CN118064284A - 一株马克斯克鲁维酵母菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一株马克斯克鲁维酵母菌及其应用。本发明首先公开了一株马克斯克鲁维酵母菌，其保藏编号为CGMCC No.28933。本发明进一步公开了上述马克斯克鲁维酵母菌在脱除玉米赤霉烯酮和/或呕吐毒素中的应用。本发明马克斯克鲁维酵母是一株可以在低pH、高渗透压和高温中生长的安全酵母菌，其蛋白含量高达58.1％，同时水解物对多种真菌毒素具有脱除效果，且风味成分丰富，产酯能力强，作为菌剂制备发酵产品和酵母蛋白及酵母加工产品，可广泛应用于食品和饲料等领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域。更具体地，涉及一株马克斯克鲁维酵母菌及其应用。
背景技术
马克斯克鲁维酵母为食品级可食用微生物，马克斯克鲁维酵母不仅是FDA认证的GRAS级别微生物，还通过了欧盟食品安全监督局(european food safety authority,EFSA)的安全认证(qualified presumption of safety,QPS)，在2013年被中国国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料，在2023年中国农业农村部批准马克斯克鲁维酵母纳为新的饲料添加剂。
马克斯克鲁维酵母不仅被认为是安全的微生物菌株，同时也被认为是可用于制备食品级重组蛋白(酶)的安全微生物菌株。它具有营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广等特点。在对碳源的选择中，马克斯克鲁维酵母菌在五碳糖和六碳糖的利用上具有较大优势。目前，以马克斯克鲁维酵母为底盘细胞已成功用于生产工业酶类：β-葡萄糖苷酶，菊粉酶，β-半乳糖苷酶，脂肪酶等；也用于制备单细胞蛋白和合成芳香族化合物；并可利用马克斯克鲁维酵母降低食品中的乳糖含量；也用于发酵低酒精饮品，包括奶啤、乳清酒、葡萄酒发酵、龙舌兰酒等，表现出巨大的应用前景；在功能性食品和功能性饲料方面也具有巨大应用潜力。
马克斯克鲁维酵母独特的生理特性主要体现在耐高温、生长速率高以及具有利用多种碳源的能力。菌株普遍都能在40℃条件下生长，生长速率可达0.86-0.99h-1，远高于其他酵母，其中部分菌株最高可耐受50℃以上的温度。高温发酵可以大幅降低冷却成本及染菌风险，且更利于一些在高温下活性更好的酶进行催化反应。除了葡萄糖以外，马克斯克鲁维酵母还可以利用一些其他糖类作为单一碳源进行生长，包括果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和菊糖等，这些糖类来源的廉价农业及食品业副产物都可以作为其发酵碳源。
目前，罕见性能(抗逆性能、风味)优良的酵母菌同时水解物具有脱除多种真菌毒素的功能的报道。不同酵母菌株蛋白含量、抗逆性能、发酵性能、风味和毒素脱除能力均存在差异，因此，筛选得到一株性能优良可脱除多种真菌毒素的马克斯克鲁维酵母菌具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一株马克斯克鲁维酵母菌，该菌株能脱除多种真菌毒素，且抗逆性能强、蛋白含量高。
本发明的另一个目的在于提供上述马克斯克鲁维酵母菌的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了一株马克斯克鲁维酵母菌，其保藏编号为CGMCCNo.28933，分类命名为马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus，于2023年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。
本发明马克斯克鲁维酵母菌具有较强的抗逆性(强酸、高渗透压、高温)。
进一步，所述马克斯克鲁维酵母菌的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，本发明还提供了一种微生物制剂，其有效成分包含上述马克斯克鲁维酵母菌或其水解物或其发酵液或其细胞重悬液或其培养物或其代谢产物。
进一步，所述马克斯克鲁维酵母菌水解物是将上述马克斯克鲁维酵母菌经经自溶和/或酶解后干燥所得。
优选的，所述自溶的温度为55～65℃，所述酶解的温度为55～60℃。
进一步，所述马克斯克鲁维酵母菌发酵液是将上述马克斯克鲁维酵母菌接种于发酵培养基中培养获得。
本发明进一步还提供了上述马克斯克鲁维酵母菌或上述微生物制剂在脱除玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)和/或呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)中的应用。
进一步，所述马克斯克鲁维酵母菌水解物在脱毒玉米赤霉烯酮和/或呕吐毒素时孵育pH为5～8。
本发明还提供了上述马克斯克鲁维酵母菌或上述微生物制剂在制备食物产品或饲料产品中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明马克斯克鲁维酵母是一株可以在复杂基质(低pH、高渗透压和高温)中生长的安全酵母菌，其蛋白含量高达58.1％，同时水解物对多种真菌毒素(如ZEN和DON)具有脱除效果，且风味成分丰富，产酯能力强，作为菌剂制备发酵产品和酵母蛋白及酵母加工产品，可广泛应用于食品和饲料等领域。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明酵母菌株的菌落形态；其中，A：培养基生长的菌落形态；B：菌株的显微镜观察形态。
图2为本发明马克斯克鲁维酵母水解物对ZEN、DON毒素脱除效果液相质谱图；其中，A：不同添加量水解物对ZEN的脱除效果；B：不同添加量水解物对DON的脱出效果。
图3为本发明马克斯克鲁维酵母水解物对ZEN和DON毒素脱除的效果。
图4为本发明马克斯克鲁维酵母水解物对含有毒素玉米浆(ZEN：560mg/L；DON：220mg/L)脱除效果液相质谱图；其中，A：不同添加量水解物对ZEN的脱除效果；B：不同添加量水解物对DON的脱除效果。
图5为本发明马克斯克鲁维酵母菌株的挥发性风味成分的测定；背景颜色为蓝色，红色的深浅代表该种物质的浓度；CK为YPD培养基；B-2为该菌株。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1菌株的分离和鉴定
通过酸性(pH为3.5)条件下，从健康牛瘤胃样品中筛选、分离和纯化出一株酵母菌株B-2，经过形态学观察(图1)和ITS序列(SEQ ID NO.1所示)测定，确定为一株马克斯克鲁维酵母。
将该马克斯克鲁维酵母菌株B-2于2023年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，其保藏编号为CGMCC No.28933，分类命名为马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus。
实施例2菌株的碳源同化情况
制备培养基：(NH4)2SO4 0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4-7H2O 0.05％，CaCl2-2 H2O0.01％，NaCl 0.01％，酵母膏0.02％，表1中所示的碳源0.5％，琼脂2.0％。用蒸馏水配，培养基过滤后分装小试管，每管3ml，115℃灭菌20min。杜氏小管法判断菌株的生长情况。结果如表1所示，显示本发明保藏编号为CGMCC No.28933的菌株可对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、糖蜜、玉米浆、纤维二糖、松三糖、木糖、蜜二糖、阿拉伯糖、乙醇、甘油和乳酸同化，具有广泛的碳源利用能力，可成为工业应用的潜力菌株。
表1菌株对不同碳源的同化情况
+：同化；-：不同化实施例3菌株的蛋白含量的测定
我国蛋白饲料资源供给不足，严重依赖进口，为了筛选出可作为微生态制剂及用于发酵生产酵母蛋白的菌株，对多株酵母菌剂(安琪(酿酒)酵母饲料添加剂和饲用高活性干酵母(酿酒)酵母)以及已授权专利CN202310484775.X(保藏编号为CCTCC No.M20211604的马克斯克鲁维酵母)和本发明菌株(保藏编号为CGMCC No.28933的马克斯克鲁维酵母)进行蛋白含量比较，具体方法如下：
接种单一菌株或菌剂在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基培养基(简称YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L)30℃、220r/min摇床培养12h，按照相同的可见分光光度计OD600nm转接到新的YPD培养基中，30℃发酵24h后离心得到菌体，冷冻干燥，测定蛋白含量。
结果如表2所示，显示本发明马克斯克鲁维酵母的蛋白含量均高于已授权专利涉及的马克斯克鲁维酵母、安琪(酿酒)酵母饲料添加剂和饲用高活性干酵母(酿酒)酵母，高达58.1％。
表2不同种类酵母的蛋白含量
实施例4菌株的脱毒效果的测定
酵母水解物是将酵母细胞壁破裂，暴露出细胞壁结构。有研究表明酵母细胞壁中β葡聚糖参与生物脱毒过程，不同的酵母其含量和结构有的差异会导致脱毒效果存在差异。本实施例对本发明马克斯克鲁维酵母菌株对ZEN和DON的脱除效果进行测定：
将本发明马克斯克鲁维酵母菌株发酵后收集菌体，在温度55℃、pH5.0条件下，质量浓度为10％，自溶24h后浓缩干燥得到酵母水解物。
取10μg玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)于2mL EP管中，得到毒素管，分别称取0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mg酵母水解物加入毒素管中，先加入100μL甲醇溶解毒素，蒸馏水定容至1mL；未添加酵母水解物的毒素管加入100μL甲醇，用蒸馏水定容至1mL作为对照(CK)。控制温度30℃，转速220r/min，自然pH条件孵育8h，12000rpm条件下离心10min，取上清液进行液相质谱检测。
取10μg呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)于2mL EP管中，得到毒素管，分别称取4.0、8.0、12.0、16.0和20.0mg酵母水解物加入毒素管中，蒸馏水定容至1mL；未添加酵母水解物的毒素管加1mL蒸馏水作为对照(CK)。控制温度30℃，转速220r/min，自然pH条件孵育8h，12000rpm条件下离心10min，取上清液进行液相质谱检测。
对ZEN和DON的脱除效果进行验证的液相质谱图如图2所示，与对照(CK)相比，本发明马克斯克鲁维酵母水解物对ZEN和DON均有较好的脱除效果。脱除结果如图3所示，对ZEN和DON最佳脱除率为2.31mg/g、0.40mg/g。
对含有毒素的玉米浆(ZEN：560mg/L；DON：220mg/L)中添加不同量的酵母水解物，调整pH为5～8，孵育8h，与对照(CK)相比，具有一定的脱除效果。脱除结果如图4，对玉米浆中ZEN和DON最佳脱除率为0.11mg/g、0.0075mg/g。
上述结果表明本发明马克斯克鲁维酵母对ZEN和DON均具有较好的脱毒效果。
实施例5菌株的挥发性风味成分的测定
利用气相离子迁移谱仪(GC-IMS)对该菌株进行风味成分检测，具体方法如下：
将菌株发酵后收集菌体冷冻干燥，利用气相离子迁移谱进行检测，结果图图5所示，共检测到68种挥发性成分；其中，酯类物质49.12％，主要成分3-甲基乙酸丁酯(3-Methyl butyl acetate)、3-甲基丙酸丁酯(3-Methylbutyl propanoate)、丙酸2-甲基丙酯(2-Methylpropyl propionate)、乙酸2-甲基-1-丙酯(2-Methyl-1-propyl acetate)、丙酸乙酯(Ethyl propanoate)、乙酸丙酯(Acetic acid propyl ester)和乙酸乙酯(Aceticacid ethyl ester)占比82.32％；酸类物质占比8.37％，主要成分乙酸(Acetic acid)占比84.6％；醇类物质34.25％，主要成分3-甲基丁-1-醇(3-Methylbutan-1-ol)、2-甲基-1-丙醇(2-Methyl-1-propanol)、乙醇(Ethanol)占比78.54％；酮类物质占比3.94％，主要成分丙酮(Acetone)占比53.80％。其风味成分丰富，产酯能力强，可用于低酒精度、气味香味怡人的发酵型风味饮料，或者可以用于气味香味醇厚的饲料。
实施例6菌株的耐受性能的检测
通过杜氏小管在不同条件下(即pH为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和7.0；渗透压(NaCl计)为0、10、30、50、70和90g/L；温度为30、35、40、45、50、55℃)，将本发明马克斯克鲁维酵母菌株在YPD培养基中(变量为pH和渗透压时，温度为30℃；变量为温度时，pH和渗透压为自然状态)在220r/min摇床进行发酵培养，对发酵24小时的产气能力进行记录以反映该菌株对低pH、渗透压和温度的耐受性能。
结果如表3、4和5所示，显示本发明马克斯克鲁维酵母菌株能够在pH不低于2.0、温度低于50℃、盐(NaCl计)浓度低于50g/L条件下的培养基中正常生长，具有良好的抗逆性能，为利用农产品加工副产物和复杂基质生产酵母蛋白提供了菌株支持。
表3不同pH产气能力
注：+表示产气达到杜氏小管的1/4；++表示产气达到杜氏小管的1/2；+++表示产气达到杜氏小管的3/4；++++表示产气达到杜氏小管的全部；-表示产气为零。
表4不同渗透压(NaCl计)产气能力
注：+表示产气达到杜氏小管的1/4；++表示产气达到杜氏小管的1/2；+++表示产气达到杜氏小管的3/4；++++表示产气达到杜氏小管的全部；-表示产气为零。
表5不同温度产气能力
注：+表示产气达到杜氏小管的1/4；++表示产气达到杜氏小管的1/2；+++表示产气达到杜氏小管的3/4；++++表示产气达到杜氏小管的全部；-表示产气为零。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (7)
1.一株马克斯克鲁维酵母菌，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌的保藏编号为CGMCC No.28933。
2.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母菌，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂的有效成分包含权利要求1或2所述的马克斯克鲁维酵母菌或其水解物或其发酵液或其细胞重悬液或其培养物或其代谢产物。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌水解物是将所述马克斯克鲁维酵母菌经自溶和/或酶解后干燥所得。
5.根据权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述自溶的温度为55～65℃，所述酶解的温度为55～60℃。
6.权利要求1或2所述的马克斯克鲁维酵母菌或权利要求3-5任一所述的微生物制剂在脱除玉米赤霉烯酮和/或呕吐毒素中的应用。
7.权利要求1或2所述的马克斯克鲁维酵母菌或权利要求3-5任一所述的微生物制剂在制备食物产品和/或饲料产品中的应用。
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