CN118058188A - 一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，包括步骤对第二天要开花的丝瓜雌花子房施加芸苔素内脂水溶液；第二天取冬瓜雄花与施加芸苔素内脂水溶液的丝瓜雌花进行授粉，同时在丝瓜子房、雌蕊施加噻苯隆水溶液，授粉后对雌花进行套袋隔离；在授粉后的3～6 h以及20～26h在子房及果柄基部施加噻苯隆溶液；收获种瓜后取相对饱满种子催芽播种获得再生植株；对再生植株进行炼苗、移栽，随后正常栽培管理。本发明将噻苯隆和芸苔素内脂联合用于远缘杂交诱导，刺激胚胎发育，提高座果率，通过噻苯隆多次处理，诱导染色体加倍，直接获得丝瓜双单倍体，解决了丝瓜双单倍体效率低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得新植物的方法，特别是一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法。
背景技术
丝瓜(Luffa cylindrica 2n=26)为葫芦科一年生攀缘植物，原产于热带和亚热带地区。经长期的进化和选择，具有较强的适应性，在我国各地区被广泛栽培。通过传统育种方式选育纯合亲本周期长、工作量大，而利用单/双单倍体育种，可较快获得纯合亲本，极大的缩短育种年限，提高育种效率。
葫芦科作物获得单倍体/双单倍体的方法主要包括：花药培养、未受精子房离体培养、辐射花粉授粉。用辐射花粉授粉是葫芦科作物中最有效的单倍体诱导方法，但辐射花粉授粉形成单倍体不够稳定，且单倍体通过染色体加倍形成稳定地双单倍体效率低下，目前丝瓜双单倍体还未见成功创制。公开号为CN113080055A的中国专利公开了一种远缘杂交诱导胚发育直接创制甜瓜双单倍体的方法，将氯吡脲和噻苯隆联合用于同为葫芦科的甜瓜的远缘杂交诱导创制双单倍体，但是该方法在丝瓜双单倍体创制时效果不佳。
发明内容
针对上述现有技术缺陷，本发明的任务在于提供一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，目的是提高丝瓜双单倍体创造的稳定性和效率。
本发明技术方案如下：一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，包括以下步骤：
步骤1、对第二天要开花的丝瓜雌花子房施加芸苔素内脂水溶液；
步骤2、第二天取冬瓜雄花与施加芸苔素内脂水溶液的丝瓜雌花进行授粉，同时在丝瓜子房、雌蕊施加噻苯隆水溶液，授粉后对雌花进行套袋隔离；
步骤3、在授粉后的3～6 h以及20～26h在子房及果柄基部施加噻苯隆溶液；
步骤4、收获种瓜后取相对饱满种子催芽播种获得再生植株；
步骤5、对再生植株进行炼苗、移栽，随后正常栽培管理。
进一步地，所述芸苔素内脂水溶液浓度为0.03～0.05 mg/L。
进一步地，所述步骤2中的噻苯隆溶液浓度为10～15mg/L。
进一步地，所述步骤3中在授粉后的3～6 h使用的噻苯隆溶液浓度为4～6 mg/L，在授粉后的20～26 h使用的噻苯隆溶液浓度为10～15 mg/L。
进一步地，所述丝瓜为筒管玉丝瓜或徐绿1号，所述冬瓜为宝玉水果冬瓜。
进一步地，所述步骤1中对施加芸苔素内脂水溶液的丝瓜雌花进行套袋隔离，并对第二天要开花的冬瓜雄花也套袋隔离。
进一步地，所述施加芸苔素内脂水溶液和所述施加噻苯隆溶液以涂抹或喷施方式进行。
进一步地，所述步骤4催芽播种是种子露白后播种在含有育苗基质中，所述步骤5包括植株长至两叶一心期时开始炼苗，置于常温下生长5～7d天后移栽大田。
进一步地，所述育苗基质包含草炭与珍珠岩。
本发明与现有技术相比的优点在于：
将芸苔素内脂和噻苯隆联合用于远缘杂交诱导，促进胚发育，保证了果实发育，提高座果率，通过噻苯隆多次处理，诱导染色体加倍，直接获得丝瓜双单倍体，诱导效率可达2%～5%，解决了单倍体不够稳定，染色体加倍困难的问题。
利用远缘花粉进行授粉诱导直接发育成为双单倍体种子，无需组培，植株移栽成活率高，父本材料来源广，培育的双单倍体植株，可自交留种，经过田间筛选可直接用作育种材料，应用于丝瓜品种的选育。
附图说明
图1为实施例1获得的两株再生植株照片。
图2为实施例1得到的细胞流式仪鉴定图。
图3为实施例1得到的再生植株自交1代SSR标记电泳图。
图4为实施例2得到的细胞流式仪鉴定图。
图5为实施例2得到的再生植株自交1代SSR标记电泳图。
图6为实施例3得到的细胞流式仪鉴定图。
图7为实施例3得到的再生植株自交1代SSR标记电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明及用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1，一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，以徐绿1号为母本，宝玉水果冬瓜为父本，具体步骤如下：
步骤1、对第二天要开花的丝瓜雌花子房涂抹芸苔素内脂0.03mg/L水溶液，并套袋隔离，同时对第二天要开花的冬瓜雄花套袋隔离；
步骤2、取冬瓜雄花与丝瓜雌花进行授粉，同时在丝瓜子房、雌蕊涂抹10mg/L噻苯隆水溶液1次，授粉后对雌花进行套袋隔离；
步骤3、授粉后的3h在子房及果柄基部喷施5 mg/L噻苯隆溶液1次，授粉后的20h在子房及果柄基部喷施10 mg/L噻苯隆溶液1次；
步骤4、授粉后6～7周时间收获种瓜，取相对饱满种子，露白后播种在含有育苗基质的营养钵中，育苗基质为草炭与珍珠岩等2:1体积混合。如图1所示，取幼苗叶片0.5～0.8cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105～1.0×107个/mL，以筒管玉丝瓜叶片为对照，用细胞流式仪进行检测，检测表明：两株幼苗均为二倍体植株，检测结果如图2所示。
步骤5、植株长至两叶一心期时开始炼苗，置于常温下生长5～7d天后移栽大田管理，自交留种。
取自交1代幼苗叶片，CTAB法提取叶片的DNA，进行SSR标记鉴定，检测再生植株基因位点纯合性，结果如图3所示，检测表明：二倍体丝瓜植株基因位点纯合，即植株为双单倍体。
对上述获得的双单倍体进行全生育期观察，发现植株在叶片变小、节间缩短、前期生长缓慢等植物学性状上都表现出典型的双单倍体特征。
实施例2，一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，以筒管玉丝瓜为母本，宝玉水果冬瓜为父本，具体步骤如下：
步骤1、对第二天要开花的丝瓜雌花子房涂抹芸苔素内脂0.05mg/L水溶液，并套袋隔离，同时对第二天要开花的冬瓜雄花套袋隔离；
步骤2、取冬瓜雄花与丝瓜雌花进行授粉，同时在丝瓜子房、雌蕊涂抹15mg/L噻苯隆水溶液1次，授粉后对雌花进行套袋隔离；
步骤3、授粉后的6h在子房及果柄基部喷施6 mg/L噻苯隆溶液1次，授粉后的26h在子房及果柄基部喷施15mg/L噻苯隆溶液1次；
步骤4、授粉后6～7周时间收获种瓜，取相对饱满种子，露白后播种在含有育苗基质的营养钵中，育苗基质为草炭与珍珠岩等2:1体积混合。取幼苗叶片0.5～0.8cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105～1.0×107个/mL，以筒管玉丝瓜叶片为对照，用细胞流式仪进行检测，检测表明：幼苗为二倍体植株，检测结果如图4所示。
步骤5、植株长至两叶一心期时开始炼苗，置于常温下生长5～7d天后移栽大田管理，自交留种。
取自交1代幼苗叶片，CTAB法提取叶片的DNA，进行SSR标记鉴定，检测再生植株基因位点纯合性，结果如图5所示，检测表明：二倍体丝瓜植株基因位点纯合，即植株为双单倍体。
对上述获得的双单倍体进行全生育期观察，发现植株在叶片变小、节间缩短、前期生长缓慢等植物学性状上都表现出典型的双单倍体特征。
实施例3，一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，以筒管玉丝瓜为母本，宝玉水果冬瓜为父本，具体步骤如下：
步骤1、对第二天要开花的丝瓜雌花子房喷施芸苔素内脂0.04mg/L水溶液，并套袋隔离，同时对第二天要开花的冬瓜雄花套袋隔离；
步骤2、取冬瓜雄花与丝瓜雌花进行授粉，同时在丝瓜子房、雌蕊喷施12mg/L噻苯隆水溶液1次，授粉后对雌花进行套袋隔离；
步骤3、授粉后的5h在子房及果柄基部喷施4 mg/L噻苯隆溶液1次，授粉后的24h在子房及果柄基部喷施12mg/L噻苯隆溶液1次；
步骤4、授粉后6～7周时间收获种瓜，取相对饱满种子，露白后播种在含有育苗基质的营养钵中，育苗基质为草炭与珍珠岩等2:1体积混合。取幼苗叶片0.5～0.8cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105～1.0×107个/mL，以筒管玉丝瓜叶片为对照，用细胞流式仪进行检测，检测表明：幼苗为二倍体植株，检测结果如图6所示。
步骤5、植株长至两叶一心期时开始炼苗，置于常温下生长5～7d天后移栽大田管理，自交留种。
取自交1代幼苗叶片，CTAB法提取叶片的DNA，进行SSR标记鉴定，检测再生植株基因位点纯合性，结果如图7所示，检测表明：二倍体丝瓜植株基因位点纯合，表明该实施例获得的植株为双单倍体。
对上述获得的双单倍体进行全生育期观察，发现植株在叶片变小、节间缩短、前期生长缓慢等植物学性状上都表现出典型的双单倍体特征。
对比例1
在实施例1的步骤1中不喷施芸苔素水溶液，其余步骤同实施例1，授粉30朵丝瓜雌花。
对比例2
在实施例1的步骤2中授粉时不喷施噻苯隆溶液，其余步骤同实施例1，授粉30朵丝瓜雌花。
对比例3
在实施例1的步骤3中仅在授粉后的20h在子房及果柄基部喷施10mg/L噻苯隆溶液1次，其余步骤同实施例1，授粉30朵丝瓜雌花。
对比例4
在实施例1的步骤3中仅在授粉后的3h在子房及果柄基部喷施5 mg/L噻苯隆溶液1次，其余步骤同实施例1，授粉30朵丝瓜雌花。
上述实施例和对比例的结果为：对比例1坐果11个，收获饱满种子1个，不发芽；对比例2坐果4个，无法获得饱满种子；对比例3能够坐果13个，无法获得饱满种子；对比例4坐果13个，收获饱满种子1个，不发芽。实施例1中处理50朵丝瓜雌花，坐果数为41个，获得2颗饱满种子，实施例2中处理50朵丝瓜雌花，坐果数为38个，获得1颗饱满种子，实施例3中处理50朵丝瓜雌花，坐果数为40个，获得1颗饱满种子，均可正常发芽，获得再生植株，丝瓜双单倍体诱导效率可达2 %～5 %。
Claims (9)
1.一种远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、对第二天要开花的丝瓜雌花子房施加芸苔素内脂水溶液；
步骤2、第二天取冬瓜雄花与施加芸苔素内脂水溶液的丝瓜雌花进行授粉，同时在丝瓜子房、雌蕊施加噻苯隆水溶液，授粉后对雌花进行套袋隔离；
步骤3、在授粉后的3～6 h以及20～26h在子房及果柄基部施加噻苯隆溶液；
步骤4、收获种瓜后取相对饱满种子催芽播种获得再生植株；
步骤5、对再生植株进行炼苗、移栽，随后正常栽培管理。
2.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述芸苔素内脂水溶液浓度为0.03～0.05 mg/L。
3.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤2中的噻苯隆溶液浓度为10～15mg/L。
4.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤3中在授粉后的3～6 h使用的噻苯隆溶液浓度为4～6 mg/L，在授粉后的20～26 h使用的噻苯隆溶液浓度为10～15 mg/L。
5.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述丝瓜为筒管玉丝瓜或徐绿1号，所述冬瓜为宝玉水果冬瓜。
6.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤1中对施加芸苔素内脂水溶液的丝瓜雌花进行套袋隔离，并对第二天要开花的冬瓜雄花也套袋隔离。
7.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述施加芸苔素内脂水溶液和所述施加噻苯隆溶液以涂抹或喷施方式进行。
8.根据权利要求1所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述步骤4催芽播种是种子露白后播种在含有育苗基质中，所述步骤5包括植株长至两叶一心期时开始炼苗，置于常温下生长5～7d天后移栽大田。
9.根据权利要求8所述的远缘杂交诱导创制丝瓜双单倍体的方法，其特征在于，所述育苗基质包含草炭与珍珠岩。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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