CN118064312A - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在制备抗肠杆菌十三肽中的生产方法和应用 - Google Patents
一种贝莱斯芽孢杆菌及其在制备抗肠杆菌十三肽中的生产方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一株贝莱斯芽孢杆菌，所述菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年9月7日，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M20231632。所述菌可用于制备具有独特结构、能强抑制革兰氏阴性肠杆菌的十三肽。本发明提供的制备方法可制备高纯度、高活性、稳定安全的抗肠杆菌十三肽，用于抗菌药物、先导兽药和饲料添加剂的开发和利用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用、制备的抗肠杆菌十三肽的方法。
背景技术
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是一类革兰氏阳性杆菌，能够产生多种结构新颖的多肽、脂肽类具有抗菌等活性的化合物，是实际工业化生产抗菌肽的常见菌株之一。脂环肽类抗菌肽又称为环脂肽，是微生物（例如某些芽孢杆菌）产生的次级代谢产物，是一类重要的由氨基酸和脂肪酸环化而成的抗菌肽，主要通过细菌的非核糖体肽和聚酮杂合途径合成。在脂环肽结构中既含有亲水性的氨基酸残基，又有疏水性脂肪酸链，因此整个脂环肽具有显著的两亲性。脂环肽通过与生物膜中的磷脂双分子层相互作用，破坏了脂膜结构，形成离子通道，促使细胞内物质外流，从而导致细胞死亡，使得脂环肽能表现出强的抗菌活性，因而脂环肽类抗菌肽可以被添加作为饲料添加剂以部分代替抗生素的作用以及作为研发新型抗菌药物的候选者。
目前多重耐药性致病肠杆菌在实际临床和养殖业中的出现使得人们意识到现有抗菌药物种类的不足。尽管目前对于抗菌肽的研究很多，真正开发出来的新型抑菌产品却不多，这也使得对更多的新型抗菌肽的发现及对其产业化研发变得尤为迫切。新型抗菌肽类药物或饲料添加剂的研发对于治疗由引起的疾病或者在养殖业饲料端的替抗过程中发挥着重要的作用，具有重要的应用前景。
发明内容
针对上述问题，本发明旨在提供一株能制备特异、稳定、高活性、高纯度的抗肠杆菌十三肽的菌株，以及十三肽的制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
提供了一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis a5546），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年9月7日，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M20231632。
所述贝莱斯芽孢杆菌在制备抗菌肽中的应用。所述抗菌肽优选为抗肠杆菌十三肽。
本发明还提供了一种抗肠杆菌十三肽，结构式如下：
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌制备抗肠杆菌十三肽的方法，包括如下步骤：
步骤1：将保藏编号为CCTCC No. M20231632的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis a5546）接种在LB斜面培养基中培养活化，于37℃环境中培养12 h后，接种到灭菌的LB培养基摇瓶中，在37℃、200 rpm、12 h条件下培养得到种子液，将种子液按体积比为1%的接种量接种到优化液体培养基中，于37℃环境中培养16 h后，获得十三肽发酵产物。将发酵液离心获得上清液经冷冻干燥获得冻干粉。
步骤2：得到的冻干粉加入超纯水溶解，并用等体积的正丁醇萃取，向正丁醇提取液中加入乙醚后在4℃环境下过夜沉淀十三肽。
步骤3：得到的沉淀用初始流动相溶解后进行半制备反相高效液相色谱分离纯化获得的馏分经旋转蒸发除乙腈后冻干即为十三肽高纯度样品。
优选的，步骤1中所述的优化液体培养基的配制如下：可溶性淀粉3.3 g，酵母浸粉10 g，硫酸铵10 g，无水硫酸镁3 g溶于1 L超纯水，溶解后用盐酸调节pH至6.5。培养基在121℃下灭菌20 min，接种量1 %，发酵温度37℃、发酵时间16 h，将发酵液离心获得上清经冷冻干燥获得冻干粉。
优选的，步骤2中提取过程为：步骤1中获得的冻干粉用超纯水溶解，冻干粉与超纯水的比例为1:1~1:5(W/V)，溶解后加入等体积的正丁醇萃取1~3次，将正丁醇萃取液转移至新的三角烧瓶内加入等体积的乙醚沉淀十三肽。
优选的，步骤3中反相高效液相色谱制备过程为：制备型液相色谱柱，AgilentZorbax 300SB-C18 PrepHT；流动相含0.1%三氟乙酸的水（A）和0.1%三氟乙酸的乙腈（B）；
洗脱模式如表1：
表1十三肽制备洗脱梯度表
流速5 mL/min，柱温30℃，检测波长220 nm。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌、上述抗肠杆菌十三肽在制备抗革兰氏阴性肠杆菌感染的药物、或饲料添加剂中的应用。所述革兰氏阴性肠杆菌包含但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌。
有益效果：
本发明提供了一株制备抗肠杆菌十三肽的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），能制备具有抗革兰氏阴性致病肠杆菌活性的十三肽，所述肽具有独特分子结构，具有高活性、高纯度且性能稳定。
本发明提供了一种抗肠杆菌十三肽，在中性和酸性环境能稳定存在，在人工胃液中能保持其结构和抑菌活性的稳定性，在人工肠液环境中可降解成其他具有一定抑菌活性的物质，并且没有明显的溶血活性；通过抗菌活性的筛选，发现该十三肽具有较强抑制大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等致病肠杆菌的活性，可用于抑制由多种革兰氏阴性致病肠杆菌引起的相关病害及感染的抗菌药物、先导兽药和饲料添加剂的开发和利用。
3、本发明提供了一种抗肠杆菌十三肽的制备方法，通过液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、十三肽提取与精制等工艺方法制备高纯十三肽成品，大大缩减了制备纯化步骤。
4、本发明利用萃取沉淀-制备反相高效液相色谱层析相结合，提高了十三肽的制备效率和样品纯度，该方法所制备的十三肽纯度高达91.76%。
附图说明
图1为本发明实施例1中贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis a5546）菌株鉴定进化树；
图2 本发明实施例1贝莱斯芽孢杆菌菌株的鉴定中PCR扩增结果比对图；
图3为本发明实施例2中十三肽的HPLC制备图；
图4为本发明实施例2中十三肽纯度分析HPLC图；
图5为本发明实施例2中十三肽质谱一级和二级图谱；
图6本发明实施例4中十三肽在不同pH水溶液中的稳定性结果；
图7本发明实施例5中十三肽在人工胃液中的稳定性结果；
图8本发明实施例6中十三肽在人工肠液中的稳定性结果；
图9本发明实施例7中十三肽溶血性结果。
具体实施方式
本发明使用的菌株为从重庆荣昌区广顺镇黄河村（N 29°22′56″，E 105°29′46″）土壤中分离得到的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis a5546），该菌株已于2023年9月7日其在中国典型培养物保藏中心进行保藏。保藏编号为CCTCC No. M20231632。
本发明分离的菌株经过鉴定，其形态特征为：菌落呈白色，表面油亮，无褶皱边缘；菌体呈杆状，长1.0~3.5 μm，宽0.4~0.8 μm，菌体有鞭毛生长，可以形成芽孢，革兰氏阳性。对该菌株16S rRNA基因进行PCR扩增，并进行测序及系统发育分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis a5546）。
本发明所涉及到的发酵及化合物分离纯化参数均为本领域技术人员所熟知的。
实施例1
一种制备抗肠杆菌十三肽的贝莱斯芽孢杆菌菌株的鉴定，具体包括如下步骤：
（1）DNA的提取
使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒（通用型），具体步骤如下：
1. 将Spin Column置于Collection Tube中，加入250 μL Buffer BL，12000 rpm离心1 min活化硅胶膜；
2. 取样本干燥组织（不大于20 mg），加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5 mL离心管中，加入400 μL Buffer gP1，涡旋振荡1 min，65℃水浴10~30 min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
3. 加入150 μL Buffer gP2，涡旋振荡1 min，冰浴5 min；
4. 12000 rpm离心 5 min，将上清转移至新的离心管中；
5. 加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃废液；
6. 向Spin Column中加入500 μL Buffer Pw（使用前已加入无水乙醇），12000rpm离心30 s，弃废液；
7. 向Spin Column中加入500 μL Wash Buffer（使用前已加入无水乙醇），12000rpm离心30 s，弃废液；
8. 重复操作步骤7；
9. 将Spin Column放回Collection Tube中，12000 rpm离2 min，开盖晾干1 min；
10. 取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50~100 μL TE Buffer（65℃预热TE Buffer），20~25℃放置2 min，12000 rpm离心2 min。
（2）PCR的扩增
1. 细菌菌种鉴定通用引物
2. 提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以擎科1×TSE101金牌mix进行扩增，扩增体系各组分如下：
以上扩增体系按一下扩增程序扩增：
（3）电泳的检测
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2 μL样品+6 μL溴酚蓝），300 V电压下12分钟，获取鉴定胶图。将准备好的PCR产物进行一代测序（测序引物为722F/907R）。
（4）鉴定
1. 用 ContigExpress 拼接测序结果，并去除两端不准的部分。
2. 将拼接好的序列在NCBI数据库（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，比对结果截图如图2。
3. 在比对结果中，一般将在NCBI上比对得到的同源性在97%以上且同源度最高的、排序靠前的、物种信息明确的物种作为鉴定的参考物种。如图1所示，鉴定菌株样本16S序列比对结果为Bacillus velezensis（或同属），故命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis a5546）。
实施例2
一种抗肠杆菌十三肽的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）发酵
将保藏编号为CCTCC No. M20231632的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensisa5546）接种在LB斜面培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）中培养活化，于37℃环境中培养12h后，接种到灭菌的LB培养基摇瓶中，在37℃，200 rpm、12 h条件下培养得到种子液，将种子液按体积比为1%的接种量接种到优化的液体培养基中，发酵温度37℃环境中培养16 h后，获得十三肽发酵产物。将发酵液离心获得上清液经冷冻干燥获得冻干粉。
液体培养基的配制如下：可溶性淀粉3.3 g，酵母浸粉10 g，硫酸铵10 g，无水硫酸镁3 g溶于1 L超纯水，溶解后用盐酸调节pH至6.5。培养基在121℃下灭菌20 min备用。
（2）提取及分离纯化
得到的冻干粉加入超纯水溶解，并用等体积的正丁醇萃取，向正丁醇提取液中加入乙醚后在4℃环境下过夜沉淀十三肽。沉淀用初始流动相溶解后进行半制备反相高效液相色谱分离纯化，如图3所示，其中1号色谱峰对应的馏分为目标十三肽。制备过程中使用的色谱柱为Agilent Zorbax 300SB-C18 PrepHT制备型液相色谱柱，流动相为含0.1%三氟乙酸的水（A）和0.1%三氟乙酸的乙腈（B）；
洗脱模式如表：
表1 十三肽制备洗脱梯度表
流速为5mL/min，柱温为：30℃，检测波长为220 nm。
获得的馏分经旋转蒸发除乙腈后冻干后得十三肽纯品，用分析型反相高效液相色谱进行纯度检测，结果如图4所示。本发明中制备的十三肽样品的纯度可高达91.76%。采用质谱进行分子结构鉴定，结果如图5所示。在正离子模式下的高分辨质谱（HR-ESI-MS）给出其分子离子峰为m/z 802.9321[M+2H]2+和535.6245[M+3H]3+。一级和二级质谱信息证明本发明的制备样品为以下结构式所示的十三肽。
实施例3 抗肠杆菌十三肽的抑菌活性
参照National Committee for Clinical Laboratory Standards，用MH培养基（MH肉汤培养基，Mueller Hinton Broth medium，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）连续倍比稀释十三肽浓度至512、256、128、64、32、16、8、4、2、1和0.5 μg/mL。96孔板每孔加50 μL稀释后的十三肽，每孔加50 μL重悬在MH的2~7×105 CFU/mL的指示菌菌液。震荡培养至少18 h，用酶标仪在600 nm处读取OD值，获得十三肽的最小抑菌浓度。其中选用的指示菌为：大肠杆菌 ATCC 25922、大肠杆菌CVCC1556、痢疾杆菌CGMCC 1.1869、沙门氏菌CVCC534、大肠杆菌CCTCC AB 2013345、绿脓杆菌ATCC 27853、停乳链球菌ATCC 35666、金黄色葡萄球菌ATCC 43300、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、李斯特菌CVCC 3746、蜡样芽孢杆菌CVCC4101，结果如表2所示。
表2 十三肽抑制11株指示菌的MIC值
其中，十三肽具有良好的抗革兰氏阴性肠杆菌活性，MIC值范围为4~8 μg/mL。抗革兰氏阳性菌活性较弱，MIC值范围为32~256 μg/mL。结果表明，十三肽具有应用于革兰氏阴性肠杆菌专用先导药物和抗菌肽的研发价值。
实施例4 抗肠杆菌十三肽在不同pH值水溶液中的稳定性
将实施例2中的十三肽纯品用超纯水配成浓度为1.0 mg/mL的溶液，用盐酸和氢氧化钠溶液分别调节pH为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0和11.0。在0、0.5、1、2、3、4、5和6 h时间点取样进行高效液相和抑菌圈检测。通过液相检测获得的降解保留率评价十三肽在不同pH水溶液中的稳定性，结果如图6所示。
由图可知，pH=11水溶液中十三肽在0.5 h时降解剩余率降至34.72 %，到2h时降解剩余率为8.21%，并在6 h内维持至8.21~10.88 %内；在pH=9水溶液中十三肽的降解剩余率从0 h的100.00%降低至6h的95.06%；在pH=7水溶液中十三肽的降解剩余率在0~6h内为96.05~100%；在pH=5水溶液中十三肽的降解剩余率在0~6h内为99.19~100%；在pH=3水溶液中十三肽的降解剩余率在0~6h内为100~100.95%。结果表明，碱性环境会造成十三肽的变性，而在中性和酸性环境在其能稳定存在。该结果为今后产品研发过程中的样品处理、辅料和储存条件选择提供了指引。
实施例5 抗肠杆菌十三肽在人工胃液中的稳定性评价
用高效液相法和抑菌圈法测定胃蛋白溶液中抗肠杆菌十三肽的稳定性，按《中华人民共和国兽药典》（2020版），取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL与胃蛋白酶10 g摇匀后，转移至1000 mL容量瓶中并用超纯水定容至刻度得人工胃液。用人工胃液溶解并稀释十三肽至浓度200 μg/mL，置于37 ℃水浴锅内，分别在0、0.5、1、2、4和6h时间点取样。样品用85 ℃水浴5 min灭活蛋白酶后，在9500 rpm、4 ℃条件下离心15 min，检测不同时间点十三肽色谱峰面积，计算剩余百分率。取100 μL溶液用抑菌圈法检测十三肽抑菌活性，结果如图7所示。由图可知，37℃水浴0~6 h，十三肽在人工胃液中的降解保留率为94.56~100 %，对指示菌大肠杆菌ATCC 25922的抑菌圈大小在1.97~1.83 cm范围内。表明十三肽在人工胃液中能保持其结构和抑菌活性的稳定性。
实施例6 抗肠杆菌十三肽在人工肠液中的稳定性评价
用高效液相法和抑菌圈法测定人工肠液中十三肽的稳定性，按《中华人民共和国兽药典》（2020版），取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 mL，加0.2 mol/L氢氧化钠溶液118mL，另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，转移至1000 mL容量瓶中并用水定容至刻度，得胰蛋白溶液。用胰蛋白酶溶液溶解并稀释十三肽至浓度200 μg/mL，置于37 ℃水浴锅内，分别在0、0.5、1、2、4和6h时间点取样。样品用85℃水浴5 min灭活蛋白酶后，在9500rpm、4 ℃条件下离心15 min，检测不同时间点十三肽色谱峰面积，计算剩余百分率。取100μL溶液用抑菌圈法检测十三肽抑菌活性，结果如图8所示。由图可知，37 ℃水浴0~6 h，十三肽在人工肠液中的降解保留率为33.36~100%，对指示菌大肠杆菌ATCC 25922的抑菌圈大小在1.97~2.07 cm范围内。十三肽在人工肠液环境中容易降解成其他具有一定抑菌活性的物质。
实施例7 抗肠杆菌十三肽的溶血性评价
用含有肝素钠的采血管静脉采集猪全血，离心后获得血红细胞。用10 mM PBS（pH7.3）洗涤血细胞至上清无明显红色。用PBS将血细胞配制成4%的悬液，取100 μL 4%血细胞和100 μL浓度范围在0~512 μg/mL的倍比稀释十三肽溶液加入到96孔板的孔内，37℃恒温箱孵育1 h，1500 rpm离心5 min，取上清转移到新的96孔板中，用酶标仪在540 nm处检测OD值。分别以10 mM PBS和0.1% Triton X-100作为阴性和阳性对照。计算获得十三肽的溶血性。计算公式如下：
其中，A十三肽为血细胞孔内加入不同浓度的十三肽的OD值；APBS为血细胞孔内加入PBS的OD值；A0.1% Triton X-100为血细胞孔内加入0.1% Triton X-100的OD值。结果如图9所示。由图可知，十三肽在浓度256~0.5 μg/mL范围内溶血率为0.303~1.924%，其变化在5%范围内。结果表明，十三肽没有明显的溶血活性。
综上所述，本发明中，基于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis a5546）生产的抗肠杆菌十三肽在各方面的应用具有抗多种革兰氏阴性致病肠杆菌的优势，具有十分广阔的应用前景。
以上的仅是本发明的实施例，该发明不限于此实施案例涉及的领域，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和本发明的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征是：所述菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年9月7日，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No. M20231632。
2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备抗菌肽中的应用。
3.如权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌在制备抗菌肽中的应用，所述抗菌肽为抗肠杆菌十三肽。
4.一种抗肠杆菌十三肽，其特征在于：结构式如（Ⅰ）所示；
（Ⅰ）。
5.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌制备抗肠杆菌十三肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）培养发酵
将权利要求1所述菌株接种在LB斜面培养基中培养活化，于37℃环境中培养12 h后，接种到灭菌的LB培养基摇瓶中，在37℃、200 rpm、12 h条件下培养得到种子液，将种子液按体积比为1%的接种量接种到优化的液体培养基中，于37℃环境中培养16 h后，将发酵液离心获得上清经冷冻干燥获得十三肽发酵液冻干粉；
（2）粗提物提取
向步骤（1）得到的冻干粉加入超纯水溶解，并用等体积的正丁醇萃取后，向正丁醇提取液中加入乙醚在4℃环境下过夜，沉淀十三肽；
（3）十三肽的分离制备
将步骤（2）得到的十三肽沉淀用初始流动相溶解后进行半制备反相高效液相色谱分离纯化获得的馏分经旋转蒸发除乙腈后冻干即为纯化十三肽纯品，并利用反相高效液相色谱法进行纯度测定。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的液体培养基为：可溶性淀粉3.3 g，酵母浸粉10 g，硫酸铵10 g，无水硫酸镁3 g溶于1L超纯水，溶解后用盐酸调节pH至6.5。
7.根据权利要求5所述的一种抗肠杆菌十三肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的溶解冻干粉超纯水的比例为1:1~1:5(W/V)，溶解后加入等体积的正丁醇萃取1~3次，将正丁醇萃取液转移至新的三角烧瓶内加入等体积的乙醚沉淀十三肽。
8.根据权利要求5所述的一种抗肠杆菌十三肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中反相高效液相色谱制备过程为：制备型液相色谱柱，Agilent Zorbax 300SB-C18PrepHT；流动相含0.1%三氟乙酸的水（A）和0.1%三氟乙酸的乙腈（B）；
洗脱模式如表1：
表1 十三肽制备洗脱梯度表
流速5 mL/min，柱温30℃，检测波长220 nm。
9.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌、权利要求4所述抗肠杆菌十三肽在制备抗革兰氏阴性肠杆菌感染的药物、或饲料添加剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征还在于：所述革兰氏阴性肠杆菌包含但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌。
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