CN118028184A - 一株源泉假单胞菌i4、微生物菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境微生物技术领域，公开了一株源泉假单胞菌I4、微生物菌剂及其应用，该菌株为源泉假单胞菌Pseudomonas sediminis I4，于2024年02月29日保藏在广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏编号为64382。本发明还提供了该源泉假单胞菌I4的应用，以及以其作为活性成分的微生物菌剂。该菌株同时具有异养硝化和好氧反硝化生物特征，环境适应性突出，在高盐度、碱性水体中能进行较好的异养硝化好氧反硝化进程，还能有效的脱除磷酸盐，其微生物菌剂在水产养殖尾水或其他含氮磷高碱性污水的生物脱氮除磷处理方面具有良好的应用前景，并且具备良好的生物安全性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及水产养殖技术领域，具体涉及同时具有异养硝化和好氧反硝化和耐盐碱特性的一株源泉假单胞菌I4、微生物菌剂及其应用。
背景技术
我国是世界渔业大国，水产养殖产量规模已经连续多年居于世界第一。但是，我国目前的水产养殖产业还存在诸多需要解决的技术问题，如土地面积缺乏、养殖基础设施差、环境污染严重、养殖成本上涨、养殖户经济效益下降等问题，特别是随着集约化水产养殖模式的推进与发展，水质恶化和废水排放制约养殖业的可持续发展。根据相关统计数据，水产养殖尾水污染物排放占农业总排放量的6%，污染物以氮和磷为主，主要影响是使水体发生富营养化。水产养殖的发展势必带来养殖密度及饲料用量的增加,相关研究表明饲料中只有小部分磷和氮可以被动物同化,其余的磷和氮以流出物的形式排放到环境中，导致周围环境中磷和氮的含量增加并破坏生态平衡。因此，迫切需要解决水产养殖产业废水中磷和氮的积累问题。
反硝化作用是降解硝酸盐的主要方式，即硝酸盐通过反硝化细菌的作用形成氮气或一氧化二氮。本发明所得的异养硝化和好氧反硝化细菌（HNADM）是利用一系列硝酸还原酶和亚硝酸还原酶，可以在有氧条件下同时完成异养硝化和好氧反硝化（HN-AD）作用的一类微生物，克服了传统的反硝化工艺的缺点。生物除磷是指微生物通过在厌氧阶段的充分释磷和好氧阶段的过量吸磷过程，实现磷的有效去除。而废水中的盐度过高，会导致渗透压的急剧增加、微生物代谢和酶活性受到抑制，高盐度会导致细胞胞浆溶解，当盐含量超过2%时，硝化和反硝化的生物活性大大降低。
国内外关于源泉假单胞菌的研究和报道均较少，现有技术中的假单胞菌为直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，是无核细菌，以极生鞭毛运动，不形成芽孢，化能有机营养，严格好氧，呼吸代谢，从不发酵。有些株产生荧光色素或（和）红、蓝、黄、绿等水溶性色素，氧化酶和触酶均为阳性（除少数菌株外）；蓝绿色或荧光色菌落，有生姜味；目前的研究方向主要是对动物或人类的致病性方面，目前尚没有将假单胞菌用于异养硝化和好氧反硝化等方面的报道。
由于大部分菌株对盐度、碱度（pH值范围在7~9）条件十分敏感，大部分的脱氮或除磷菌株来自高强度废水或活性污泥，难以适应高碱、低营养比的养殖水体环境，达不到产业化有效应用。
综上所述，大部分从工业废水或活性污泥分离的菌株只能单独进行脱氮或者除磷作用，现有技术目前还缺乏在一定碱度和较高C/N比条件下，具备高效脱氮除磷能力、较高生物安全性、能单独处理高盐度、碱性的含氮磷污水的异养硝化-好氧反硝化菌株，难以使用生物方法处理高盐度、碱性的含氮磷的工业和养殖废水。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是：提供一株经过专门采集和培育、筛选得到的一株源泉假单胞菌I4，其具有特有的生物遗传特性，能够在一定盐度、碱性条件下高效降解NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N以及PO4 3--P，同时具有进行异养硝化和好氧反硝化的生物特性。本发明还提供了采用该菌株的微生物菌剂及其应用，该菌株的环境适应性良好、耐碱性突出且安全性高，可以满足沿海养殖业等高碱污水的低成本、高安全、高效去除氮、磷的需求，在近海水产养殖尾水或其他含氮磷高碱性污水的生物脱氮除磷处理方面具有良好的应用前景。
本发明的上述目的，是采用以下技术方案来实现：
一株源泉假单胞菌I4，其特征在于，其为源泉假单胞菌Pseudomonas sediminis I4，于2024年02月29日保藏在广东省微生物菌株保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：64382。
所述的源泉假单胞菌I4，为革兰氏染色阴性、菌落干燥，微隆起，用接种环难以挑起，呈圆形淡黄色，菌落周围有透明圈带，直径4-6mm，无特殊气味；具有异养硝化-好氧反硝化同步脱氮除磷的生物特性，其耐受的水体酸碱度的pH值为7～11，盐度为0～10%。
所述的源泉假单胞菌I4的应用，将其应用于含氮磷污水的生物脱氮除磷处理。
所述的含氮磷污水的碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠、蔗糖和葡萄糖中的至少一种；所述的含氮磷污水的碳氮比为0~15，磷氮比为0~1.0；pH值为5~12，盐度为0～10%；温度为20℃~40℃。
所述的源泉假单胞菌I4的应用，将其应用于养殖水体中抗生素的投放的生物安全指示剂，可用于对养殖水体中对霉素、氯曲南、链霉素、四环素、头孢唑林、诺氟沙星、亚胺培南、多粘菌素B、阿莫西林、环丙沙星、头孢西丁等的生物安全浓度的指示，当上述抗生素在养殖水体中投放的浓度达到设定值时，引发源泉假单胞菌I4的死亡。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现为：
（1）本发明通过特定地点的采集，和培育、筛选步骤，使筛选出的源泉假单胞菌I4菌株具有独特的生物特性，不仅在高盐度和碱性水体中能进行高效的异养硝化好氧反硝化进程，还能有效的脱除磷酸盐，并且还具备良好的生物安全性，能够满足沿海养殖业等高盐碱污水的低成本、高安全、高效去除氮、磷的需求。
（2）将本发明的源泉假单胞菌I4应用于含氮磷污水处理领域，在完全好氧的条件下，该菌株可分别利用NH4 +-N、NO3 --N和NO2 --N作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；其降解效率达到最高分别可达88.42%、83.64%、95.45%。对应PO4 3-去除效率为100%。
（3）本发明的源泉假单胞菌I4同时具有异养硝化和好氧反硝化的生物特性，可利用多种有机碳源的同时对高浓度的有机碳有很强的耐受性，具有较好的水体有机碳去除能力，该菌株尤其适合于高C/N的含氮磷污水的处理。
（4）本发明的源泉假单胞菌I4能耐受7~11的pH值，在此pH值范围内的脱氮除磷效果不受影响。该菌株不仅能应用于常规养殖水体pH值范围，而且可用于高碱水体的脱氮除磷，一定程度上突破了高碱水体对微生物处理含碱废水处理的限制。在现有的耐碱研究中，pH值范围在7~9，而本发明的pH值范围为7~11，分离出的菌株耐碱性能有了显著提升。该菌株的耐碱特性有助于响应国家“积极发展盐碱水养殖”号召，推动盐碱地水产养殖，增加水产养殖用地面积，防治水污染，提高生态效益。
（5）本发明的源泉假单胞菌I4能耐受7~11%的碱度，在7~11的pH值范围内的脱氮除磷效果不受影响；因此该菌不仅能应用于常规养殖水体碱度，而且可用于高碱水体的脱氮除磷，一定程度上突破了高碱对微生物处理含盐废水处理的限制。将该菌株应用于盐碱地、含氮磷工业废水的处理，有利于简化废水处理工艺，提高处理效率，符合环境友好要求，具有良好的经济及环保效益。
（6）本发明的源泉假单胞菌I4能更好的利用有机底物，生长速度快，容易达到较高的生物量浓度，保持高脱氮率的同时实现有机碳的去除。
（7）本发明的源泉假单胞菌I4，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性；并对霉素、氯曲南、链霉素、四环素、头孢唑林、诺氟沙星、亚胺培南、多粘菌素B、阿莫西林、环丙沙星、头孢西丁等多种临床常用抗生素表现为敏感，具有较高的生态安全性，能够作为养殖水体中抗生素投放安全浓度的指示剂。
（8）本发明的源泉假单胞菌I4，能克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，使硝化和反硝化作用在同一好氧反应器内同步进行成为可能。将该菌株运用于水产养殖水体的微生物脱氮工艺，有利于减少设备占地面积和建设成本，提高处理效率，还能大幅减少水产养殖过程中的周期性换水，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例的源泉假单胞菌I4在营养琼脂平板上的菌落形态图；
图2为本发明实施例的源泉假单胞菌I4的革兰氏染色图；
图3为本发明实施例的源泉假单胞菌I4的扫描电镜图，包括A-C，其中，A为细菌形态，B为I4长度，C为I4宽度；
图4为本发明实施例的源泉假单胞菌I4在不同有机碳源和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮除磷效果对比图，包括A-C，其中，A唯一氮源为NH4 +-N，B唯一氮源为NO3 --N，C唯一氮源为NO2 --N；
图5为本发明的源泉假单胞菌I4在不同C/N和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮除磷效果对比图，包括A-C，其中，A唯一氮源为NH4 +-N，B唯一氮源为NO3 --N，C唯一氮源为NO2 --N；
图6为本发明的源泉假单胞菌I4在不同P/N和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮除磷效果对比图，包括A-C，其中，A唯一氮源为NH4 +-N，B唯一氮源为NO3 --N，C唯一氮源为NO2 --N；
图7为本发明的源泉假单胞菌I4在不同pH和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮除磷效果对比图，包括A-C，其中，A唯一氮源为NH4 +-N，B唯一氮源为NO3 --N，C唯一氮源为NO2 --N；
图8为本发明的源泉假单胞菌I4在不同温度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮除磷效果对比图，包括A-C，其中，A唯一氮源为NH4 +-N，B唯一氮源为NO3 --N，C唯一氮源为NO2 --N；
图9为本发明的源泉假单胞菌I4在不同盐度和不同无机氮源条件下的生长情况和脱氮除磷效果对比图，包括A-C，其中，A唯一氮源为NH4 +-N，B唯一氮源为NO3 --N，C唯一氮源为NO2 --N；
图10是斑马鱼在本发明实施例的源泉假单胞菌I4菌液中的时间-存活率结果图；
图11是本发明实施例临床常用抗生素对本发明的源泉假单胞菌I4的抑菌作用图，包括A-Q，其中，A为新霉素、B为头孢噻吩、C为氯曲南、D为链霉素、E为甲硝唑、F为四环素、G为青霉素、H为头孢唑林、I为诺氟沙星、J为红霉素、K为苯唑西林、L为亚胺培南、M为多黏菌素B、N为磺胺、O为阿莫西林、P为环丙沙星、Q为头孢西丁。
具体实施方式
下面结合附图1-11及实施例，对本发明作进一步详细描述。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
在各实施例的实验中，NH4 +、NO3 -、NO2 -三种氮元素的测定与分析方法均参考于国标，其中：
NH4 +的测定与分析根据《水质-氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》（GB HJ535-2009）；
NO3 -的测定与分析根据《水质-硝酸盐氮的测定-紫外分光光度法》（GB HJ/T346-2007）；
NO2 -的测定与分析根据《水质-亚硝酸盐氮的测定-分光光度法》（GB 7493-87）；
PO4 3--P采用钼酸铵分光光度法。
本发明申请涉及菌株的《存活性报告书》记载了如下内容：申请人申请保藏的一株源泉假单胞菌I4生物材料样品，名称为Pseudomonas sediminis I4，分类学名称为Pseudomonas sediminis ，该样品已于2024年02月29日保藏在广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：64294，2024年02月29日检测结果是存活。
实施例1
请参见附图1-3，本发明实施例提供的一株源泉假单胞菌I4，是一株同时具有异养硝化和好氧反硝化生物特性的细菌，其为源泉假单胞菌Pseudomonas sediminis I4，已于2024年02月29日保藏在广东省微生物菌株保藏中心（GDMCC），保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：64382，保藏结论为存活。
所述异养硝化和好氧反硝化细菌源泉假单胞菌I4为革兰氏染色阴性、菌落在营养琼脂上外表干燥，微隆起，用接种环难以挑起，呈圆形淡黄色，菌落周围有透明圈带，直径4-6mm，无特殊气味。具有异养硝化-好氧反硝化同步脱氮除磷的生物特性，其耐受的水体酸碱度为pH 值7～11、盐度为0～10%，生长效率较优的盐度为0～2%，与传统的假单胞菌株具有显著的区别。
所述的源泉假单胞菌I4的应用，将其应用于含氮磷污水的生物脱氮除磷处理。
所述的含氮磷污水的碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠、蔗糖和葡萄糖中的至少一种；所述的含氮磷污水的碳氮比为0~15，磷氮比为0~1.0，pH值为5~12，盐度为0～10%，温度为20℃~40℃。
所述的源泉假单胞菌I4的应用，将其应用于养殖水体中抗生素的投放的生物安全指示剂，可用于对养殖水体中对霉素、氯曲南、链霉素、四环素、头孢唑林、诺氟沙星、亚胺培南、多粘菌素B、阿莫西林、环丙沙星、头孢西丁等抗生素的生物安全浓度的指示，当上述抗生素在养殖水体中投放的浓度达到设定值时，引发源泉假单胞菌I4的死亡。
该源泉假单胞菌I4是从水产养殖池塘和排水沟渠中采集原始菌株后，经富集、分离和筛选而得到的筛选株。
该源泉假单胞菌I4的原始菌株，是采用梅花点采样法定点取样，从水产养殖池塘和排水沟渠的水样以及泥样中混合采集，分别采集表层、中层以及深层水体和底泥，分别获得水样混合样品和泥样混合样品；
I4的筛选株是采用如下的方法，从混合样品中富集、分离与筛选而得到，包括如下步骤：
S1、样品预处理：称取适量的泥样混合样品加入加有无菌生理盐水和少许灭菌玻璃珠的锥形瓶中，稀释为10倍的悬浮液，塞上棉塞；以振荡，使泥样混合样品均匀打散，微生物充分悬浮于生理盐水中，获得泥样混合物；以同样的方法处理水样、得到水样混合物；
S2、富集培养：取适量泥样混合物于富集培养基，摇床培养，得到富集泥样；取水样混合物于富集培养基，摇床培养，得到富集水样；
S3、样品富集液平板涂布：取相同容量的上述富集培养后的富集水样和富集泥样，加入到无菌生理盐水中将其稀释到10 -2，取各装有无菌水的试管多支，编号为“稀释倍数+水样/泥样”，用移液枪吸取试管内悬浮液加入编号为“泥样-10 -2”的试管中，并在试管内轻轻反复吹洗数次，即成为10 -2的泥样稀释液，同法依次连续稀释为10 -10的泥样稀释液；并同法完成富集水样的稀释，得到水样稀释液；重复操作，将富集水样和富集底泥稀释到10-10；分别取10 -7～10 -10的水样泥样稀释液和泥样稀释液，取适量稀释液于已制备好的BTB平板中，用灼烧后的涂布器沿一个方向涂匀，并置于恒温生化培养箱中倒置培养，得到不同形态的菌落；
S4、分离纯化：观察不同稀释度下的平板，选取菌落数在30～300的平板，舍弃不符合的平板；用接种环挑取不同形态和质地的单菌落，并用平板采用“之”字形进行四区分区划线，用接种环取菌落于一区内并作数次划线，再在二、三、四区依次划线，每划完一个区域均将接种环灭菌一次并冷却，再划下一个区域；在室温中晾干后倒置，于恒温生化培养箱中培养；挑取第三或第四区的单菌落进行草酸铵结晶紫进行单染色后，镜检验纯；若不纯，继续重复分区划线，或者增加稀释倍数再次富集培养，直到得到纯化的单菌落；
S5、点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于BTB反硝化鉴定培养基中培养；根据菌落生长情况和菌落周围BTB培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的菌株，观察蓝色晕圈、越大，则反硝化能力越高；接种于斜面，恒温培养后，将试管置于4℃保藏；
S6、菌株扩大培养：配置营养肉汤培养基，于高压蒸汽灭菌；将四株菌种分别接种于已灭菌的营养肉汤培养基中， 恒温培养，使菌株生长至对数生长期；
S7、硝化与反硝化性能复筛：配置复筛培养基并灭菌，将四株菌种分别加入到复筛培养基中，每组三个平行，恒温培养；分别在0h、12h、24h、36h、48h时间点取适量样品，测定OD600，超高速离心 5min 后，分别测定上清液NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N以及PO4 3--P的含量，选取其中性状最优的一株，即为I4菌株。
更为具体的，本发明实施例源泉假单胞菌I4菌株的采集、选育、分离、鉴定的具体过程如下：
1、原始菌株样品采集
本发明的源泉假单胞菌I4的原始菌株是从广东省珠海市斗门区南水产养殖池塘的水样以及泥样采集，然后经过筛选、分离而得到。样品采集根据《土壤环境监测技术规范》（HJ/T 166-2004）中的“混合样品采集方法”，采用梅花点采样法定点取样，从养殖池塘中采集表层、中层以及深层水体和底泥于无菌采样袋中，4℃冷藏运输储藏备用。
2、培养基及溶液的配置
（1）盐溶液（g/L）：NaCl 2.5g，MgSO4·7H2O 2.5g，MnSO4·4H2O 0.05g，FeSO4·7H2O0.05g；调pH至6，4℃密封避光保存；
（2）微量元素溶液（g/L）：MgSO4·7H2O 50.0g，CaCl2·2H2O 5.5g, CuSO4·5H2O1.57g，ZnSO4·7H2O 2.2g，FeSO4·7H2O 5.0g，MnCl2·4H2O，CoCl2·6H2O 1.60g， Na2EDTA50.0g；
（3）富集培养基（g/L）：琥珀酸钠 5.62g，KH2PO4 0.087g，(NH4)2 SO4 0.472g，NaNO30.24g，NaNO2 0.165g，盐溶液 50mL；
（4）BTB培养基（g/L）：无水柠檬酸钠 5.66g，KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，Na2HPO4 7.9g，NaNO3 0.842g，NaNO2 0.362g，NH4Cl 0. 192g，琼脂 25g，1% BTB 乙醇溶液1mL，微量元素溶液 2mL，调节pH 至7.0～7.5；
（5）单一氮源发酵培养基（DMⅠ）（g/L）：4.08g 柠檬酸钠，0.087g KH2PO4、0.472g(NH4)2 SO4，微量元素溶液 2 mL，pH 7.0；
（6）单一氮源发酵培养基（DMⅡ）（g/L）：4.08g 柠檬酸钠、0.087g KH2PO4、0.607gNaNO3，微量元素溶液 2 mL，pH 7.0；
（7）单一氮源发酵培养基（DMⅢ）（g/L）：4.08g 柠檬酸钠、0.087g KH2PO4、0.4928gNaNO2，微量元素溶液 2 mL，pH 7.0。
上述实验所用到的基础培养基，均经121℃、20min高压蒸汽灭菌后使用。
3、异养硝化-好氧反硝化菌株I4富集、分离与筛选
（1）样品预处理：称取10g底泥样品于加有90mL无菌生理盐水和少许灭菌玻璃珠的锥形瓶中，即为稀释10倍的悬浮液，塞上棉塞（此过程于超净工作台中操作）。以160r/min的转速，振荡1h，使底泥样品均匀打散，微生物充分悬浮于生理盐水中；（水样同理处理）；
（2）富集培养：取22.2mL上述混合物（10 -1底泥）于200mL富集培养基，在30℃，160r/min摇床培养24h；取10mL水样于90mL富集培养基，在30℃，160r/min摇床培养24h。该步骤主要增加目的菌株的数量，以便于后续菌株的分离和纯化；
（3）样品富集液平板涂布：取上述富集培养后的水样和泥样各1mL，加入到9mL无菌生理盐水中将其稀释到10 -2，取各装有9mL无菌水的试管55支，编号为“稀释倍数+水样/泥样”，用移液枪吸取试管内悬浮液1mL加入编号为“泥样-10 -2”的试管中，并在试管内轻轻反复吹洗数次，即成为10 -2的泥样稀释液，同法依次连续稀释为10 -10的泥样稀释液。并同法完成水样的稀释。重复操作，将水样和底泥稀释到10 -10。分别取10 -7～10 -10的水样和底泥（每个梯度3个平行，1个空白对照），取100μL稀释液于已制备好的BTB平板中，用灼烧后的涂布器沿一个方向涂匀。并置于30℃恒温生化培养箱中倒置培养2d，得到不同形态的菌落。
（4）分离纯化：观察不同稀释度下的平板，选取菌落数在30～300的平板，舍弃不符合的平板。用接种环挑取不同形态和质地的单菌落，并用平板采用“之”字形进行四区分区划线，用接种环取菌落于一区内并作数次划线，再在二、三、四区依次划线，每划完一个区域均将接种环灭菌一次并冷却，再划下一个区域（重复3～4次）。在室温中晾干后倒置，于30℃恒温生化培养箱中培养2～3d。挑取第三或第四区的单菌落进行草酸铵结晶紫进行单染色后，镜检验 纯。若不纯，继续重复分区划线，或者增加稀释倍数再次富集培养，直到得到纯化的单菌落。最后，用100×油镜观察并拍照记录。
（5）点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于BTB反硝化鉴定培养基中培养2~3天。根据菌落生长情况和菌落周围BTB培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的菌株四株，各菌株的蓝色晕圈越大，表征其反硝化能力越高；分别接种于斜面30℃恒温培养2~3天后试管置于4℃保藏；
（6）菌株扩大培养：配置营养肉汤培养基，于 121℃，20min 条件下高压蒸汽灭菌；将四株菌种分别接种于已灭菌的营养肉汤培养基中，30℃、160rpm 恒温培养 16h，使菌株生长至对数生长期；
（7）硝化与反硝化性能复筛：配置复筛培养基并灭菌，将四株菌种分别加入到复筛培养基中，每组三个平行，30℃、160rpm恒温培养；分别在0h、12h、24h、36h、48h时间点取适量样品，测定OD600，12000rpm、4℃超高速离心 5min 后，分别测定上清液NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N以及PO4 3--P的含量，选取其中性状最优的一株，即为I4菌株。
4、异养硝化-好氧反硝化菌株I4鉴定
（1）形态学鉴定：经过上述筛选分离后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株I4，该菌株革兰氏反应为阴性，菌落干燥，微隆起，用接种环难以挑起，呈圆形淡黄色，菌落周围有透明圈带，直径4-6mm，无特殊气味。在扫描电镜下，菌体呈杆状，无鞭毛结构，长度约为4.33±1.1μm。
（2）分子生物学鉴定：菌株WM32的DNA提取采用Takara Lysis Buffer forMicroorganism to Direct PCR裂解酶。以此模板扩增其16S rDNA，扩增采用一对通用引物：上游引物（27F）：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物（1492R）：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'。通用引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系（25μL）：2×UniqueTM Taq Master Mix（With Dye） 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR程序如下：①94℃，5 min；②94℃预变性，1min；③55℃退火，1min；④72℃延伸1.5min；⑤72℃，10min；②~④循环30次。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果。PCR扩增的16SrDNA产物测序由上海生物工程有限公司完成。
经过上述筛选、分离后得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株I4，其生理生化特征见表1；菌株I4的16s rDNA序列长度为1361bp，核苷酸序列如附后的序列表。
表1
注：“+”为阳性；“-”为阴性
经过上述采集、培育、筛选步骤后，得到一株异养硝化-好氧反硝化菌株I4，综合其16SrDNA、细菌形态、菌落形态以及生理生化等各项鉴定项目，判断菌株I4为源泉假单胞菌（Pseudomonas sediminis）。
本实施例还提供一种微生物菌剂，其是以前述的源泉假单胞菌I4作为活性成分，具体浓度可以根据具体用途而选择。
实施例2
参见附图4-9，本实施例是在实施例1的基础上，提供所述的源泉假单胞菌I4的应用，将其应用于含氮磷污水的生物脱氮除磷处理。
所述的含氮磷污水的碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠、蔗糖和葡萄糖中的至少一种；所述的含氮磷污水的碳氮比为0~15，pH值为5~12，温度为20℃~40℃，盐度为0~10%。
源泉假单胞菌I4（以下简称I4）最优生长及脱氮条件测试过程如下：
（1）不同有机碳源对源泉假单胞菌I4生长及脱氮性能影响
选择草酸钠、琥珀酸钠、葡萄糖以及柠檬酸钠四种碳源，固定C/N=10，30℃、160r/min、pH=7.0。以DM发酵培养基为基础，草酸钠、琥珀酸钠、葡萄糖以及柠檬酸钠四种有机碳源每升培养基加入量分别为5.58g、5.62g、2.50g、4.08g；作为单一无机氮源的(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养16h，再以1%的接种量，分别接入不同有机碳源的上述反硝化培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD600，8000r/min，4℃，高速离心5~10min后取上清分别测定NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N三种氮元素以及PO4 3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析选择草酸钠、琥珀酸钠、葡萄糖以及柠檬酸钠四种不同的有机碳源对I4生长情况及脱氮除磷效果的影响，具体结果见图4。
（2）不同C/N对I4生长及脱氮性能影响
选择柠檬酸钠作为反硝化培养基碳源，固定30℃、160r/min、P/N=0.2、pH=7.0等条件，设置C/N梯度为0、2、5、10、15。每种梯度的培养基琥珀酸钠加入量为0g/L、1.125g/L、2.812g/L、5.62g/L、8.44g/L；作为单一无机氮源的(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养16h，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD600，8000r/min，4℃高速离心5~10min后取上清分别测定NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N三种氮元素以及PO4 3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0、2、5、10、15五种不同的C/N对I4生长情况及脱氮除磷效果的影响，具体结果见图5。
（3）不同P/N对I4生长及脱氮性能影响
选择柠檬酸钠作为反硝化培养基碳源，固定30℃、160r/min、C/N=10、pH=7.0等条件，设置P/N梯度为0、0.1、0.2、0.4、0.8。每种梯度的培养基KH2PO4加入量为0.0000g/L、0.0430g/L、0.0870g/L、0.2193g/L、0.4387g/L；作为单一无机氮源的(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养16h，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD600，8000r/min，4℃高速离心5~10min后取上清分别测定NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N三种氮元素以及PO4 3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0、0.1、0.2、0.5、1.0五种不同的P/N对I4生长情况及脱氮除磷效果的影响，具体结果见图6。
（4）不同pH对I4生长及脱氮性能影响
固定C/N=10，P/N=0.2、30℃、160r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置pH梯度为5、6、7、8、9、10、11、12。作为单一无机氮源的(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养16h，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD600，8000r/min，4℃高速离心5~10min后取上清分别测定NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N三种氮元素以及PO4 3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析5、6、7、8、9、10、11、12八种不同的pH对I4生长情况及脱氮除磷效果的影响，具体结果见图7。
（5）不同温度对I4生长及脱氮性能影响
固定C/N=10、pH=7.0、160r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置温度梯度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。作为单一无机氮源的(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养16h，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD600，8000r/min，4℃高速离心5~10min后取上清分别测定NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N三种氮元素以及PO4 3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五种不同的温度对I4生长情况及脱氮除磷效果的影响，具体结果见图8。
（6）不同盐度对I4生长及脱氮性能影响
固定C/N=10、P/N=0.2、pH=7.0、160r/min、柠檬酸钠为单一有机碳源等条件，设置盐度梯度为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%。盐度通过额外添加NaCl来控制，其每升对应的添加量为0g、0.5g、1。0g、1.5g、2.0g、3.0g、5.0g、7.0g、10.0g。作为单一无机氮源的(NH4)2SO4、NaNO3、NaNO2每升培养基加入量分别为0.472g、0.607g、0.493g。取候选菌株分别接种于营养肉汤培养基中，以30℃，160r/min培养16h，再以1%的接种量，分别接入上述培养基中，于0h、4h、8h、12h、24h、36h、48h取培养液测定其OD600，8000r/min，4℃高速离心5~10min后取上清分别测定NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N三种氮元素以及PO4 3--P含量。实验设置3个技术重复的实验组以及一个空白对照组，对照组加入等接种量的生理盐水。分析0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%九种不同的盐度对I4生长情况及脱氮除磷效果的影响，具体结果见图9。
通过本实施例及图4-图9和实施例1的表1可以看出，I4菌株能够用柠檬酸钠、琥珀酸钠等多种有机碳源生长。利用柠檬酸钠生长时，生长情况和氮磷的去除效果最好。在C/N为0~15、P/N为0~1、pH为7~11、盐度为0%～3%、温度为25℃~35℃下都能生长，在C/N为0时，I4仍能进行生长，说明其能通过聚磷和释磷来进行能量代谢；当P/N为0时，氮的去除效果明显不如P/N比为0.1时，说明P为I4生长代谢必备元素；当盐度从0升高至2%时，菌株生长情况随之增进，说明该菌适宜低盐条件，当NO3 --N为单一氮源时，能够在低温下正常生长，说明该菌在该条件下对硝态氮有一定偏好性。最佳脱氮条件为碳源使用柠檬酸钠、C/N=10、P/N=0.2、pH=8、T=30℃。I4脱氮效率分别为88.42%、83.64%、95.45%，其对应磷的去除率分别为100%。最佳脱氮除磷条件下，pH值从7升高至11，其对应的氮磷元素去除率在统计学上没有显著性差异，说明其对碱性环境具有很好的耐受性。
实施例3
参见附图10-11，本实施例是在实施例1和实施例2的基础上，提供另一种源泉假单胞菌I4的应用，将其应用于养殖水体中多种抗生素的投放的生物安全指示剂，发现其对养殖水体中对新霉素、氯曲南、链霉素、四环素、头孢唑林、诺氟沙星、亚胺培南、多粘菌素B、阿莫西林、环丙沙星、头孢西丁等抗生素呈敏感，可用于对养殖水体中的多种抗生素生物安全浓度的指示，当上述抗生素在养殖水体中投放的浓度达到设定值时，引发源泉假单胞菌I4的死亡。环境安全性评价的实验的具体过程如下：
(1)鱼类毒性实验：选取体长在3±1cm范围内，健康的斑马鱼（Danio rerio），于持续曝气的大水体中暂养30天，期间正常喂食与定期换水；状态稳定后随机分配到15L玻璃缸中，设置加入菌液的实验组（Pseudomonas sediminis I4）和加入等体积无菌水的对照组（CRT），每个实验组30条斑马鱼，每组设置3个重复；取过夜培养的菌液，8000r/min，5min离心后弃上清，用无菌PBS缓冲液重悬，重复1~2次后用灭菌水悬浮，根据测定的标准曲线得到OD600与菌浓度之间的关系，调节实验水体菌浓度约1×108CFU/mL，空白对照组则加入等量的灭菌水；实验期间，实验对象正常喂养且每三天对实验水体进行完全更换，换水后重复上述方法分别加入菌液和灭菌水，记录下每个组斑马鱼存活率，实验持续14d；
参见附图10，在正常条件下养殖14天，对照组斑马鱼存活率为100%，实验组水体中试验菌浓度为108 CFU/mL，高于常见病原菌的致病剂量（104 CFU/mL）；实验组斑马鱼存活率为100%，与对照组无显著差异（p>0.05）；初步判断源泉假单胞菌I4具有较高的水生生物安全性。
（2）常用抗生素耐药性实验：抗生素耐药性实验（抗生素纸片药敏试验）实验方法步骤和评判标准根据《M100 抗微生物药敏感性试验执行标准（第十三版）》和《M02-A10抗菌药物敏感试验纸片法执行标准（Vol. 32 No. 1）》；具体步骤如下：
a）配置MHA（广东环凯生物科技有限公司）平板，矫正pH=7.2~7.4；
b) 使用无菌空白药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）制作对应药物含量的纸片；
c) 取菌株接种于营养肉汤培养基中，30℃，160r/min培养至对数期，实验前稀释到指定浓度；
d) 使用一次性灭菌棉签蘸取稀释后的菌液，在离心管壁挤干水分后在MHA平板上均匀涂布，室温干燥5min；
e) 使用无菌镊子将含有抗生素的纸片呈等边三角形贴于MHA平板，每个实验设置3个平行重复组；
f) 15min内倒置平板，于30℃恒温培养18h；
g) 使用IP54金属壳数显游标卡尺（永康市晶思达贸易有限公司）测量抑菌圈直径；
观察抑菌圈大小，参见附图11（A-Q分别为新霉素、头孢噻吩、氯曲南、链霉素、甲硝唑、四环素、青霉素、头孢唑林、诺氟沙星、红霉素、苯唑西林、亚胺培南、多黏菌素B、磺胺、阿莫西林、环丙沙星、头孢西丁），结果发现I4菌株对新霉素、氯曲南、链霉素、四环素、头孢唑林、诺氟沙星、亚胺培南、多粘菌素B、阿莫西林、环丙沙星、头孢西丁等抗生素具有敏感性，对红霉素呈中介，对头孢噻吩、甲硝唑、青霉素、苯唑西林、磺胺具有耐药性，抗生素耐药性试验结果具体参见表2。
因此，I4菌株对多种抗生素呈敏感，为日后实际应用时养殖池塘中各种抗生素的投放安全浓度提供参考，也为I4菌株的杀灭提供防治手段，保障I4菌株的生物安全性。
表2
注：R：敏感；I：中介；S：耐药
综合上述各实施例，本发明采集、培育、筛选出的I4菌株不仅在高盐碱性条件下能进行较好的异养硝化好氧反硝化进程，还能有效的脱除磷酸盐。将本发明提供的I4菌株应用于高碱的氮磷水产养殖尾水处理领域，对水产养殖对象无不良影响，具有较高的水生生物生物安全性。适宜在大多数的养殖水体应用；其同时具有异养硝化好氧反硝化以及脱磷功能；可利用多种有机碳源的同时对高浓度的有机碳以及碱度有很强的耐受性，具有较好的水体有机碳去除能力。该菌株尤其适合于高C/N的含氮污水的处理；在完全好氧的条件下，该菌株可分别利用NH4 +、NO3 -和NO2 -作为唯一无机氮源进行好氧硝化和反硝化脱氮；该菌株能克服不同需氧量引起的硝化反硝化不相容问题，使硝化和反硝化作用在同一好氧反应器内同步进行成为可能，具有良好的经济及环保效益，应用前景广阔。
最后应当说明的是，尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (9)
1.一株源泉假单胞菌I4，其特征在于，其为源泉假单胞菌Pseudomonas sediminis I4，于2024年02月29日保藏在广东省微生物菌株保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：64382。
2.根据权利要求1所述的源泉假单胞菌I4，其特征在于，其为革兰氏染色阴性、菌落干燥，微隆起，用接种环难以挑起，呈圆形淡黄色，菌落周围有透明圈带，直径4-6mm，无特殊气味；具有异养硝化-好氧反硝化同步脱氮除磷的生物特性，其耐受的水体pH值为7～11，盐度为0～10%。
3.根据权利要求1所述的源泉假单胞菌I4，其特征在于，所述源泉假单胞菌I4，是从水产养殖池塘和排水沟渠中采集原始菌株后，经富集、分离和筛选而得到。
4.根据权利要求3所述的源泉假单胞菌I4，其特征在于，其原始株是采用如下方法采集得到：
该源泉假单胞菌I4的原始菌株，是采用梅花点采样法定点取样，从水产养殖池塘和排水沟渠的水样以及泥样中混合采集，分别采集表层、中层以及深层水体和底泥，分别获得水样混合样品和泥样混合样品。
5.根据权利要求3所述的源泉假单胞菌I4，其特征在于，其原始株是采用如下的方法，从混合样品中富集、分离与筛选而得到：
S1、样品预处理：称取适量的泥样混合样品加入加有无菌生理盐水和少许灭菌玻璃珠的锥形瓶中，稀释为10倍的悬浮液，塞上棉塞；以振荡，使泥样混合样品均匀打散，微生物充分悬浮于生理盐水中，获得泥样混合物；以同样的方法处理水样、得到水样混合物；
S2、富集培养：取适量泥样混合物于富集培养基，摇床培养，得到富集泥样；取水样混合物于富集培养基，摇床培养，得到富集水样；
S3、样品富集液平板涂布：取相同容量的上述富集培养后的富集水样和富集泥样，加入到无菌生理盐水中将其稀释到10 -2，取各装有无菌水的试管多支，编号为“稀释倍数+水样/泥样”，用移液枪吸取试管内悬浮液加入编号为“泥样-10 -2”的试管中，并在试管内轻轻反复吹洗数次，即成为10 -2的泥样稀释液，同法依次连续稀释为10 -10的泥样稀释液；并同法完成富集水样的稀释，得到水样稀释液；重复操作，将富集水样和富集底泥稀释到10 -10；分别取10 -7～10 -10的水样泥样稀释液和泥样稀释液，取适量稀释液于已制备好的BTB平板中，用灼烧后的涂布器沿一个方向涂匀，并置于恒温生化培养箱中倒置培养；
S4、分离纯化：观察不同稀释度下的平板，选取菌落数在30～300的平板，舍弃不符合的平板；用接种环挑取不同形态和质地的单菌落，并用平板采用“之”字形进行四区分区划线，用接种环取菌落于一区内并作数次划线，再在二、三、四区依次划线，每划完一个区域均将接种环灭菌一次并冷却，再划下一个区域；在室温中晾干后倒置，于恒温生化培养箱中培养；挑取第三或第四区的单菌落进行草酸铵结晶紫进行单染色后，镜检验纯；若不纯，继续重复分区划线，或者增加稀释倍数再次富集培养，直到得到纯化的单菌落；
S5、点接初筛：使用接种针挑取纯化后菌株点接于BTB反硝化鉴定培养基中培养；根据菌落生长情况和菌落周围BTB培养基中蓝色晕圈大小挑选出反硝化能力高的数株菌株，观察各菌株的蓝色晕圈、越大，则表征其反硝化能力越高；分别接种于斜面，恒温培养后，将试管置于4℃保藏；
S6、菌株扩大培养：配置营养肉汤培养基，于高压蒸汽灭菌；将数株菌种分别接种于已灭菌的营养肉汤培养基中， 恒温培养，使菌株生长至对数生长期；
S7、硝化与反硝化性能复筛：配置复筛培养基并灭菌，将数株菌种分别加入到复筛培养基中，每组三个平行，恒温培养；分别在0h、12h、24h、36h、48h时间点取适量样品，测定OD600，超高速离心 5min 后，分别测定上清液NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N以及PO4 3--P的含量，选取其中性状最优的一株。
6.根据权利要求1-5任一项所述源泉假单胞菌I4的应用，其特征在于，将其应用于含氮磷污水的生物脱氮除磷处理。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的含氮磷污水的碳源为柠檬酸钠、琥珀酸钠、蔗糖和葡萄糖中的至少一种；所述的含氮磷污水的碳氮比为0~15，磷氮比为0~1.0，pH值为5~12，温度为20℃~40℃，盐度为0～10%。
8.根据权利要求1-5任一项所述源泉假单胞菌I4的应用，其特征在于，将其应用于养殖水体中抗生素投放的生物安全指示剂。
9.一种微生物菌剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的源泉假单胞菌Pseudomonas sediminis I4作为活性成分。
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