合物。具体地，所公开的化合物及其药物组合物的某些实施方式具有抗炎作用。式(I)化合物或其药物组合物可以配制用于医药，并且可以将治疗有效量的式(I)化合物或其药物组合物施用于患有或疑似患有由缺氧介导而产生炎症响应的病况的对象。示例性的由缺氧介导而产生炎症响应的病况包括但不限于恶性肿瘤、肠道炎症(例如，炎性肠病)、肺部炎症(例如，由急性肺损伤引起)、缺血、动脉粥样硬化、心肌梗塞、类风湿性关节炎和伤口愈合。
一方面，本公开的特征在于治疗过度增殖性疾病例如癌症的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂以及化疗免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂。
另一方面，本公开描述了对象选择标准，例如基于例如炎症的临床体征和症状和/或实验室证据而对由缺氧介导的炎症状况的明确诊断。这种对象的例子是C反应蛋白水平升高的人。
另一方面，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗眼部疾病的用途，所述眼部疾病包括但不限于糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成和新生血管性青光眼。
另一方面，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗或预防Von Hippel-Lindau病，或HIF-1、HIF-2或缺氧响应被确定为治疗靶向的潜在机制的任何其他疾病。
在某些前述实施方式中，该方法还包括向对象施用一种或多种另外的治疗剂。例如，本文所述的治疗癌症的方法还可包括施用免疫检查点抑制剂或任何其他护理标准抗癌剂。作为另一个实例，治疗本文所述的眼部疾病(例如，致盲眼病)的方法还可包括施用抗血管内皮生长因子(VEGF)剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、过氧化物酶体增殖剂-激活受体(PPAR)-γ激动剂、肾素抑制剂、类固醇、自噬调节剂、塞马莫德(semapimod)、MIF抑制剂、CCR2抑制剂、CKR-2B、2-硫代咪唑、CAS 445479-97-0、CCX140、氯膦酸盐、氯膦酸盐脂质体制备物和氯化钆。
实施例可包括以下优点中的一项或多项。在一些实施方式中，本文描述的化合物和方法可以提高对象对免疫检查点抑制剂治疗的响应率，和/或降低与免疫检查点抑制剂治疗相关的副作用的严重程度。尽管不希望受到理论的束缚，但据信所有人类癌症对免疫检查点抑制剂治疗的较低响应率部分是由于癌细胞逃避免疫系统的分子机制的多样性(其中许多是HIF调节的)(Semenza GL,Physiology.2021；36(2):73-83)。据信，HIF抑制剂的广泛作用可以提供一条途径来减少大量介导免疫逃避的基因的表达(图16)，从而改善对免疫检查点阻断的治疗响应。再次，尽管不希望受理论束缚，但据信本文所述的化合物和方法可有益于治疗眼部疾病，例如致盲眼病。据信，额外的HIF调节的血管生成因子参与许多眼部新生血管疾病中病理性NV的促进。抑制HIF-1会导致广谱血管生成介质减少回到生理水平，因此可能更安全，但与完全中和VEGF同等有效。另外，本文描述的化合物和方法可以降低对象经历与慢性VEGF抑制相关的不利副作用的可能性(例如，视网膜萎缩，例如，潜在地导致(永久性)视力丧失；例如，眼内压升高，例如，可能导致青光眼)。
在任何前述实施方式中，抑制剂抑制HIF-1和HIF-2(例如式(I)化合物)。
附图说明
图1描绘了HIF抑制剂的基于细胞的筛选测定。(A)荧光素酶报告物，(B)33-063对缺氧诱导型荧光素酶活性的影响，(C)六种化合物的化学结构及其IC50计算值。
图2描绘了IC50<3.3μM的HIF抑制剂的化学结构。
图3描绘了HIF靶基因表达的分析。
图4描绘HIF抑制剂对报告基因反式激活、HIF蛋白表达和HIF异二聚化的影响。(A)与p2.1和pSVR共转染的Hep3B的Fluc/Rluc，(B-C)将Hep3B细胞暴露于O2下4小时(B)、或8小时或24小时(C)。
图5描绘了HIF抑制剂(32-134D、33-063和12-143)对HIF-1α反式激活结构域功能的影响。(A)将Hep3B细胞用包含5个Gal4结合位点并编码Fluc的pG5E1bFLuc和编码融合蛋白的表达载体共转染，所述融合蛋白由Gal4 DNA结合结构域与HIF-1α反式激活域(TAD)序列融合而组成。(B)HIF-1αTAD包含N端(N-TAD)和C端(C-TAD)激活子结构域和抑制结构域(ID)；测试了5种含有所示HIF-1α残基的GAL4融合蛋白。(C)将共转染细胞在溶媒(Veh；DMSO)存在下暴露于20％O2(白条)或1％O2(黑条)24小时；或在20％O2(白色条)或1％O(红色条)下用10μM浓度的指定HIF抑制剂(32-134D、33-063或12-143)处理。
图6描绘了化合物32-134D对裸鼠中Hep3B肿瘤异种移植物生长(肿瘤体积)的剂量响应，其以个体肿瘤的生长(A)或平均肿瘤生长(B)的形式呈现，并且32-134D对小鼠体重没有任何影响(C)。
图7描绘了32-134D(以40mg/kg/天的剂量施用)对裸鼠中Hep3B肿瘤异种移植物生长的影响，其以个体肿瘤的生长(A)或平均肿瘤生长(B)的形式呈现，并且32-134D对小鼠体重没有任何影响(C)。还显示了切除的肿瘤的外观(D)和重量(E)。
图8描绘了32-134D对Hep3B肿瘤血管生成和免疫逃避的影响。(A)分析从肿瘤组织分离的总RNA，证明了32-134D治疗小鼠的肿瘤中编码介导血管生成或免疫逃避的蛋白质的mRNA表达降低。(B)ELISA显示32-134D治疗的小鼠中促血管生成蛋白的表达降低。(C)用CD31抗体处理肿瘤切片，证明32-134D治疗的小鼠的肿瘤血管形成减少。
图9描绘了与PT-2385或溶媒的作用(最左侧的条)相比，HIF抑制剂(32-134D、33-063)对Hepa1-6细胞中血管生成因子mRNA的缺氧诱导型表达的作用。
图10描绘了5μM浓度的32-134D对Hepa1-6细胞中编码介导免疫逃避的蛋白质的mRNA的缺氧诱导型表达的作用。
图11描绘了抗PD1和32-134D对同基因(免疫活性)小鼠中Hepa1-6肿瘤生长的作用，证明了32-134D的功效以及组合治疗与单独抗PD1相比的优异功效。
图12描绘了32-134D对肿瘤免疫微环境的作用，证明了介导癌细胞杀伤的激活T细胞和自然杀伤(NK)细胞的数量增加；介导免疫逃避的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和骨髓源性抑制细胞(MDSC)数量减少。
图13描绘了32-134D对肿瘤内基因表达的作用，证明编码血管生成因子(A)和介导免疫逃避的蛋白质(C右上和D)的mRNA表达减少，以及编码介导抗肿瘤免疫的蛋白质的mRNA表达增加(C左下)。
图14描绘了32-134D对编码细胞因子和趋化因子的mRNA的瘤内表达的作用。
图15描绘了通过ELISA测定的32-134D对免疫调节蛋白的瘤内表达的作用。
图16描绘了32-134D对与治疗益处一致的基因表达的作用。
图17描绘了安全性；使用32-134D治疗(IP给药)后C57BL/6小鼠视网膜的眼底照片和荧光素血管造影图像。
图18描绘了安全性；每天腹膜内注射32-134D后在C57BL/6小鼠中进行ERG测量。
图19描绘了安全性；与溶媒对照相比，用32-134D治疗(IP给药)的小鼠的各种组织的图像。
图20描绘了功效；C57BL/6小鼠中32-134D治疗(IP给药)后Vegf和Angptl4表达降低(湿型年龄相关性黄斑变性的CNV模型)。
图21描绘了功效；C57BL/6小鼠中32-134D治疗(IP给药)后脉络膜新生血管病变减少(针对湿性AMD的CNV模型)。
图22描绘了功效；C57BL/6小鼠中32-134D治疗(IP给药)后血管渗漏减少(糖尿病水肿的STZ模型)。
图23描绘了功效；C57BL/6小鼠中32-134D治疗(IP给药)后黄斑水肿减少(与视网膜静脉阻塞相关的血管通透性I/R模型)。
图24描绘了功效；C57BL/6小鼠幼崽中32-134D治疗(IP给药)后新生血管形成减少(针对缺血性视网膜新生血管形成的OIR模型)。
图25描绘了功效；C57BL/6小鼠中眼内施用32-134D后病变面积减少(新生血管性AMD的激光CNV模型)。
图26描绘了功效；在C57BL/6小鼠幼崽眼内施用32-134D后视网膜新生血管形成减少(针对缺血性视网膜新生血管形成的OIR模型)。
图27描绘了在存在1μM或10μM 32-134D持续4小时的情况下(A)或者在存在10μM32-134D 1至24小时的情况下(B)，在低氧条件下培养的永生化人视网膜Müller神经胶质细胞系(MIO-M1)中32-134D对HIF-1α和HIF-2α积累的抑制。
图28描绘了在溶媒或32-134D(10μM)存在下在低氧条件下培养的MIO-M1细胞中的以下mRNA表达：(A)血管内皮细胞生长因子(Vegf)(A)和(B)血管生成素样4(Angptl4)。
图29描绘了在MG-132和32-134D(10μM)存在的情况下，在缺氧条件下培养4小时的MIO-M1细胞中HIF-1α和HIF-2α积累的抑制(A)，或在MG-132或硼替佐米(10μM)或巴弗洛霉素(10nM)存在的情况下，在低氧条件下培养4小时的MIO-M1细胞中HIF-1α的积累的抑制(B)。
图30描绘了在低氧条件下培养4小时的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中32-134D(10μM)对HIF-1α和HIF-2α积累的抑制。
图31描绘了在溶媒或32-134D(1或10μM)存在下，在低氧条件下培养4小时的HUVEC中以下mRNA的表达：(A)Vegf和Angptl4；(B)血管生成素2(Angpt2)和血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶(Veptp)；(C)纤溶酶原激活剂抑制剂1(Pai1)。
图32描绘了(A)源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的120日龄(D120)视网膜类器官的明场图像；(B)D120 hiPSC源性视网膜类器官的苏木精和伊红染色；(C和D)D120 hiPSC源性视网膜类器官的代表性免疫荧光图像，显示内层和外层视网膜细胞中针对Pax6和恢复蛋白(REC；C)和CRALBP的染色(D)。比例尺＝25μm。
图33描绘了在32-134D(1、10或100μM)存在下在低氧条件下培养12小时的D120hiPSC源性视网膜类器官中HIF-1α和HIF-2α积累的抑制。
图34描绘了在32-134D(1或10μM)存在下在低氧条件下培养12小时的D120 hiPSC源性视网膜类器官中Vegf(A)和Angptl4(B)mRNA的表达。
图35描绘了OIR出生后第13天(P13)和P14小鼠中各自单次腹膜内注射32-134D(20mg/kg)后24小时的HIF-1α(左)和HIF-2α(右)累积。
图36描绘了以5次连续(P12-P16)腹膜内注射20mg/kg 32-134D治疗的P17 OIR小鼠中血管活性介质Vegf、Angptl4、血小板源性生长因子(Pdgf)和促红细胞生成素(Epo)的mRNA表达(A)，包括内皮细胞特异性表达的那些物质[Angpt2、Veptp、Pai1和VEGF受体2(Kdr)](B)。
图37描绘了来自链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠的神经感觉视网膜中的(A)HIF-1α和HIF-2α表达、或Vegf和Angptl4(B)或Angpt2和Veptp(C)mRNA的表达，所述糖尿病小鼠用单次腹膜内注射32-134D(40或80mg/kg)治疗(在处死前24小时)之前处于高血糖(血清葡萄糖大于250mg/dl)6个月。
图38描绘了与溶媒对照(0)相比，单次眼内施用递增剂量的32-134D(70、140、210或350ng)后每周对C57BL/6小鼠采集的视网膜电图(ERG)。
图39描绘了单次眼内注射210ng或350ng的32-134D后35天的视网膜切片的苏木精和伊红染色。插图展示了神经节细胞层(GCL)的高精度图像。比例尺＝200μm。
图40描绘了单次眼内注射210ng或350ng的32-134D后35天，对视网膜平片中的RGC中的神经节细胞标志物RNA结合蛋白、mRNA加工因子(RBPMS)(A)的免疫染色；(B)以及A中观察到的RGC的定量。
图41描绘了在递增浓度的32-134D存在下在低氧条件下培养4小时的MIO-M1细胞中的HIF-1α积累。
图42描绘了(A)在低氧条件下培养4小时的经32-134D处理的MIO-M1细胞(来自图41)中HIF-1α积累的免疫印迹的定量，证明了3.5μM的半数最大抑制浓度(IC50)；(B)单次眼内注射70ng 32-134D治疗的小鼠中32-134D的浓度-时间曲线。神经感觉视网膜中32-134D的浓度持续5.25天超过计算的体外IC50，3.5μM。
图43描绘了P13和P14 OIR小鼠中各自进行单次眼内注射70ng 32-134D后24小时的HIF-1α和HIF-2α表达。
图44描绘了在P12时单次眼内注射70ng 32-134D治疗的OIR小鼠在P17时的HIF调节基因Vegf、Angptl4、Kdr、Epo和Pai1的mRNA表达。
图45描绘了STZ小鼠中血管内伊文思蓝染料渗漏所证实的血管通透性过高的图像，所述STZ小鼠在用70ng 32-134D治疗(处死前5天)之前处于高血糖6个月(左)；和血管通透性过高的定量(右)。
图46描绘了与溶媒对照(0)相比，单次眼内施用500ng或1,000ng剂量的32-134D后C57BL/6小鼠的每周ERG。
图47描绘了单次眼内注射280ng后神经感觉视网膜中32-134D的浓度。280ng剂量后，32-134D的浓度至少持续11.7天超过体外IC50，3.5μM。
具体实施方式
本公开的特征在于抑制HIF-1和/或HIF-2的化学实体(例如，化合物或其药学上可接受的盐)(例如，抑制HIF介导的转录激活的化学实体)。所述化学实体是有用的，例如可用于在对象(例如，人类)中治疗这样的病况、疾病或病症，其中HIF-1和/或HIF-2活性增加(例如过量)促进所述病况、疾病或病症的病理学和/或症状和/或进展，所述病况、疾病或病症例如为癌症如肝细胞癌，或致盲眼病如湿性(新生血管性)AMD，或包括糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变在内的缺血性视网膜病变(IR)中的一种。本公开的特征还在于包含其的组合物以及其使用和制备方法。所述方法包括但不限于治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子HIF-1α和/或HIF-2α表达增加相关或与这两者相关的病况、疾病或病症的方法。该方法包括向需要这种治疗的对象施用抑制HIF-1和/或HIF-2的化合物；例如，式(I)的化合物。在实施方式中，抑制HIF-1和/或HIF-2的化合物抑制HIF介导的转录激活。在实施方式中，本文描述的化合物抑制HIF-1和HIF-2。
式(I)化合物
一方面，本公开的特征在于式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
，其中：
环A是包含8-10个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-4个Xa取代；
环B是包含8-10个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-4个Xb取代；
环C是包含5-6个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-2个Rb取代；
每个Xa和Xb独立地选自由以下组成的组：卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-NO2、氰基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、SO2(C1-6烷基)、杂环基、杂芳基、C3-6环烷基、NR1R2、C(O)R3和C(O)NR1R2；
Ra每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、-C(＝O)R3、-C(＝O)OR3、-C(＝O)NR1R2和-SO2R4；
Rb每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤素和氰基；
R1和R2每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苄基、C(＝O)R5、C(＝O)OR5和C(＝O)NR5R6；或
同一氮原子上的一对R1和R2与连接它们的所述氮原子一起形成包含4-8个环原子的饱和环、部分不饱和环或芳族环，其中0-2个环原子(除了连接R1和R2的氮原子之外)各自独立地是选自由N、N(Ra)、O和S组成的组中的环杂原子；
R3每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基和任选取代的苯基；
R4每次出现时独立地选自由以下组成的组：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基；和任选取代的苄基；和
R5和R6每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基。
在一些实施方式中，本文所述的化合物和方法不包括WO2018/060367[化合物2-25]、WO1998/018466[化合物I(a)-I(i)、II(j)、III(k)、III(l)、IV(m)、V(n)-V(p)、VI(p)、VI(q)、VII(r)、VIII(s)、IX(t)、X(u)和XI(v)]、US5428175A[化合物HS-1]、US5290777A[化合物I(a)-I(h)、II(j)-II(l)、III(m)、III(n)、IV(o)]、US4970226(A)[Nortopentin A-D]、WO1991/004975)[Nortopentin A-D]、WO2001/094310[化合物2、3、16、23和26]、CN109418267A[Nortopentin A-D和化合物Ia-1至Ia-8、Ib-1至Ib-8、Ic-1和Ic-2]，WO2015/173321[2,4-双(苯并[d][1,3]间二氧杂环己烷-5-基)-1H-咪唑]和JP2009120589A中公开的一种或多种化合物，其各自通过引用整体并入。
如本文所用，术语“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
如本文所用，术语“烷基”是指可以为直链或支链的烃链，其含有指定数量碳原子。例如，C1-6表示该基团中可具有1至6个(含)碳原子。非限制性实例包括甲基、乙基、异丙基、叔丁基、正己基。
本文所用的术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被独立选择的卤素取代的烷基。
如本文所用，术语“烷氧基”是指-O-烷基(例如-OCH3)。因此，术语“卤代烷氧基”是指-O-卤代烷基(例如-OCF3)。
如本文所用，术语“亚烷基”是指二价烷基(例如-CH2-)。
如本文所用，术语“杂环基”是指具有3-16个环原子的单环、双环、三环或多环非芳族环系统(5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统)，如果是单环，则具有1-3个杂原子，如果是双环，则具有1-6个杂原子，或如果是三环或多环，则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(O)0-2(例如，如果是单环、双环或三环，则分别为碳原子和1-3、1-6或1-9个N、O或S(O)0-2杂原子)，其中每个环的0、1、2或3个原子可以被取代基取代。杂环基的实例包括哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、吗啉基、四氢呋喃基等。杂环基可以包括多个稠合和桥连的环。稠合/桥接的杂环的非限制性实例包括：2-氮杂双环[1.1.0]丁烷、2-氮杂双环[2.1.0]戊烷、2-氮杂双环[1.1.1]戊烷、3-氮杂双环[3.1.0]己烷、5-氮杂双环[2.1.1]己烷、3-氮杂双环[3.2.0]庚烷、八氢环戊二烯并[c]吡咯、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷、7-氮杂双环[2.2.1]庚烷、6-氮杂双环[3.1.1]庚烷、7-氮杂双环[4.2.0]辛烷、2-氮杂双环[2.2.2]辛烷、3-氮杂双环[3.2.1]辛烷、2-氧杂双环[1.1.0]丁烷、2-氧杂双环[2.1.0]戊烷、2-氧杂双环[1.1.1]戊烷、3-氧杂双环[3.1.0]己烷、5-氧杂双环[2.1.1]己烷、3-氧杂双环[3.2.0]庚烷、3-氧杂双环[4.1.0]庚烷、7-氧杂双环[2.2.1]庚烷、6-氧杂双环[3.1.1]庚烷、7-氧杂双环[4.2.0]辛烷、2-氧杂双环[2.2.2]辛烷、3-氧杂双环[3.2.1]辛烷等。杂环基还包括螺环(例如，其中两个环仅通过一个原子连接的螺环二环)。螺环杂环基的非限制性实例包括2-氮杂螺[2.2]戊烷、4-氮杂螺[2.5]辛烷、1-氮杂螺[3.5]壬烷、2-氮杂螺[3.5]壬烷、7-氮杂螺[3.5]壬烷、2-氮杂螺[4.4]壬烷、6-氮杂螺[2.6]壬烷、1，7-二氮杂螺[4.5]癸烷、7-氮杂螺[4.5]癸烷、2，5-二氮杂螺[3.6]癸烷、3-氮杂螺[5.5]十一烷、2-氧杂螺[2.2]戊烷、4-氧杂螺[2.5]辛烷、1-氧杂螺[3.5]壬烷、2-氧杂螺[3.5]壬烷、7-氧杂螺[3.5]壬烷、2-氧杂螺[4.4]壬烷、6-氧杂螺[2.6]壬烷、1，7-二氧杂螺[4.5]癸烷、2，5-二氧杂螺[3.6]癸烷、1-氧杂螺[5.5]十一烷、3-氧杂螺[5.5]十一烷、3-氧杂-9-氮杂螺[5.5]十一烷等。
如本文所用，术语“杂芳基”是指5-10元单环或双环4n+2芳族环系统(例如，具有在环状阵列中共享的6或10个π电子)的基团，在该芳族环系统中具有环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-10元杂芳基”)。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，当化合价容许时连接点可以是碳或氮原子。杂芳基双环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂芳基”还包括其中如上所定义的杂芳基环与一个或多个芳基稠合的环系统，其中连接点是在芳基或杂芳基环上，并且在这类情况下，环成员的数目指示该稠合的(芳基/杂芳基)环系统中的环成员的数目。其中一个环不含有杂原子的双环杂芳基(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)，连接点可以在任一环上，即带有杂原子的环(例如，2-吲哚基)或不含有杂原子的环(例如，5-吲哚基)。杂芳基可以描述为例如6-10元杂芳基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。
在一些实施方式中，杂芳基是5-10元芳族环系统，在该芳族环系统中具有环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-10元杂芳基”)。在一些实施方式中，杂芳基是5-8元芳族环系统，在该芳族环系统中具有环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-8元杂芳基”)。在一些实施方式中，杂芳基是5-6元芳族环系统，在该芳族环系统中具有环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-6元杂芳基”)。在一些实施方式中，5-6元杂芳基具有1-3个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方式中，5-6元杂芳基具有1-2个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施方式中，5-6元杂芳基具有1个选自氮、氧和硫的环杂原子。杂芳基的每种情况可以独立地任选地被取代，即未取代(“未取代的杂芳基”)或被一个或多个取代基取代(“取代的杂芳基”)。在某些实施方式中，杂芳基是未取代的5-14元杂芳基。在某些实施方式中，杂芳基是取代的5-14元杂芳基。
含有一个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于吡咯基、呋喃基和噻吩基。含有两个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。含有三个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于三唑基、噁二唑基和噻二唑基。含有四个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于四唑基。含有一个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于吡啶基。含有两个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。含有三个或四个杂原子的示例性6元杂芳基分别包括但不限于三嗪基和四嗪基。含有一个杂原子的示例性7元杂芳基包括但不限于氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性5,6-双环杂芳基包括但不限于吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、吲哚嗪基和嘌呤基。示例性6,6-双环杂芳基包括但不限于萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。
如本文所述，术语“芳基”是指6-15个碳原子(除非另有说明)的单价芳香碳环基团，其具有单环(例如苯基)或多个稠环，其中所述稠环可以是芳香族的或不是芳香族的(例如苯并二噁茂等)，条件是，连接点是通过所述芳基的芳香部分的原子，并且连接点上的芳香部分在芳族环中仅含有碳。如果任何芳族环部分含有杂原子，那么该基团为杂芳基而不是芳基。芳基为单环、双环、三环或四环。除非另有说明，芳基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键并且没有三键的直链或支链烃基的基团。在一些实施方式中，烯基具有2至6个碳原子(“C2-6烯基”)。在一些实施方式中，烯基具有2至4个碳原子(“C2-4烯基”)。在一些实施方式中，烯基具有2至3个碳原子(“C2-3烯基”)。在一些实施方式中，烯基具有2个碳原子(“C2烯基”)。该一个或多个碳-碳双键可以是内部的(如在2-丁烯基中)或末端的(如在1-丁烯基中)。C2-4烯基的实例包括乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)等。C2-C6烯基的实例包括前面提到的C2-4烯基以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)等。烯基的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的烯基”)或被一个或多个取代基，例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代的(“取代的烯基”)。在某些实施方式中，该烯基是未取代的C2-6烯基。在某些实施方式中，该烯基是取代的C2-6烯基。
如本文所用，术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键并且没有双键的直链或支链烃基的基团。在一些实施方式中，炔基具有2至6个碳原子(“C2-6炔基”)。在一些实施方式中，炔基具有2至4个碳原子(“C2-4炔基”)。在一些实施方式中，炔基具有2至3个碳原子(“C2-3炔基”)。在一些实施方式中，炔基具有2个碳原子(“C2炔基”)。该一个或多个碳-碳三键可以是内部的(如在2-丁炔基中)或末端的(如在1-丁炔基中)。C2-4炔基的实例包括乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)等。C2-C6烯基的实例包括前面提到的C2-4烯基以及戊炔基(C5)、己炔基(C6)等。炔基的每个实例可以是独立地任选取代的，即，未取代的(“未取代的炔基”)或被一个或多个取代基，例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代的(“取代的炔基”)。在某些实施方式中，该烯基是未取代的C2-6炔基。在某些实施方式中，该烯基是取代的C2-6炔基。
如本文所用，术语“环烷基”是指在非芳族环系统中具有零个杂原子的非芳族环状烃基的基团。在一些实施方式中，环烷基具有3至6个环碳原子(“C3-6环烷基”)。在一些实施方式中，环烷基具有5至6个环碳原子(“C5-6环烷基”)。示例性C3-C6环烷基包括但不限于环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环己二烯基(C6)等。在某些实施方式中，环烷基是单环的(“单环环烷基”)或者含有稠合的、桥联的或螺环系统，如双环系统(“双环环烷基”)，并且可以是饱和的或者可以是部分不饱和的。“环烷基”还包括环系统，其中如上定义的环烷基环与一个或多个芳基稠合，其中连接点在环烷基环上，并且在此类情况下，碳的数目继续表示环烷基环系统中的碳的数目。环烷基的每个实例可以是独立地任选地取代的，例如，未取代(“未取代的环烷基”)或被一个或多个取代基取代(“取代的环烷基”)。在某些实施方式中，环烷基是未取代的C3-6环烷基。在某些实施方式中，环烷基是取代的C3-6环烷基。
本公开的化合物包括所公开的化合物的互变异构形式、包括非对映异构体在内的异构形式、及其药学上可接受的盐。
本公开的某些化合物具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；在本公开的范围内涵盖根据绝对立体化学可定义为(R)-或(S)-的对映异构体、外消旋体、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构形式以及单独的异构体。本公开的化合物不包括本领域已知太不稳定而无法合成和/或分离的那些化合物。本公开旨在包括外消旋形式和光学纯形式的化合物。光学活性(R)-和(S)-异构体可以使用本文公开的手性合成子或手性试剂来制备，或者使用常规技术来拆分。当本文所述的化合物含有烯键或其他几何不对称中心时，除非另有说明，否则该化合物意指包括E和Z几何异构体。
在一些实施方式中，环A是10元杂芳基。在一些实施方式中，环A是9元杂芳基。在一些实施方式中，环A是8元杂芳基。
在一些实施方式中，环A是
其中：
L和T独立地为C*、N*、CR5、N、O或S；
Z和Q独立地为N和C；和
U、W、X和Y独立地为C*、N*、CR6和N；其中
C*和N*表示与环C的连接点。
在一些实施方式中，环A选自由以下组成的组：
在一些实施方式中，环A是
其中：
L是CR6、N、O或S；
Z和Q独立地为N和C；和
U、W、X和Y独立地为CR6和N。
在一些实施方式中，环A任选地被1-4个Xa取代，其中Xa独立地选自由卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、氰基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基和SO2(C1-6烷基)组成的组。
在一些实施方式中，环A选自由以下组成的组：
在一些实施方式中，环A选自由以下组成的组：
其中Xa’选自Xa。
在一些实施方式中，环A选自由以下组成的组：
其中Xa’和Xa”独立地选自Xa。
在一些实施方式中，一个Xa是F、Br或Cl。在一些实施方式中，一个Xa是F。在一些实施方式中，一个Xa是Br。在一些实施方式中，一个Xa是Cl。
在一些实施方式中，一个Xa是C1-6烷基。在一些实施方式中，一个Xa是C1-3烷基。
在一些实施方式中，一个Xa是C1-6卤代烷基。在一些实施方式中，一个Xa是C1-3卤代烷基。
在一些实施方式中，一个Xa是C2-6烯基。在一些实施方式中，一个Xa是C2-3烯基。
在一些实施方式中，一个Xa是C2-6炔基。在一些实施方式中，一个Xa是C2-3炔基。
在一些实施方式中，一个Xa是-NO2。在一些实施方式中，一个Xa是氰基。
在一些实施方式中，一个Xa是C1-6烷氧基。在一些实施方式中，一个Xa是C1-3烷氧基。
在一些实施方式中，一个Xa是C1-6卤代烷氧基。在一些实施方式中，一个Xa是C1-3卤代烷氧基。在一些实施例中，一个Xa是C1-6氟烷氧基。在一些实施例中，一个Xa是C1-3氟烷氧基。
在一些实施方式中，一个Xa是SO2(C1-6烷基)。在一些实施方式中，一个Xa是SO2(C1-3烷基)。
在一些实施方式中，一个Xa是杂环基。在一些实施方式中，一个Xa是杂芳基。
在一些实施方式中，一个Xa是C3-6环烷基。
在一些实施方式中，一个Xa是NR1R2。在一些实施方式中，一个Xa是C(O)NR1R2。
在一些实施方式中，一个Xa是C(O)R3。
在一些实施方式中，环A选自由以下组成的组：
在一些实施方式中，环B是10元杂芳基。在一些实施方式中，环B是9元杂芳基。在一些实施方式中，环B是8元杂芳基。
在一些实施方式中，环B是
其中：
l、t和g是C*、N*、CR5、NR5、N、O、C(＝O)或S；
z和q独立地为N和C；和
u、w、x和y独立地为C*、N*、CR6和N；其中
C*和N*表示与环C的连接点。
在一些实施方式中，环B选自由以下组成的组：
其中
l、t和g为CR5、NR6、N、O、C(＝O)或S；
z和q独立地为N和C；和
u、w、x和y独立地为CR6和N。
在一些实施方式中，环B选自由以下组成的组：
其中：
l、t和g为CR5、NR6、N、O、C(＝O)或S；
z和q独立地为N和C；和
u、w、x和y独立地为CR6和N。
在一些实施方式中，环B任选地被1-4个Xb取代，其中Xb独立地选自由卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-NO2、氰基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、SO2(C1-6烷基)、杂环基、杂芳基、C3-6环烷基、NR1R2、C(O)R3和C(O)NR1R2组成的组。
在一些实施方式中，环B选自由以下组成的组：
在一些实施方式中，环B选自由以下组成的组：
其中Xb’选自Xb。
在一些实施方式中，环B选自由以下组成的组：
其中Xb’和Xb”独立地选自Xb。
在一些实施方式中，Xb是F、Br或Cl。在一些实施方式中，一个Xb是F。在一些实施方式中，一个Xb是Br。在一些实施方式中，一个Xb是Cl。
在一些实施方式中，一个Xb是C1-6烷基。在一些实施方式中，一个Xb是C1-3烷基。
在一些实施方式中，一个Xb是C1-6卤代烷基。在一些实施方式中，一个Xb是C1-3卤代烷基。
在一些实施方式中，一个Xb是C2-6烯基。在一些实施方式中，一个Xb是C2-3烯基。
在一些实施方式中，一个Xb是C2-6炔基。在一些实施方式中，一个Xb是C2-3炔基。
在一些实施方式中，一个Xb是-NO2。在一些实施方式中，一个Xb是氰基。
在一些实施方式中，一个Xb是C1-6烷氧基。在一些实施方式中，一个Xb是C1-3烷氧基。
在一些实施方式中，一个Xb是C1-6卤代烷氧基。在一些实施方式中，一个Xb是C1-3卤代烷氧基。在一些实施方式中，一个Xb是C1-6氟烷氧基。在一些实施方式中，一个Xb是C1-3氟烷氧基。
在一些实施方式中，一个Xb是SO2(C1-6烷基)。在一些实施方式中，一个Xb是SO2(C1-3烷基)。
在一些实施方式中，一个Xb是杂环基。在一些实施方式中，一个Xa是杂芳基。
在一些实施方式中，一个Xb是C3-6环烷基。
在一些实施方式中，一个Xb是NR1R2。在一些实施方式中，一个Xa是C(O)NR1R2。
在一些实施例中，一个Xb是C(O)R3。
在一些实施方式中，环B选自由以下组成的组：
在一些实施方式中，环B选自由以下组成的组：
在一些实施方式中，环C是5元杂芳基。一些实施方式中，环C是选自由吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、呋喃基、苯硫基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻唑基、呋咱基(furzanyl)、噁二唑基、噻二唑基、噁三唑基和噻三唑基组成的组中的5元杂芳基。
在一些实施方式中，环C是选自由吡唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻唑基、噁二唑基和噻二唑基组成的组中的5元杂芳基。
在一些实施方式中，环C是选自由以下组成的组中的5元杂芳基：其中星号表示与环A的连接点。
在一些实施方式中，环C是选自由以下组成的组中的5元杂芳基：其中星号表示与环A的连接点。
在一些实施方式中，环C是其中星号表示与环A的连接点。
在一些实施方式中，环C是其中星号表示与环A的连接点。
在一些实施方式中，环C是其中星号表示与环A的连接点。
在一些实施方式中，环C是其中星号表示与环A的连接点。
在一些实施方式中，环C是选自由吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基和三嗪基组成的组中的6元杂芳基。
在一些实施方式中，环C是选自由以下组成的组中的6元杂芳基：
其中星号表示与环A的连接点。
在一些实施方式中，Rb每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤素和氰基。
在一些实施方式中，R1和R2每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苄基、C(＝O)R5、C(＝O)OR5和C(＝O)NR5R6；或
在一些实施方式中，同一氮原子上的一对R1和R2与连接它们的所述氮原子一起形成包含4-8个环原子的饱和环、部分不饱和环或芳族环，其中0-2个环原子(除了连接R1和R2的氮原子之外)是各自独立地选自由N、N(Ra)、O和S组成的组中的环杂原子。
在一些实施方式中，R3每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基和任选取代的苯基。
在一些实施方式中，R4每次出现时独立地选自由以下组成的组：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基；和任选取代的苄基。
在一些实施方式中，R5和R6每次出现时独立地选自由以下组成的组：H和C1-4烷基。
在一些实施方式中，式(I)化合物是式(II)或其药学上可接受的盐
在一些实施方式中，式(I)化合物是式(II')或其药学上可接受的盐
在式(II')的一些实施方式中，环C是5元杂芳基。
在式(II')的一些实施方式中，环C是选自由吡唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻唑基、噁二唑基和噻二唑基组成的组中的5元杂芳基。
在式(II')的一些实施方式中，环C是选自由吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基和三嗪基组成的组中的6元杂芳基。
在一些实施方式中，式(I)化合物选自图2和下表中的那些。
药物组合物和施用
术语“药学上可接受的盐”包括通常被用来形成碱金属盐以及形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。可以被用以形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括诸如以下的无机酸：盐酸、硫酸以及磷酸，以及诸如以下的有机酸：马来酸、琥珀酸以及柠檬酸。其他药学上可接受的盐包括具有碱金属或碱土金属比如钠、钾、钙以及镁的盐，或具有有机碱比如二环己胺的盐。本公开化合物的合适的药学上可接受的盐包括例如酸加成盐，所述酸加成盐可以例如通过使根据本公开的化合物的溶液与药学上可接受的酸的溶液混合来形成，药学上可接受的酸比如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。所有的这些盐可以通过常规方法通过例如使合适的酸或碱与本公开的相应的化合物反应来制备。
由游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、或氢氧化铁，以及衍生自有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
为了在医药中使用，本公开的化合物的盐应该是药学上可接受的盐。然而，其它盐在制备根据本公开的化合物或其药学上可接受的盐中可以是有用的。
此外，本公开的实施方式包括本公开的化合物的水合物。术语“水合物”包括但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物以及类似的。本公开的化合物的水合物可以通过使化合物与水在合适的条件下接触以产生选择的水合物来制备。
一方面，本发明提供了药物组合物，其包含式(I)化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体，以及药学上可接受的载体。
本公开的实施方式还包括用于制备包含该化合物的药物产品的方法。术语“药物产品”意指如本文所定义的适用于药物用途的组合物(药物组合物)。包括本公开的化合物的被配制用于特定应用的药物组合物也是本公开的一部分，并且将被认为是其实施方式。
因此，在另一个方面，本公开提供了包含式(I)化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物还可包含至少一种另外的治疗剂。
另一方面，本公开提供了药物组合物，其包含有效量的式(I)化合物和药学上可接受的载体，该药物组合物用作药物，例如用于在哺乳动物细胞或细胞群中抑制(HIF)-1α和/或HIF-2α或两者，或用于治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)-1α和/或HIF-2α表达增加相关或与这两者相关的病况或疾病。关于本文所描述的药物组合物，药学上可接受的载体可以是常用的那些中的任何一种，并且仅受物理化学考虑因素比如溶解度和与活性化合物的反应性的缺乏限制，并且受施用途径限制。本文所描述的药学上可接受的载体，例如，溶媒、佐剂、赋形剂、以及稀释剂对本领域的技术人员是熟知的并且对公众是容易得到的。药学上可接受的载体的实例包括可溶性载体比如可以是生理学上可接受的已知的缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂)以及固体组合物比如固态载体或胶乳珠。优选的是，药学上可接受的载体是对活性试剂是化学惰性的载体，并且是在使用条件下具有很少或没有有害的副作用或毒性的载体。
组合物或药物组合物可以通过任何途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、肌内、腹膜内或关节内注射或输注，或通过舌下、口服、外用、鼻内、眼部或经粘膜施用，或通过肺部吸入。
本文所使用的载体或稀释剂可以是用于固体制剂的固体载体或固体稀释剂、用于液体制剂的液体载体或液体稀释剂、或其混合物。
固体载体或固体稀释剂包括但不限于树胶、淀粉(例如，玉米淀粉、预胶凝淀粉)、糖(例如，乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖)、纤维素材料(例如，微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石、或其混合物。
对于液体制剂，药学上可接受的载体可以是，例如，含水溶液或非水溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、以及可注射的有机酯比如油酸乙酯。含水载体包括，例如水、含醇/含水的溶液、环糊精、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。
油的实例是石油、动物、植物、或合成来源的那些，例如，花生油、豆油、矿物油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、芝麻油、棉花籽油、玉米油、橄榄、矿脂、以及矿物。用在肠胃外制剂中的合适的脂肪酸包括例如油酸、硬脂酸、以及异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
肠胃外溶媒(用于皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、或肌内注射)包括例如氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏油和固定油。适用于肠胃外施用的制剂包括例如含水的和非水的等渗无菌注射溶液以及含水的和非水的无菌悬浮液，所述等渗无菌注射溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、以及致使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质，所述无菌悬浮液可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、以及防腐剂。
静脉内溶媒包括例如流体和营养补充剂、电解质补充剂比如基于林格氏葡萄糖的那些等。示例是无菌液体比如添加或没有添加表面活性剂和其它的药学上可接受的佐剂的水和油。通常，水、盐水、含水的葡萄糖以及相关的糖溶液、以及二醇类比如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别地用于可注射的溶液。
此外，在实施方式中，本公开的化合物还可以包括例如粘合剂(例如，阿拉伯树胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔胶、羟基乙酸淀粉钠)、不同pH和离子强度的缓冲剂(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、防止表面吸收的添加剂比如白蛋白或明胶、洗涤剂(例如，吐温20、吐温80、普朗尼克F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如，月桂基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(例如，氢化蓖麻油、甘油、聚乙二醇、苯扎氯铵、苯甲酸苄酯、环糊精、脱水山梨醇酯、硬脂酸)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、叔丁对甲氧酚)、稳定剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、粘度增加剂(例如，卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如，阿斯巴特、柠檬酸)、防腐剂(例如，硫柳汞、苄醇、对羟基苯甲酸酯类)、润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)、助流剂(例如，胶体二氧化硅)、增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如，卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)、聚合物涂层(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)、涂层和膜形成剂(例如，乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)、和/或佐剂。
载体的选择将部分地由特定的化合物以及由用于施用该化合物的特定的方法来确定。因此，有多种合适的本公开的药物组合物的制剂。以下的用于肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内和腹膜内施用的制剂是示例性的并且决不是限制性的。超过一种途径可以用来施用化合物，并且在某些情况中，特定的途径可以提供比另一种途径更直接并且更有效的响应。
用在肠胃外制剂中的合适的脂肪酸盐包括例如脂肪碱金属盐、脂肪铵盐、以及脂肪三乙醇胺盐，并且合适的洗涤剂包括例如：(a)阳离子型洗涤剂比如，例如，二甲基二烷基卤化铵、以及烷基吡啶鎓卤化物；(b)阴离子型洗涤剂比如，例如，烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、以及烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、烯烃硫酸盐、醚硫酸盐、以及单酸甘油酯硫酸盐、以及磺基琥珀酸盐；(c)非离子型洗涤剂比如，例如，脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺、以及聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)两性洗涤剂比如，例如，烷基-β-氨基丙酸盐、以及2-烷基-咪唑啉季铵盐；以及(e)其混合物。
肠胃外制剂将通常在溶液中包含按重量计从约0.5％到约25％的化合物。防腐剂和缓冲剂可以被使用。为了最小化或消除在注射部位的刺激，此类组合物可以包含一种或多种非离子型表面活性剂，例如，具有从约12至约17的亲水亲油平衡(HLB)的非离子型表面活性剂。表面活性剂在此类制剂中的量将通常在按重量计从约5％到约15％的范围内。适当的表面活性剂包括，例如，聚乙二醇失水山梨糖醇脂肪酸酯比如失水山梨糖醇单油酸酯，以及通过氧化丙烯与丙二醇的缩合形成的环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物。
肠胃外制剂可以存在于单元剂量的密封容器中或多剂量的密封容器中，比如安瓿和小瓶，并且可以被存储在冷冻干燥的(冻干的)条件中，只需要在使用之前直接添加无菌液体赋形剂例如水，以用于注射。临时的注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、无菌颗粒、以及无菌片剂制备。
可注射的制剂与本公开一致。对用于可注射的组合物的有效药物载体的要求对本领域普通技术人员是熟知的(参见，例如，Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker and Chalmers,eds.,pages 238250(1982)和ASHP Handbook on Injectable Drugs,Trissel,15th ed.,pages 622630(2009))。--
在一些实施方式中，本文描述的化学实体或其药物组合物适合于局部和外用施用至眼睛(例如，滴眼剂)。眼部组合物可以包含但不限于以下中的任一种或多种：粘精(viscogen)(例如，羧甲基纤维素、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇)；稳定剂(例如，普朗尼克(三嵌段共聚物)、环糊精)；防腐剂(例如，苯扎氯铵、ETDA、SofZia(硼酸、丙二醇、山梨糖醇和氯化锌；Alcon Laboratories公司)、Purite(稳定化的氧氯复合物；Allergan公司))。
在一些实施方式中，本文描述的化学实体或其药物组合物适合于局部和外用施用至皮肤(例如，软膏和乳膏)。软膏是典型地基于矿脂或其他石油衍生物的半固体制备物。含有所选活性剂的乳膏典型地是粘稠液体或半固体乳剂，常常是水包油或油包水的。乳膏基质典型地是可水洗的，并且含有油相、乳化剂和水相。油相，有时还称作“内部”相，一般包括石蜡脂及脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇；尽管不必需，但水相的体积通常超过油相，且一般含有保湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。像其他载体或溶媒那样，软膏基质应是惰性、稳定、无刺激性且不致敏的。
出于本公开的目的，施用的如上所述的任何一种式(I)化合物的化合物、盐、溶剂化物或立体异构体的量或剂量应足以在合理的时间范围内在对象中实现例如治疗性或预防性响应。剂量将根据特定化合物的功效和人的病况以及待治疗的人的体重来确定。
对于口服施用，药物组合物可以采取例如，通过常规手段用药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)制备的片剂或胶囊的形式。可以通过本领域众所周知的方法将片剂包覆。用于口服施用的液体制备物可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者其可以呈现为干燥产品以在使用前用水或其它适合的溶媒构造。这类液体制备物可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性溶媒(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)制备。该制剂还可以酌情含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
治疗方法
普通技术人员应当理解，本公开的化合物是通过一种或多种作用机制的(HIF)-1和/或HIF-2或两者的抑制剂。不受任何特定理论的限制，本公开的化合物可以抑制(HIF)-1和/或HIF-2或两者，并且因此可用于治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)-1α和/或HIF-2α表达增加相关或与这两者相关的病况或疾病，该方法包括向需要这种治疗的对象施用能够抑制HIF介导的转录激活的式(I)化合物。
使用所公开的式(I)化合物的方法的实施方式包括向患有或疑似患有由缺氧介导的病况的对象施用式(I)化合物(包括其药学上可接受的盐)和/或其药物组合物。具体地，可以施用所公开的式(I)化合物和/或药物组合物的实施方式以通过抑制由HIF介导的转录激活来治疗或减轻(HIF)-1α和/或HIF-2α或两者介导缺氧的病况。
另一方面，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)-1α和/或HIF-2α表达增加相关或与这两者相关的病况、疾病或病症的用途，该方法包括向需要这种治疗的对象施用能够抑制HIF介导的转录激活的式(I)化合物。
因此，一方面，本公开提供了治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)-1α和/或HIF-2α表达增加相关的病况、疾病或病症的方法，其包括向对象施用式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。在一些实施方式中，该方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。
在一些实施方式中，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗对象的癌症或过度增殖性疾病的用途，其包括向对象施用包含式(I)化合物的药物组合物。在一些实施方式中，该用途包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。
因此，在一些实施方式中，本公开提供了治疗对象的癌症或过度增殖性疾病的方法，其包括向对象施用式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。在这些实施方式中的某些中，该方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。
在一些实施方式中，本公开提供了治疗过度增殖性疾病例如癌症的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用HIF-1和/或HIF-2抑制剂以及化疗免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂。
另一方面，本公开提供了调节对象的血管生成的方法，其包括向对象施用式(I)化合物、其药学上可接受的盐或其药物组合物。在这些实施方式中的某些中，该方法还包括向对象施用至少一种另外的治疗剂。
所公开的式(I)化合物及其药物组合物的一些实施方式能够通过抑制HIF-1活化来减轻炎症。具体地，所公开的化合物及其药物组合物的某些实施方式具有抗炎作用。式(I)化合物或其药物组合物可以配制用于人类医药和/或兽类医药，并且可以将治疗有效量的式(I)化合物或其药物组合物施用于患有或疑似患有由缺氧介导而产生炎症响应的病况的对象。示例性的由缺氧介导而产生炎症响应的病况包括但不限于恶性肿瘤、肠道炎症(例如，炎性肠病)、肺部炎症(例如，由急性肺损伤引起)、缺血、动脉粥样硬化、心肌梗塞、类风湿性关节炎和伤口愈合。
在一些实施方式中，使用特定标准来选择对象，例如基于例如炎症的临床体征和症状和/或实验室证据而对由缺氧介导的炎症状况的明确诊断。这种对象的例子是C反应蛋白水平升高的人。
在一些实施方式中，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗对象的眼部疾病的用途，所述眼部疾病包括但不限于致盲眼病例如湿性(新生血管性)AMD，缺血性视网膜病变如糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变、早产儿视网膜病变、角膜新生血管形成和新生血管性青光眼。
一方面，本公开的特征在于治疗眼部疾病的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗致盲眼病的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗湿性(新生血管性)AMD的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗缺血性视网膜病变(IR)的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在某些实施方式中，IR是糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗角膜新生血管形成的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
一方面，本公开的特征在于治疗新生血管性青光眼的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的HIF-1和/或HIF-2抑制剂(例如式(I)化合物)、或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。在一些实施方式中，施用通过口服或血管内、或眼内、或眼周、或向眼表面进行。
眼部组合物可以包含但不限于以下中的任一种或多种：粘精(viscogen)(例如，羧甲基纤维素、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇)；稳定剂(例如，普朗尼克(三嵌段共聚物)、环糊精)；防腐剂(例如，苯扎氯铵、ETDA、SofZia(硼酸、丙二醇、山梨糖醇和氯化锌；AlconLaboratories公司)、Purite(稳定化的氧氯复合物；Allergan公司))。
本公开的如上所述的式(I)化合物中任何一种的化合物、盐、溶剂化物、或立体异构体的剂量还将由可能伴随特定化合物的施用的任何不良副作用的存在、性质、以及程度确定。通常，主治医生将决定用其来治疗每个个体患者的化合物的用量，这考虑到多种因素比如年龄、体重、总体健康、饮食、性别、待施用的化合物、施用途径、以及正被治疗的病况的严重程度。举例而言，并且不意图限制本公开，化合物的剂量可以是约0.001mg/kg待治疗的对象的体重/天到约1000mg/kg待被治疗的对象的体重/天、从约0.01mg/kg体重/天到100mg/kg体重/天、或从约1mg/kg体重/天到100mg/kg体重/天。在一些实施方案中，化合物的用量可以在约0.1μM至约100μM、优选约1μM至约50μM的范围内。
可替代地，本公开的化合物可以修饰成储库(depot)形式，使得化合物释放到其施用的体内的方式在时间和体内位置方面受到控制(参见，例如，美国专利号4,450,150)。化合物的储库形式可以是例如包含化合物和多孔或无孔材料(例如聚合物)的可植入组合物，其中化合物被材料封装或扩散到整个材料和/或通过无孔材料降解扩散。然后将储库植入体内所需位置，并且化合物以预定速率从植入物中释放。
在一些实施方式中，本文提供的本公开的化合物可以是控释组合物，即其中一种或多种化合物在施用后一段时间内释放的组合物。控释或缓释组合物包括在亲脂性储库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在另一个实施方式中，组合物是速释组合物，即其中所有或基本上所有化合物在施用后立即释放的组合物。
在一些实施方式中，本公开的化合物在控释系统中递送。例如，可以使用静脉内输注、可植入的渗透泵、经皮贴剂、或其他施用方式来施用药剂。在一个实施方式中，可以使用泵。在另一个实施方式中，可以使用聚合物材料。在又一个实施方式中，控释系统可以放置在治疗靶标(即大脑)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Design ofControlled Release Drug Delivery Systems,Xiaoling Li and Bhaskara R.Jastieds.(McGraw-Hill,2006))。
本公开的药物组合物中包含的化合物还可以包括将活性成分掺入聚合物化合物(例如聚乳酸，聚乙醇酸，水凝胶等)的颗粒制备物之中或之上，或结合于脂质体、微乳、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。这类组合物会影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
根据本公开，本公开的化合物可以通过例如水溶性聚合物的共价连接来修饰，所述水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸。已知所述修饰的化合物与相应的未修饰的化合物相比，静脉内注射后在血液中表现出明显更长的半衰期。这类修饰也可以增加化合物在水溶液中的溶解度，消除聚集，提高化合物的物理和化学稳定性，并大大降低化合物的免疫原性和反应性。因此，与未修饰的化合物相比，可以通过以更小频率或更低剂量施用这类聚合物-化合物加合物来实现期望的体内生物活性。
活性剂和治疗剂在本文中可互换使用，是指诱导期望的药理学和/或生理学作用的化学或生物化合物，其中该作用可以是预防性或治疗性的。该术语也涵盖本文具体提及的那些活性剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物，包括但不限于，盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。则当使用术语“活性剂”、“药理学活性剂”和“药物”时，应当理解本公开包括活性剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。活性剂可以是生物实体如病毒或细胞，无论其是天然存在的或经操作的，例如经转化。
本公开考虑了单一治疗方案以及组合治疗方案。因此，所公开的药物组合物的一些实施方式可以包含治疗有效量的除式(I)化合物之外的第二治疗剂。相对于仅包含式(I)化合物作为活性剂的药物组合物，第二治疗剂可以增加药物组合物的有效性。第二治疗剂的示例性类别包括但不限于抗癌剂、抗疟剂、抗组胺剂、抗生素、抗病毒药物、抗炎剂及其组合。
在某些实施方式中，在接触化学实体或施用化学实体之前(例如，约1小时前、或约6小时前、或约12小时前、或约24小时前、或约48小时前、或约1周前、或约1个月前)向对象施用第二治疗剂或方案。
在其他实施方式中，在与化学实体接触或施用化学实体的大约同时，将第二治疗剂或方案施用给对象。举例而言，第二治疗剂或方案和化学实体以相同剂型同时提供给对象。作为另一个示例，第二治疗剂或方案和化学实体以单独的剂型同时提供给对象。
在其他实施方式中，在接触化学实体或施用化学实体后(例如，约1小时后、或约6小时后、或约12小时后、或约24小时后、或约48小时后、或约1周后、或约1个月后)向对象施用第二治疗剂或方案。
在一些实施方式中，第二治疗剂是抗癌剂。合适的抗癌剂包括但不限于化疗药物治疗、放射、基因治疗、激素操作、免疫治疗和反义寡核苷酸治疗。化疗剂包括但不限于烷化剂，例如氮芥(nitrogen mustard)(例如，苯丁酸氮芥、氯甲胺(chlormethine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀和链佐星)、铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂和BBR3464)、白消安、达卡巴嗪、二氯甲二乙胺、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替派和尿嘧啶氮芥；抗代谢物，例如叶酸(例如，氨甲蝶呤、培美曲塞和雷替曲塞)、嘌呤(例如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤和硫鸟嘌呤(tioguanine))、嘧啶(例如，卡培他滨)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶和吉西他滨；植物生物碱，例如鬼臼(podophyllum)(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、紫杉烷类(例如，多西他赛和紫杉醇)、长春花类(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)；细胞毒性/抗肿瘤抗生素，例如蒽环类家族成员(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌和戊柔比星)、博来霉素、羟基脲(hydroxyurea)和丝裂霉素；拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑替康和伊立替康；单克隆抗体，例如阿仑单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、吉姆单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗；光敏剂，例如氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、卟吩姆钠和维替泊芬；以及其他药剂，例如阿利维A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、贝沙罗汀、硼替佐米、塞来昔布、地尼白介素(denileukin diftitox)、厄洛替尼、雌莫司汀、吉非替尼、羟基尿素、伊马替尼、喷司他丁、马索丙考、米托坦、培门冬酶和维甲酸(tretinoin)。还考虑了所公开的式(I)化合物与放射治疗的共同施用。使用放射治疗来治疗癌症的方法是本领域众所周知的。
在其他实施方式中，第二治疗剂是抗疟剂。合适的抗疟剂包括但不限于奎宁、奎尼丁、辛可因(cinchoine)、辛可尼丁、4-氨基喹诺酮类如阿莫地喹、氯喹、氯喹类似物、喹啉类似物、羟氯喹、乙胺嘧啶、氯胍(白乐君)、阿托伐醌(可以以Malarone获得，其是阿托伐醌和氯胍的组合)、磺胺类药物如磺胺多辛和磺胺甲氧基哒嗪、甲氟喹、伯氨喹、青蒿素、青蒿素衍生物如青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚和二氢青蒿素、卤泛群(一种菲甲醇)、Halfan、多西环素、四环素、克林霉素、prodiginines及其组合。
在又其他实施方式中，第二治疗剂是抗炎剂。示例性的抗炎药包括非甾体抗炎药(NSAID)，例如布洛芬、酮洛芬、吡罗昔康、萘普生、舒林酸、阿司匹林、碱式水杨酸胆碱、二氟尼柳、非诺洛芬、吲哚美辛、甲氯芬那酸、双水杨酯、托美丁、酮咯酸、氟比洛芬和水杨酸镁。
本公开的化合物可以任选地与选自以下的一种或多种活性剂组合使用：STING激动剂化合物、抗病毒化合物、抗原、佐剂、CTLA-4和PD-1途径拮抗剂和其他免疫调节剂、脂质、脂质体、肽、抗癌剂和化疗剂，包括但不限于PARP抑制剂、ACAT1抑制化合物、自噬抑制化合物、酪氨酸激酶和信号激酶抑制剂(例如AKT、MEK)、细胞周期抑制剂(例如CDK4/6、Wee1、Plk、极光激酶)和染色质修饰剂。
另外的治疗剂的进一步实例包括但不限于酶、受体拮抗剂或激动剂、激素、生长因子、自体骨髓、抗生素、抗微生物剂、RNA和DNA分子和核酸以及抗体。上述类别的有用治疗剂的具体实例包括：抗肿瘤剂例如雄激素抑制剂、抗代谢剂、细胞毒剂和免疫调节剂。
烷基化抗肿瘤剂的其他实例包括卡铂和顺铂；亚硝基脲烷化抗肿瘤剂，例如卡莫司汀(BCNU)；抗代谢物抗肿瘤剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶类似物抗肿瘤剂，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨；激素抗肿瘤药，例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗肿瘤药，例如阿地白介素、白介素-2、多西他赛、依托泊苷、干扰素；紫杉醇、其它紫杉烷衍生物和维甲酸(ATRA)；抗生素天然抗肿瘤药，例如博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星和丝裂霉素；长春花生物碱天然抗肿瘤药，例如长春碱和长春新碱，以及PD1抑制剂，例如兰博利珠单抗。
本公开的化合物可以任选地与一种或多种HIF-1和/或HIF-2抑制剂组合使用，所述HIF-1和/或HIF-2抑制剂包括但不限于苯并吡喃基三唑、BIX01294、卡烯内酯、CRLX-101、EZN-2208、大豆抗毒素、IDF-1174、LBH589、MPT0G157、伏立诺他、NNC55-0396、醚菌酯类似物、贝组替凡和PT2399。
在某些实施方式中，另外的化疗剂是免疫调节部分，例如免疫检查点抑制剂。在这些实施方式的某些中，免疫检查点抑制剂靶向选自由以下组成的组中的免疫检查点受体：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-1–PD-L1、PD-1–PD-L2、白细胞介素-2(IL-2)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-10、转化生长因子-β(TGFβ)、T细胞免疫球蛋白和粘液素3(TIM3或HAVCR2)、半乳糖凝集素9–TIM3、磷脂酰丝氨酸–TIM3、淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG3)、MHC II类–LAG3、4-1BB–4-1BB配体、OX40–OX40配体、GITR、GITR配体–GITR、CD27、CD70-CD27、TNFRSF25、TNFRSF25–TL1A、CD40L、CD40–CD40配体、HVEM–LIGHT–LTA、HVEM、HVEM–BTLA、HVEM–CD160、HVEM–LIGHT、HVEM–BTLA–CD160、CD80、CD80–PDL-1、PDL2–CD80、CD244、CD48–CD244、CD244、ICOS、ICOS–ICOS配体、B7-H3、B7-H4、VISTA、TMIGD2、HHLA2–TMIGD2、嗜乳脂蛋白，包括BTNL2、Siglec家族、TIGIT和PVR家族成员、KIR、ILT和LIR、NKG2D和NKG2A、MICA和MICB、CD244、CD28、CD86–CD28、CD86–CTLA、CD80–CD28、CD39、CD73腺苷–CD39–CD73、CXCR4–CXCL12、磷脂酰丝氨酸、TIM3、磷脂酰丝氨酸–TIM3、SIRPA–CD47、VEGF、神经菌毛素、CD160、CD30和CD155(例如CTLA-4或PD1或PD-L1)。参见，例如，Postow,M.J.Clin.Oncol.2015,33,1。
免疫检查点抑制剂包括但不限于乌瑞芦单抗(Urelumab)、PF-05082566、MEDI6469、TRX518、伐立鲁单抗(Varlilumab)、CP-870893、派姆单抗(PD1)、纳武单抗(PD1)、阿特珠单抗(以前称为MPDL3280A)(PDL1)、MEDI4736(PD-L1)、阿维单抗(Avelumab)(PD-L1)、PDR001(PD1)、BMS-986016、MGA271、利瑞鲁单抗(Lirilumab)、IPH2201、依米妥珠单抗(Emactuzumab)、INCB024360、Galunisertib、乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)、BKT140、巴维妥昔单抗(Bevacizumab)、CC-90002、贝伐珠单抗和MNRP1685A、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、伊匹单抗、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、KN035、IBI308、BGB-A317、BCD-100、JS001和MGA271。
作为另一个实例，治疗本文所述的眼部疾病(例如，致盲眼病)的方法还可包括施用抗血管内皮生长因子(VEGF)剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、过氧化物酶体增殖剂-激活受体(PPAR)-γ激动剂、肾素抑制剂、类固醇、自噬调节剂、塞马莫德(semapimod)、MIF抑制剂、CCR2抑制剂、CKR-2B、2-硫代咪唑、CAS 445479-97-0、CCX140、氯膦酸盐、氯膦酸盐脂质体制备物和氯化钆。
在一些实施方式中，本公开提供了有效量的本文公开的化合物或药物组合物用于治疗或预防Von Hippel-Lindau病，或HIF-1、HIF-2或缺氧响应被确定为治疗靶向的潜在机制的任何其他疾病。
使用所公开的式(I)化合物的方法的实施方式包括通过使细胞与有效量的式(I)化合物(包括其药学上可接受的盐)接触来抑制HIF-1和/或HIF-2或两者的活性。细胞可以在体外或体内与式(I)化合物接触。细胞还可以与第二治疗剂接触。在一些实施方式中，接触细胞包括向对象施用治疗有效量的(i)式(I)化合物或其药学上可接受的盐，或(ii)包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
如本文所用，术语“对象”指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，例如小鼠和仓鼠，以及兔形目哺乳动物，例如兔。优选的是，哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。优选的是，哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)，或者属于奇蹄目，包括马科动物(马)。最优选的是，哺乳动物属于灵长目、Ceboids目或Simoids(猴)或类人猿目(人和猿)。特别优选的哺乳动物是人。
如本文所用，术语“调节”是指本文所述的式(I)化合物增加或减少例如血管生成的活性。
如本文所用，术语“过度增殖性疾病”包括癌症和其他疾病，例如瘤形成和增生。细胞增殖性疾病包括例如类风湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉粥样硬化、肿瘤前病变、原位癌、口腔毛状白斑或牛皮癣。
根据一个或多个实施方式，术语“癌症”包括但不限于以下任一种：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、与AIDS相关的癌症、与AIDS相关的淋巴瘤、肛门癌、阑尾肿瘤、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑基底细胞癌、肝外胆管癌(见胆管上皮癌)、膀胱癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤骨肿瘤、脑干神经胶质瘤脑癌、小脑星形细胞瘤脑瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤脑瘤、室管膜瘤脑瘤、髓母细胞瘤脑瘤、幕上原始神经外胚瘤脑瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、儿童期类癌瘤、未知的原发性胃肠道癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性脊髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌症、室管膜瘤、食管癌、Ewing肉瘤、颅外胚细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼内黑素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、胚细胞瘤：颅外、性腺外或卵巢、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干神经胶质瘤、神经胶质瘤、儿童期星形细胞瘤、儿童期视觉途径和下丘脑神经胶质瘤、胃类癌、多毛细胞白血病、肝细胞(肝)癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、儿童期下丘脑和视觉途径神经胶质瘤、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、急性淋巴母细胞白血病(也称作急性淋巴细胞性白血病)、急性髓性白血病(也称作急性髓性白血病)、慢性淋巴细胞性白血病(也称作慢性淋巴细胞白血病)、慢性髓性白血病(也称作慢性髓样白血病)、多毛细胞白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS-相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍金奇淋巴瘤、非霍金奇淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、巨球蛋白血症、骨恶化纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、脊髓发育不良/骨髓组织增殖性疾病、慢性髓系白血病、成人急性髓性白血病、儿童期急性髓性白血病、多发性急性骨髓瘤(骨髓癌)、慢性骨髓增殖性疾病、粘液瘤、鼻腔和鼻窦肿瘤、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、儿童期松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、儿童期横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉瘤、Ewing家族肿瘤肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌(非黑素瘤)、皮肤癌(黑素瘤)、皮肤癌、Merkel细胞、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌—参见皮肤癌(非黑素瘤)、具有不可思议的原发性转移性鳞状颈癌、胃癌、儿童期幕上原发性神经外胚层瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、未知的原发位点癌、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌症、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌症、视觉途径和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、巨球蛋白血症和/或Wilms瘤(肾癌)。
如本文所用，术语“致盲眼病”是指多种眼科疾病中的一种并且包括眼睛和眼附属器的疾病。致盲眼病包括但不限于年龄相关性黄斑变性(AMD)(例如非渗出性AMD、新生血管性AMD)、缺血性视网膜病变(包括但不限于糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变)、以及在炎症性眼病(例如，匐行性脉络膜视网膜病、匐行性视网膜病、急性后多病灶盾鳞状色素上皮病(APMPPE)、多发性易消散白点综合征(MEWDS)、急性带状潜隐性外视网膜病(AZOOR)、点状内层脉络膜病(PIC)以及弥漫性视网膜下纤维化(DSF))的背景下的眼部新生血管形成、或中心性浆液性视网膜病变(CSR)、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼和翼状胬肉，以及眼内或眼周肿瘤(包括但不限于葡萄膜黑色素瘤、结膜黑色素瘤、视网膜母细胞瘤和结膜鳞状细胞癌)。
在各种实施方式中，致盲眼病是AMD。AMD是发达国家中失明的主要原因。早期AMD的特点是玻璃膜疣的积累，这是疾病的标志，而地图样萎缩(GA)和脉络膜新生血管(CNV)分别是晚期非渗出性(所谓的“干性”或萎缩性)和渗出性(所谓的“湿性”或新生血管性)疾病的致盲并发症。抗VEGF治疗彻底改变了湿性AMD的治疗方法，但仅占所有AMD病例的12-15％。尽管补充维生素可以减缓进展速度，但目前尚无针对干性AMD的治疗方法。
在各种实施方式中，致盲眼病是湿性AMD。湿性AMD的特征是视网膜或RPE下方生长新生血管，可能会出血和渗漏液体，导致大多数情况下中心视力迅速且通常严重丧失。中心视力的丧失会损害阅读、驾驶和识别面孔的能力，从而对日常生活产生不利影响。在一些情况下，黄斑变性从干性进展为湿性。
在一个实施方式中，致盲眼病是渗出性或湿性AMD。在一个实施方式中，致盲眼病与脉络膜新生血管形成(CNV)相关。
在一些实施方式中，致盲眼病是缺血性视网膜病变，包括糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变。在一个实施方式中，致盲眼病与视网膜新生血管形成或黄斑水肿相关。
在一个实施方式中，致盲眼病是角膜新生血管形成。在一个实施方式中，致盲眼病与角膜新生血管形成(CoNV)相关。
在一个实施方式中，致盲眼病是新生血管性青光眼。在一个实施方式中，致盲眼病与虹膜新生血管形成(NVI)或房角新生血管形成(NVA)相关。
在其他实施方式中，致盲眼病是特发性病症，不希望受理论束缚，其特征可以是视网膜炎症，伴有或不伴有黄斑变性，包括但不限于糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变、早产儿视网膜病变、白点综合征(例如匐行性脉络膜视网膜病、匐行性视网膜病、急性后多病灶盾鳞状色素上皮病(APMPPE)、多发性易消散白点综合征(MEWDS)、急性带状潜隐性外视网膜病(AZOOR)、点状内层脉络膜病(PIC)以及弥漫性视网膜下纤维化(DSF))。
在其他实施方式中，致盲眼病是中心性浆液性视网膜病变(CSR)。CSR是黄斑层与其支持组织的流体脱离。CSR的特征通常是流体渗漏和积聚到视网膜下或RPE下空间。不希望受理论束缚，由于RPE中的小破裂，可能会发生流体的渗漏和积聚。
除了治疗预先存在的致盲眼病之外，本公开内容还包括预防方法，以预防或减缓这些疾病的发作。在预防性应用中，可以将药剂施用于易患特定致盲眼病或处于特定致盲眼病风险的对象。这种易感性可以通过例如家族易感性、基因测试、危险因素分析、血液或其他细胞因子或生物标志物水平以及眼部检查来确定，眼部检查可以包括多模式分析，例如FAF、蓝光、白光、无红光、近红外、红外、DNIRA等。这种敏感性还可以通过例如OCT检测、横截面、三维和正面观察来确定。
如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”是指减轻症状或阻止或抑制疾病的进一步发展(完全或部分地)。“治疗(treating/treatment)”包括导致疾病等的改善的任何效果，例如减轻、降低、调节或消除。例如，本文的某些方法通过减少或降低癌症的发生、生长、转移或进展或减少癌症的症状来治疗癌症。
如本文所用，术语“有效量”是足以实现规定的目的(例如实现其施用的效果、治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性或减轻疾病的一种或多种症状)的量。“有效量”的实例是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可称为“治疗有效量”。药物的“预防有效量”是当施用于对象时会具有预期预防效果(例如预防或延迟疾病的发作(或复发)或降低疾病或其症状发作(或复发)的可能性)的药物的量。
如本文所用，术语一种或多种症状的“降低”是指一种或多种症状的严重性或频率减小，或一种或多种症状的完全消除。
如本文所使用的，术语“接触”是指允许至少两种不同的种类变得足够接近以进行反应、相互作用和/或物理接触的过程。然而，应当理解，所得的反应产物可以直接由所添加的试剂之间的反应产生，或者由可在反应混合物中产生的来自一种或多种所添加的试剂的中间体产生。术语“接触”包括允许两种物质反应、相互作用和/或物理接触，其中两种物质可以是本文所述的化合物和药物靶标，例如HIF-1α和/或HIF-2α。
如本文所定义，关于蛋白质-抑制剂(例如，拮抗剂)相互作用的术语“抑制(inhibition/inhibit/inhibitng等)”意指相对于不存在抑制剂时蛋白质的活性或功能，对蛋白质的活性或功能产生负面影响(例如，降低)。在一些实施方式中，抑制是指疾病进展和/或疾病症状的减少。在一些实施方式中，抑制是指信号转导途径或信号传导途径的活性的降低。因此，抑制包括至少部分地、不完全地或完全地阻断刺激，减少、防止或延迟激活，或失活、脱敏或下调信号转导或酶活性或蛋白质的量。在一些实施方式中，抑制是指由HIF介导的转录激活的减少。
如本文所用，术语“疾病”是指对象或能够用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的对象的存在状态或健康状况。在一些实施方式中，本文所述的化合物和方法包括降低或消除疾病的一种或多种症状，例如通过施用本文所述的化合物、其药学上可接受的盐、或包含本文所述的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
如本文所用，术语“HIF-1”是指转录调节缺氧诱导因子-1(HIF-1)，是一种由氧调节亚基(HIF-1α)和组成型表达的核亚基(HIF-1β)组成的异二聚体复合蛋白。
如本文所用，术语“HIF-2”是指转录调节缺氧诱导因子-2(HIF-2)，是一种由氧调节亚基(HIF-2α)和组成型表达的核亚基(HIF-1β)组成的异二聚体复合蛋白。
实施例
示例性化合物是通过以下实施例中列出的几种通用合成路线制备的。本发明所公开的任何化合物可以根据这些合成路线或具体实施例中的一种或多种来制备，或者通过本领域普通技术人员可获得的其变型来制备。
除非另有说明，所有市售试剂和溶剂均未经进一步纯化而使用。使用TeledyneIsco或Grace/Buchi快速硅胶和/或C18柱在Teledyne Isco CombiFlash Rf+或GraceReveleris上进行自动快速色谱分析。在Bruker Avance-III光谱仪上(1H NMR，500MHz和13CNMR，125MHz)，以296K在CDCl3(1H NMR参考内标四甲基硅烷0ppm，13C NMR参考77.00ppm)，d6-DMSO(1HNMR参考2.50ppm，13C NMR参考39.510ppm)中记录光谱。使用配备自动进样器的Agilent 1260(Agilent Poroshell 120色谱柱(50x3.0mm ID，2.7μm)；0.05％TFA水/乙腈梯度溶液；220和254nm处UV检测)和电喷雾电离进行分析LC-MS。除非另有说明，否则使用此方法，所有最终化合物在215和254nm处的纯度均大于95％。
7-溴-1H-吲哚-3-甲腈的合成。
向快速搅拌的7-溴吲哚(5.0g，25.5mmol，1.0当量)在无水DMF(17ml)中的溶液中滴加氯磺酰异氰酸酯(2.4ml，28.1mmol，1.1当量)，同时用冰水浴冷却。添加完成后，使冰水浴平衡至室温过夜(约18小时)。将反应缓慢加入到快速搅拌的冰水中，产生沉淀。过滤固体，用水洗涤并真空干燥，得到红棕色固体状的7-溴-1H-吲哚-3-甲腈(5.32g，94％)。该物质无需进一步纯化即可使用。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.28(s,1H),7.76(s,1H),7.60(d,J＝8.49Hz,1H),7.37(dd,J＝1.41,8.49Hz,1H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ136.1,135.6,125.7,124.6,120.2,115.9,115.8,115.6,84.6.LCMS tR＝2.33min,m/z 220.9,222.8[M+H]+242.9,244.9[M+Na]+。
7-溴-1H-吲哚-3-硫代甲酰胺的合成。
向5ml Biotage小瓶中装入7-溴-1H-吲哚-3-甲腈(398mg，1.80mmol，1.00当量)，20wt％(NH4)2S水溶液(3.1ml，9.0mmol，5.0当量)和MeOH(0.6mL)。密封小瓶后，将悬浮液在Biotage Initiator微波炉中于100℃照射3小时。将反应混合物冷却后，过滤沉淀物，用水洗涤并真空干燥，得到7-溴-1H-吲哚-3-硫代甲酰胺的浅黄色晶体(438mg，95％收率)。该物质无需进一步纯化即可用于下一步。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.84(br.s.,1H),9.03(br.s.,1H),8.90(br.s.,1H),8.59(d,J＝8.65Hz,1H),8.09(s,1H),7.62(d,J＝1.73Hz,1H),7.27(dd,J＝1.73,8.65Hz,1H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ193.2,137.7,128.4,125.2,123.7,123.6,116.3,114.8,114.6.LCMS tR＝2.07min.m/z 257.0,254.9[M+H]+.
2-溴-1-(6-溴-1-甲苯磺酰基-1H-吲哚-3-基)乙烷-1-酮的合成。
在室温下，向AlCl3(30.17mmol)在CH2Cl2(60mL)中的悬浮液中添加溴乙酰溴(1440uL，16.5mmol)，持续15分钟。在0℃下向该混合物中滴加6-溴-1-甲苯磺酰基-1H-吲哚(7.31mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液。将混合物在0℃搅拌1小时并倒在冰(60g)上。用CH2Cl2萃取水层。将有机萃取物用饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤并经无水Na2SO4干燥。除去溶剂后，将粗产物用CHCl3/EtOH重结晶并用二氯甲烷/己烷进行柱色谱纯化，得到2-溴-1-(6-溴-1-甲苯磺酰基-1H-吲哚-3-基)乙烷-1-酮(2.32g，67％产率)，为白色固体。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.30(s,1H),8.16(d,J＝8.49Hz,1H),8.12(d,J＝1.57Hz,1H),7.82-7.87(m,J＝8.49Hz,2H),7.48(dd,J＝1.65,8.57Hz,1H),7.30-7.37(m,J＝8.17Hz,2H),4.33(s,2H),2.41(s,3H)；13C NMR(125.7MHz,氯仿-d)δ186.8,146.6,135.4,134.0,133.0,130.6,128.6,127.2,126.4,124.3,120.0,117.8,116.3,31.1,21.8；LCMS m/z 471.6[M+H]+.
4-(6-溴-1-甲苯磺酰基-1H-吲哚-3-基)-2-(7-溴-1H-吲哚-3-基)噻唑的合成。
7-溴-1H-吲哚-3-硫代甲酰胺(815mg，3.19mmol)和2-溴-1-(6-溴-1-甲苯磺酰基-1H-吲哚-3-基)乙烷-1-酮4(1.58g，3.35mmol)在EtOH(100ml)中的悬浮液回流30分钟。将混合物冷却并过滤沉淀物，用冷EtOH(20mLx2)洗涤并真空干燥以提供4-(6-溴-1-甲苯磺酰基-1H吲哚-3-基)-2-(7-溴-1H-吲哚-3-基)噻唑(2.00g，99.9％收率)，为白色固体。该物质无需进一步纯化即可用于下一步。
实施例1：4-(6-溴-1H-吲哚-3-基)-2-(7-溴-1H-吲哚-3-基)噻唑(32-134D)。
向4-(6-溴-1-甲苯磺酰基-1H-吲哚-3-基)-2-(7-溴-1H-吲哚-3-基)噻唑(2.00g，3.19mmol)在乙醇(40ml)和水(40ml)中的悬浮液中添加KOH(4g，5％W/V)。将混合物在氮气下加热回流直至完成(1天)。在室温下添加水(40ml)以稀释混合物。将反应混合物过滤，用水(30mlx3)洗涤并将沉淀物干燥。将沉淀物用EtOAc和EtOH溶解并吸收到硅胶上。柱色谱法(己烷/(EtOAc+10％EtOH))得到4-(6-溴-1H-吲哚-3-基)-2-(7-溴-1H-吲哚-3-基)噻唑(32-134D))(1.20g，两步总收率79.4％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.00(br.s.,1H),11.54(br.s.,1H),8.39(d,J＝8.02Hz,1H),8.18(d,J＝8.65Hz,1H),8.17(s,1H),8.04(s,1H),7.69(s,1H),7.67(s,1H),7.49(d,J＝7.55Hz,1H),7.30(d,J＝8.65Hz,1H),7.21(t,J＝7.78Hz,1H)；13C-NMR(125.7MHz,DMSO-d6)δ161.8,150.5,138.0,135.4,127.9,126.5,126.3,125.6,124.2,123.0,122.7,122.4,120.6,114.9,114.8,112.4,111.9,107.7,105.3；LCMS m/z 471.6[M+H]+.
实施例2：3,5-二(1H-吲哚-3-基)-1,2,4-噻二唑(33-063)。
在25℃下，将碘苯二乙酸酯(1.02g，2.41mmol)添加至吲哚-3-硫代甲酰胺(416mg，2.36mmol)在MeOH/CH3CN(12mL/12mL)中的搅拌溶液中。反应在20分钟内完成。将反应混合物浓缩并通过硅藻土过滤，用EtOAc洗涤。真空浓缩EtOAc，并通过硅胶柱色谱法纯化残余物。获得3,5-二(1H-吲哚-3-基)-1,2,4-噻二唑(275mg，收率74％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.13(br.s.,1H),11.72(br.s.,1H),8.47(m,1H),8.43(s,1H),8.27(m,2H),7.57(m,1H),7.53(m,1H),7.32(m,2H),7.23(m,2H))；13C NMR(125.7MHz,DMSO-d6)δ180.7,170.2,137.2,137.1,129.8,129.2,125.6,124.7,123.4,122.6,122.0,121.0,120.7,113.1,112.5,110.7,108.1；LCMS m/z 317.0[M+H]+.
实施例3：生物学和药理学的总结。
NCI CellMiner数据库包含60个人类癌细胞系中25,698个mRNA的表达数据，这些癌细胞系暴露于21,770种化学化合物(Reinhold WC,et.al.,Cancer Res.2012；72(14):3499-3511)。查询CellMiner数据库以寻找诱导基因表达变化的化合物，所述基因表达变化与吖啶黄诱导的基因表达变化高度相关，但在结构上与吖啶黄无关。在用HIF依赖性报告质粒p2.1以及对照报告物pSVR稳定转染的Hep3B-c1细胞中分析满足这些标准的化合物(Zhang H.et.al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(50):19579-19586)，在HIF依赖性报告质粒p2.1中，萤火虫荧光素酶(FLuc)编码序列位于缺氧响应元件(HRE)和基础SV40启动子的下游；在对照报告物pSVR中，海肾荧光素酶(RLuc)编码序列位于仅基础SV40启动子的下游(图1A)。缺氧细胞中的FLuc/RLuc比率是HIF依赖性基因表达的具体量度(图1B)。NSC-705870(本文中指定为11-88)是一种双溴吲哚噻唑化合物，其在CellMiner数据库中与吖啶黄的Pearson相关性为0.475(p＝1.2x10-4)，显著抑制缺氧Hep3B细胞中的FLuc/RLuc比率，其IC50为2.9μM(图1C)。
以苗头化合物11-88为基础制备了许多类似物，所述类似物中，吲哚基团的卤素取代被改变，或中心噻唑被咪唑、异噁唑、噁二唑、噁唑、吡嗪酮、哒嗪、吡嗪、吡唑、吡啶、噻二唑、三嗪或三唑取代。在224种类似物中，鉴定出27种化合物可抑制HIF转录活性，其IC50<3.3μM(图1C、2和表7)。进一步在关于Hep3B细胞中内源HIF靶基因表达方面表征双溴吲哚噻唑32-134D和双吲哚噻二唑33-063(图1B和1C)。逆转录(RT)和定量实时PCR(qPCR)显示，这两种化合物均抑制以下HIF靶基因的缺氧诱导型表达：CA9，其在Hep3B细胞中仅被HIF-1激活；ANGPTL4和VEGFA，受HIF-1和HIF-2两者调节；NDRG1和EPO，其在Hep3B细胞中仅被HIF-2激活(图3)。这些数据表明这些化合物抑制HIF-1或HIF-2介导的转录。为了进行比较，我们测试了PT2385的影响，PT2385抑制EPO、NDRG1、ANGPTL4和VEGFA表达，但对CA9没有影响，这与其HIF-2选择性作用机制一致(Wallace EM et al.,Cancer Res.2016；76(18):5491-5500)。这些化合物对RPL13A表达均没有任何影响，RPL13A表达既不是缺氧诱导的，也不是HIF调节的(图3)。
为了研究作用机制，确认了几种化合物抑制缺氧诱导型和HIF依赖性报告基因表达的能力(图4A)；结果发现，所测试的化合物对HIF-1α、HIF-2α或HIF-1β蛋白的表达(图4B)和HIF亚基二聚化(图4C)均没有任何影响。为了检验新的HIF抑制剂通过阻断HIF反式激活结构域(TAD)功能起作用的假设，使用了由质粒pG5-E1b-FLuc和pGal表达载体组成的报告系统(Jiang BH et al.,J Biol Chem.1997；272(31):19253-19260)，质粒pG5-E1b-FLuc含有针对酵母GAL4转录因子的五个结合位点，该五个结合位点在基础腺病毒E1b启动子和FLuc编码序列上游(图5A)，pGal表达载体编码由GAL4 DNA结合结构域和编码完整的TAD(Gal A)或其亚片段(Gal B、G、H和L)的HIF-1a氨基酸残基531-826组成的融合蛋白(图5B)。Gal A、B、G和L的表达导致缺氧诱导型FLuc反式激活，如先前所描述的(Jiang BH et al.,JBiol Chem.1997；272(31):19253-19260)。相反，融合蛋白Gal H介导组成型反式激活，因为它缺乏与FIH-1相互作用所需的抑制结构域中的氨基酸757-785(Mahon PC et al.GenesDev 2001；15(20):2675-2686)，当O2可获得时，其使天冬酰胺803羟基化，从而阻断共激活剂p300的募集(Lando D et al.,Genes Dev.2002；16(12):1466-1471)。注意到，所有三种抑制剂都阻断了由Gal A、B、G或L介导的缺氧诱导型FLuc表达，但对Gal H的组成型活性没有影响(图5C)，这消除了化合物直接抑制p300共激活子功能的可能性。
32-134D对Hep3B人HCC肿瘤异种移植物的作用。为了分析HIF抑制剂32-134D对肿瘤异种移植物生长的作用，将Hep3B细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠体内，当肿瘤体积达到150mm3(指定为治疗第1天)时，用溶媒或32-134D通过每天腹膜内注射来治疗小鼠。在20mg/kg下观察到部分生长抑制并且在40和80mg/kg下观察到最大生长抑制(图6A-B)。用32-134D治疗17天对小鼠体重(图6C)、外观或行为没有影响。我们用32-134D治疗另外的小鼠并证实了肿瘤生长的抑制而不影响体重(图7A-C)。与来自溶媒处理的小鼠的肿瘤的血色外观(图7E)相比，从32-134D处理的小鼠收获的肿瘤质量显著减少(图7D)并且表现出苍白，表明对肿瘤血管形成的作用。
肿瘤RNA分析显示，响应于32-134D治疗时，编码以下物质的mRNA的表达显著下降：(i)血管生成生长因子，包括干细胞因子(SCF；也称为Kit配体[KITLG])、胎盘生长因子(PGF)和促红细胞生成素(EPO))；(ii)介导免疫逃避的蛋白质(CD73、PDL1)；(iii)对血管生成和免疫都有影响的蛋白质，包括血管内皮生长因子A(VEGFA)和基质源性因子1(SDF1；也称为CXCL12)(图8A)。对整个肿瘤裂解物进行ELISA，显示用32-134D治疗的小鼠肿瘤中EPO、SCF、SDF1和VEGFA蛋白的表达显著降低(图8B)。使用抗CD31(由血管内皮细胞表达)的抗体进行免疫组织化学分析，证明32-134D治疗小鼠肿瘤中的血管面积明显减少(图8D)。因此，用32-134D治疗可通过抑制多个HIF靶基因的表达来有效抑制人HCC肿瘤异种移植物的生长和血管生成。
32-134D对Hepa1-6小鼠HCC细胞和肿瘤的作用。用33-063或32-134D处理缺氧Hepa1-6小鼠HCC细胞显示，对编码Angptl4、Pgf、Vegfa和Pgk1(糖酵解酶磷酸甘油酸激酶1)的mRNA的缺氧诱导型表达有显著的剂量依赖性抑制(图9)。PT2385是对Angptl4、Pgf和Vegfa mRNA表达的效力较低的抑制剂，并且对仅由HIF-1介导的Pgk1 mRNA表达没有影响。32-134D处理还阻断Glut1(葡萄糖转运蛋白1)和Ldha(糖酵解酶乳酸脱氢酶A)的缺氧诱导型表达(图10A)。因此，32-134D抑制缺氧HCC细胞通过刺激血管生成(Angptl4、Pgf、Vegfa)而增加O2递送或通过增加糖酵解通量(Glut1、Pgk1、Ldha)而刺激无氧代谢的能力。
对乳腺癌中由HIF进行缺氧诱导并促进免疫逃避的基因进行分析(Samanta D etal.,Proc Natl Acad Sci U S A 2018；115(6):E1239-E1248)，其显示Cd47和Cd73在Hepa1-6细胞中不是缺氧诱导的，而Pdl1 mRNA在溶媒处理的细胞中是缺氧诱导的，但在32-134D处理的细胞中则不是缺氧诱导的(图10A)。然而，B7h4和Tim3 mRNA与Pdl1一样，编码受HIF调节(Jeon YK et al.,Biochem Biophys Res Commun.2015；459:277-2833.；Koh HSet al.,Nat Commun.2015；6:6340)并与HCC患者死亡率相关(Shrestha R et al.,FrontOncol.2018；8:269)的免疫检查点受体，它们在溶媒中是缺氧诱导的，但在32-134D处理的细胞中则不是缺氧诱导的(图10A)。
为了测试32-134D是否在免疫活性小鼠模型中抑制HCC生长，将Hepa1-6HCC细胞注射到同基因C57L小鼠的胁腹中(Darlington GJ et al.,J Natl Cancer Inst.1980；64(4):809-819)。当肿瘤变得可触知时(治疗第1天)，小鼠每天腹膜内注射32-134D(40mg/kg/d)(相比于溶媒对照)、或抗Pd1抗体(相比于IgG2a同种型对照)(第1、4、7、10和16天200μg)、或32-134D和抗Pd1两者。所有用溶媒或IgG2a治疗的小鼠中肿瘤生长非常迅速，需要在第24天或之前实施安乐死(图9)。12只接受抗Pd1治疗的小鼠中，有5只的肿瘤消退，但在最后一次抗体治疗(第16天)后，有2只肿瘤复发，肿瘤根除率仅为25％。用32-134D治疗，结果所有小鼠的肿瘤生长均得到显著抑制，12只小鼠中有4只实现了肿瘤根除。在用32-134D和抗Pd1的组合治疗的小鼠中，12只小鼠中有8只肿瘤生长明显减少并且肿瘤根除，并且在停止抗体治疗后没有复发(图11)。因此，添加32-134D可使对抗Pd1免疫检查点阻断产生持久完全响应的小鼠的百分比从25％增加至67％。
为了分析32-134D增加对抗Pd1治疗的响应的机制，用32-134D或溶媒治疗荷瘤小鼠，并通过流式细胞术分析已建立的200mm3肿瘤中的免疫细胞群。在8天内，HIF抑制剂治疗显著增加了Cd8+Ifng+激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和Nk1.1+Cd3-Cd314+激活的自然杀伤(NK)细胞的百分比，这是两个作为抗肿瘤免疫效应子的至关重要的免疫细胞群(图12)。相比之下，Cd11b+F4/80+肿瘤相关巨噬细胞和Cd11b+Ly6g+Ly6c-骨髓源性抑制细胞的百分比有所下降(图12)，这些是对HCC的免疫抑制至关重要的免疫细胞群(Yuen VW et al.,J ClinInvest.2020；130(10):5052-5062)。
通过RT-qPCR对肿瘤组织中的基因表达进行分析显示，32-134D治疗显著降低了编码血管生成因子(Angptl4、Epo、Pgf、Vegfa；图13A)和介导免疫抑制的蛋白质(B7h4、Cd47、Cd70、Cd73、Glut1、Ldha、Pdl1、Tim3、Vegfa；图13A-B)的多种mRNA的表达，而32-134D治疗增加了Cxcl9和Cxcl10的表达，这两种细胞因子对于CTL和NK细胞的募集至关重要(图13C)。为了扩展我们对肿瘤免疫微环境的表征，我们利用RT-qPCR阵列分析了84种细胞因子和趋化因子，结果显示在来自32-134D治疗的小鼠的肿瘤中，40种mRNA的表达下降，其中包括编码免疫抑制细胞因子Cxcl1、Il3、Il4、Il6、Il10、Il12A、Il12B、Il13和Vegfa的那些，并且5种mRNA的表达增加，其中包括Cxcl9和Cxcl10(图14和表1)。为了扩展这些mRNA数据，通过对肿瘤裂解物进行ELISA来对蛋白质表达定量，证实了在32-134D治疗的小鼠的肿瘤中，促进抗肿瘤免疫的Cxcl9和Cxcl10的水平显著增加，并且促进免疫抑制性肿瘤微环境的建立的Cxcl1、Il10和Vegfa的水平显著降低(图15)。
在两种培养的Hepa1-6细胞中，IL22 mRNA表达是缺氧诱导的并且被32-134D抑制(图10B)，并且Hepa1-6肿瘤中IL22 mRNA(图13D)和蛋白质(图15)的表达均被32-134D抑制。相反，在来自32-134D治疗的小鼠的肿瘤组织中观察到Cxcl1、Il6和Il10 mRNA水平降低(图13D)，但在暴露于32-134D的培养的Hepa1-6细胞中则没有观察到降低(图10B)，这表明体内32-134D在免疫细胞或其他基质细胞类型(也已知HIF在这些细胞类型中发挥着关键作用)中抑制了后者mRNA的表达(Kumar V et al.,Immunology.2014；143(4):512-519；Noman MZet al.,Oncoimmunology.2015；3(12):e954463；Palazon A et al.,Immunity.2014；41(4):518-528)，而不是在HCC细胞中。
HIF抑制剂对基因表达的作用与治疗益处一致。32-134D治疗导致：(i)Ca9、Cxcl1、Epo、Ldha、Pgf、Scf/Kitlg和Glut1/Slc2a1 mRNA表达降低，这些都与HCC患者死亡相关；(ii)Ccl12/CCL2、Cxcl2、Cxcl9、Cxcl10和Hc/C5 mRNA表达增加，这些都与HCC患者存活相关(表2)。综上所述，上述数据表明，用HIF抑制剂32-134D治疗HCC小鼠显著损害肿瘤血管形成，明显改变肿瘤免疫微环境以有利于抗肿瘤免疫，并阻断驱动癌症进展的关键信号转导途径(图16)，从而为在用32-134D和抗Pd1抗体治疗的小鼠中观察到的肿瘤根除增加提供了广泛的分子和细胞基础。
HIF抑制剂32-134D在体外有效抑制HIF积累和HIF调节基因的表达。
先前有报道称，视网膜内核层中响应于缺氧/缺血时表达VEGF的细胞是Müller胶质细胞(X.Xin et al.,Proc Natl Acad Sci USA 110,E3425-3434(2013))。用低至1μM的32-134D处理永生化人Müller细胞系MIO-M1，导致响应于缺氧时的HIF-1α和HIF-2α蛋白积累减少(图27A)。32-134D对HIF-1α积累的作用在处理培养的细胞后持续长达16小时(图27B)。这进而导致VEGF和ANGPTL4的mRNA表达的有效抑制(图28A和28B)。用蛋白酶体抑制剂MG-132预处理阻止了32-134D阻断HIF-1α和HIF-2α蛋白质积累的能力(图29A)，表明32-134D诱导了MIO-M1细胞中HIF-α亚基的蛋白酶体化，如先前针对Hep3B人肝细胞癌细胞的描述(S.Salman et al.,J Clin Invest 132(2022))。使用另一种蛋白酶体抑制剂硼替佐米证实了这些结果(图29B)。相反，巴弗洛霉素(一种溶酶体酸化抑制剂)不阻止32-134D抑制响应于缺氧时的HIF-1α积累(图29B)。总的来说，这些结果表明，尽管存在缺氧，32-134D仍促进HIF-1α和HIF-2α蛋白的蛋白酶体依赖性降解。
血管内皮细胞还分泌促进糖尿病性眼病的进展的血管生成介质(Y.Qin et al.,Sci Adv 8,eabm1896(2022))。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)暴露于缺氧诱导了HIF-1α和HIF-2α蛋白积累，而这被32-134D抑制(图30)。由此，与用MIO-M1细胞观察到的相似，32-134D有效抑制缺氧诱导型VEGF和ANGPTL4mRNA表达(图31A)。值得注意的是，ANGPT2和VE-PTP是治疗糖尿病性眼病的两个新兴靶标，均由血管细胞特异性表达(G.Fachinger,et al.,Oncogene 18,5948-5953(1999)；P.C.Maisonpierre et al.,Science 277,55-60(1997))。用缺氧处理HUVEC导致ANGPT2和VEPTP mRNA的表达增加，而这被32-134D抑制(图31B)。对最近鉴定的HIF-2依赖性血管细胞特异性旁分泌血管生成介质PAI-1也获得了类似的结果(Y.Qin et al.,Sci Adv 8,eabm1896(2022)；图31C)。总的来说，这些结果表明，32-134D可以有效抑制HIF-1α和HIF-2α的缺氧诱导型积累以及多种视网膜细胞类型中由它们调节的关键血管生成基因的表达。
32-134D抑制人诱导型多能干细胞源性3维视网膜类器官中HIF积累和HIF调节基因的表达。
为了评估32-134D对糖尿病患者的治疗潜力，用32-134D处理人类诱导多能干细胞(hiPSC)源性3维(3D)视网膜类器官。此前有报道称，在低氧条件(1％O2)下培养的hiPSC源性3D视网膜类器官与缺血性人类视网膜组织相似，HIF-1α和HIF-2α的积累增加(J.Zhanget al.,J Clin Invest 131(2021))。分化120天(D120)时，视网膜内层和外层已清晰界定(图32A和32B)，并且包含主要视网膜细胞类型的前体，包括外视网膜光感受器(表达恢复蛋白)、少数新分化的双极细胞前体细胞(缺乏恢复蛋白和Pax6的表达)、无长突细胞(表达高水平的Pax6)以及Müller细胞(表达CRALBP；图32C和32D)。在1％O2中培养D120视网膜类器官导致HIF-1α和HIF-2α蛋白积累增加(图33)以及HIF调节的血管活性介质的表达增加(图34A和34B)。用32-134D处理hiPSC源性3D视网膜类器官有效阻止HIF-1α和HIF-2α蛋白积累(图33)以及HIF调节的血管活性介质的表达(图34A和34B)。
全身施用耐受良好剂量的32-134D抑制HIF和HIF调节的基因表达并且有效治疗小鼠视网膜血管疾病。
用少至20mg/kg的32-134D单次腹膜内注射治疗的OIR小鼠表现出分别在P13和P14处于其峰值表达的HIF-1α和HIF-2α蛋白积累的减少(图35)(J.Zhang et al.,J ClinInvest 131(2021))。用20mg/kg 32-134D连续五次(P12-P16)腹膜内注射治疗小鼠导致关键性HIF调节的血管活性介质的mRNA表达明显降低(图36A)，其中包括血管细胞特异性表达的那些(图36B)。在处于高血糖6个月并连续5天腹膜内注射40或80mg/kg 32-134D治疗的STZ小鼠中观察到类似的结果(图37)。
眼内施用32-134D不影响视网膜功能。
为了降低全身性副作用的风险，同时优化药物向视网膜组织的递送，眼血管疾病的治疗通常通过玻璃体内注射进行。因此，评估了32-13D在眼内施用后是否引起视网膜毒性。为此，在单次眼内注射递增剂量(70、140、210和350ng)的32-134D后，检查长达5周的ERG。在所测试的32-134D的任何剂量下均没有视网膜毒性的ERG证据(图38)。在通过眼内注射高达350ng的32-134D进行治疗的35天后，对眼内施用32-134D治疗的小鼠的眼睛进行仔细检查，显示出正常的组织学，包括正常出现GCL(图39)。视网膜平片上RGC量的定量证明，RGC数量未受到以所测试的最高剂量施用32-134D的影响(图40)。
为了确定小鼠眼内施用32-134D的适当剂量，测定了MIO-M1细胞中的半数最大抑制浓度(IC50)。在缺氧下培养的32-134D处理的MIO-M1细胞中HIF-1α蛋白积累的免疫印迹定量(图41)显示IC50为3.5μM(图42A)。通过液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)测定眼内施用后神经感觉视网膜中32-134D的药代动力学分析，以对单次70ng眼内注射32-134D后14天内视网膜组织中32-134D的浓度定量(参见所有参数的方法)。第1天达到的最大浓度(Cmax)为19.1nmol/g，具有明显的单指数下降。总暴露量(曲线下面积或AUClast)为72.3nmol*天/g。神经感觉视网膜中32-134D的浓度持续5.25天超过计算的体外IC50，3.5μM(图42B)。由于相关系数较差(r2＝0.35)，因此没有报告终末半衰期(T1/2)。
眼内注射32-134D减少糖尿病性眼病小鼠模型的视网膜新生血管形成和血管通透性过高。
测定了OIR小鼠中在P12时眼内施用70ng以及较低剂量(14ng)后32-134D的功效(J.Zhang et al.,J Clin Invest 131(2021))。单次14ng眼内注射32-134D后，分别在P13和P14时达到峰值表达的HIF-1α和HIF-2α蛋白积累的显著减少(J.Zhang et al.,J ClinInvest 131(2021))(图43)。这导致在P17时OIR小鼠中编码VEGF、其HIF调节的内皮细胞表面受体、VEGF受体2(KDR)以及其他关键HIF调节的血管生成介质的mRNA的表达降低(图44)。由此，用单次眼内注射70ng 32-134D治疗处于高血糖6个月的STZ小鼠有效抑制血管渗透性过高(图45)。
在小鼠中眼内施用较高剂量的32-134D后，治疗剂量的32-134D的持续功效。
为了评估较高剂量的32-134D是否可以便于较低频率施用，评估了较高剂量的32-134D眼内施用的安全性。为此，在单次眼内注射高剂量(500和1,000ng的)32-134D后，检查长达2周的ERG。在所测试的32-134D的任何剂量下均没有视网膜毒性的ERG证据(图46)。
使用280ng的剂量(低于已证明在小鼠中安全的最高测试剂量的剂量)对眼内施用后的32-134D进行药代动力学分析。使用LC-MS/MS对单次眼内注射280ng后14天内视网膜组织中32-134D的浓度进行定量，神经感觉视网膜中的Cmax为18nmol/g(图47)，与70ng所达到的水平类似。然而，14天的AUClast为147nmol*day/g，神经感觉视网膜中32-134D的浓度持续11.7天超过体外IC50，3.5μM，均相当于70ng剂量的效果的两倍(图47)。280ng时的终末半衰期(T1/2)为1.8天。总的来说，这些数据表明32-134D是一种安全有效的HIF活性和视网膜血管病理的抑制剂，具有非常宽的治疗窗，并且在单次眼内施用后具有持续疗效的潜力。
实施例4：NCI-60虚拟屏幕。
模式比较分析工具和CellMiner数据库版本2.1(国家癌症研究所发展治疗计划)可通过https://discover.nci.nih.gov/cellminer/访问。
实施例5：荧光素酶报告基因测定。
将用报告质粒p2.1(含有缺氧响应元件(HRE)的缺氧诱导型萤火虫荧光素酶报告基因)和pSVR(组成型表达的海肾荧光素酶报告基因)稳定共转染的Hep3B-c1细胞(Zhang2008)接种于24孔板。第二天用化合物处理细胞并暴露于20％或1％O2 24小时。对于瞬时转染，接种细胞，用列出的质粒和化合物转染，并暴露于20％或1％O2 24小时。使用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)和VICTOR Nivo读板器(PerkinElmer)测定FLuc/RLuc比率。
实施例6：细胞培养。
人Hep3B和小鼠Hepa1-6细胞购自ATCC，并在补充有10％(vol/vol)胎牛血清和1青霉素/链霉素的高葡萄糖(4.5mg/ml)杜氏改良伊格尔培养基中于37℃下在5％CO2/95％空气培养箱(20％O2)中培养。通过分析短串联重复序列来验证人细胞系的身份，所有细胞系都保持不含支原体，其使用在约翰·霍普金斯大学遗传资源核心设施进行的基于PCR的测定。细胞在受控气氛室(PLAS Labs)中经受缺氧，受控气氛室中的环境气体混合物含有1％O2和5％CO2。
实施例7：RT-qPCR测定。
使用TRIzol试剂(ThermoFisher)提取RNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(BioRad)进行定量实时PCR，并使用BioRad热循环仪(BioRad)运行反应。引物序列列于表3中。将靶基因的mRNA表达标准化至18S rRNA的表达，并根据阈值循环(Ct)计算倍数变化(FC)：
FC＝2-Δ(ΔCt)，其中ΔCt＝Ct靶基因-Ct18S rRNA，Δ(ΔCt)＝ΔCt治疗-ΔCt对照
实施例8：免疫印迹和免疫沉淀测定。
在补充有蛋白酶抑制剂(PI)的RIPA缓冲液(50mM Tris·HCl[pH7.5]、1mMβ-巯基乙醇、150mM NaCl、1mM Na3VO4、1mM NaF、1mM EDTA、0.25％脱氧胆酸钠和1％Igepal CA-630)中制备全细胞裂解物。使用针对表4中列出的抗体的抗体探测印迹。
实施例9：染色质免疫沉淀(ChIP)测定。
将细胞接种过夜，然后在化合物或溶媒存在下暴露于20％或1％O2 16小时。通过向培养基中添加37％甲醛，使蛋白质与DNA在37℃下交联10分钟，并通过添加0.1M甘氨酸淬灭。将细胞用5ml含有PI的冷PBS洗涤并收集。使细胞成团并重悬于含有PI的SDS裂解缓冲液(50mM Tris-HCl[pH8.1]、10mM EDTA、1％SDS)中，并在冰上孵育10分钟。对裂解物进行超声处理，产生200至900bp范围内的DNA片段，并在4℃下离心10分钟。收集上清液并用稀释缓冲液稀释10倍，并用20ml鲑鱼精子DNA/蛋白A琼脂糖浆预澄清，并保留20ml作为输入对照。添加抗体(2μg)，并将样本在4℃下旋转过夜。用50μl鲑鱼精子DNA/蛋白A琼脂糖浆沉淀免疫复合物。使用以下缓冲液依次洗涤成团的珠子：低盐洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl[pH 8.1]、150mM NaCl、2mM EDTA、0.1％ SDS,1％ Triton X-100)；高盐洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl[pH 8.1]、500mM NaCl、2mM EDTA、0.1％ SDS、1％ Triton X-100)、LiCl洗涤缓冲液(10mMTris-HCl[pH 8.1]、0.25M LiCl、1％ Nonidet P-40、1％脱氧胆酸盐、1mM EDTA)和TE缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 8.1]、1mM EDTA)。添加洗脱缓冲液(1％SDS-0.1M NaHCO3)并将洗脱液在65℃下加热过夜以逆转交联。将洗脱液在45℃下用蛋白酶K处理1小时，并通过在苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，v/v/v)中提取和异丙醇沉淀来纯化所得DNA。用70％乙醇洗涤球团并重悬于水中以进行qPCR分析。
实施例10：动物研究。
方案经约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准，并根据NIH实验动物护理和使用指南(国家研究委员会，2011)使用。雌性裸鼠(NCI Athymic NCr-nu/nu)和雄性C57L/J小鼠分别购自Charles River和The Jackson Laboratory。将Hep3B(8x106)和Hepa1-6(1x107)细胞皮下植入6至8周龄小鼠体内，计算肿瘤体积：V＝abc x 0.52。对于Hep3B肿瘤研究，在肿瘤达到100-150mm3后，将小鼠随机分组，每天接受溶媒或32-134D的腹膜内注射。对于Hepa1-6肿瘤，在肿瘤大小达到50-100mm3后，小鼠随机接受治疗。最后一次治疗后4小时收获肿瘤。实施例11：免疫组织化学。
将肿瘤在磷酸盐缓冲液中的10％福尔马林中固定24小时，并于第二天置于PBS中进行石蜡包埋和切片。抗CD31免疫组织化学染色、苏木精和伊红复染以及全玻片扫描由NDBBio(www.ndbbio.com)进行。
实施例12：ELISA。
使用来自Novus Biologicals的ELISA试剂盒(表4)测定肿瘤匀浆中的人(EPO、SCF、SDF1a、VEGFA)和小鼠(Cxcl1、Cxcl2、Cxcl9、Cxcl10、Il6、Il10、IL22、Vegfa)蛋白浓度。使用VICTOR Nivo读板器(PerkinElmer)在450nm处获得光密度(针对570nm处的读数进行校正)。通过标准曲线的线性回归计算样本蛋白质浓度。
实施例13：细胞因子mRNA测定。
根据制造商的说明，使用小鼠细胞因子和趋化因子的RT2 Profiler PCR阵列(Qiagen，目录号330231PAMM-150ZA)分析Hepa1-6肿瘤的总RNA。
实施例14：流式细胞术。
Hepa1-6肿瘤用胶原酶(1mg/ml)在37℃消化30分钟，使所得单细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器并用冷PBS洗涤两次。将细胞重悬于FC缓冲液中以进行后续流式细胞术分析。用以下抗体对细胞进行染色(参见表4)以捕获不同的免疫细胞群：TAN：AF405缀合的抗CD11b、FITC缀合的抗Ly6C和APC缀合的抗Ly6G；TADC：AF-405缀合的抗CD11b、FITC缀合的抗CD11c和APC缀合的抗F4/80；MDSC：AF405缀合的抗CD11b和FITC缀合的抗Ly6C；TAM：AF405缀合的抗CD11b和APC缀合的抗F4/80；M1-TAM：AF405缀合的抗CD11b、APC缀合的抗F4/80和FITC缀合的抗CD80；M2-TAM：AF405缀合的抗CD11b、APC缀合的抗F4/80和FITC缀合的抗CD206；NK细胞：FITC缀合的抗CD3和APC缀合的抗NK1.1；细胞毒性NK细胞：FITC缀合的抗CD3、APC缀合的抗NK1.1和AF405缀合的抗CD314；效应T细胞：PE缀合的抗CD8A和AF405缀合的抗IFN-g；激活的T细胞：PE缀合的抗CD8A、FITC缀合的抗CD69和APC缀合的抗CD44；调节性T细胞：APC缀合的抗CD4、FITC缀合的抗CD25和PE缀合的抗FoxP3；CD8A T细胞：AF405缀合的抗CD45和PE缀合的抗CD8A；和CD4 T细胞：AF405缀合的抗CD45和APC缀合的抗CD4。使用侧向散射图和前向散射图对活细胞进行门控，并使用FACSDiva软件(Becton Dickinson)获取数据。使用未染色的对照和单染色的细胞样本对细胞群进行门控。使用FlowJo软件进行数据分析。
实施例15：统计学分析。
数据表示为平均值±SEM。p<0.05的差异被认为具有统计学显著性。使用双尾Mann-Whitney非参数t检验分析数据以进行两组之间的比较，或使用ANOVA与Tukey-Kramer检验进行多重比较。使用斯皮尔曼等级相关检验进行关联分析。Kaplan-Meier生存分析通过在线工具(kmplot.com)使用对数秩检验进行，其使用中位mRNA表达水平进行分层，并使用3年总存活率作为风险比计算的结果指标。
实施例16：安全性研究。
32-134D在小鼠中的安全性。
与溶媒对照相比，进行5次每天腹膜内(IP)注射(第0天至第5天)40或80mg/kg的32-134D后的第30天，C57BL/6小鼠视网膜的眼底照片和荧光素血管造影图像(图17)。照片和血管造影图像显示所有测试动物的视网膜脉管系统完整且不存在毛细血管渗漏。
进行5次每天IP注射(第0天至第5天)溶媒对照(Veh)或20、40或80mg/kg/天的32-134D后的第7天(D7)和第14天(D14)，在C57BL/6小鼠中进行ERG测量。比较32-134D在D7(图18A)和D14(图18B)在不同剂量下的a波，证明32-134D和溶媒对照之间没有统计学显著差异。32-134D在D7(图18C)和D14(图18D)在不同剂量下的b波的比较证明32-134D和溶媒对照之间没有统计学显著差异。
为了调查全身施用后可能的器官损伤，连续五天(第0-4天)通过腹膜内注射80mg/kg/天的32-134D治疗三月龄小鼠。第30天，处死小鼠，用PBS灌注，收获组织并固定在4％多聚甲醛(PFA)中。收获的组织包括脑、心脏、肌肉、肝脏、脾、肾、胃、小肠和大肠。将组织用石蜡包埋，切成10μm的切片，并用苏木精和伊红染色。图像以20倍放大倍率拍摄。在所检查的任何组织中均未发现毒性证据(图19)。用20或40mg/kg/天治疗的动物也获得了类似的结果。
实施例17：功效研究
32-134D对小鼠的功效。
使用针对新生血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性的激光CNV模型来评估32-134D在阻断眼睛中HIF调节的基因表达方面的功效(图20A)。C57BL/6小鼠在第0天用激光治疗。从第2天开始，进行5次每天腹膜内(IP)注射(第2天至第6天)40mg/kg的32-134D或溶媒对照来治疗小鼠。第7天，制备脉络膜平片并用异凝集素-B4染色以检查CNV病变。还在激光治疗后第7天测量了Vegf(图20B)和Angptl4(图20C)mRNA的表达。用40mg/kg剂量的32-134D治疗的小鼠眼中Vegf mRNA显著降低。用20或40mg/kg的32-134D治疗的小鼠眼睛中的Angptl4mRNA表达显著降低。
新生血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性的激光CNV模型的结果如图21A所示。C57BL/6小鼠在第0天用激光治疗。从第2天开始，进行5次每天腹膜内注射(第2天至第6天)40mg/kg的32-134D或溶媒对照来治疗小鼠。第7天，对小鼠实施安乐死，并用异凝集素-B4对脉络膜平片染色以检查CNV病变的面积。高放大倍率(20X)的代表性病变的图像表明，与溶媒对照相比，用32-134D治疗的小鼠中CNV显著降低(图21B-C)。
使用针对糖尿病黄斑水肿的链脲佐菌素(STZ)模型评估32-143D抑制糖尿病患者血管通透性的能力。通过腹膜内注射对8至10周龄的C57BL/6小鼠进行STZ施用。2周后通过血糖仪证实了高血糖(血清葡萄糖>250mg/dL)。持续高血糖6个月后，进行5次每天腹膜内注射40mg/kg的32-134D或溶媒对照来治疗小鼠。第五次腹膜内注射后24小时，对小鼠实施安乐死，进行伊文思蓝灌注，并检查视网膜平片上的血管渗漏。用溶媒相比于32-134D处理的动物在高放大倍率(20X)下的代表性血管渗漏的图像表明，用32-134D治疗后渗漏减少(图22A)。通过伊文思蓝染料的相对荧光强度对血管通透性进行定量表明，与溶媒对照相比，32-134D治疗的小鼠中血管渗漏显著减少(图22B)。
使用针对缺血性视网膜疾病中血管通透性的缺血/再灌注(I/R)模型评估32-134D抑制视网膜静脉阻塞患者血管通透性的能力。在8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠中诱导左眼短暂性缺血；右眼用作非I/R对照。缺血后，进行5次每天腹膜内注射溶媒对照或40mg/kg的32-134D来治疗小鼠。第五次腹膜内注射后24小时，对小鼠实施安乐死，进行伊文思蓝灌注，并检查视网膜平片上的血管渗漏。用溶媒相比于32-134D处理的动物在高放大倍率(20X)下的代表性血管渗漏的图像表明，用32-134D治疗后渗漏减少(图23A)。通过伊文思蓝染料的相对荧光强度对血管渗透性定量表明，与非I/R眼睛相比，I/R眼睛中的血管渗漏显著增加，并且与溶媒对照相比，32-134D治疗的I/R眼睛中的血管渗漏显著减少(图23B)。非I/R(健康)眼睛和用32-134D治疗的I/R眼睛之间没有差异。
使用针对缺血性视网膜疾病(例如早产儿视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、缺血性视网膜静脉阻塞或镰状细胞性视网膜病变)中视网膜新生血管形成的氧诱导视网膜病变(OIR)模型评估32-143D抑制缺血诱导的视网膜新生血管形成的能力。出生后第7天(P7)新生C57BL/6幼崽连续5天暴露在高氧(75％O2)中，然后在P12返回室内空气中。从P13开始，进行4次每天腹膜内注射20mg/kg的32-134D或溶媒对照来治疗幼崽。在P17时的第五次IP注射后24小时，用异凝集素-B4对视网膜平片进行染色以检查视网膜新生血管形成的发展。用溶媒相比于32-134D治疗的幼崽在低放大倍率(10X)下的代表性视网膜平片图像表明，与溶媒相比，用32-134D治疗的小鼠中视网膜新生血管病变减少(图24A)。视网膜新生血管形成(图24B；左)和无血管视网膜(图24B；右)的定量证明，与溶媒对照相比，32-134D治疗的OIR眼睛中新生血管形成显著减少。用32-134D治疗的OIR眼睛中无血管视网膜的面积与溶媒对照没有显著差异。
为了评价在眼内施用后32-134D的功效，使用针对新生血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性的激光CNV模型(图25A)。C57BL/6小鼠在第0天用激光治疗。在第3天，进行单次IVT注射32-134D(1μl的14或70ng/μl溶液)或溶媒对照来治疗小鼠。第7天，对小鼠实施安乐死，并用异凝集素-B4对脉络膜平片染色以检查CNV的面积。用溶媒相比于32-134D治疗的动物在高放大倍率(20X)的代表性脉络膜新生血管病变图像证明，与溶媒对照相比，用32-134D治疗的小鼠中CNV降低(图25B)。CNV面积的定量证明，与载体对照相比，用70ng 32-134D治疗的小鼠的CNV面积显著减少(图25C)。
还在OIR模型中评估了在IVT施用后32-134D的功效。在P14时，进行单次玻璃体内注射1ul中的32-134D(14或70ng)或溶媒(DMSO)对照来治疗幼崽。P17时，用异凝集素-B4对视网膜平片进行染色以检查视网膜新生血管形成的发展。用DMSO溶媒相比于32-134D治疗的幼崽在低放大倍率(10X)下的代表性视网膜平片图像表明，与DMSO对照相比，用32-134D治疗的小鼠中视网膜新生血管病变减少(图26A)。视网膜新生血管形成的定量证明，与溶媒对照相比，32-134D治疗的OIR眼睛中视网膜新生血管形成显著减少(图26B)。
还在STZ模型中评估了在IVT施用后32-134D的功效。进行单次眼内注射在1ul中的70ng 32-134D或溶媒(DMSO)对照来治疗处于高血糖6个月的STZ小鼠。5天后，通过检查STZ小鼠血管内伊文思蓝染料的渗漏来评估血管通透性过高。用溶媒(左)相比于32-134D治疗的幼崽在低放大倍率(10X)下的代表性视网膜平片图像表明，与溶媒对照相比，用32-134D治疗的小鼠的血管渗漏减少(图45，左)。血管渗漏的定量证明，与溶媒对照相比，32-134D治疗的STZ眼睛的血管渗漏显著减少(图45，右)。
材料和方法
细胞培养和试剂：MIO-M1细胞由AstridLimb博士(英国伦敦大学学院眼科研究所)馈赠。MIO-M1和HUVEC细胞在含有10％(vol/vol)FBS(QualityBiological)和1％青霉素/链霉素(Cellgro)的DMEM中培养。使用缺氧室来暴露细胞。伊文思蓝(E2129)购自Sigma-Aldrich。
小鼠：8周龄的无病原体雌性C57BL/6小鼠获自Jackson Laboratory。特定时间妊娠C57BL/6小鼠获自Charles River Laboratories。所有动物均按照视觉和眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的指导方针进行治疗。
视网膜类器官：本研究使用了源自CD34+脐带血的hiPSC系(A18945，ThermoFisherScientific)(P.W.Burridge et al.,2011,PLoS One 6,e18293)。通过PCR常规检测未分化hiPSC和衍生的视网膜类器官的支原体污染情况。细胞培养、视网膜分化和类器官形成按照先前的描述进行(X.Zhong et al.,2014,Nat Commun5,4047)。使用分化120天的视网膜类器官进行实验。
免疫印迹测定和ELISA：对细胞、神经感觉视网膜和D120视网膜类器官裂解物进行4-15％梯度SDS/PAGE(Invitrogen)。如前所述进行免疫印迹测定(X.Xin et al.,2013,Proc Natl Acad Sci U S A 110,E3425-3434)。
通过伊文思蓝示踪法测定血管通透性：用氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)的混合物麻醉小鼠，并通过阴茎静脉注射进行伊文思蓝(Sigma)(50mg/kg)灌注。10分钟后，通过CO2窒息处死动物。将眼睛摘除并立即在室温下浸入4％(重量/体积)多聚甲醛中2小时。分离视网膜并在干净的载玻片上制备整体制片，并将玻璃体面朝上封在具有抗褪色介质的盖玻片下(Vectashield；Vector Laboratories，加利福尼亚州伯林盖姆)。通过Zeiss荧光显微镜或共焦显微镜捕获图像，并通过imageJ软件(NIH)进行荧光定量。与对照组相比，糖尿病小鼠的视网膜表现出主要毛细血管和分支毛细血管的显著渗漏。通过手动计数每组视网膜毛细血管的主要渗漏，对渗漏血管的数量进行盲量化。由于平片处理造成的非毛细管人为伊文思蓝或FITC-葡聚糖渗漏以及轻微渗漏不包括在定量中。当存在渗漏时，通过选择每个视网膜瓣(petal of retina)的渗漏，通过ImageJ软件进行荧光强度定量；在没有泄漏的情况下，对每个视网膜瓣进行随机拍摄。从不存在泄漏的视网膜中选择随机视野来确定毛细血管产生的基线荧光。为了进行定量，拍摄了高放大倍率(20X)的图像。图中包含的整个平片视网膜是使用低放大倍率(5X)拍摄的。
眼内注射：使用拉丝玻璃微量移液器(pulled-glass micropipette)用PLI-100A皮升显微注射器(Warner Instruments，Harvard Bioscience)进行玻璃体内注射。每个微量移液器均经过校准，可在踩下脚踏开关时输送1μl体积。用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)混合物麻醉小鼠，在解剖显微镜下，将微量移液器的尖头穿过角膜缘后方的巩膜进入玻璃体腔，踩下脚踏开关，导致液体渗入玻璃体腔。将测试化合物注射到OIR和STZ小鼠的玻璃体腔中进行血管通透性测试、视网膜脉管系统和裂解物WB和qPCR分析。
OIR小鼠模型：如前所述进行OIR实验(M.Rodrigues et al.,2013,Diabetes 62,3863-3873)。简言之，C57BL/6小鼠在P7时被置于75％O2中。在P12，将小鼠放回室内空气中，并通过腹膜内注射(地高辛和测试化合物)或玻璃体内注射进行施用。P17时体重小于6克的小鼠被排除在分析之外。数据是从雄性和雌性身上收集的，并将结果合并起来，因为性别之间没有明显的差异。显示了来自至少三个独立实验的选定时间点的代表性图像。在每个时间点获得3-8只幼崽的数据。
STZ诱导的糖尿病小鼠模型：8至10周龄雄性小鼠接受腹膜内注射40mg/kg体重的在0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中的STZ，连续进行5天。在此期间提供正常饲料和10％蔗糖水。在实验第6天停止添加10％蔗糖并用普通水替代。在实验第28天禁食16小时后测量血糖，血糖水平>250mg/dL的小鼠被认为患有糖尿病。
免疫荧光测定：表5中提供了抗体的详细信息。视网膜类器官和小鼠视网膜组织中的免疫荧光测定按照先前的描述进行(J.Zhang et al.,2021,J Clin Invest 131)。简言之，使用CO2窒息法处死小鼠，将处理过的小鼠的眼睛摘除并用4％多聚甲醛的PBS溶液(Thermo ScientificTM)在室温下固定两小时，然后在摇床中用PBS清洗10分钟。然后分离视网膜并在0.5％BSA溶液中于4℃下孵育过夜。然后在摇床中用PBS清洗视网膜3次，持续10分钟，然后用异凝集素B4(Invitrogen；1:200稀释于PBS)在4℃下染色过夜。在摇床中清洗3次，每次10分钟后，将视网膜封片。图像是用Zeiss荧光显微镜捕获的。选择图像(每只眼睛8个视野，每个瓣2个视野，包括新生血管形成区域)，并通过ImageJ软件(NIH)测量荧光强度。
逆转录和定量实时PCR：使用PureLinkTM RNA Mini Kit(Invitrogen#12183025)从培养细胞或视网膜中分离总RNA，并使用MuLV逆转录酶(Applied Biosystems)制备cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和MyiQ实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行定量实时PCR。使用亲环蛋白A对小鼠组织和人类细胞系进行标准化。引物列于表6中。
闪光暗视ERG：所有程序均在暗红光下进行。小鼠进行黑暗适应过夜，用氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)麻醉，并用局部滴托吡卡胺(1％)散瞳。使用Celeris ERG刺激器(Diagnosys，Lowell，MA)以0.025、0.25、2.5、7.96和79.06cd/s/m2的闪光强度测量暗视ERG响应。使用放置在两眼之间前额的接地电极和放置在臀部的参考电极同时测量双眼的ERG。
小鼠荧光素血管造影：为了评估32-134D对视网膜脉管系统和血管通透性的作用，进行连续5次每天腹膜内注射40或80mg/kg的32-134D来治疗实验动物。第30天，通过肌内注射氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)来麻醉小鼠。然后使用1％托吡卡胺滴眼液散瞳，并将小鼠放置在Phoenix Micron III视网膜成像显微镜(Phoenix Research Laboratories，加利福尼亚普莱森顿)的成像平台上。在成像研究过程中大量使用Goniovisc 2.5％(羟丙甲纤维素；Sigma Pharmaceuticals公司，艾奥瓦州蒙蒂塞洛)以保持眼睛湿润。在腹膜内注射10至20μl 10％荧光素钠(Apollo Ophthalmics，加利福尼亚州新港滩)之前拍摄眼底照片。然后进行5分钟的荧光素血管造影图像快速采集。荧光素渗漏表现为血管边界模糊，逐渐发展为弥漫性模糊荧光。通过使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达)对荧光素注射后1、2和3分钟后收集的荧光强度定量，比较不同组之间的荧光素渗漏。
小鼠药代动力学：C57BL/6小鼠以70ng或280ng单次眼内注射施用32-134D。注射后1、3、7或14天对小鼠(每个时间点至少3只小鼠)实施安乐死。对于280ng剂量，添加了10天的时间点。如先前所述(S.Salman et al.,2022,J Clin Invest 132)并进行以下修改，通过LC-MS/MS对视网膜中的32-134D进行定量。提取前，将视网膜组织样本在200μL 1×PBS(pH7.4)中匀浆。在1×PBS中制备标准曲线和质量控制样本作为替代基质。然后以nmol/g为单位对视网膜组织样本进行定量：标称浓度(nM)×初始稀释度([组织重量(mg)+溶剂体积(μl)]/组织重量(mg))。对于所有<10nM的样本，报告的值低于检测限。如果至少一个样品>10nM，并且一个样品<10nM，则输入该值的一半(5nM)以计算该试样的浓度，并用于平均值和标准偏差计算。
药代动力学参数：这些参数是使用Phoenix WinNonlin8.3版(Certara，美国新泽西州普林斯顿)中的非房室方法根据平均浓度-时间数据计算得出的。Cmax和达到Cmax的时间(Tmax)是观察值。使用对数线性梯形方法计算最后一个可量化时间点的AUClast。λz使用1/y2加权因子从浓度-时间曲线终期斜率上的至少3个点确定。T1/2是通过0.693除以λz确定的。如果λz的相关系数(r2)小于0.9，则不报告T1/2。计算高于IC50(3.51nmol/g)的总时间。
小鼠药代动力学的生物分析方法：提取前将视网膜组织样品在200μL 1×PBS(pH7.4)中匀浆。在1×PBS中制备标准曲线和质量控制样本作为所有基质的替代基质。将组织匀浆或PBS(25μL)添加到硼硅酸盐玻璃试管中，并与含有内标(1ng/mL EXP-3179)的150μL乙腈混合。对于空白样本，添加不含内标的150μL乙腈。将样品涡旋混合并离心(在环境温度下1200×g，5分钟)，然后转移至自动进样器小瓶中。然后使用在约10℃下运行的温度控制自动进样装置，将2μL注射到液相色谱系统中。使用Waters Acquity TM UItraPerformance LC进行色谱分析。使用粒径为2.7μm的Halo C18色谱柱(50x2.1mm内径)在环境温度下实现了分析物与潜在干扰物质的分离。用于色谱分离的流动相由0.1％(v/v)甲酸的水溶液(流动相A)和0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液(流动相B)组成，流速为0.4mL/分钟。初始流动相组成为60％流动相A和40％流动相B。从0.5到2.0分钟，流动相B从40％线性增加到100％并维持到3.0分钟。从3.0分钟到3.1分钟，梯度降至40％流动相B，并维持该条件直至5分钟，重新平衡色谱柱以进行下一次进样。使用AB Sciex三重四极杆5500质谱仪监测柱流出物。该仪器配备有电喷雾接口，以正离子模式运行并由Analyst v1.7软件控制。设置如下：帘气20psi，介质碰撞气体，离子喷雾电压5500V，探头温度450℃，离子源气体一30psi，离子源气体二40psi，入口电位10。32-134D和内标的碰撞池出口电位分别为14.0和6.0。32-134D和内标的去簇电位分别为141和80。32-134D和内标的碰撞能量分别为43和25。MRM m/z转换如下：32-134D和内标分别为474.6、393.8和421.0、207.1。停留时间为150毫秒。32-134D的校准曲线是根据分析物的峰面积与其内标的峰面积之比来构建的，其使用最小二乘二次回归分析，1/x2权重范围为10-2,110nM，稀释度高至1:10(v/v)。
统计分析：在所有情况下，结果均显示为至少三次独立实验的平均值±SD或平均值±SEM。使用Microsoft Excel和Prism 8.0软件(GraphPad)进行统计学分析。两个或多个异种组之间的统计学差异通过非配对学生t检验和单因素或双因素ANOVA来确定。该数据的分析是在MATLAB和Excel中进行的。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。NS＝不显著。
表1.通过RT-qPCR阵列测定的经32-134D(测试组)或溶媒(对照组)治疗的小鼠肿瘤中细胞因子mRNA的表达。
表1(续)
表2.根据Kaplan-Meier分析，与HCC患者(n＝364)3年总存活率增加(HR<1)或减少(HR>1)相关的肝癌mRNA表达。
mRNA HR p
CA9 2.49 6.0E-6
CXCL1 1.49 4.5E-2
CXCL2 0.51 8.5E-4
CXCL9 0.63 2.0E-2
CXCL10 0.61 1.4E-2
EPO 1.67 9.8E-3
KITLG 2.28 4.8E-5
LDHA 2.35 2.6E-5
PGF 1.50 4.1E-2
SLC2A1 1.73 5.7E-3
表3.用于扩增人类(H)和小鼠(m)序列的PCR引物。
表4.用于定量人(h)、小鼠(m)和兔(r)蛋白质的ChIP、免疫沉淀(IP)、免疫印迹(IB)测定和ELISA的抗体；用于流式细胞术(FC)的荧光标记抗体；和用于体内研究(IV)的抗体。
靶蛋白 目录号 供应商 应用
h-HIF-1α NB100-479 Novus Biologicals ChIP
h-HIF-1β NB100-110 Novus Biologicals IB，IP，ChIP
h-HIF-2α NB100-122 Novus Biologicals IB，ChIP
h-p300 NB500-161 Novus Biologicals IB，ChIP
m-β-肌动蛋白 Sc-47778 Santa Cruz IB
r-IgG NBP2-36463 Novus Biologicals IB，IP
HRP-抗r-IgG NA934V ThenmoFisher IB
HRP-抗r-IgG NA931V TheBmoFisher IB
m-Cc12 NBP1-92659 Novus Biologicals ELISA
m-Cxc11 DY453 Novus Biologicals ELISA
m-Cxc12 MM200 Novus Biologicals ELISA
m-Cxc15 MX000 Novus Biologicals ELISA
m-Cxc19 MCX900 Novus Biologicals ELISA
m-Cxc110 DY466 Novus Biologicals ELISA
m-Ifng MIF00 Novus Biologicah ELISA
m-Il1b MLB00C Novus Biologicals EIISA
m-I16 M6000B Novus Biologicals ELISA
m-I19 NBP3-06772 Novus Biologicals ELISA
m-I110 DY417 Novus Biologicals ELISA
m-I111 NBP3-06794 Novns Biologicals ELISA
m-I122 M2200 Novus Biologicals ELISA
m-Vegfa MMV00 Novus Biologicals ELISA
h-EPO DEP00 Novus Biologicals ELISA
h-SCF DCK00 Novus Biologicals FLISA
h-SDF-1α DSA00 Novus Biologicals ELISA
h-VEGFA DVE00 Novus Biologicals ELISA
m-Cd3 FAB4841G Novus Biologicals FC
m-Cd4 FAB554A Nobus Biologicals FC
m-Cd8A NBP1-49045-PE Novus Biologicals FC
m-Cd11b NB110-89474-AF405 Nobus Biologicals FC
m-Cd11c NB110-40766-AF488 Novus Biologicals FC
m-Cd25 NBP2-27425-AF488 Novus Biologicals FC
m-Cd44 NBP1-47386-APC Novus Biologicals FC
表5.用于免疫荧光(IF)和蛋白质印迹(WB)的抗体
名称 公司 物种 目录号 稀释度 应用
异凝集素GS IB4 Thermo Fisher I21413 1:200 IF
HIF-1α Gene Tex 兔 GTX127309 1:1000 WB
HIF-2α Gene Tex 小鼠 GTX632015 1:1000 WB
α/β微管蛋白 Cell signaling 兔 2148s 1:5000 WB
RBPMS Abcam 兔 ab152101 1:200 IF
CRALBP Abcam 小鼠 ab15051 1:500 IF
REC MilliporeSigma 兔 AB5585 1:500 IF
PAX-6 DSHB 小鼠 AB_528427 1:50 IF
二抗 Invitrogen 1:1000 IF
表6.实时(RT)-PCR的引物序列
表7.HIF转录活性
化合物ID IC50/μM
11-88 2.9
32-134C 2.3
32-134D 2.5
12-143 2.6
33-063 2.2
33-093B 2.7
11-147B 2.92
12-58 3.09
33-057A 2.86
12-70C 2.31
12-93A 2.40
12-93F 2.48
33-087 2.51
33-103B 2.87
33-103C 2.80
33-123 3.24
12-147A 2.52
12-147B 3.08
34-090 1.83
34-110 1.27
34-122 2.02
34-146 2.04
35-020 2.37
35-092 2.07
35-140 1.94
13-01 2.07
13-03 2.69

Claims (46)

1.一种治疗抑制HIF-1和/或HIF-2是有益处的病况或疾病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象施用式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
，
其中：
环A是包含8-10个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-4个Xa取代；
环B是包含8-10个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-4个Xb取代；
环C是包含5-6个环原子的杂芳基，其中1-4个环原子是各自独立地选自由以下组成的组中的杂原子：N、N(Ra)、O和S(O)0-2，其任选地被1-2个Rb取代；
每个Xa和Xb独立地选自由以下组成的组：卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、NO2、氰基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、SO2(C1-6烷基)、杂环基、杂芳基、C3-6环烷基、NR1R2、C(O)R3和C(O)NR1R2；
Ra每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、-C(＝O)R3、-C(＝O)OR3、-C(＝O)NR1R2和-SO2R4；
Rb每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、卤素和氰基；
R1和R2每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基、任选取代的苄基、C(＝O)R5、C(＝O)OR5和C(＝O)NR5R6；或
同一氮原子上的一对R1和R2与连接它们的所述氮原子一起形成包含4-8个环原子的饱和环、部分不饱和环或芳族环，其中0-2个环原子(除了连接R1和R2的氮原子之外)是各自独立地选自由N、N(Ra)、O和S组成的组中的环杂原子；
R3每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基和任选取代的苯基；
R4每次出现时独立地选自由以下组成的组：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、任选取代的C3-6环烷基、任选取代的苯基；和任选取代的苄基；和
R5和R6每次出现时独立地选自由以下组成的组：H、C1-4烷基。
2.一种治疗与缺氧相关或与缺氧诱导因子(HIF)-1α和/或HIF-2α表达增加相关或与这两者相关的病况或疾病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象施用能够抑制HIF介导的转录激活的式(I)化合物。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用第二治疗剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二治疗剂是化疗剂，例如卡铂、多柔比星、吉西他滨或紫杉醇。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述化疗剂是化疗免疫调节剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述化疗免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂靶向选自由CTLA4、PD-1和PD-L1组成的组中的免疫检查点受体。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述疾病的病况是癌症。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
11.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象施用HIF-1和/或HIF-2抑制剂以及化疗免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中环A是9元杂芳基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中环A是
其中：
L和T独立地为C*、N*、CR5、N、O或S；
Z和Q独立地为N和C；和
U、W、X和Y独立地为C*、N*、CR6和N；其中
C*和N*表示与环C的连接点。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中环A是
其中：
L是CR6、N、O或S；
Z和Q独立地为N和C；和
U、W、X和Y独立地为CR6和N。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中环A任选地被1-4个Xa取代，其中Xa独立地选自由卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、氰基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基和SO2(C1-6烷基)组成的组。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中环A选自由以下组成的组：
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中环B是9元杂芳基。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中环B是
其中：
l、t和g是C*、N*、CR5、NR5、N、O、C(＝O)或S；
z和q独立地为N和C；和
u、w、x和y独立地为C*、N*、CR6和N；其中
C*和N*表示与环C的连接点。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中环B是
其中：
l、t和g为CR5、NR6、N、O、C(＝O)或S；
z和q独立地为N和C；和
u、w、x和y独立地为CR6和N。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中环B任选地被1-4个Xb取代，其中Xb独立地选自由卤素、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、氰基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基和SO2(C1-6烷基)组成的组。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中环B选自由以下组成的组：
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中环C是5元杂芳基。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中环C是选自由吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、呋喃基、苯硫基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻唑基、呋咱基(furzanyl)、噁二唑基、噻二唑基、噁三唑基和噻三唑基组成的组中的5元杂芳基。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中环C是选自由吡唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻唑基、噁二唑基和噻二唑基组成的组中的5元杂芳基。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中环C是选自由以下组成的组中的5元杂芳基：其中星号表示与环A的连接点。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中环C是选自由以下组成的组中的5元杂芳基：其中星号表示与环A的连接点。
27.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中环C是选自由吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基和三嗪基组成的组中的6元杂芳基。
28.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中环C是选自由以下组成的组中的6元杂芳基：其中星号表示与环A的连接点。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述化合物为式(II)或其药学上可接受的盐：
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述化合物为式(II’)或其药学上可接受的盐：
31.根据权利要求29或30的方法，其中环C是5元杂芳基。
32.根据权利要求29或30的方法，其中环C是6元杂芳基。
33.根据权利要求29、30或31所述的方法，其中环C是选自由吡唑基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻唑基、噁二唑基和噻二唑基组成的组中的5元杂芳基。
34.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述化合物是或其药学上可接受的盐。
35.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述化合物是或其药学上可接受的盐。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，选自表C1。
37.一种治疗致盲眼病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象施用HIF-1和/或HIF-2抑制剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述致盲眼病是干性AMD。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述致盲眼病是湿性AMD。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述致盲眼病是缺血性视网膜病变，例如糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、镰状细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变。
41.根据权利要求37或40所述的方法，其中所述致盲眼病是糖尿病性视网膜病变。
42.根据权利要求37或40所述的方法，其中所述致盲眼病是视网膜静脉阻塞。
43.根据权利要求37或40所述的方法，其中所述致盲眼病是镰状细胞性视网膜病变。
44.根据权利要求37或40所述的方法，其中所述致盲眼病是早产儿视网膜病变。
45.一种具有下式的化合物或其药学上可接受的盐：
46.一种具有下式的化合物或其药学上可接受的盐：
CN202280068123.1A 2021-08-09 2022-08-09 缺氧诱导因子抑制剂 Pending CN118076350A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163231216P 2021-08-09 2021-08-09
US63/231,216 2021-08-09
PCT/US2022/039883 WO2023018747A1 (en) 2021-08-09 2022-08-09 Inhibitors of hypoxia-inducible factors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118076350A true CN118076350A (zh) 2024-05-24

Family

ID=85200310

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280068123.1A Pending CN118076350A (zh) 2021-08-09 2022-08-09 缺氧诱导因子抑制剂

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4384164A1 (zh)
CN (1) CN118076350A (zh)
WO (1) WO2023018747A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4970226A (en) * 1989-10-03 1990-11-13 Harbor Branch Oceanographic Institution, Inc. Bis-indole imidazole compounds which are useful antitumor and antimicrobial agents
KR20060110741A (ko) * 2003-06-30 2006-10-25 히프 바이오 인크 화합물, 조성물 및 방법
EP3280761A1 (en) * 2015-04-06 2018-02-14 The Johns Hopkins University Shape memory particles for biomedical uses

Also Published As

Publication number Publication date
EP4384164A1 (en) 2024-06-19
WO2023018747A1 (en) 2023-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102533599B1 (ko) 단백질 티로신 포스파타제 억제제 및 이의 사용 방법
CN113214287B (zh) Hpk1抑制剂及其使用方法
TWI786322B (zh) 免疫療法與ｍｄｍ２抑制劑的組合及其用途
KR20220034739A (ko) Tead 억제제 및 이의 용도
JP7065117B2 (ja) Ｎ－置換インドール誘導体
JP2020522520A (ja) Ｉｒｅ１小分子阻害薬
JP2022514778A (ja) 筋膜損傷の予防および治療におけるアネキシンの使用
JP2021528396A (ja) ラパマイシン類似体およびその使用
JP2023515630A (ja) Ｃｓｆ－１ｒキナーゼ阻害剤の使用
JP2022539840A (ja) Ｍａｐキナーゼ相互作用セリン／スレオニン－プロテインキナーゼ１（ｍｎｋ１）及びｍａｐキナーゼ相互作用セリン／スレオニン－プロテインキナーゼ２（ｍｎｋ２）の阻害剤、癌治療及び治療的組合せ
JP6795502B2 (ja) キナーゼモジュレーターとしての重水素化トリアゾロピリダジン
TW201713328A (zh) 治療癌症之方法
US11267824B2 (en) Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and/or tryptophan 2,3-dioxygenase
CA3087807A1 (en) Inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase and/or tryptophan 2,3-dioxygenase
WO2022090746A1 (en) Nmt inhibitors for treating senescence-associated diseases or disorders
TW201833099A (zh) 喹啉衍生物的乙磺酸鹽
CN118076350A (zh) 缺氧诱导因子抑制剂
JP2024521418A (ja) 放射性免疫複合体とチェックポイント阻害剤併用療法
WO2021066062A1 (ja) 免疫チェックポイント分子の発現抑制剤
KR20230172548A (ko) Mek 억제제 및 이의 용도
IT201800006399A1 (it) Agenti melanocortinici per l’impiego nel trattamento terapeutico del melanoma, dei tumori del tratto gastroenterico e del carcinoma tiroideo.
WO2023192935A1 (en) Methods and compositions for the treatment for inflammation and fibrosis in retinal neovascular diseases
US20220071955A1 (en) Methods of Treatment, Prevention and Diagnosis
Scott et al. Intracellular Cardiac Signaling Pathways Altered by Cancer Therapies
TW202416995A (zh) 用於治療與至少一種抗體分泌細胞標記物之表現相關的疾病的腺苷受體拮抗劑及其組合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination