CN118063551A - 一种兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽及其应用，可有效解决制备不易形成耐药性的抗伤口感染药物的问题，一种兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽，长度为7个氨基酸，序列是HFQFQYE，从N端到C端为His‑Phe‑Gln‑Phe‑Gln‑Tyr‑Glu；本发明的抗菌肽具有优秀的pH响应抗菌和酶响应抗氧化效果，在伤口部位微酸性条件下发生质子化从而带正电，具有抗菌活性，可以缓解伤口氧化应激，促进伤口愈合，不易形成耐药性，制备方法简单，易制备，还可根据需要制成抗伤口感染的水凝胶、药物组合物，用途广，有显著的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是有抗氧化功能的一种兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽及其应用。
背景技术
伤口感染在日常生活中很常见，许多常规抗生素已被用于治疗感染的伤口，但获得性耐药性和常规抗生素的副作用限制了其治疗效果。因此，有效治疗伤口感染一直是一个重大挑战。然而目前抗菌药物依赖于开发新型抗生素、循环不同类型的抗生素以及不同抗生素的组合，这会导致多重耐药微生物的发展。研究表明，带正电的抗菌肽通过与带负电的细菌膜通过静电吸引力结合，进而物理破坏细菌膜来杀死细菌，导致细胞质渗漏和细胞死亡。这种作用方式是物理的和快速的，不易形成耐药性。同时，考虑到细菌感染引起氧化应激，会阻滞伤口的愈合，因此，研制具有抗氧化特性的抗菌肽药物促进伤口愈合，已成为伤口抗菌药物开发的热点技术之一。
发明内容
针对上述情况，本发明之目的就是提供一种兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽及其应用，可有效解决制备不易形成耐药性的抗伤口感染药物的问题。
本发明解决的技术方案是，一种兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽，长度为7个氨基酸，序列是HFQFQYE，从N端到C端为His-Phe-Gln-Phe-Gln-Tyr-Glu；
制备方法是，采用9-芴基甲氧基羰基保护基（Fmoc）多肽固相合成法制备得到，包括以下步骤：
（1）Rink酰胺树脂的预处理：Rink酰胺树脂中加入二氯甲烷（DCM），静置，使树脂充分溶胀，然后通过减压抽滤除去二氯甲烷，得Rink酰胺固相树脂；
（2）Fmoc保护基团的脱去：向玻璃固相管的Rink酰胺固相树脂中加入哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（DMF），将固相管封好，置于摇床上振摇，依次用甲醇，DCM、DMF洗涤树脂三次；
（3）制备多肽HFQFQYE：通过固相合成方法，将Fmoc-His（Boc）-OH、N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）、N-芴甲氧羰基-L-谷氨酰胺（Fmoc-Gln-OH）、N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）、FFmoc-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺（Fmoc-Gln-OH）、芴甲氧羰基-L-酪氨酸（Fmoc-Tyr-OH）和Fmoc-Glu-OH依次偶联到Rink酰胺固相树脂上，得到多肽HFQFQYE；
（4）多肽HFQFQYE的切割：将多肽HFQFQYE置于切割试剂中，切割过夜，收集滤液，旋蒸除去三氟乙酸得到粗产物，粗产物中加入冷乙醚沉淀，离心弃去乙醚，沉淀自然晾干；
（5）多肽HFQFQYE的纯化与鉴定：使用高效液相色谱法对所制备的多肽HFQFQYE进行纯化，接出保留时间为12min的峰处组分，旋蒸并冻干，得到纯化的多肽HFQFQYE粉末，纯度≥95%，质谱鉴定特征峰[M+2H]2+500.07,[M+H]+999.24。
所述的多肽HFQFQYE兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能，在制备具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能药物中的应用；
所述的多肽HFQFQYE在制备抗伤口感染药物中的应用，所述的抗伤口感染药物是抗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌所引起的细菌性伤口感染药物；
所述的多肽HFQFQYE在制备HFQFQYE水凝胶中的应用；
所述的多肽HFQFQYE在制备药物组合物中的应用，所述的药物组合物包括所述的抗菌肽，或其药学上可接受的盐，以及其在药学上可接受的载体。
所述的HFQFQYE水凝胶是，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为8-12mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
本发明的抗菌肽具有优秀的pH响应抗菌和酶响应抗氧化效果，在伤口部位微酸性条件下发生质子化从而带正电，具有抗菌活性，可以缓解伤口氧化应激，促进伤口愈合，不易形成耐药性，制备方法简单，易制备，还可根据需要制成抗伤口感染的水凝胶、药物组合物，用途广，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明一种兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽，长度为7个氨基酸，序列是HFQFQYE，从N端到C端为His-Phe-Gln-Phe-Gln-Tyr-Glu；
制备方法由以下步骤实现：
（1）Rink酰胺树脂的预处理：称取0.35mmol/g的Rink酰胺树脂1g，置于25mL的玻璃固相管中，向玻璃固相管中加入15mL的二氯甲烷（DCM），静置15min，使树脂充分溶胀，然后通过减压抽滤除去二氯甲烷，得Rink酰胺固相树脂；
（2）Fmoc保护基团的脱去：向玻璃固相管的Rink酰胺固相树脂中加入15mL体积比1︰4的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（DMF），将固相管封好，置于摇床上振摇15min，弃去液体，再加入15mL体积比1︰4的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（DMF），振摇15min，弃去液体，沉淀部分依次用甲醇，DCM、DMF洗涤树脂三次，每次10mL；
（3）制备多肽HFQFQYE：通过固相合成方法，将氨基酸N-(9-芴甲氧羰基)-L-谷氨酸（Fmoc-Glu-OH）、N-(9-芴甲氧羰基)-L-酪氨酸（Fmoc-Tyr-OH）、N-(9-芴甲氧羰基)-L-谷氨酰胺（Fmoc-Gln-OH）、N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）、N-(9-芴甲氧羰基)-L-谷氨酰胺（Fmoc-Gln-OH）、-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH）和N-(9-芴甲氧羰基)-L-组氨酸（Fmoc-His-OH），用量均为1.05mmol、3eq，依次偶联到Rink酰胺固相树脂上，偶联试剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）1.05mmol、3eq，1-羟基苯并三氮唑（HOBT）1.05mmol、3eq和N,N-二异丙基乙胺（DIEA）2.10mmol、6eq；脱Fmoc保护基团的条件为：体积比1︰4的哌啶/DMF混合物15mL，每步氨基酸偶联反应及脱Fmoc保护之后，均使用甲醇、DCM、DMF各洗涤树脂3次，每次用量各10mL，得到多肽HFQFQYE；
（4）多肽HFQFQYE的切割：将多肽HFQFQYE置于15mL切割试剂中，切割过夜8-12h，收集滤液，旋蒸除去三氟乙酸得到粗产物，粗产物中加入冷乙醚沉淀，2000r/min离心弃去乙醚，沉淀自然晾干；
所述的切割试剂是，体积比计的：三氟乙酸︰三羟甲基甲胺基乙磺酸︰水＝95︰2.5︰2.5混合均匀制成；
（5）多肽HFQFQYE的纯化与鉴定：使用高效液相色谱法对所制备的多肽HFQFQYE进行纯化，流动相A：含有质量浓度0.1%三氟乙酸的乙腈，流动相B：含有质量浓度0.1%三氟乙酸的水，流动相A︰流动相B＝20%-45%︰80%-55%（流动相A和流动相B之和为100%），梯度洗脱20min，接出保留时间为12min的峰处组分，81℃旋蒸45 min，将剩余液体置于-20 ℃预冻之后再置于-80 ℃冷冻过夜8-12h，再将其放入冷冻干燥机，进行真空冷冻，得到纯化的多肽HFQFQYE粉末，纯度≥95%，质谱鉴定特征峰[M+2H]2+500.07,[M+H]+999.24。
所述的HFQFQYE水凝胶是，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为10mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
所述的HFQFQYE水凝胶是，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为8mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
所述的HFQFQYE水凝胶是，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为12mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
本发明基于抗菌肽的抗菌原理以及各种氨基酸的性质，对氨基酸序列进行合理排列，得到兼具pH响应抗菌和酶响应抗氧化功能的肽序列，其序列为HFQFQYE，本发明所述的抗菌肽在伤口部位微酸性条件下发生质子化从而带正电，具有抗菌活性，而伤口部位高表达的酪氨酸酶又可以将抗菌肽中的酪氨酸氧化为类黑色素样物质，使其具有抗氧化活性，因此该抗菌肽可以缓解伤口氧化应激，促进伤口愈合。通过在微酸性和中性条件下对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等细菌的抗菌实验反映其pH敏感抗菌效果；通过傅里叶红外光谱反映序列HFQFQYE被酪氨酸酶催化后的结构变化；通过自由基清除实验反映多肽序列的酶响应抗氧化效果；通过对细菌感染伤口的小鼠的药效学试验反映其对小鼠伤口氧化应激水平的调节以及促进伤口愈合的效果，结果表明序列HFQFQYE具有比较优秀的pH响应抗菌和酶响应抗氧化效果，最小抑菌浓度为1.25mg/mL，有关试验资料如下：
1、HFQFQYE的pH敏感的抗菌效果试验
选用金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），细菌在溶菌肉汤培养基中37℃振摇培养过夜，监测600nm处的光密度（OD600）以监测细菌浓度，将菌液浓度定为1.0×108CFU/mL，并用不同pH（5.6和7.4）的培养基将其稀释至1.0×106CFU/mL备用。取96孔板，先加入100μL的HFQFQYE溶液使其形成凝胶，再分别加入不同pH的菌液100μL，并设置纯菌的空白对照孔。将96孔板置入培养箱37℃振摇培养，在0-12h内每隔1h监测各组的OD600值。结果可得，孵育12h后，pH为5.6的实验组的菌液OD600是空白对照组的20%，而pH为7.4的实验组与空白对照组无明显差别。由此可知HFQFQYE在微酸性条件下对金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌能力。
2、HFQFQYE的pH敏感的抗菌效果试验
选用枯草芽孢杆菌，细菌在溶菌肉汤培养基中37℃振摇培养过夜，监测600nm处的光密度（OD600）以监测细菌浓度，将菌液浓度定为1.0×108CFU/mL，并用不同pH（5.6和7.4）的培养基将其稀释至1.0×106CFU/mL备用。取96孔板，先加入100μL的HFQFQYE溶液使其形成凝胶，再分别加入不同pH的菌液100μL，并设置纯菌的空白对照孔。将96孔板置入培养箱37℃振摇培养，在0-12h内每隔1h监测各组的OD600值。结果可得，孵育12h后，pH为5.6的实验组的菌液OD600是空白对照组的16.7%，而pH为7.4的实验组与空白对照组无明显差别。由此可知HFQFQYE在微酸性条件下对枯草芽孢杆菌具有显著的抗菌能力。
3、HFQFQYE的pH敏感的抗菌效果试验
选用铜绿假单胞菌，细菌在溶菌肉汤培养基中37℃振摇培养过夜，监测600nm处的光密度（OD600）以监测细菌浓度，将菌液浓度定为1.0×108CFU/mL，并用不同pH（5.6和7.4）的培养基将其稀释至1.0×106CFU/mL备用。取96孔板，先加入100μL的HFQFQYE溶液使其形成凝胶，再分别加入不同pH的菌液100μL，并设置纯菌的空白对照孔。将96孔板置入培养箱37℃振摇培养，在0-12h内每隔1h监测各组的OD600值。结果可得，孵育12h后，pH为5.6的实验组的菌液OD600是空白对照组的20%，而pH为7.4的实验组与空白对照组无明显差别。由此可知HFQFQYE在微酸性条件下对铜绿假单胞菌具有显著的抗菌能力。
4、HFQFQYE的酶响应抗氧化效果试验
取2mg的HFQFQYE粉末溶于3.8mL无水乙醇，并加入200μL的酪氨酸酶的乙醇溶液（1000U/mL）。充分反应之后用无水乙醇依次稀释成HFQFQYE浓度为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL的溶液，作为样品溶液。
取2mg的HFQFQYE粉末溶于4mL无水乙醇，后用无水乙醇依次稀释成HFQFQYE浓度为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.3μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）测试液的配制：取DPPH 1mg溶于20mL无水乙醇中，超声5min。A0值检测：取2mL该DPPH溶液和1mL无水乙醇充分混合后在519nm处检测吸收值。A值测：取2mL DPPH测试液，同1mL梯度浓度处理之后的样品溶液充分混合后测519nm处吸收值，AB值检测：取1.6mL DPPH测试液，同0.6mL水测734nm处吸收值。
即活性氧清除率=(A0-A+AB)/A0×100%
以未经酪氨酸酶处理的HFQFQYE为对照，经酪氨酸酶处理之后的肽的活性氧清除率是它的3倍，并且其清除率是具有多肽浓度依赖性的。
5、HFQFQYE水凝胶对伤口感染小鼠的药效学试验
首先在小鼠的背部留下两个直径为4.5mm的圆形伤口。然后，将10μL浓度为1×108CFU/mL的细菌悬液（金黄色葡萄球菌，ATCC 6538）滴在伤口上。一天后，伤口出现溃疡，即为伤口感染模型。然后，将伤口感染的小鼠随机分为2组（每组n=5）。在第1天和第5天，两组伤口分别用以下分组进行治疗：(i)PBS；（ii）HFQFQYE。治疗期间记录所有小鼠的伤口面积和体重。相对创面面积按如下公式计算：第X天相对创面面积=第X天创面面积/第0天创面面积。第5天处死每组4只小鼠。每组收集3处创面，用PBS洗涤，镀在溶菌肉汤固体培养基上进行菌落计数。为进行体内超氧化物水平分析，每组再收集3处伤口，立即保存在-80°C的冰箱中，然后冷冻切片，用自由基荧光探针二氢乙锭（5.0μM）染色。在共聚焦激光扫描显微镜下观察组织切片。结果表明，在第10天时，HFQFQYE治疗组的小鼠伤口基本愈合，其相对创面面积基本为0；而PBS组在第10天的相对创面面积仍为40%。伤口菌落涂板结果也显示HFQFQYE治疗组伤口表面菌落数更少。并且HFQFQYE治疗组的组织切片在共聚焦激光扫描显微镜下观察其荧光信号显著低于PBS组。这证明HFQFQYE具有优秀的抗菌能力、缓解氧化应激以及促进伤口愈合的能力。
实验表明，本发明所述的多肽HFQFQYE兼具pH响应抗菌和酶响应抗氧化功能。且应用于伤口抗菌的时候，能够更好的减少细菌感染，降低氧化应激水平以促进伤口更快更好地愈合：
1、本发明对氨基酸序列进行合理排列，引入组氨酸和酪氨酸，得到兼具pH响应抗菌和酶响应抗氧化功能的多肽，用途广。
2、本发明结构简单，易于合成，对常见革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著抑制效果。
3、本发明应用于针对感染伤口的治疗，该抗菌肽在伤口微酸性以及酪氨酸酶高表达的环境下被激活，抑制细菌增殖，缓解氧化应激，不易形成耐药性，促进伤口恢复，有显著的经济和社会效益。
Claims (9)
1.一种兼具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能的多肽，长度为7个氨基酸，序列是HFQFQYE，从N端到C端为His-Phe-Gln-Phe-Gln-Tyr-Glu。
2.权利要求1所述的多肽HFQFQYE在制备具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能药物中的应用。
3.权利要求2所述的多肽HFQFQYE在制备具pH响应抗菌与酶响应抗氧化功能药物中的应用，其特征在于，所述的药物为抗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌所引起的细菌性伤口感染药物。
4.权利要求1所述的多肽HFQFQYE在制备药物组合物中的应用，所述的药物组合物包括所述的抗菌肽，或其药学上可接受的盐，以及其在药学上可接受的载体。
5.权利要求1所述的多肽HFQFQYE在制备HFQFQYE水凝胶中的应用。
6.权利要求5所述的HFQFQYE水凝胶的制备方法，其特征在于，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为8-12mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
7.根据权利要求6所述的HFQFQYE水凝胶的制备方法，其特征在于，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为10mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
8.根据权利要求6所述的HFQFQYE水凝胶的制备方法，其特征在于，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为8mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
9.根据权利要求6所述的HFQFQYE水凝胶的制备方法，其特征在于，纯化并冻干的HFQFQYE粉末加入去离子水中，浓度为12mg/mL，充分溶解之后静置4h即得HFQFQYE水凝胶。
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