CN1180312A

CN1180312A - 抗肥胖蛋白

Info

Publication number: CN1180312A
Application number: CN 96193022
Authority: CN
Inventors: M·B·巴辛斯基; R·D·迪马奇埃; D·B·弗洛拉; J·E·黑尔; 小·W·F·希思; J·A·霍夫曼; B·E·舍恩厄尔
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1996-01-29
Publication date: 1998-04-29

Abstract

本发明提供抗肥胖蛋白,给病人施用此蛋白时可调节脂肪组织。因此,这种药物可使病人克服其肥胖性障碍,并可极大地减少二型糖尿病、心血管疾病和癌症的发病风险而过上正常生活。

Description

抗肥胖蛋白

本发明属于人类医学领域，特别是涉及肥胖以及与肥胖相关的失调的治疗。更具体地说，本发明涉及抗肥胖蛋白，当将其施用于病人时可调节脂肪组织。

肥胖，特别是上身肥胖，在美国以至全世界都是一个常见而又十分严重的公共健康问题。根据近期的统计，美国百分之二十五的人口和加拿大百分之二十七的人口体重超重。Kuczmarski，Amer.J.of Clin.Nutr.55：495S-502S(1992)；Reeder et.al.，Can.Med.Ass J.，23：226-233(1992)。已知上身肥胖是二型糖尿病的最主要危险因素，也是心血管疾病和癌症的一个主要危险因素。近来估计全世界用于治疗肥胖的医药费用达1500亿美元。这个问题已变得如此严重以致使公共卫生局医务长官开始对美国社会日益增长的肥胖的蔓延趋势展开斗争。

大多数肥胖诱发的病状可以归因于其与异常脂血症、高血压和胰岛素抗性密切相关。许多研究业已表明通过节食和体育锻炼减肥可显著降低这些危险因素。不尽人意的是这些方法百分之九十五是不成功的。失败的原因可能由于病症与遗传因素密切相关。这些遗传因素可导致食欲增加、喜食高热量食物、身体活动力减少和产脂代谢增加。这表明有这些遗传特征的人不管他们多么努力与自身状况做斗争都容易发胖。因此，能够纠正这种肥胖性障碍并使医生成功治疗肥胖病人而无须考虑病人的遗传因素的药物就成为人们的需要。

数年来，生理学家们一直推测当哺乳动物饮食过量时会发出脂肪过量信号，告诉大脑身体正在发胖，继而减少进食并消耗更多热量。G.R.Hervey，Nature 227：629-631(1969)。这种“反馈”模型得到联体实验的支持，这个实验表明循环系统中的激素控制着肥胖。

ob/ob小鼠是肥胖和糖尿病的一种动物模型，已知其携带与第六染色体上突变相联的特征。最近，Yiying Zhang与其同事发表了与此病症相联的定位克隆。Yiying Zhang et al.Nature 372：425-32(1994)。这份报告公开了一个编码167个氨基酸的蛋白的基因，此蛋白有21个氨基酸的信号肽，在脂肪组织中专一表达。同样，Murakami等人在Biochemical and BiophysicalResearch Communications 209(3)：944-52(1995)中报道了大鼠肥胖基因的克隆与表达。目前推测这种显然由ob基因编码的蛋白是一种肥胖调节激素。Zhang等人没有报告此蛋白的药物活性。

然而，我们发现Zhang等人所发现的蛋白由于其化学和物理上的不稳定性而不是一个良好的药物。例如，人类蛋白更倾向于沉淀。含有沉淀的天然蛋白的药物制剂增加了在病人体内产生免疫应答的危险。因此，仍然需要开发具有改进的物理和化学稳定性的药物和用于帮助病人调节其食欲和代谢的药物。

更有意义的是，现已确定，对人肥胖蛋白的77，79到111，118和/或138的氨基酸残基进行专一性替换，可形成具有更高稳定性的优良的治疗药物。因此，本发明提供具有生物活性的肥胖蛋白。本发明的蛋白更易于配制和储存。而且，这种化合物具有更好的药物特点，其治疗成分易于进入体内发挥作用。因此，这种药物使病人能克服其肥胖性障碍使其二型糖尿病，心血管疾病和癌症的风险趋于正常而过上正常的生活。

发明概述本发明涉及式(I)的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：1)Val Pro Ile Xaa Lys Val Xaa Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr1 5 10 15Ile Val Thr Arg Ile Xaa Asp Ile Ser His Xaa Xaa Ser Val Ser Ser

20 25 30Lys Xaa Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

35 40 45Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Xaa Thr Leu Ala Val Tyr Xaa Xaa Ile

50 55 60Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val Ile Xaa Ile Xaa Xaa Asp Leu65 70 75 80Glu Xaa Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

85 90 95His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

100 105 110Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

115 120 125Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa Asp Xaa Leu Trp Xaa Leu Asp Leu Ser Pro

130 135 140145Gly Cys (I)

其中：

位置4的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置7的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置22的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；

位置27的Xaa是苏氨酸或丙氨酸；

位置28的Xaa是谷氨酰胺、谷氨酸或缺失；

位置34的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置54的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸；

位置56的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置62的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置63的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置68的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸；

位置72的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；

位置75的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置77的Xaa是丝氨酸或丙氨酸；

位置78的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；

位置82的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；

位置118的Xaa是甘氨酸或亮氨酸；

位置130的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置134的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置136的Xaa是甲硫氨酸、甲硫氨酸亚砜、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸；

位置139的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

所述蛋白有至少一处发生替换，该替换选自：

位置97的组氨酸被谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸替换；

位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或亮氨酸替换；

位置101的丙氨酸被丝氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸替换；

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的丝氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；

位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或亮氨酸替换；

本发明还提供一种治疗肥胖的方法，包括给需要这种治疗的哺乳动物施用式(I)的蛋白。

本发明还提供一种药物制剂，它包括式(I)的蛋白以及一种或多种药用稀释剂、载体或赋形剂。

本发明的另一实施方案是制备式(I)蛋白的方法，其包括：

(a)用编码式(I)蛋白的DNA转化宿主细胞，所述蛋白含有适当的前导肽；

(b)培养宿主细胞并分离步骤(a)中编码的蛋白；并可任选地，

(c)酶促切除前导序列从而产生式(I)蛋白。

发明详述

为本文公开并要求保护的本发明的目的，下列术语和缩略语定义如下：

碱基对(bp)--指DNA或RNA。在DNA分子中缩写A、C、G、T分别代表(脱氧)腺嘌呤、(脱氧)胞嘧啶、(脱氧)鸟嘌呤、(脱氧)胸腺嘧啶核苷酸的5’单磷酸盐形式。缩写U、C、G、T对应于RNA分子中的尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶核苷的5’单磷酸盐形式。在双链DNA中，碱基对指A与T或C与G的配对。在DNA/RNA杂交双链中，碱基对可指T与U(T与A)和C与G的配对关系。

DNA--脱氧核糖核酸。

EDTA--乙二胺四乙酸的缩写形式。

免疫活性蛋白--泛指抗体、二抗体的抗原结合区以及申请号为PCT/US87/02208，International Publication No.WO 88/01649中的PCT中描述的单链多肽结合分子。

mRNA--信使RNA。

质粒--染色体外自我复制遗传元件。

PMSG--苯甲基磺酰氟

阅读框架--由tRNA反密码子、核糖体和相关因子阅读三联体时所翻译的核酸序列，其中每个三联体对应一个特定的氨基酸。由于每个三联体是唯一的并具有同等长度，编码序列一定是3的倍数。一个碱基对的插入或缺失(称框架移动突变)可导致同一DNA片段编码两种蛋白。为防止这类情况发生，所所需多肽的三联体密码必须与启始密码为起点的3的倍数相吻合。即必须保持正确的阅读框架。

重组DNA克隆载体--任何自主复制的因子，包括但不限于质粒和噬菌体，既可加入一个以上的DNA片段的DNA分子。

重组DNA表达载体--任何已有启动子插入的重组DNA载体。

复制子--控制并容许质粒或其他载体自主复制的DNA序列。

RNA--核糖核酸。

RP-HPLC--反相高效液相层析的缩写。

转录--DNA核苷酸序列中的信息转移到互补RNA序列中的过程。

翻译--用信使RNA的遗传信息专一化并指导多肽链合成的过程。

Tris--三羟甲基氨基甲烷的缩写。

治疗--描述为抵抗疾病、病症或失调而对病人进行安排和护理。包括施用本发明的化合物预防症状及并发症的发生，减轻症状或并发症，或消除疾病、病症或失调。因此，治疗肥胖包括对需治疗的病人限制进食，限制增重并诱导减轻体重。

载体--用于基因操作中转化细胞的复制子。它载有相应于适当蛋白分子的多核苷酸序列，当其与适当的控制序列结合时，能够赋予将要转化的细胞专一的特性。质粒、病毒和噬菌体都是合适的载体，因为他们都可自主复制。人工载体可通过使用限制性内切酶和连接酶切割和连接不同来源的DNA分子而构建起来。载体包括重组DNA克隆载体和重组DNA表达载体。

X-gal--5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷的缩写。

氨基酸缩写被美国专利与商标局接受，如37 C.F.R.§1.822(b)(2)(1933)所示。本专业技术人员应知道某些氨基酸容易发生重排。例如天冬酰胺可能重排成天冬氨酸和异天冬氨酸，如I.Schon et al.，Int.J.PeptideProtein Res.14：485-94(1979)描述的，在此引入作为参考。这些重排衍生物包括在本发明的范围之内。除非另行说明，这些氨基酸具有L构型。

如上所示，本发明提供式(I)蛋白。优先的蛋白是式(II)蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：2)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

50 55 60Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile65 70 75 80Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro145Gly Cys (II)其中：位置22的天冬酰胺可任选地是谷氨酰胺或天冬氨酸；位置27的苏氨酸可任选地是丙氨酸；位置28的谷氨酰胺可任选地是谷氨酸或缺失；位置54的甲硫氨酸可任选地是丙氨酸；位置68的甲硫氨酸可任选地是亮氨酸；位置72的天冬酰胺可任选地是谷氨酸或天冬氨酸；位置77的丝氨酸可任选地是丙氨酸；位置118的甘氨酸可任选地是亮氨酸；所述蛋白有至少一处发生替换，该替换选自：

位置101的丙氨酸被丝氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苏氨酸、或缬氨酸替换；

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；

位置138的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或亮氨酸替换。

优选的蛋白是这样的式(II)蛋白，其中：

位置100的色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸；或

位置138的位色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸。

式(III)的其它优选蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：3)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

50 55 60Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile65 70 75 80Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Set Asn Asp Leu

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser pro145Gly Cys (III)

其中：

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；

最优选的蛋白是这样一些式(III)蛋白，其中：

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；或

位置138的色氨酸是丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或亮氨酸；

进一步优选的式(III)蛋白是这样一些蛋白，其中：

位置97的组氨酸被丝氨酸或脯氨酸替换；

位置100的色氨酸被丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸替换；

位置101的丙氨酸被苏氨酸替换；

位置138的色氨酸是丙氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸或亮氨酸。

另外优选的式(III)蛋白是这样一些蛋白，其中：

位置97的组氨酸被丝氨酸或脯氨酸替换；

位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸替换；

位置101的丙氨酸被苏氨酸替换；或

位置138的色氨酸是甘氨酸。

本发明其他优选的蛋白包括SEQ ID NO：3的蛋白，其中位置97、100、101、105、106、107、108、111位的氨基酸残基按下面表1替换：

表1

氨基酸位置蛋白 97 100 101 105 106 107 108 11l

1234567891011121314151617181920212223242526272829303132

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69707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899100101102103104

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GluAspAspGluAspAspGluGluGluGluGluAspGluGluGluGluGluAspGluGluGluGluAspGluGluGluAspGluGluAspGluAspGluAspGluGlu

GlyGlyAspGlyGlyGlyAspAspAspAspAspAspGlyAspAspAspAspAspGlyAspAspAspAspGlyAspAspAspGlyAspAspGlyAspGlyGlyAspAsp

249250251252253254255256257258

SerSerSerSerSerSerSerHisHisPro

GlnGlnGlnGlnGlnGlnGlnAlaLeuTrp

AlaThrThrThrThrThrThrAlaAlaAla

GlnGluGlnGlnGlnGlnGlnGluGluGlu

LysLysThrLysLysLysLysThrThrThr

ProProProLeuProProProLeuLeuLeu

GluGluGluGluAspGluGluAspAspAsp

AspAspAspAspAspGlyAspGlyGlyGly

最优选的式(III)和表1的序列种类包括SEQ ID NO：4-11的序列种类：

(SEQ ID NO：4)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Ala Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro145Gly Cys

(SEQ ID NO：5)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

(SEQ ID NO：6)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Gln Gln Leu Asp Leu Ser Pro145Gly Cys

(SEQ ID NO：7)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Ash Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

(SEQ ID NO：8)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Ala Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Ala Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

(SEQ ID NO：9)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

50 55 60Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile65 70 75 80Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser Ash Asp Leu

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Ala Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

(SEQ ID NO：10)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

(SEQ ID NO：11)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110Ser Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

本发明提供可有效治疗肥胖的生物活性蛋白。出人意料的是，由于对人肥胖蛋白作了特异性替换，使申请保护的蛋白的性质得以改进。它们比小鼠和人的肥胖蛋白更稳定，因此是优良的治疗药物。

该申请保护的蛋白一般地由重组技术制备。有关已知序列的DNA定点置换突变技术是众所周知的，例如M13引物诱变。编码本文的抗肥胖蛋白的DNA中可能发生的突变必须不能将序列置于阅读框架之外，并且优选不产生可形成mRNA二级结构的互补区。见DeBoer et al EP 75，444A(1983)。

本发明的化合物可通过重组DNA技术或众所周知的化学法制备，如溶液或固相肽合成法，或在溶液中进行以蛋白片段起始的半合成法，所述蛋白片段是通过常规的溶液法偶联的。

A固相

本发明的蛋白可通过固相肽合成法或重组法制备。多肽固相肽合成法是本领域中熟知的方法。其一般方法可在Dugas，H.and Penney，C.，Bioorganic Chemistry Springer-Vetlag，New York，pgs.54-92(1981)中找到。例如可用PE-Applied Biosystems 443A肽合成仪固相合成这些肽(购自Applied Biosystems，Foster City California)并可使用他们提供的循环合成仪合成。Boc氨基酸和其它试剂也可以从那里以及其他化学试剂商店买到。应用双偶联技术化学合成Boc序列使对甲基二苯甲基胺树脂初始化以生产C末端甲酰胺。制备C末端氨基酸要用到PAM树脂。精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸和甲硫氨酸用事先制备好的羟基苯并三唑酯进行偶联。可用下列侧链保护。

精氨酸，甲苯磺酰基

天冬氨酸，环己基或苄基

半胱氨酸， 4-甲基苄基

谷氨酸，环己基

组氨酸，苄氧甲基

赖氨酸， 2-氯苄氧羰基

甲硫氨酸，亚砜

丝氨酸，苄基

苏氨酸，苄基

色氨酸，甲酰基

酪氨酸， 4-溴苄酯基

可用二氯甲烷中的三氟醋酸(TFA)使Boc脱保护。在4℃下用在二甲基甲酰胺中浓度为20％的哌啶处理肽基树脂60分钟，除去色氨酸的甲酰基。甲硫氨酸可用TFA/二甲亚砜/conHCl处理树脂25℃下60分钟进行还原(95/5/1)。用含有10％间甲苯酚或间甲苯酚/10％对硫代甲苯酚或间甲苯酚/对硫代甲苯酚/二甲硫醚的混合物的无水氟化氢将肽脱保护并裂解下来。从树脂上裂解侧链保护基和肽要在摄氏零度或以下进行，优选在-20℃下进行30分钟，然后在0℃下30分钟。除去FH后，肽/树脂用乙醚洗脱，用冰醋酸抽提肽并冻干。纯化由C18反相层析柱(Vydac)完成，TFA＝0.1％，乙腈浓度梯度递增。

专业人员知道固相合成也可用FMOC方法和TFA/清除剂裂解混合物来完成。

B重组子合成法

本发明蛋白也可用重组子法制备。若所需得到高产率，推荐使用重组子法。重组子法生产蛋白的基本步骤包括：

a)构建编码本发明蛋白的合成的或半合成的(或从天然来源分离到的)DNA；

b)将编码序列以适合此蛋白单独表达或以融合蛋白表达的方式整合进表达载体；

c)用表达载体转化适当的真核或原核宿主细胞；

d)回收和纯化重组产生的蛋白。

a.基因的构建

合成的基因，其体外或体内转录和翻译将产生蛋白，可以用本领域熟知的技术合成。由于遗传密码的简并性，专业人员知道有相当数目的DNA序列可合成本发明的蛋白。在本发明的优选实践中，合成是用重组DNA技术完成的。

基因构建体的合成方法是众所周知的。例如Brown，et al.，(1979)酶学方法，Academic Press，N.Y.，Vol.68，pgs.109-151中给出的方法。本发明的蛋白的DNA序列可用常规DNA合成仪产生，例如Applied Biosystems 380A型或380B型DNA合成仪(购自Applied Biosystems，Inc.，850 LincolnCenter Drive，Foster City，CA 94404)

优选对编码本发明蛋白的编码序列进行一些修饰，以便将常用的蛋白酶敏感切割部位掺入到序列中信号肽与结构蛋白之间的部位，以便于控制将信号肽从融合蛋白构建体中切除。

编码本发明蛋白的基因也可由聚合酶链式反应(PCR)完成。模板可用从人脂肪组织提取的mRNA或cDNA文库(购自CLONETECH或STRATAGENE)。这种方法是本领域所熟知的。见Maniatis，et al.，分子克隆实验指南，冷泉港出版社，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)

b.直接表达或融合蛋白

本发明蛋白可直接表达，也可作为包含本发明蛋白的融合蛋白进行表达，然后用酶促或化学法切割。有各种肽酶(如胰酶)将多肽在特定部位切开或在已知肽链的氨基端或羧基端(如二氨基肽酶)消化这些肽。而且，一些特殊化学物质(如溴化氰)可在特定部位切割肽。技术人员常愿意对氨基酸序列做必要的修饰(若是用重组子的话也对合成或半合成编码序列进行修饰)以便掺入位点特异性的内切位点。见例如Carter P.，融合蛋白的定点水解，《蛋白纯化：从分子机制到大规模方法》第13章，美国化学协会，Washington，D.C.(1990)。

c.载体构建

利用标准的连接技术构建含所需的编码序列和调控序列的适当载体。分离的质粒或DNA片段被切开、加尾并连接成所需的形式以构成需要的质粒。

用适当的DNA限制性内切酶将基因工程合成的DNA序列插入到众多的相应DNA重组表达载体中使所需的蛋白有效表达。合成的编码序列配制成在转录子的两端有限制性内切酶识别位点以便于从表达和扩增的质粒中分离和结合到这些质粒中。分离到的cDNA编码序列易于用合成接头修饰以便用众所周知的技术将此序列连到需要的克隆载体中。所用的特定内切酶可用亲本表达载体的限制性内切酶裂解图谱指示出来。对限制位点做出选择以便编码序列的取向适合于调控序列从而达到本发明蛋白的框内阅读和表达。

一般说来，质粒含有与其宿主细胞相一致的启动子和调控序列并应用于此类宿主细胞。这种载体通常载有复制位点和可供表型筛选转化细胞的标记序列。例如大肠杆菌常用pBR322转化，后者从大肠杆菌中得到(Bolivaret al.，Gene 2：95(1977))。质粒pBR322含有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，为鉴别转化细胞提供了方便。pBR322质粒或其他微生物质粒必须含有或加上通常重组技术所使用的启动子和其他调控序列。

所需要的编码序列以启动子和核糖体结合部位为起点相一致的方向插入到表达载体中而启动子和核糖体应在表达所需蛋白的宿主细胞中具有功能。这种表达载体的一个例子是Belagaje et al.，美国专利5,304,493号中描述的质粒，在此引入作为参考。美国专利5304493号中描述的A-C-B胰岛素原的基因用限制酶NdelI和BamHI从质粒pBR182中除去。本发明的蛋白基因可插入到这个质粒的NdeI/BamHI限制酶切点。

d.在原核细胞中表达

一般说来，原核细胞用于克隆DNA序列，构建对本发明有用的载体。例如大肠杆菌K12菌株294(ATCC No 31446)就特别有用。其他可用的微生物菌株有大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC No 31537)。这些例子用作解释而不是做限制。

原核细胞也用于表达。可利用的菌株除上述菌株外还有大肠杆菌W3110(原养菌，ATCC No.27325)，芽胞杆菌，如枯草芽胞杆菌，其它肠道菌属如鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌和各种假单胞菌。适合于原核宿主细胞的启动子包括β-内酰胺酶(载体Pgx2907[ATCC 39344]含有复制子和β-内酰胺酶基因)和乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature，275：615(1978)；and Goeddel et al.，Nature 281：544(1979))，碱性磷酸脂酶，色氨酸(trp)启动子系统(载体pATH1[ATCC 37695]配制用于在色氨酸启动子控制下表达trpE融合蛋白开放阅读框架)和杂合启动子如TAC启动子(从质粒pDR540 ATCC-37282分)。然而，其它已知序列的有功能的细菌启动子可被专业人员用DNA接头或连接子将本发明蛋白基因连接到任何限制酶切点处。细菌系统中的SD序列也可用人工方法连接到编码这种蛋白的DNA上。

e.在真核细胞中表达

这种蛋白可用重组法在真核表达系统中生产。优先选用的哺乳动物宿主细胞中控制转录的启动子可有各种来源，例如病毒基因组如：多瘤病毒，猴病毒(SV40)，腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、优选用的是巨细胞病毒，或用异源哺乳动物启动子，如β-肌动蛋白启动子。SV40早期或后期启动子也可通过限制酶解方便地获得，其中含有SV40病毒的复制起点。Fiers，et al.，Nature，273：113(1978)整个SV40基因组可从质粒pBRSV，ATCC45019得到。靠近早期的人巨细胞病毒启动子从质粒pCMBβATCC77177)得到。当然，从这种宿主细胞或相关细胞得到的启动子也可用于此目的。

在载体中插入增强子序列可增加编码本发明蛋白的DNA在高等真核生物的转录。增强子是DNA顺式效应因子，通常在10-300bp之间。它作用于启动子使其转录增加。增强子的取向和位置都是独立的。在转录单位的5’端(Laimins，L.et al.，PNAS 78：993(1981))和3’端(Lusky，M.L.，at al.，Mol.Cell Biol.3：1108(1983))，在内含子中(Banerji，J.L.et al.，Cell 33：729(1983))以及在编码序列中(Osborne，T.F.，et al，Mol.Cell Bio.4：1293(1984))都发现过增强子。现已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白，RSV，SV40，EMC，弹性蛋白酶，白蛋白，a-甲胎蛋白和胰岛素)。然而，典型应用还是用真核细胞病毒的增强子。例如SV40后期增强子，巨细胞病毒早期增强子，后期复制起点的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其它多细胞组织的有核细胞)的表达载体也包含转录终止所必须的序列，它可能影响mRNA的表达。这些区段被转录成编码蛋白的mRNA中非翻译区的多聚腺苷酸片段。此3’非翻译区还包括转录终止部位。

表达载体可含有筛选基因，亦称筛选标记。适合做哺乳动物筛选标记的例子有二氢叶酸还原酶(DHFR，可从pJOD-10[ATCC68815]，BglII/HindIII限制性内切片段中获得)，腺苷激酶(单纯疱疹病毒腺苷激酶，位于vP-5克隆[ATCC2028]的BamHI片段中)或新霉素(G418)抗性基因(从pNN414酵母人工染色体载体[ATCC37682]得到)。这类筛选标记成功转化进入哺乳动物宿主细胞后，被转化宿主细胞就能在选择压力下生存。广泛采用的有两套截然不同的筛选体系。一套基于细胞代谢原理并用突变细胞株，这种突变株在没有补充营养的培养基中不能生长。有两个例子即CHO DHFR缺陷型细胞(ATCCCRL-9096)和小鼠LTK缺陷型细胞(L-M(TK-)ATCC CCL-2。3)。这些细胞在没有添加营养成分胸腺嘧啶核苷和次黄嘌呤核苷时不能生长。由于这种细胞缺乏完整核苷代谢途径中的某些基因，它们只能在有这些核苷的补充培养基中存活。另一种代替这种培养基的方法是将完整的DHFR或TK基因引入缺乏相应基因的细胞，由此改变它们的生长需要。没有受到转化的细胞则不能在非补充培养基中生长。

第二套筛选体系是显性性状筛选体系，可用于任何细胞并且不要求使用突变细株。这些细胞有一种特殊的基因，可表达执行药物抗性的蛋白，从而可在筛选中存活。这种显性性状筛选的例子有新霉素，Southern P.andBerg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982)，霉酚酸，Mulligan，R.C.andBerg，P.Science 209：1422(1980)，或潮霉素，Sugden，B.et al.，Mol Cell.Biol5：410-413(1985)。上述化合物是细菌基因在真核调控下执行对相应药物即G418，新霉素(遗传霉素)，xgpt(霉酚酸)，或潮霉素的抗性的三个示例。

真核表达的优选载体是pRc/CMV。pRc/CMV的购自InvitrogenCoroiration，3985 Sorrento Valley Blvd.，San Diego，CA 92121。为了肯定构建的质粒中的序列是正确的，将连接混合物转化大肠杆菌K12菌株DH5a(ATCC31446)并用适当的抗菌素抗性筛选转化子。制备转化子质粒并用限制酶法和/或Messing等人的方法进行分析(Nucleic Acids Res.9：309(1981)。

宿主细胞用本发明中的表达载体转化并在适合于诱导启动子，筛选转化子或扩增基因的常用营养培养基中培养。培养条件如温度，PH等与培养宿主细胞的条件相同并对技术人员来说都是常见的。用上述载体转化细胞的技术是众所周知的并且可在一般参考书和一些补充刊物中找到如Maniatis，et al.，分子克隆实验指南，冷泉港出版社，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)，当代分子生物学方案(1989)。

优选的适合在真核细胞中表达的本发明蛋白载体的宿主细胞包括：SV40转化的非洲绿猴肾细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；转化的人原胚肾细胞系293，(Graham，F.L.et al.，J.Gen Virol.36：59-72(1977)，Virology77：319-329，Virology 86：10-21)；幼龄仓鼠肾细胞(BHK-21(C-13)，ATCCCCL-10，Virology 16：147(1962))；中国仓鼠卵巢细胞CHO-DHFR-(ATCCCRL-9096)，小鼠Sertoli细胞(TM4，ATCC CRL-1715，Biol Reprod23：243-250(1980))；非洲绿猴肾细胞(VERO 76，ATCC CRL-1587)；人子宫颈上皮癌细胞(Hela，ATCC-2)；狗肾细胞(MDCK，ATCC CCL-34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL-1442)；人二倍体肺细胞(WI-38，ATCCCCL-75；人肝细胞癌细胞(Hep G2，ATCC HB-8065)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562，ATCC CCL51)。

f.在酵母中表达

除原核细胞外也可用真核微生物如酵母培养。啤酒酵母是最常用的真核微生物，虽然许多其它菌株也是常用的。在啤酒酵母中表达常用质粒YRp7，(ATCC-40053，Stinchcomb，et al.，Nature 282：39(1979)；Kingsmanet al.，Gene 7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene 10：157(1980))此质粒含有色氨酸基因，后者可为不能在色氨酸中生长的酵母突变株例如ATCCno.44076或PEP4-1提供筛选标记(Jones，Genetics 85：12(1977))。

适合用作酵母宿主细胞的启动序列有下列各种酶的启动子：3-磷酸甘油酸激酶(在质粒pAP12BD ATCC 53231中发现，在1990年6月19日美国专利4,935,350号中有描述)或其它糖酵解途径的酶，如烯醇化酶(在质粒pAC1 ATCC 39532中发现)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(从质粒PHcGAPC1 ATCC 57090，57091衍生而来)，运动发酵单胞菌(1991年3月19日公开的美国专利5,000,000号)，已糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶。

其他酵母启动子是下列酶的启动子区域：乙醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，金属硫蛋白(得自质粒载体pCL28XhoLHBPV ATCC 39475，美国专利4,840,896号)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及与麦芽糖和乳糖利用有关的酶(GAL1在质粒pRY121ATCC 37658中发现)，所述启动子是具有由生长条件控制的转录这一优点的可诱导启动子。适合在酵母中表达的载体和启动子在R.Hitzeman et al.，European Patent Publication No.73,657A中有进一步描述。酵母增强子如啤酒酵母的UAS Gal(与质粒YEpsec-hIlbeta ATCC 67024中的CYC启动子相结合)也特别适合与酵母启动子一起使用。

下面以实施例进一步阐明本发明的蛋白的制备。本发明范围不被下述实施例所限制。

实施例1

载体的构建

SEQ ID NO：12基因由一220bp的片段和一240bp片段装配而成。这两个片段由寡核苷酸化学合成得到。

(SEQ ID NO：12)1 CATATGAGGG TACCTATCCA AAAAGTACAA GATGACACCA AAACACTGAT51 AAAGACAATA GTCACAAGGA TAAATGATAT CTCACACACA CAGTCAGTCT101 CATCTAAACA GAAAGTCACA GGCTTGGACT TCATACCTGG GCTGCACCCC151 ATACTGACAT TGTCTAAAAT GGACCAGACA CTGGCAGTCT ATCAACAGAT201 CTTAACAAGT ATGCCTTCTA GAAACGTGAT ACAAATATCT AACGACCTGG251 AGAACCTGCG GGATCTGCTG CACGTGCTGG CCTTCTCTAA AAGTTGCCAC301 TTGCCATGGG CCAGTGGCCT GGAGACATTG GACAGTCTGG GGGGAGTCCT351 GGAAGCCTCA GGCTATTCTA CAGAGGTGGT GGCCCTGAGC AGGCTGCAGG401 GGTCTCTGCA AGACATGCTG TGGCAGCTGG ACCTGAGCCC CGGGTGCTAA451 TAGGATCC

220碱基对的片段从NdeI到220的XbaI是由7个相互交叠的长度在34～83个碱基之间的寡聚合苷酸组成。240碱基对的片段从XbaI到BamHI也是由7个长度为57～92个碱基的寡聚合苷酸交叠而成。

为装配这些片段，7个寡聚合苷酸等克分子量混合，通常浓度为每微米1～2个pmol浓度。组合前，几乎所有的寡聚合苷酸片段的5’端都在标准激酶缓冲液的条件下由T4 DNA激酶磷酸化，使用的条件由试剂供货商给定。混合物加热到95度然后慢慢冷却到室温持续1～2小时以保证寡核苷酸退火。然后用T4 DNA连接酶将寡核苷酸相互连接并克隆到适当载体如pUC18和pUC19中。缓冲液和连接条件由酶的供货商提供。用于连接220碱基对片段的载体事先用NdeI和XbaI酶解，而用于240碱基对片段的载体用XbaI和BanmHI酶解。用连接混合物转化大肠杆菌DH10B细胞(购自Gibco/BRL)并接种到含100g/ml氨苄青霉素，X-gal和IPTG的蛋白胨-酵母膏(TY)平板中。克隆菌落培养过夜后再培养在100μg/ml氨苄青霉素的TY液体培养基中用于分离质粒和DNA测序。载有目的序列的质粒包括了组合起来即为完整的基因。组合过程是：纯化220碱基对片段和240碱基对片段并连接这两个片段到表达载体中如pRB182其中的A-B-C胰岛素原的编码序列已被除去并在使用前用NdeI和BamHI酶解开。

实施例2

含有编码所需蛋白DNA序列的质粒用PmlI和Bsu36I酶解。这些酶的识别序列分别在编码区内第275和360核苷酸处。克隆的载体不含这些识别序列。结果只有两个片段出现在PmlI和Bsu36I酶解物中，一个是载体片段，另一个相当于此蛋白编码序列中的～85碱基对片段。这段序列可由编码表1中任何氨基酸替换序列的DNA序列来替换。将这些DNA序列用化学合成法合成为两个有互补碱基对的寡核苷酸序列并带有PmlI和Bsu36I的酶解末端。化学合成的寡核苷酸按等分子量混合(1-10pmol/ml)，加热到95度后缓慢降温到20-25度使之退火。对退火的寡核苷酸进行标准连接。用连接产物转化并分析如表1所示。

实施例3

使用实施例2给出的质粒和方法得到表1中第255号蛋白，它具有甲硫氨酸精氨酸前导序列。此质粒用PmlI和Bsu36I酶解。再将合成DNA片段5’序列SEQ ID NO：13与5’序列SEQ ID NO：14退火。连接之后，转化并分离质粒，通过DNA序列分析鉴定合成的序列。

(SEQ ID NO：13)

GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCAGCTTGCCACAGACCAGTGGCCTGCAGAAACCGGAAA

GTCTGGACGGAGTCCTGGAAGCC

(SEQ ID NO：14)

TGAGGCTTCCAGGACTCCGTCCAGACTTTCCGGTTTCTGCAGGCCACTGGTCTGTGGCAAG

CTGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC

实施例4

用实施例2给出的质粒和方法得到具有甲硫氨酸精氨酸前导序列的DNA编码序列SEQ ID NO：4。此质粒用PmlI和Bsu36I酶解。合成的DNA片段5’序列SEQ ID NO：15与5’序列SEQ ID NO：16退火，然后插入到PmlI和Bsu36I之间。连接后转化并进行质粒分离。通过DNA序列分析鉴定合成的片段序列。

(SEQ ID NO：15)

GTGCTGGCCTTCTCTAAAAGTTGCCACTTGCCAGCTGCCAGTGGCCTGGAGACATTGGACA

GTCTGGGGGGAGTCCTGGAAGCC

(SEQ ID NO：16)

TGAGGCTTCCAGGACTCCCCCCAGACTGTCCAATGTCTCCAGGCCACTGGCAGCTGGCAAG

TGGCAACTTTTAGAGAAGGCCAGCAC

前述载体转化细胞的技术是本领域熟知的并可在一般参考书和一些补充刊物中找到如Maniatis，et al.，分子克隆实验指南，冷泉港出版社，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)，当代分子生物学方法(1989)。本发明实施例中推荐的转化E.coli细胞的技术也是本领域所熟知的，培养转化的E.coli细胞的确切条件取决于E.coli宿主细胞株的自然性质和所用载体的克隆和表达情况。例如，结合有热诱导启动子-操纵子区的载体，如c1857热诱导λ噬菌体启动子-操纵子区，需要在培养时将温度从30度升高到40度。以便诱导蛋白合成。

本发明推荐使用的宿主细胞是大肠杆菌K12 RV308细胞，但也可使用其他细胞如大肠杆菌K12 L201，L687，L693，L507，L640，L641，L695，L814(大肠杆菌B)并不限于这些细胞。然后将转化的宿主细胞平铺在与表达质粒中抗性基因相对应的抗菌素选择压力培养基上。在与宿主细胞系相适应的温度下培养一段时间。

在高水平的细菌表达系统中表达的蛋白聚积成颗粒或在包含体中积累，后者含有高水平表达过量的蛋白。Kreuger et al.，蛋白折叠，Gieraschand King编，pgs 136-142(1990)，American Association for the Advancementof Science Publication No.89_18S，Washington，D.C.这种蛋白聚集必须溶解开以便进一步纯化和分离所所需的蛋白产品。溶解蛋白可采用各种技术，包括强变性溶液如盐酸胍和/或弱变性溶液如尿素。然后逐步除去溶液中的变性试剂(常用透析法)使蛋白恢复其天然形式。变性和折叠的条件由特定的蛋白表达系统和/或蛋白本身决定。

实施例5

实施例3中具有甲硫氨酸精氨酸前导序列的蛋白在E.coli中表达、分离并以折叠形式溶解于PBS或8M尿素中(两种溶液都含5mM半胱氨酸)并在PBS中彻底透析。在这两种情况下几乎没有蛋白聚集现象。蛋白最后纯化用排阻层析法，蛋白被浓缩成3-3.5mg/mlPBS。此蛋白没有聚集现象发生而天然人类蛋白在浓缩时可见到大量聚集现象。

反相HPLC蛋白分析表明人Ob蛋白用56.6％的乙腈洗脱下来，小鼠的蛋白在55.8％时洗脱下来，而本发明的带有甲硫氨酸精氨酸前导肽蛋白在53.7％时洗脱下来。因此，有小鼠蛋白插入的人蛋白表现出比人和小鼠的蛋白有更高的亲水性。

实施例6

有甲硫氨酸精氨酸前导肽的SEQ ID NO：4蛋白在大肠杆菌中表达。分离蛋白颗粒并溶于有5mM半胱氨酸的8M尿素中。用阴离子交换层析纯化蛋白并以折叠形式溶于8M尿素中(含5mM半胱氨酸)，再用PBS彻底透析。蛋白溶液pH降到2.8。每毫克蛋白加入6-10毫单位的dDAP是使甲硫氨酸精氨酸前导序列裂解下来。此转换反应在室温进行2-8小时。反应过程在高效反相层析法监控下进行。用氢氧化钠调pH到8终止反应。脱甲硫氨酸精氨酸蛋白进一步由7-8M尿素阳离子交换层析纯化经排层析后溶于PBS。最后用排阻层析法纯化蛋白，溶于3-3.5mg/ml PBS中。实际上没有发现有蛋白聚集。

本发明蛋白的表达优选有前导序列。装配前导序列是一项常规技术。然而，推荐使用的前导序列是甲硫氨酸-R1，此处R1是除脯氨酸外的任何一中氨基酸。这样所表达的蛋白易于被组织蛋白酶C转换成本发明的蛋白。R1优选精氨酸、天冬氨酸或酪氨酸；最优选有甲硫氨酸-精氨酸前导序列的蛋白的表达。有趣的是，前导序列并不明显影响蛋白的稳定性和活性。然而，在应用此蛋白前，优选将前导序列从此蛋白中除去。因此，具有式：甲硫氨酸-R1-SEQ ID NO：1的蛋白是很有用的生物药，特别适合作为药物中间体。

纯化此蛋白的技术是众所周知的。其中包括反相层析，亲和层析，离子交换和体积排阻层析。

本发明蛋白含有两个半胱氨酸残基。因此，可形成二硫键稳定蛋白。本发明包括式(I)或(II)，其中96位的半胱氨酸与146位半胱氨酸交联还有一些没有此二硫键的蛋白。除本发明的蛋白外，还有二聚体、三聚体、四聚体、多聚体。这些多聚体亦在本发明范围内。

本发明提供治疗肥胖的方法。这种方法包括给生物体每公斤体重施用1到1000微克的抗肥胖蛋白药物。推荐的用药剂量是每公斤体重10-100微克活性化合物。典型成人日用剂量是0.5-100毫克。在实际用药时式(I)的蛋白药物可日服一次或数次。治疗方案可能需要在较长时间内施用。每次服用量或总服用量由医生决定并取决于身体状况和疾病的严重程度、年龄、病人一般健康情况和病人对此药物的耐受能力。

本发明进一步提供了由本发明蛋白成分构成的药物制剂。这种蛋白优选以药用盐的形式存在，也可以在治疗和预防肥胖时不经肠胃给药。例如，式(I)的药物可与常规的药物载体和赋形剂混合使用。其组成含量可从活性蛋白占重量的0.1％到90％，并优选是可溶性形式。更常用范围是10到30％。而且，本发明蛋白可单独施用或与其它抗肥胖药物或有效试剂结合施用。

作为静脉给药的蛋白通常用静脉输液通过输注方式给药。这种输液可以是生理盐水、Ringer’s液或5％葡萄糖。

作肌内注射用时，要用无菌制剂。优选用合适的式(I)或(II)的蛋白的可溶性盐，例如盐酸盐，它可溶解于药用稀释剂如无热源水(蒸馏水)、生理盐水或5％葡萄糖溶液并通过这些溶液给药。这种药物的不溶形式，可制成水基或药用油基(例如长链脂肪酸如乙基油酸)悬浮液的形式给药。

本发明药物治疗肥胖的效果可由下述体内实验证实。

生物检测

联体实验提示周边脂肪组织释放蛋白而且被释放的蛋白能够控制正常情况的身体增重从而控制肥胖小鼠。而且，最直接的生物实验是通过几种途径给药(如静脉注射、皮下、腹膜内，微量泵和插管)然后检测各时期的食物和水的消耗，身体增重情况，血浆化学或激素情况(葡萄糖、胰岛素、ACTH、皮质酮、GH、T4)。

适合的实验动物是正常小鼠(ICR等)和肥胖小鼠(ob/ob，Avy/a，KK-Ay，tubby，fat)。糖尿病和肥胖ob/ob小鼠模型在此研究领域中通常当做肥胖的指标。实验的对照组用有或无类似成分药物的载体给同样的动物并检测同种参数或只将药物本身(不加其它成分)给缺乏受体的动物(db/db小鼠，fa/fa或cp/cp大鼠)。在这些动物中显示的蛋白活性将证实其在其它动物中的类似活性特别是人。

由于认为受试组织应该是调节进食和生脂代谢的下丘脑。一种类似的实验模型是直接注射受试药物给大脑(即给侧脑室或第三脑室做颈内注射或直接注射进入特定的下丘脑核(即周边穹窿核))然后测定上述参数或监测调节进食或代谢的神经递质(即NPY，甘丙肽，去甲肾上腺素，多巴胺，β-内啡肽的释放)。

表2例举的有代表性的蛋白是按照上述实施例的技术制备的。表2和表3描述的蛋白显示了具有式(I)的SEQ IN NO：3的氨基酸替换。例如，Ala(100)表示蛋白SEQ ID NO：3的100位色氨酸被丙氨酸替换。MetArg-表示这个蛋白在制备和检测时带有甲硫氨酸精氨酸前导序列。表2和表3的蛋白由质谱仪和/或氨基酸分析仪确定。本发明蛋白对ob/ob小鼠的肥胖治疗作用也在表2给出。

表2：蛋白制备和检测
表2：蛋白制备和检测													剂量		食物摄入克/小鼠			食物摄入对照百分数			从0时起的体重改变
蛋白	(μg)	途径	第1天	第2天	第3天	第1天	第2天	第3天	BWΔ1	BWΔ2	BWΔ3		剂量		食物摄入克/小鼠			食物摄入对照百分数			从0时起的体重改变
蛋白	(μg)	途径	第1天	第2天	第3天	第1天	第2天	第3天	BWΔ1	BWΔ2	BWΔ3	Met-Arg-(Gln138)	300	SC	3.9	2.6	2.3	75.0	50.0	44.2		-1.1	-1.9	-2.7
	30	SC	4.8	4.3	3.6	92.3	82.7	69.2	-0.5	-0.8	-0.8	Met-Arg-(Gln138)	300	SC	3.9	2.6	2.3	75.0	50.0	44.2		-1.1	-1.9	-2.7
	30	SC	4.8	4.3	3.6	92.3	82.7	69.2	-0.5	-0.8	-0.8	Met-Arg-(Gln100)	300	SC	4.1	3.6	2.6	61.2	53.7	38.8		-0.1	-1.1	-1.6
	30	SC	4.8	4.5	3.7	71.6	67.2	55.2	-0.5	-0.8	-1.0	Met-Arg-(Gln100)	300	SC	4.1	3.6	2.6	61.2	53.7	38.8		-0.1	-1.1	-1.6
	30	SC	4.8	4.5	3.7	71.6	67.2	55.2	-0.5	-0.8	-1.0	Met-Arg-(Gln108)	300	SC	2.5	1.9	1.1	59.5	45.2	26.2		-0.5	-1.7	-3.1
	30	SC	3.7	3.1	2.8	88.1	73.8	66.7	-0.6	-1.0	-1.3	Met-Arg-(Gln108)	300	SC	2.5	1.9	1.1	59.5	45.2	26.2		-0.5	-1.7	-3.1
	30	SC	3.7	3.1	2.8	88.1	73.8	66.7	-0.6	-1.0	-1.3	(Ala27，Gln100)	300	SC	3.7	2.4	1.8	52.9	34.3	25.7		-0.7	-1.5	-2.7
	30	SC	4.3	4.1	3.3	61.4	58.6	47.1	-0.6	-0.6	-1.0	(Ala27，Gln100)	300	SC	3.7	2.4	1.8	52.9	34.3	25.7		-0.7	-1.5	-2.7
	30	SC	4.3	4.1	3.3	61.4	58.6	47.1	-0.6	-0.6	-1.0	(Leu100)	300	SC	4.2	3.4	3.1	79.2	64.2	58.5		-0.7	-1.1	-0.9
	30	SC	4.0	3.5	3.6	75.5	66.0	67.9	0.1	-0.2	0.0	(Leu100)	300	SC	4.2	3.4	3.1	79.2	64.2	58.5		-0.7	-1.1	-0.9
	30	SC	4.0	3.5	3.6	75.5	66.0	67.9	0.1	-0.2	0.0	(Ala27，Leu100L)	300	SC	4.3	3.4	2.7	81.1	64.2	50.9		-0.7	-1.1	-1.4
	30	SC	4.3	3.5	3.9	81.1	66.0	73.6	-0.8	-1.3	-1.1	(Ala27，Leu100L)	300	SC	4.3	3.4	2.7	81.1	64.2	50.9		-0.7	-1.1	-1.4
	30	SC	4.3	3.5	3.9	81.1	66.0	73.6	-0.8	-1.3	-1.1	(Ala27，Gln100)	300	SC	3.9	3.6	2.6	76.5	70.6	51.0		-0.3	-0.3	-0.6
	30	SC	3.7	3.7	3.5	72.5	72.5	68.6	-0.4	0.2	-0.1	(Ala27，Gln100)	300	SC	3.9	3.6	2.6	76.5	70.6	51.0		-0.3	-0.3	-0.6
	30	SC	3.7	3.7	3.5	72.5	72.5	68.6	-0.4	0.2	-0.1	(Gln100)	300	SC	2.9	2.6	2.0	56.9	51.0	39.2		-0.7	-0.8	-1.3
	30	SC	4.7	4.7	4.3	92.2	92 2	84.3	-0.5	-0.2	-0.4	(Gln100)	300	SC	2.9	2.6	2.0	56.9	51.0	39.2		-0.7	-0.8	-1.3
	30	SC	4.7	4.7	4.3	92.2	92 2	84.3	-0.5	-0.2	-0.4	Met-Arg-(Gln100，	300	SC	3.3	2.1	1.6	70.2	44.7	34.0		-1.1	-1.9	-2.8
Gln138)	30	SC	3.8	3.5	2.5	80.9	74.5	53.2	-0.7	-1.0	-1.8	Met-Arg-(Gln100，	300	SC	3.3	2.1	1.6	70.2	44.7	34.0		-1.1	-1.9	-2.8
Gln138)	30	SC	3.8	3.5	2.5	80.9	74.5	53.2	-0.7	-1.0	-1.8	Met-Arg-(Ser97，Gln100，	0	SC	4.6	5.4	5.1
Thr101，G1n105，Lys106，	300	SC	4.1	3.5	2.9	89.1	64.8	56.9	-0.7	-1.4	-2.0	Met-Arg-(Ser97，Gln100，	0	SC	4.6	5.4	5.1
Thr101，G1n105，Lys106，	300	SC	4.1	3.5	2.9	89.1	64.8	56.9	-0.7	-1.4	-2.0	Pro107，Glu108，Asp111)	30	SC	4.2	4.3	3.8	91.3	79.6	74.5		-0.7	-0.6	-0.8
(Ser97，Gln100，Thr101，	0	SC	5.9	5.4	5.5							Pro107，Glu108，Asp111)	30	SC	4.2	4.3	3.8	91.3	79.6	74.5		-0.7	-0.6	-0.8
(Ser97，Gln100，Thr101，	0	SC	5.9	5.4	5.5							Gln105，Lys106，Pro107，	300	SC	4.1	3.2	2.3	69.5	54.2	39.0		-0.7	-1.0	-1.6
Glu108，Asp111)	30	SC	5.0	3.9	3.8	84.7	66.1	64.4	-0.5	-0.6	-0.3	Gln105，Lys106，Pro107，	300	SC	4.1	3.2	2.3	69.5	54.2	39.0		-0.7	-1.0	-1.6
Glu108，Asp111)	30	SC	5.0	3.9	3.8	84.7	66.1	64.4	-0.5	-0.6	-0.3	Met-Arg-( Ser97，Gln100，	300	SC	4.7	3.5	2.9	61.8	46.1	38.2		-0.2	-1.1	-1.8
Thr101)	30	SC	5.7	5.1	4.3	75.0	67.1	56.6	-0.1	-0.3	-0.3	Met-Arg-( Ser97，Gln100，	300	SC	4.7	3.5	2.9	61.8	46.1	38.2		-0.2	-1.1	-1.8
Thr101)	30	SC	5.7	5.1	4.3	75.0	67.1	56.6	-0.1	-0.3	-0.3

	剂量		食物摄入克/小鼠			食物摄入对照百分数			从0时起的体重改变
	剂量		食物摄入克/小鼠			食物摄入对照百分数			从0时起的体重改变				蛋白	(μg)	途径	第1天	第2天	第3天	第1天	第2天	第3天	BWΔ1	BWΔ2	BWΔ3
Met-Arg-(Lys106，	300	SC	5.0	4.0	4.0	65.8	52.6	52.6		0.2	-0.2	-0.9	蛋白	(μg)	途径	第1天	第2天	第3天	第1天	第2天	第3天	BWΔ1	BWΔ2	BWΔ3
Met-Arg-(Lys106，	300	SC	5.0	4.0	4.0	65.8	52.6	52.6		0.2	-0.2	-0.9	Pro107，Glu108，Asp111)	30	SC	5.4	5.4	5.1	71.1	71.1	67.1	-0.1	0.0	-0.3
(Ser97，Gln100)	300	SC	2.1	1.6	1.3	39.6	30.2	24.5		-1.0	-2.0	-2.7	Pro107，Glu108，Asp111)	30	SC	5.4	5.4	5.1	71.1	71.1	67.1	-0.1	0.0	-0.3
(Ser97，Gln100)	300	SC	2.1	1.6	1.3	39.6	30.2	24.5		-1.0	-2.0	-2.7		30	SC	3.7	3.3	2.9	69.8	62.3	54.7	-0.5	-0.7	-1.1
(Ser97)	300	SC	3.4	2.8	2.6	64.2	52.8	49.1		-0.6	-1.4	-1.4		30	SC	3.7	3.3	2.9	69.8	62.3	54.7	-0.5	-0.7	-1.1
(Ser97)	300	SC	3.4	2.8	2.6	64.2	52.8	49.1		-0.6	-1.4	-1.4		30	SC	3.5	3.4	2.8	66.0	64.2	52.8	-0.7	-1.2	-1.7
Met-Arg-(Ala100)	300	SC	4.1	3.1	2.4	78.8	59.6	46.2		-0.7	-1.1	-1.7		30	SC	3.5	3.4	2.8	66.0	64.2	52.8	-0.7	-1.2	-1.7
Met-Arg-(Ala100)	300	SC	4.1	3.1	2.4	78.8	59.6	46.2		-0.7	-1.1	-1.7		30	SC	3.7	3.4	3.9	71.2	65.4	75.0	-0 1	-0.5	-0.5
Met-Arg-(Ser97)	300	SC	5.6	4.2	2.6	107.7	80.8	50.0		0.0	-0.5	-1.0		30	SC	3.7	3.4	3.9	71.2	65.4	75.0	-0 1	-0.5	-0.5
Met-Arg-(Ser97)	300	SC	5.6	4.2	2.6	107.7	80.8	50.0		0.0	-0.5	-1.0		30	SC	5.2	4.5	4.3	100.0	86.5	82.7	0.1	0.0	0.0
(Ser97，Gln100，Thr101)	300	SC	4.4	3.6	2.4	86.3	70.6	47.1		-0.6	-0.4	-1.4		30	SC	5.2	4.5	4.3	100.0	86.5	82.7	0.1	0.0	0.0
(Ser97，Gln100，Thr101)	300	SC	4.4	3.6	2.4	86.3	70.6	47.1		-0.6	-0.4	-1.4		30	SC	3.8	3.5	3.0	74.5	68.6	58.8	-0.3	-0.3	-0.6
(Ala100)	300	SC	4.5	3.2	2.3	70.3	50.0	35.9		-0.5	-1.1	-1.1		30	SC	3.8	3.5	3.0	74.5	68.6	58.8	-0.3	-0.3	-0.6
(Ala100)	300	SC	4.5	3.2	2.3	70.3	50.0	35.9		-0.5	-1.1	-1.1		100	SC	4.6	3.2	3.1	71.9	50.0	48.4	-0.6	-1.4	-1.4
	70	SC	5.6	5.0	4.6	87.5	78.1	71.9		-0.4	-0.8	-0.8		100	SC	4.6	3.2	3.1	71.9	50.0	48.4	-0.6	-1.4	-1.4

类似的体外研究用分离的下丘脑组织在灌注或组织浴系统中完成。在这种情况下，监测神经递质释放或电生理变化。

本发明的化合物的物理和化学性质如下所示：

振摇测试

起始液含有磷酸缓冲生理盐水中的Ob蛋白(Gibco BRL，Dulbecco’sPBS无磷酸钙或磷酸镁，购自Life Technologies，Inc，Grand Island，NY)。蛋白浓度通常由280nm吸收峰确定。还有一种替代方法是在1-厘米比色杯中测定0.5毫升浓度为1毫克/毫升的Ob蛋白的280nm理论吸收值。整个吸收峰区的确定是将25微升的样品上排阻层析(SEC)分析柱(Superdex-75，Pharmacia)，室温PBS中操作，检测214nm吸收值。这个吸收峰区再与第一次测定的280nm Ob蛋白完整ESC吸收峰值相比。经分析后，用PBS将各Ob蛋白稀释到终浓度约为1.6mg/ml。用微量稀醋酸或稀氢氧化钠分别调这些溶液的到pH5.0，pH6.0，pH7.0和pH8.0。调整pH后的溶液用紫外吸收或SEC技术做定量分析。

将Ob蛋白溶液加入到2毫升玻璃自动取样器小瓶中(Varian InstrumentGroup，Sinnyvale，CA产)，其中每个小瓶有15个直径为8分之1英寸的Teflon珠(Curtin Matheson Scientific，Florence，KY产)。轻轻振摇除去溶液中的气泡。小心填满小瓶后用Teflon封口并旋紧瓶盖。每次用于评估的振摇实验小瓶要相互分开。

测试小瓶放在精确设置温度为40℃的温箱的旋转装置上。按每分钟30转转动小瓶使Teflon珠完全在溶液中从上到下轻轻的运动。

在一定时间后，除去小瓶的中的珠粒然后在室温下离心5分钟(FisherScientific Model 345C型离心机)。上清液中的蛋白浓度再用紫外吸收或SEC法测定。溶液中存留的Ob蛋白量通过调整pH后的起始液中Ob蛋白浓度以及振摇测试后的上清液中的Ob蛋白浓度计算出。

本发明蛋白的化学和物理稳定性如表3所示。表3描述的蛋白显示了式(I)的蛋白SEQ ID NO：3中的氨基酸替换。例如，Ala(100)表示SEQ ID NO：3的蛋白中100位的色氨酸被丙氨酸替换。人Ob蛋白和小鼠ob蛋白也列出作为参考。

表3

蛋白	mg/mL	温度	rpm	pH	时间(小时)	残留百分数
蛋白	mg/mL	温度	rpm	pH	时间(小时)	残留百分数	人	1.6	40	30	5	7	44.7
5	47	36.6									5	7	44.7
5	47	36.6	6	7	63.4
6	47	56.9	6	7	63.4
6	47	56.9	7	7	98.6
7	47	93.7	7	7	98.6
7	47	93.7	8	7	99.9
8	47	95.9	8	7	99.9
8	47	95.9	小鼠	1.6	40	30					5	47	73.5
6	47	94.9									5	47	73.5
6	47	94.9					7	47	67.4
8	47	31.6					7	47	67.4
8	47	31.6					Ala100	1.6	40	30	5	47	98.4
6	47	98.0									5	47	98.4
6	47	98.0	7	47	95.5
8	47	94.2	7	47	95.5
8	47	94.2	Met-Arg-(Ser97)	1.6	40	30					5	47	26.4
6	47	38.9									5	47	26.4
6	47	38.9					7	47	55.0
8	47	63.3					7	47	55.0
8	47	63.3					Met-Arg(Gln100)	1.6	40	30	5	47	93.5
6	47	77.0									5	47	93.5
6	47	77.0	7	47	85.6
8	47	98.0	7	47	85.6
8	47	98.0	Met-Arg-(Ser97，Gln100)	1.6	40	30					5	47	87.9
6	47	91.8									5	47	87.9
6	47	91.8					7	47	94.6
8	47	93.3					7	47	94.6
8	47	93.3					Met-Arg-(Ser97，Gln100，Thr101)	1.6	40	30	5	47	93.8
6	47	96.5									5	47	93.8
6	47	96.5	7	47	96.5
8	47	99.8	7	47	96.5
8	47	99.8	Met-Arg-(Lys106，Pro107，Glu108，Asp111)	1.6	40	30					5	47	92.4
6	47	62.8									5	47	92.4
6	47	62.8					7	47	46.8
8	47	41.3					7	47	46.8
8	47	41.3					Met-Arg-(Ser97，Gln100，Thr101，Lys106，Pro107，Glu108，Asp111)	1.6	40	30	5	47	100.3
6	47	99.9									5	47	100.3
6	47	99.9	7	47	98.0
8	47	94.4	7	47	98.0

Met-Arg-(Ala100)	1.6	40	30	5	47	91.3
				5	47	91.3	6	47	92.3
				7	47	98.5	6	47	92.3
				7	47	98.5	8	47	100.3
				Met-Arg-(Leu100)	1.6	40	8	47	100.3	30	5	47	46.9
6	47	3 6.3									5	47	46.9
6	47	3 6.3	7				47	51.2
8	47	84.8	7				47	51.2

Met-Arg-(Pro97)	1.6	40	30	5	47	22.4
				5	47	22.4	6	47	33.8
				7	47	48.1	6	47	33.8
				7	47	48.1	8	47	54.8
				Met-Arg-(Ala27，Gln100)	1.6	40	8	47	54.8	30	5	47	93.8
6	47	87.2									5	47	93.8
6	47	87.2	7				47	96.7
8	47	98.0	7				47	96.7
8	47	98.0	Met-Arg-(Ala27，Leu100)				1.6	40	30		5	47	57.8
6	47	49.3									5	47	57.8
6	47	49.3		7	47	69.3
8	47	93.3		7	47	69.3

此化合物在至少上述一种生物实验中具有抗肥胖蛋白活性。因此，可用于治疗肥胖和由肥胖引起的失调症。然而，专业人士知道这种蛋白不仅可用于治疗也可用作诊断用抗体和作为动物的饲料添加剂。而且，这种蛋白可用来控制体重以达到哺乳动物美容之目的。通过控制体重达到美容目的是为了改进外观形象。哺乳动物不是不可避免地发胖。这种美容用途构成本发明的一部分。

本发明的原理、具体实施方案和操作方式已在前面说明书中描述。但是，本文中所要保护的发明不限于所公开的具体形式，因为这些具体形式是解释性的而不是限制性的。本领域技术人员在不背离本发明实质的条件下，可作出一些变化和修改。

Claims

1.式(I)的蛋白或其药用盐：

20 25 30Lys Xaa Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

35 40 45Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Xaa Thr Leu Ala Val Tyr Xaa Xaa Ile

85 90 95His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

100 105 110Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

115 120 125Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa Asp Xaa Leu Trp Xaa Leu Asp Leu Ser Pro

130 135 140Gly Cys (I)145

其中：

位置4的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置7的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置22的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；

位置27的Xaa是苏氨酸或丙氨酸；

位置28的Xaa是谷氨酰胺、谷氨酸或缺失；

位置34的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置56的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置62的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置63的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置72的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；

位置75的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置77的Xaa是丝氨酸或丙氨酸；

位置78的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；

位置82的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；

位置118的Xaa是甘氨酸或亮氨酸；

位置130的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置134的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置139的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

所述蛋白有至少一处发生替换，该替换选自：

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；或

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；

2.权利要求1中的蛋白或其药用盐，该蛋白有至少一处发生替换，该替换选自：

位置100的色氨酸被丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸替换；

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换。

3.式(II)的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：2)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro145Gly Cys (II)

其中：

位置22的天冬酰胺可任选地是谷氨酰胺或天冬氨酸；

位置27的苏氨酸可任选地是丙氨酸；

位置28的谷氨酰胺可任选地是谷氨酸或缺失；

位置54的甲硫氨酸可任选地是丙氨酸；

位置68的甲硫氨酸可任选地是亮氨酸；

位置72的天冬酰胺可任选地是谷氨酸或天冬氨酸；

位置77的丝氨酸可任选地是丙氨酸；

位置118的甘氨酸可任选地是亮氨酸；

所述蛋白有至少一处发生替换，该替换选自：

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；

4.权利要求3中的蛋白，其中：

位置100的色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸；

位置138的色氨酸是谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸。

5.式(III)的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：3)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

其中：

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；

6.权利要求5中的蛋白，其中：

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；

7.权利要求6中的蛋白，其中：

位置97的组氨酸被丝氨酸或脯氨酸替换；

位置101的丙氨酸被苏氨酸替换；或

8.权利要求1至7中任一权项的蛋白，其中位置96的半胱氨酸与位置146的半胱氨酸形成二硫键。

9.一种具有SEQ ID NO：4序列的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：4)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Ala Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro145Gly Cys其中位置96的半胱氨酸与位置146的半胱氨酸形成二硫键。

10.一种具有SEQ ID NO：5序列的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：5)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

11.一种具有SEQ ID NO：6序列的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：6)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

130 135 140Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Gln Gln Leu Asp Leu Ser Pro145Gly Cys其中位置96的半胱氨酸与位置146的半胱氨酸形成二硫键。

12.一种具有SEQ ID NO：7序列的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：7)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

13.一种具有SEQ ID NO：8序列的蛋白或其药用盐：

(SEQ ID NO：8)

5 10 15Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr

20 25 30Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Ala Gln Ser Val Ser Ser

35 40 45Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile

85 90 95Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys

100 105 110His Leu Pro Ala Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly

115 120 125Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg

14.一种下式蛋白：Met-R¹-ValPro Ile Xaa Lys Val Xaa Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile

1 5 10Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Xaa Asp Ile Ser His Xaa Xaa Ser Val15 20 25 30Ser Ser Lys Xaa Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly Leu His

35 40 45Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Xaa Asp Xaa Thr Leu Ala Val Tyr Xaa

50 55 60Xaa Ile Leu Thr Ser Xaa Pro Ser Arg Xaa Val Ile Xaa Ile Xaa Xaa

65 70 75Asp Leu Glu Xaa Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys

80 85 90Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu95 100 105 110Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Xaa Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu

115 120 125Ser Arg Leu Xaa Gly Ser Leu Xaa Asp Xaa Leu Trp Xaa Leu Asp Leu

130 135 140Ser Pro Gly Cys

145

其中：

R¹是除脯氨酸外的任意氨基酸；

位置4的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置7的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置22的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；

位置27的Xaa是苏氨酸或丙氨酸；

位置28的Xaa是谷氨酰胺、谷氨酸或缺失；

位置34的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置56的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置62的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置63的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置72的Xaa是天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；

位置75的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置77的Xaa是丝氨酸或丙氨酸；

位置78的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；

位置82的Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或天冬氨酸；

位置118的Xaa是甘氨酸或亮氨酸；

位置130的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置134的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

位置139的Xaa是谷氨酰胺或谷氨酸；

所述蛋白有至少一处发生替换，该替换选自：

位置102的丝氨酸被精氨酸替换；

位置103的甘氨酸被丙氨酸替换；

位置105的谷氨酸被谷氨酰胺替换；

位置106的苏氨酸被赖氨酸或丝氨酸替换；

位置107的亮氨酸被脯氨酸替换；

位置108的天冬氨酸被谷氨酸替换；

位置111的甘氨酸被天冬氨酸替换；或

15.权利要求14中的蛋白，其中R¹是精氨酸。

16.权利要求1至13中任一权项的蛋白的制备方法，其包括：

(a)用编码权利要求1至13中任一权项的蛋白的DNA转化宿主细胞，所述蛋白具有任选的前导序列；

(b)培养宿主细胞并分离步骤(a)中编码的蛋白；并任选地，

(c)酶促切除前导序列以产生权利要求1至13中任一权项的蛋白。

17.权利要求16的方法，其中前导序列是Met-R₁-。

18.权利要求17的方法，其中前导序列是Met-Arg-。

19.一种药物制剂，它包含权利要求1至13中任一权项的蛋白，以及一种或多种药用稀释剂、载体或赋形剂。

20.一种治疗肥胖的方法，它包括给需要治疗的哺乳动物施用权利要求1至13中任一权项的蛋白。

21.权利要求1至13中任一权项的蛋白，它被用作药剂。