CN118028357A - 一种用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明的CRISPR/Cas9基因编辑载体能够对大豆GmSPL家族的15个靶基因进行编辑，将该载体转化入大豆中，获得的突变体植株分枝数和主茎节数均有所增加，单株荚数显著增加，表明大豆基因GmSPL家族的15个靶基因在调控大豆分枝数、主茎节数、单株荚数方面发挥了作用，本发明的CRISPR/Cas9基因编辑载体对提高大豆产量具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体及其制备方法和应用。
背景技术
大豆是重要的粮油经济作物，也是重要的饲料作物。随着人们对蛋白质的需求提高，对大豆的需求也日益增加。大豆单产主要受品种特性、栽培条件和气候等因素影响，培育出具有理想株型的超高产突破性大豆新品种尤为重要。大豆具有独特的植物结构，每个节点都有叶、花序和豆荚，也是形成分枝的重要部位。因此大豆节数的增加也能有效增加大豆产量。大豆分枝数与大豆株型、产量潜力和适应性密切相关。大豆分枝的数量通过影响群体冠层中的光分布和通透性，进而影响群体的叶面积指数和光合速率，最终影响产量。因此，通过基因工程增加大豆节数、调控分枝数实现大豆产量提高具有重要意义。
基因组编辑技术是指通过核酸内切酶在基因组中特定位置产生DNA双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复断裂的双链DNA，因为修复过程容易出错，从而导致靶向突变。因此基因编辑技术，可以通过基因组的定点修饰调控基因的表达，作为研究基因功能的重要工具。CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌的获得性免疫系统，负责抵御噬菌体感染、质粒接合和转化等所造成的外源遗传物质入侵。CRISPR/Cas系统可特异性地识别外源DNA，切割并沉默外源基因的表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行作物遗传改良具有很多优点，现已成功运用于多种作物如水稻、小麦、玉米、棉花等的遗传改良。多靶点编辑不仅可以提高对基因组某一个序列的突变效率，实现片段缺失或重复，同时对某个代谢途径进行多基因敲除还有助于阐明相关基因的功能。
实现多靶点编辑需要有Cas9和多个靶向不同位点的独立SgRNA存在。传统的方法通过显微注射或者表达包含多个单一gRNA(SgRNA)的表达盒来实现。将体外表达的gRNA和Cas9蛋白(或者Cas9的mRNA)注射到细胞或者胚胎只适用于很少的一些系统，将多个SgRNA的表达盒压缩到一个载体上以实现多靶点切割主要有两种方式：(1)使用多个RNA聚合酶启动子同时驱动多个SgRNA表达盒，分别转录出对应的SgRNA序列，以实现对靶序列进行切割。典型的SgRNA的表达盒大约是400～500bp，包含RNA聚合酶III型(Pol III)的启动子，SgRNA和Pol III终止子；由于目前已知有功能的RNA聚合酶III型启动子较少，若一个载体中需要同时转录3个以上的靶点，必然会重复使用RNA聚合酶III型启动子(U3或U6)，因重复序列的存在将可能导致基因组发生同源重组。另外，受质粒载体承载能力的限制，同时表达多个SgRNA表达盒也将增加载体构建的难度，而且，真核生物III型聚合酶转录的RNA需要有一个特定的核苷酸开始，这使得Cas9/gRNA的靶位点受限。(2)将多个SgRNA通过一些识别序列或自切割连接，借用蛋白切割对应序列，释放出带有不同靶点的独立SgRNA序列，实现对应靶序列的切割。一个成功的案例是利用tRNA剪切系统—多个SgRNA可以由一个tRNA-gRNA结构的合成基因通过真核生物体内的Rnase的精确剪切产生，借用真核生物体内的Rnase系统进行切割，另一个案例是来源于病毒的HH和HDV自切割序列。前者(tRNA剪切系统)是一种相对高效的多靶点切割方式，而后者(HH和HDV自切割序列)的多靶点载体构建过程比较复杂，一般不采用。但是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建多靶点编辑系统，改良大豆分枝数和节荚数，进而提高大量产量还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体及其制备方法和应用，本发明的多靶点基因编辑系统能对大豆GmSPL家族的多个基因进行编辑，可以产生不同编辑组合的突变体单株，促进大豆分枝、增加主茎节数、增加大豆单株荚数，进而提高大豆单株产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体是将靶点的SgRNA与启动子连接后，插入骨架载体制备而成；所述靶点包括SPL2a(b)、SPL6a(b)、SPL6c(d)、SPL9a(b)、SPL9c(d)、SPL13Aa(b)、SPL13Ac(d)、SPL6e；
靶点SPL2a(b)和SPL9c(d)的SgRNA分别与SgRNA载体1的启动子U3d连接，分别简写为SPL2a(b)-U3d、SPL9c(d)-U3d；
靶点SPL6a(b)和SPL13Aa(b)的SgRNA分别与SgRNA载体2中的启动子U3b连接，分别简写为SPL6a(b)-U3b、SPL13Aa(b)-U3b；
靶点SPL6c(d)和SPL13Ac(d)的SgRNA与SgRNA载体3中的启动子U6-1连接，分别简写为SPL6c(d)-U6-1、SPL13Ac(d)-U6-1；
靶点SPL9a(b)的SgRNA和靶点SPL6e的SgRNA与SgRNA载体4中的启动子U6-29连接，分别简写为SPL9a(b)-U6-29、SPL6e-U6-29。
靶点SgRNA和启动子序列位于骨架载体的两个酶切位点中间，连接启动子的靶点在表达载体上从5’端到3’端的顺序依次为：SPL2a(b)-U3d、SPL6a(b)-U3b、SPL6c(d)-U6-1、SPL9a(b)-U6-29、SPL9c(d)-U3d、SPL13Aa(b)-U3b、SPL13Ac(d)-U6-1、SPL6e-U6-29；
所述靶点的SgRNA包括Sg1和Sg2，Sg1和Sg2退火成双链后再与对应的SgRNA载体连接；
靶点SPL2a(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:2所示，Sg2序列如SEQ ID NO:3所示；
SPL6a(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:5所示，Sg2序列如SEQ ID NO:6所示；
SPL6c(d)的Sg1序列如SEQ ID NO:8所示，Sg2序列如SEQ ID NO:9所示；
SPL9a(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:11所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:12所示；
SPL9c(d)的Sg1序列如SEQ ID NO:14所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:15所示；
SPL13Aa(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:17所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:18所示；
SPL13Ac(d)的Sg1序列如SEQ ID NO:20所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:21所示；
SPL6e的Sg1序列如SEQ ID NO:23所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:24所示。
优选的，所述骨架载体包括pYL载体。
本发明还提供了所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体的制备方法包括以下步骤：
(1)8个靶点的SgRNA退火后，分别与对应的SgRNA连接，获得8个连接产物；
靶点SPL2a(b)和SPL9c(d)的SgRNA分别与SgRNA载体1的启动子U3d连接，靶点SPL6a(b)和SPL13Aa(b)的SgRNA分别与SgRNA载体2中的启动子U3b连接，靶点SPL6c(d)和SPL13Ac(d)的SgRNA与SgRNA载体3中的启动子U6-1连接，靶点SPL9a(b)和靶点SPL6e的SgRNA分别与SgRNA载体4中的启动子U6-29连接，；
(2)分别以步骤(1)的连接产物为模板进行第一轮扩增，每个连接产物有两个扩增体系，体系1的正向引物为CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG，反向引物为该靶点的Sg2；体系2的正向引物为该靶点的Sg1，反向引物为CGGAGGAAAATTCCATCCAC，获得扩增产物；
(3)将步骤(2)的扩增产物同体积混合后作为模板进行第二轮扩增，共8个扩增体系，用各位置特异引物将靶点的SgRNA排序，获得扩增产物；
(4)将步骤(3)的扩增产物等体积混合后，回收扩增产物；
(5)酶切pYL质粒，将酶切后的pYL质粒与步骤(4)中的扩增产物连接，得到所述的基因编辑载体。
优选的，靶点SPL2a(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28所示；
靶点SPL6a(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；
靶点SPL6c(d)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示；
靶点SPL9a(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示；
靶点SPL9c(d)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；
靶点SPL13Aa(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示；
靶点SPL13Ac(d)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示；
靶点SPL6e的SgRNA的位置特异引物如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示。
本发明还提供了所述的用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体在调控植物分枝数、主茎节数或单株荚数中的应用。
优选的，将所述用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入植物体内，获得分枝数主茎节数或单株荚数增多的植物，所述导入的方法包括农杆菌转化法。
优选的，所述植物包括蝶形花科植物。
本发明还提供了一种试剂盒，包含所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体。
本发明还提供了GmSPL2a、GmSPL2b、GmSPL6a、GmSPL6b、GmSPL6c、GmSPL6d、GmSPL6e、GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c、GmSPL9d、GmSPL13Aa、GmSPL13Ab、GmSPL13Ac或GmSPL13Ad基因在调控植物分枝数、主茎节数、单株荚数中的应用。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明的CRISPR/Cas9基因编辑载体能够对大豆GmSPL家族的GmSPL2a、GmSPL2b、GmSPL6a、GmSPL6b、GmSPL6c、GmSPL6d、GmSPL6e、GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c、GmSPL9d、GmSPL13Aa、GmSPL13Ab、GmSPL13Ac、GmSPL13Ad 15个靶基因进行编辑，将该载体转化入大豆中，获得的突变体植株分枝数和主茎节数均有所增加，荚数显著增加，表明大豆基因GmSPL家族的15个靶基因在调控大豆分枝数、主茎节数、单株荚数方面发挥了作用，本发明的CRISPR/Cas9基因编辑载体对提高大豆产量具有重大意义。
附图说明
图1为载体的质粒图谱。
图2为突变体在田间结荚期的表型情况，其中：
(a)为背景品种DN50(东农50)的田间表型和分枝状况；
(b)为突变体Gmspls-3-1-4-3-1的田间表型和分枝状况；
(c)为突变体Gmspls-10-x1-4-2-1的田间表型和分枝状况；
(d)为Gmspls-10-x1-4-2-2的田间表型和分枝状况。
图3为突变体在田间结荚期的统计数据，其中：
(a)为DN50和突变体的分枝数统计图；
(b)为DN50和突变体主茎上的节数统计图；
(c)为DN50和突变体的荚数统计图。
图4为突变体的突变基因和突变类型，其中：
(a)为Gmspls-3-1-4-3-1突变基因的情况和类型；
(b)为Gmspls-10-x1-4-2-1突变基因的情况和类型；
(c)为Gmspls-10-x1-4-2-2突变基因的情况和类型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可自常规生化试剂公司购买得到。
实施例1GmSPL-pYL载体构建
本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体能够对GmSPL家族的15个基因进行编辑，分别为：GmSPL2a、GmSPL2b、GmSPL6a、GmSPL6b、GmSPL6c、GmSPL6d、GmSPL6e、GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c、GmSPL9d、GmSPL13Aa、GmSPL13Ab、GmSPL13Ac、GmSPL13Ad。
以下为各个基因在NCBI的基因号：
GmSPL2a：LOC100796013、GmSPL2b：LOC100781289；
GmSPL6a：LOC100820149、GmSPL6b：LOC100797372；
GmSPL6c：LOC100817547、GmSPL6d：LOC100812110；
GmSPL6e：LOC100777766；GmSPL13Aa：LOC100806582、
GmSPL13Ab：LOC100805328；GmSPL13Ac：LOC102664649、
GmSPL13Ad:LOC100787407；
GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c、GmSPL9d为目前已经命名的基因；
1.靶点引物设计
在本实施例中，序列相似的基因共用一个靶点，通过序列比对，针对上述15个基因设计了8个靶点，SPL2a(b)、SPL6a(b)、SPL6c(d)、SPL9a(b)、SPL9c(d)、SPL13Aa(b)、SPL13Ac(d)、SPL6e；分别命名为靶点1～8。
(1)GmSPL2a和GmSPL2b共用靶点为SPL2a(b)，靶点序列如SEQ ID NO:1所示：
GCACAATTCTTTCTTCCCAGTGG(SEQ ID NO:1)，该靶点的SgRNA与U3d启动子连接；
该靶点的Sg1序列如SEQ ID NO:2所示，Sg2序列如SEQ ID NO:3所示；
SEQ ID NO:2：GTCAGCACAATTCTTTCTTCCCAG，
SEQ ID NO:3：AAACCTGGGAAGAAAGAATTGTGC。
(2)GmSPL6a和GmSPL6b共用靶点为SPL6a(b)，靶点序列如SEQ ID NO:4所示：
TCATAGCTAGATGTCTCTAGAGG(SEQ ID NO:4)，该靶点的SgRNA与U3b启动子连接；
该靶点的Sg1序列如SEQ ID NO:5所示，Sg2序列如SEQ ID NO:6所示；
SEQ ID NO:5：GTCATCATAGCTAGATGTCTCTAG，
SEQ ID NO:6：AAACCTAGAGACATCTAGCTATGA。
(3)GmSPL6c和GmSPL6d共用靶点为SPL6c(d)，序列如SEQ ID NO:7所示：
CCAAGTCTATGGCTGCAACAAGG(SEQ ID NO:7)，该靶点的SgRNA与U6-1启动子连接；
该靶点的Sg1序列如SEQ ID NO:8所示，Sg2序列如SEQ ID NO:9所示；
SEQ ID NO:8：ATTGCCAAGTCTATGGCTGCAACA，
SEQ ID NO:9：AAACTGTTGCAGCCATAGACTTGG。
(4)GmSPL9a和GmSPL9b共用靶点为SPL9a(b)，靶点序列如SEQ ID NO:10所示：
GGCTGCAAAGTAGATCTGAGTGG(SEQ ID NO:10)，该靶点的SgRNA与U6-29启动子连接；
该靶点的Sg1序列如SEQ ID NO:11所示，Sg2序列如SEQ ID NO:12所示；
SEQ ID NO:11：ATTGGCTGCAAAGTAGATCTGAG，
SEQ ID NO:12：AAACCTCAGATCTACTTTGCAGC。
(5)GmSPL9c和GmSPL9d共用靶点为SPL9c(d)，靶点序列如SEQ ID NO:13所示：
TAGCTGGCCATAATGAACGTCGG(SEQ ID NO:13)，该靶点的SgRNA与U3d启动子连接；
该靶点的Sg1序列如SEQ ID NO:14所示，Sg2序列如SEQ ID NO:15所示；
SEQ ID NO:14：GTCATAGCTGGCCATAATGAACGT，
SEQ ID NO:15：AAACACGTTCATTATGGCCAGCTA。
(6)GmSPL13Aa和GmSPL13Ab共用靶点为SPL13Aa(b)，靶点序列如SEQ ID NO:16所示：
GTAACTGCAGGGACTATCATAGG(SEQ ID NO:16)，该靶点的SgRNA与U3b启动子连接；
该靶点的Sg1序列如SEQ ID NO:17所示，Sg2序列如SEQ ID NO:18所示；
SEQ ID NO:17：GTCAGTAACTGCAGGGACTATCAT，
SEQ ID NO:18：AAACATGATAGTCCCTGCAGTTAC。
(7)GmSPL13Ac和GmSPL13Ad共用靶点为SPL13Ac(d)，序列如SEQ ID NO:19所示：
GCTCTCTTAGAAGACCCTGAAGG(SEQ ID NO:19)，该靶点的SgRNA与由U6-1启动子连接；
该靶点的Sg1序列如SEQ ID NO:20所示，Sg2序列如SEQ ID NO:21所示；
SEQ ID NO:20：ATTGCTCTCTTAGAAGACCCTGA，
SEQ ID NO:21：AAACTCAGGGTCTTCTAAGAGAG。
(8)GmSPL6e的靶点为SPL6e，序列如SEQ ID NO:22所示：
TGCTGTTCAGAGCAGAAAGGTGG(SEQ ID NO:22)，该靶点的SgRNA与U6-29启动子连接；
该靶点接头的正向引物如SEQ ID NO:23所示，反向引物如SEQ ID NO:24所示；
SEQ ID NO:23：ATTGTGCTGTTCAGAGCAGAAAGG，
SEQ ID NO:24：AAACCCTTTCTGCTCTGAACAGCA。
2.GmSPL-pYL重组质粒构建
分别将每个靶点接头的正向引物和反向引物混合，并用水稀释至终浓度为1μM，于90℃反应30s。分别将各靶点的SgRNA与对应的SgRNA载体连接。
SgRNA载体1～4出处：Yao-Guang Liu.A Robust CRISPR/Cas9 System forConvenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and DicotPlants.2015，网址链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2015.04.007。
用BsaⅠ酶切SgRNA载体后，用T4 DNA ligase连接。酶切连接体系为：20ng gRNA载体质粒，0.5μL接头引物，0.5μL BsaⅠ酶，0.1μL T4ligase，0.5μL T4 ligase buffer，1μLcutsmart，6.65μL H2O，酶切的温度为37℃，连接温度为20℃程序为37℃5min，20℃5min，5个循环，此过程中，边酶切边连接。
此步骤获得了启动子连接对应靶点的8个连接产物，即分别含有SPL2a(b)-U3d、SPL6a(b)-U3b、SPL6c(d)-U6-1、SPL9a(b)-U6-29、SPL9c(d)-U3d、SPL13Aa(b)-U3b、SPL13Ac(d)-U6-1、SPL6e-U6-29的质粒。
将上述8个连接产物单独地作为模板，分别用UF+Sg1、Sg2+gR进行扩增，此步骤每一个靶点有2个扩增体系，第一个扩增体系中，加入0.5μL UF(CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG)(SEQ ID NO:25)和0.5μLSg2，2μL dNTP，0.5μL KOD酶，7.5μL KOD buffer，3μL H2O；第二个扩增体系的引物为0.5μL gR(CGGAGGAAAATTCCATCCAC)(SEQ ID NO:26)和0.5μL Sg1，反应体系中的其他试剂及其用量均与第一个扩增体系相同。扩增程序为：95℃10s,60℃15s,68℃20s,27个循环。8个靶点为16个扩增体系。
16个扩增体系如下：
以含有SPL2a(b)-U3d的质粒为模板，用UF+靶点SPL2a(b)的Sg1作为引物进行扩增；
以含有SPL2a(b)-U3d的质粒为模板，靶点SPL2a(b)的Sg2+gR作为引物进行扩增；
……
以含有SPL6e-U6-29的质粒为模板，用UF+靶点SPL6e-U6-29的Sg1作为引物进行扩增；
以含有SPL6e-U6-29的质粒为模板，靶点SPL6e-U6-29的Sg2+gR作为引物进行扩增。
将上一步的每个靶点的两个扩增产物用水稀释10倍各取1μL，混合后做为模板进行第二轮扩增，用各位置特异引物将靶点排序，此轮扩增有8个体系。
SPL2a(b)靶点的位置特异引物序列如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28所示：
SEQ ID NO:27：
TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:28：
AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC。
SPL6a(b)靶点的位置特异引物序列如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示：
SEQ ID NO:29：
TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:30：
AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC。
SPL6c(d)靶点的位置特异引物如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示：
SEQ ID NO:31
TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:32
AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC。
SPL9a(b)靶点的位置特异引物序列如SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示：
SEQ ID NO:33：
TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:34：
AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC。
SPL9c(d)靶点的位置特异引物序列如SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36所示：
SEQ ID NO:35：
TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:36：AGCGTGggtctcGcagaGGTCCATCCACTCCAAGCTC。
SPL13Aa(b)靶点的位置特异引物序列如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38所示：
SEQ ID NO:37：
TTCAGAggtctcTtctgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:38：
AGCGTGggtctcGacctGGTCCATCCACTCCAAGCTC。
SPL13Ac(d)靶点的位置特异引物序列如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40所示：
SEQ ID NO:39：
TTCAGAggtctcTaggtCACTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:40：
AGCGTGggtctcGagcgGGTCCATCCACTCCAAGCTC。
SPL6e靶点的位置特异引物如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42所示：
SEQ ID NO:41：
TTCAGAggtctcTcgctCACTGGAATCGGCAGCAAAGG，
SEQ ID NO:42：
AGCGTGggtctcGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC。
扩增体系：1μL上一步稀释10倍的产物，1μL位置特异引物，1μLKOD酶，10μL KODbuffer，4μL dNTP，1μL H2O。
扩增程序：95℃10s,58℃15s,68℃20s,18个循环。
扩增完成后，将扩增产物等体积混合，回收扩增产物，纯化回收的试剂盒来自生工生物工程有限公司。回收的具体步骤为：在PCR反应液中加入5倍体积的Buffer B3，充分混匀；8,000g离心30s，倒掉收集管中的液体；加入500μL Wash Solution，9,000g离心30s，倒掉收集管中液体，重复一次；将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入15～40μLElution Buffer，室温静置1min后，离心1min，保存管中的DNA溶液，为纯化的目标产物。
将上一步8个体系的目标产物混合到一起，加入pYL质粒，用BsaⅠ进行酶切，酶切体系为：0.5μL纯化产物，1μL pYL质粒，0.5μL BsaⅠ，1.5μL Cutsmart，10.5μL H2O；37℃酶切10min；加入0.5μL T4 DNA ligase和0.5μL T4 DNA ligase buffer，连接程序为37℃2min,10℃3min,20℃5min,37℃2min，12个循环，将各个靶点的SgRNA连接到终载体pYL上。在GmSPL-pYL重组载体上，从5’端到3’端的排列顺序依次为：SPL2a(b)-U3d、SPL6a(b)-U3b、SPL6c(d)-U6-1、SPL9a(b)-U6-29、SPL9c(d)-U3d、SPL13Aa(b)-U3b、SPL13Ac(d)-U6-1、SPL6e-U6-29，载体图谱如图1所示。
pYL质粒出处：A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants，文章链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2015.04.007。
取50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞，加入15μL连接产物，冰上放置30min，42℃反应90s，冰上放置2min，加入800μL LB无抗性液体培养基中，37℃，180r/min培养40min，4000r/min离心30s，弃上清，悬浮菌体后涂布于含有50mg/mL壮观霉素的培养基中；置37℃培养至白色转化子长出，鉴定出阳性克隆。
使用质粒提取试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取GmSPL-pYL重组载体。具体步骤为：
挑取阳性克隆进行培养，取5mL过夜培养的菌液，8,000g离心2min收集菌体，弃去培养基；在菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，悬浮菌体；加入250μL Buffer P2后，立即温和颠倒离心管5～10次，混匀后室温静置2～4min；加入350μL Buffer P3，立即温和颠倒离心管5～10次；然后于12,000g离心5～10min，将上清液移入吸附柱，8000g离心30s，倒掉收集管中的液体，然后加入500μL Wash Solution，9,000g离心30s，再次倒掉收集管中的液体；重复上一步；空吸附柱于9000g离心1min；将吸附柱放入新的的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50～100μL Elution Buffer，室温静置1min后，离心1min钟，得到GmSPL-pYL重组载体。
实施例2GmSPL-pYL重组质粒转化大豆
取出冻存的50μL感受态农杆菌菌株，融化后加入10μL GmSPL-pYL重组质粒，轻弹管壁混匀，冰上孵育30min；然后放入液氮中5min后取出，再将管转入金属浴37℃5min，冰上放置5min，加入800μL无抗性LB液体培养基中，于28℃，150r/min培养4h；4000r/min离心30s，弃上清，加入100μLYEP液体培养基，悬浮菌体后涂布于含有50mg/mL卡那霉素、50mg/mL壮观霉素和25mg/mL利福平的YEP培养基中；置于28℃培养至白色转化子长出，得到农杆菌转化子。将农杆菌转化子在含有50mg/mL卡那霉素、25mg/mL利福平、50mg/mL壮观霉素的YEP培养基中培养，培养至农杆菌的OD值为1.0时，得到农杆菌菌液。
取大豆东农50的种子，用氯气消毒10h后，置于灭菌水中，在26℃条件下暗培养16h，使大豆种子萌发。用15号手术刀片将萌发好的大豆上胚轴切断，后沿两片子叶正中间将两片子叶分开，确保每片子叶都附有生长点(每个外植体是由一片子叶连着一段下胚轴组成的，即一枚种子可以形成两个外植体)后开始接种。50片外植体为一组放于一个三角瓶中，加入50mL用CCM培养基重悬的农杆菌菌液，在90r/min，26℃的摇床上暗培养12h。培养结束后，将外植体与农杆菌菌液倒入高压灭菌的滤纸中，用外植体将农杆菌菌液蘸干后，置于超净工作台内吹干。然后近轴面向下平铺于滤纸上面，滤纸平铺于CCM固体培养基的玻璃皿(直径11cm)上，放置30～40个外植体，在温度26℃暗培养4天后，接种于丛生芽培养基中，丛生芽培养基配方为Gamborg Basal Salt Mixture G768(购自Phyto Tech官网)3.1g/L，Surcose(上海沪试实验室器材股份有限公司)30g/L，MES(品牌：)0.59g/L。26℃，18h Light/6h Dark光照体系下培养14天后，切掉丛生芽，使外植体在丛生芽培养基上继代培养2周。
取已生成的分生组织，在生长点的基部沿水平方向切开新的切口，并将外植体转移至伸长培养基，培养基配方为MURASHIGE&SKOOG BAS SALT MIX M524(购自Phyto Tech官网)4.4g/L，Surcose(上海沪试实验室器材股份有限公司)30g/L，MES(品牌：)0.59g/L。每2周将培养物转移至新的伸长培养基，每次转移时在外植体的基部作一个新的水平切口。培养8周后，伸长的芽产生清晰的分化。继续培养4周左右，得到伸长芽。剪取5cm的芽，用1mg/mL IBA蘸2min后移入生根培养基上生根，配方为MURASHIGE&SKOOG BAS SALT MIX M5242.2g/L,Surcose 20g/L,MES 0.59g/L。2周后，长出足量的根系，得到待移栽苗。
将待移栽苗移入花盆中，花盆里放入培养土，培养土由蛭石与营养土按照重量比3：1混合而成。蛭石来自灵寿县艺兰，粒径为2～4mm，营养土来自镇江培蕾基质，移栽后套保鲜袋一周，之后取下保鲜袋，在26℃培养，根据大豆表型筛选出分枝数、主茎节数或荚数增多的大豆植株，培养成熟后结出的种子为T0代种子。
实施例3大豆突变体Gmspls基因编辑鉴定
对实施例2中筛选出的T0代种子收获后获得了两个line，分别将这两个突变命名为Gmspls-3和Gmspls-10。将稳定转化Gmspls-3，Gmspls-10的植株T0代种子种植于温室中培养，筛选转基因阳性植株，并得到T1代种子，再次种植，直至获得T3代种子，稳定转化Gmspls-3的有一种，命名为Gmspls-3-1-4-3，稳定转化Gmspls-10的有一种，命名为Gmspls-10-x1-4-2。6月，将Gmspls-3，Gmspls-10突变体植株的T3代种子及野生型东农50种子种植于田间，每个种植60粒，并于同年10月统计田间表型。结果如图2、图3所示。由图2和图3可知，在完全相同的实验环境下，通过基因编辑产生的突变体植株Gmspls-3-1-4-3-1、Gmspls-10-x1-4-2-1、Gmspls-10-x1-4-2-2与东农50相比，分枝数和主茎节数均有所增加，荚数显著增加。
取东农50和转化植株Gmspls-3，Gmspls-10的T4代突变体大豆叶片组织0.1g放到2mL EP管中，加入2mm钢珠，用液氮速冻有样品和钢珠的EP管后用打样机研磨至粉状；加入650μL CTAB，65℃放置20min；加入0.5倍体积氯仿，猛烈混匀，12000rpm离心10min；取上清于新的1.5mL EP管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min，12000rpm离心10min；弃上清，离心，干燥，溶于50μL水中，得到大豆叶片组织总DNA，保存在4℃冰箱中备用。
在靶基因上下游设计特异性引物进行编辑情况鉴定，
鉴定基因GmSPL2a的正向引物序列如SEQ ID NO:43所示，反向引物如SEQ ID NO:44所示；
SEQ ID NO:43：GGGAAATCAACGTTGGAATG，
SEQ ID NO:44：GGATGCTGTAAAGTCTGACTACTGG。
鉴定基因GmSPL2b的正向引物序列如SEQ ID NO:45所示，反向引物如SEQ ID NO:46所示；
SEQ ID NO:45：GTGAAGCAGATCCAGAAATCAATG，
SEQ ID NO:46：GACAGGAAACTCAATCTGACTGAC。
鉴定基因GmSPL6a的正向引物序列如SEQ ID NO:47所示，反向引物如SEQ ID NO:48所示；
SEQ ID NO:47：ATCTTGGAGTTATGTCCCCGA，
SEQ ID NO:48：AAGTGAACCCTTCTTTTGCAAC。
鉴定基因GmSPL6b的正向引物序列如SEQ ID NO:49所示，反向引物如SEQ ID NO:50所示；
SEQ ID NO:49：GAGAAGTAGAAAGGCATTGGTTG，
SEQ ID NO:50：TTTCTTGCTCTTCACCTTGT。
鉴定基因GmSPL6c的正向引物序列如SEQ ID NO:51所示，反向引物如SEQ ID NO:52所示；
SEQ ID NO:51：AGCTTTCAAACTCAAATTCCCTC，
SEQ ID NO:52：AACACTGCTTCTCATGTCAACC。
鉴定基因GmSPL6d的正向引物序列如SEQ ID NO:53所示，反向引物如SEQ ID NO:54所示；
SEQ ID NO:53：ACAACAACACCACAGTGACAGA，
SEQ ID NO:54：CACAGCTAGCTTCTCATGTCAAAC。
鉴定基因GmSPL9a的正向引物序列如SEQ ID NO:55所示，反向引物如SEQ ID NO:56所示；
SEQ ID NO:55：CTCATCACCCAACTCTTCTTCTACT，
SEQ ID NO:56：GCAGAAACCAAGGAGTAAGATGAG。
鉴定基因GmSPL9b的正向引物序列如SEQ ID NO:57所示，反向引物如SEQ ID NO:58所示；
SEQ ID NO:57：TTCTTCATCACCCAACTCTTCCT，
SEQ ID NO:58：GAAGTAAGATGAGGAAAGGAAACC。
鉴定基因GmSPL9c的正向引物序列如SEQ ID NO:59所示，反向引物如SEQ ID NO:60所示；
SEQ ID NO:59：AACAAGAGATGCGTTTAAGTGC，
SEQ ID NO:60：CAGATGATGTCTCCGAGTTC。
鉴定基因GmSPL9d的正向引物序列如SEQ ID NO:61所示，反向引物如SEQ ID NO:62所示；
SEQ ID NO:61：CCAAACAAGCTCACATGATGT，
SEQ ID NO:62：TGAGTTGCCATTCCAGCTAAGT。
鉴定基因GmSPL13Aa的正向引物序列如SEQ ID NO:63所示，反向引物如SEQ IDNO:64所示；
SEQ ID NO:63：CTTTCTTGGGATTTGAGTGAAGTG，
SEQ ID NO:64：CCGGCAGAATTTTCCAGTATAG。
鉴定基因GmSPL13Ab的正向引物序列如SEQ ID NO:65所示，反向引物如SEQ IDNO:66所示；
SEQ ID NO:65：CTTGGGATTTGAGTGAAGTGGATC，
SEQ ID NO:66：CTTTAACACCTACTTCTAACTCCGG。
鉴定基因GmSPL13Ac的正向引物序列如SEQ ID NO:67所示，反向引物如SEQ IDNO:68所示；
SEQ ID NO:67：CAAAACATAGGAACAAAGGAGGAGC，
SEQ ID NO:68：AGTTATGAGATTGGTTGGGTGG。
鉴定基因GmSPL13Ad的正向引物序列如SEQ ID NO:69所示，反向引物如SEQ IDNO:70所示；
SEQ ID NO:69：TGGAGTTTATAGAATGAAAGGGGAG，
SEQ ID NO:70：ATTAAATGTCCACACCGGGTAC。
鉴定基因GmSPL6e的正向引物序列如SEQ ID NO:71所示，反向引物如SEQ ID NO:72所示；
SEQ ID NO:71：CTATCACCTCCCAACACACTTG，
SEQ ID NO:72：AGATTGACCAACCTACTACATTGC。
分别以东农50和突变体DNA为模板，加入Taq PCR MasterMix(北京艾德莱生物)和对应的鉴定引物，体系为：15μLTaq PCR MasterMix，2μLDNA，1μL正向扩增引物，1μL反向扩增引物，11μL H2O。扩增程序为：95℃30s,55℃30s,72℃60s，35个循环。将产物送到武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序并比对，结果如图4所示。
由图4可知，突变体植株Gmspls-3-1-4-3-1的GmSPL2a、GmSPL6a、GmSPL6b、GmSPL9a、GmSPL9c、GmSPL9d、GmSPL13Aa、GmSPL13Ab基因发生了突变；突变体植株Gmspls-10-x1-4-2-1和Gmspls-10-x1-4-2-2的GmSPL2a、GmSPL2b、GmSPL6a、GmSPL6b、GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c、GmSPL13Aa、GmSPL13Ab基因发生了突变。
由以上实施例可知，本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑载体、试剂盒及其应用。利用本发明构建的基因编辑CRISPR/Cas9载体转化受体大豆植株，能够显著增加大豆的分枝数、节数和单株荚数，对提高大豆产量具有重大的意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑载体是将靶点的SgRNA与SgRNA载体连接后，插入骨架载体制备而成；所述靶点包括SPL2a(b)、SPL6a(b)、SPL6c(d)、SPL9a(b)、SPL9c(d)、SPL13Aa(b)、SPL13Ac(d)、SPL6e；
靶点SPL2a(b)和SPL9c(d)的SgRNA分别与SgRNA载体1的启动子U3d连接，靶点SPL6a(b)和SPL13Aa(b)的SgRNA分别与SgRNA载体2中的启动子U3b连接，靶点SPL6c(d)和SPL13Ac(d)的SgRNA与SgRNA载体3中的启动子U6-1连接，靶点SPL9a(b)的SgRNA和靶点SPL6e的SgRNA分别与SgRNA载体4中的启动子U6-29连接；
靶点SgRNA和启动子序列位于骨架载体的两个酶切位点中间，连接启动子的靶点在表达载体上从5’端到3’端的顺序依次为：SPL2a(b)-U3d、SPL6a(b)-U3b、SPL6c(d)-U6-1、SPL9a(b)-U6-29、SPL9c(d)-U3d、SPL13Aa(b)-U3b、SPL13Ac(d)-U6-1、SPL6e-U6-29；
所述靶点的SgRNA包括Sg1和Sg2，Sg1和Sg2退火成双链后再与对应的SgRNA载体连接；
靶点SPL2a(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:2所示，Sg2序列如SEQ ID NO:3所示；
SPL6a(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:5所示，Sg2序列如SEQ ID NO:6所示；
SPL6c(d)的Sg1序列如SEQ ID NO:8所示，Sg2序列如SEQ ID NO:9所示；
SPL9a(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:11所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:12所示；
SPL9c(d)的Sg1序列如SEQ ID NO:14所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:15所示；
SPL13Aa(b)的Sg1序列如SEQ ID NO:17所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:18所示；
SPL13Ac(d)的Sg1序列如SEQ ID NO:20所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:21所示；
SPL6e的Sg1序列如SEQ ID NO:23所示，Sg2引物序列如SEQ ID NO:24所示。
2.根据权利要求1所述的用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述骨架载体包括pYL载体。
3.权利要求1或2所述的用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)8个靶点的SgRNA退火后，分别与对应的SgRNA连接，获得8个连接产物；
靶点SPL2a(b)和SPL9c(d)的SgRNA分别与SgRNA载体1的启动子U3d连接，靶点SPL6a(b)和SPL13Aa(b)的SgRNA分别与SgRNA载体2中的启动子U3b连接，靶点SPL6c(d)和SPL13Ac(d)的SgRNA与SgRNA载体3中的启动子U6-1连接，靶点SPL9a(b)和靶点SPL6e的SgRNA分别与SgRNA载体4中的启动子U6-29连接；
(2)分别以步骤(1)的连接产物为模板进行第一轮扩增，每个连接产物有两个扩增体系，体系1的正向引物为CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG，反向引物为该靶点的Sg2；体系2的正向引物为该靶点的Sg1，反向引物为CGGAGGAAAATTCCATCCAC，获得扩增产物；
(3)将步骤(2)的扩增产物同体积混合后作为模板进行第二轮扩增，共8个扩增体系，用各位置特异引物将靶点的SgRNA排序，获得扩增产物；
(4)将步骤(3)的扩增产物等体积混合后，回收扩增产物；
(5)酶切pYL质粒，将酶切后的pYL质粒与步骤(4)中的扩增产物连接，得到所述的基因编辑载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，靶点SPL2a(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示；
靶点SPL6a(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；
靶点SPL6c(d)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示；
靶点SPL9a(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示；
靶点SPL9c(d)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；
靶点SPL13Aa(b)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示；
靶点SPL13Ac(d)的SgRNA的位置特异引物序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示；
靶点SPL6e的SgRNA的位置特异引物如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示。
5.权利要求1或2所述的用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体在调控植物分枝数、主茎节数或单株荚数中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将权利要求1或2所述的用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体导入植物体内，获得分枝数主茎节数或单株荚数增多的植物，所述导入的方法包括农杆菌转化法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括蝶形花科植物。
8.一种试剂盒，其特征在于，包含括权利要求1或2所述的用于提高大豆产量的CRISPR/Cas9基因编辑载体。
9.GmSPL2a、GmSPL2b、GmSPL6a、GmSPL6b、GmSPL6c、GmSPL6d、GmSPL6e、GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c、GmSPL9d、GmSPL13Aa、GmSPL13Ab、GmSPL13Ac或GmSPL13Ad基因在调控植物分枝数、主茎节数、单株荚数中的应用。
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