CN118006691A - 一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗及制备方法与应用 - Google Patents

一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗及制备方法与应用，涉及疫苗技术领域。将表位多肽Pep‑EB表位、Pep‑ETh表位和Pep‑ECTL表位以多表位与IBV广西优势基因型(LX4型)和优势血清型(血清Ⅰ型)代表性毒株GX‑YL5的S1基因、S2基因的跨膜区和胞质尾区(TM/CT)以柔性肽串联，并化学合成基因片段rS‑EB‑Th‑CTL，如SEQ ID NO:4所示；本发明巧妙利用柔性肽、S2蛋白的跨膜区和胞质尾区蛋白的作用及VLPs良好的抗原展示效果，将多个表位通过串联更加立体，高密度的表达嵌合在VLPs表面，免疫原性更强，更加稳定。

Description

一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗及制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，更具体的说是涉及一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗及制备方法与应用。
背景技术
禽传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性呼吸道疾病。IBV基因组非常容易发生变异和重组，导致血清型复杂且不同血清型间交叉保护效果差，给全世界养鸡业带来严重经济损失。IBV流行具有地域性，不同国家和地区在不同时间流行的IBV毒株也不同。目前，国内IBV处于LX4型占优、多基因型并存的现状，LX4承受的选择压力最大且自1999年以后即为优势基因型。
疫苗免疫是防控IB最有效的措施，但传统疫苗在安全性或免疫原性方面存在缺陷，无法提供完全有效的保护。弱毒疫苗存在毒力返强的风险，并可为IBV的基因重组提供条件。灭活苗存在灭活不全的危险，单价的灭活疫苗很难控制IBV变异株引起的IB暴发，往往需要制备多价油乳灭活疫苗，且存在使用量大、需配合佐剂使用、制备复杂、抗原结构易受破坏、成本较高等缺点。此外，由于流行毒株血清型与所用疫苗株不同，常常出现免疫偏差，导致免疫失败。因此，研发针对当地优势流行株的安全高效新型疫苗具有重要的现实意义。
IBV属冠状病毒科冠状病毒属，是不分节段的单股正链RNA病毒。病毒粒子在电镜下呈圆形或多边形，有囊膜，直径在90nm～200nm，表面有长约20nm的棒状纤突。IBV有S、E、M及N四个结构蛋白。S蛋白由蛋白酶切割成S1和S2两个亚蛋白，S1蛋白具有细胞吸附和决定血清型特异性的关键抗原位点，是IBV蛋白中变异程度最大但也是最重要的结构蛋白。因此，基于IBV分子流行病学分析和疫苗研发中，S1蛋白均为首选靶基因；M蛋白在病毒粒子组装中发挥非常重要作用，在补体存在时，M蛋白还可中和病毒；E蛋白与M蛋白协同作用形成病毒样颗粒，参与病毒出芽，对传染性病毒粒子的释放至关重要。病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)是利用基因重组技术，由病毒的一个或多个结构蛋白自动组装而成但不含病毒核酸的空壳结构，形态和结构类似于天然病毒颗粒可通过和病毒感染一样的途径递呈给免疫细胞。VLPs不含病毒遗传物质不能在体内自主复制，因此也不具有传染性、安全性高。VLPs形态结构与真正的病毒粒子相似，大小为15nm～400nm之间。研究表明，VLPs作为制备新型疫苗理想的重组蛋白抗原具有以下明显的优势：(1)不含病毒遗传物质、不会产生变异或重组；(2)具有相似的免疫原性可产生特异性的体液和细胞免疫；(3)经MHC II分子提呈并活化CD4+辅助T细胞，也可经MHC I分子以“交叉呈递”的形式提呈并活化CD8+细胞毒性T淋巴细胞；(4)可激活B细胞产生高滴度的中和抗体；(5)良好的载体功能，VLPs可允许外源片段插入并在VLPs表面高效展示有效的抗原表位形成嵌合型VLPs。此外，VLPs还具有病原体相关模式分子活性、可激活固有免疫应答、产生适应性和炎症反应以控制感染、诱导机体产生体液、细胞和黏膜免疫应答。因此，基于VLPs作为疫病的新型疫苗研发已成为热点。
表位疫苗(Epitope Vaccine)，一般指利用生物信息学、结构生物学以及分子免疫学等多个交叉学科，筛选出病毒有效抗原表位并模拟其空间构象以间隔序列(Linker)串联起来，应用基因工程技术进行体外表达或者人工合成微生物抗原表位高效表达并纯化后加入免疫增强剂将其制作成的疫苗。表位疫苗具有容易生产、工艺低廉、安全性高、稳定性好、能充分展示不同毒株的优势抗原表位、不是全病毒不具有散毒风险等优点，近年来备受科研工作者的青睐。但是，表位疫苗也有缺陷，例如免疫原性差、成本较为高昂、如何选择合适的载体进行高效表达、需要反复高剂量免疫方可产生较好的免疫应答反应等。目前，IBV结构蛋白优势抗原表位嵌合VLPs的构建及其免疫机制的研究国内外还处于空白的状态。
因此，如何提供一种LX4优势基因型禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒并将其应用于疫苗制备中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种LX4优势基因型禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒，其有效地刺激了固有免疫应答、体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜免疫应答以及提供更好的免疫保护效果，可应用于制备疫苗中，具有巨大的开发潜力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，制备方法包括以下步骤：
将表位多肽Pep-EB表位、Pep-ETh表位和Pep-ECTL表位以多表位与IBV广西优势基因型(LX4型)和优势血清型(血清Ⅰ型)代表性毒株GX-YL5的S1基因、S2基因的跨膜区和胞质尾区(TM/CT)以柔性肽串联，并化学合成基因片段rS-EB-Th-CTL，如SEQ ID NO:4所示；
通过同源重组技术克隆到pFastBacTM/HBM-TOPO重组转座载体，构建了pFastBacTM/HBM-TOPO-rS-EB-Th-CTL载体，转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，获得rHBM-rS-EB-Th-CTL重组杆粒；
将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，利用IFA、Westernblot鉴定表达的重组蛋白；
上述构建并获得的分别表达IBV GX-YL5株重组S蛋白、M蛋白和E蛋白的重组杆状病毒rHBM-rS-EB-Th-CTL、rHBM-M和rHBM-E共感染Sf9细胞制备多表位嵌合VLPs(rS-EB-Th- CTLME-VLPs)，纯化后进行Westernblot、透射电镜和免疫电镜鉴定，成功制备IBV多表位嵌合VLPs即rS-EB-Th-CTLME-VLPs。
进一步的，所述表位多肽Pep-EB表位，如SEQ ID NO:1所示；
所述表位多肽Pep-ETh表位，如SEQ ID NO:2所示；
所述表位多肽Pep-ECTL表位，如SEQ ID NO:3所示；
进一步的，所述rHBM-M，如SEQ ID NO:13所示；
所述rHBM-E，如SEQ ID NO:14所示。
一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗在制备防治禽传染性支气管炎药物中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明巧妙利用柔性肽、S1和S2蛋白的跨膜区和胞质尾区蛋白的作用及VLPs良好的抗原展示效果，将多个表位通过串联更加立体，高密度的表达嵌合在VLPs表面，免疫原性更强，更加稳定。构建的多表位嵌合VLPs既有VLPs疫苗的优点，又有表位疫苗的优点，在一定程度上优于常规表位研究的表达质粒和蛋白的形式。
本发明研究内容较系统，对构建的多表位嵌合VLPs免疫应答机制的研究，既包括固有免疫、体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫，同时对多表位嵌合VLPs对不同血清型强毒株的免疫保护效果进行评价。
目前尚未有利用IBV VLPs作为呈现平台展示同种或异种病原表位的相关研究。本发明着眼于VLPs具有极强的安全性和免疫原性的优点，借鉴其表面能够重复高密度地表达或携带抗原表位、DNA、小分子的特点，首次将IBV H120的串联多表位通过GX-YL5 VLPs展示，构建嵌合VLPs并对其免疫应答机制进行研究，为今后开展针对不同血清型IBV的安全高效广谱的新型多价疫苗或IBV与其它病原的新型多联苗的研发提供理论基础和技术平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为多表位、双表位、单表位及未嵌合表位的基因片段示意图，图中：S1为IBV毒株GX-YL5 S1基因序列(去除信号肽)；Linker为柔性肽序列；EB为B细胞表位多肽序列；ETh、ECTL为T细胞表位多肽序列；TM/CT为GX-YL5毒株S基因的TM/CT序列；
图2附图为重组S基因及TOPO载体扩增产物电泳图，图中：M为DNA标准DL5000Marker；1～8分别为重组S基因片段rS-EB-Th-CTL、rS-EB-Th、rS-EB-CTL、rS-ECTL-Th、rS-EB、rS-ETh、rS-ECTL、rS的扩增产物；9为线性化的pFastBacTM/HBM-TOPO载体；10为阴性对照；
图3附图为pFastBacTM/HBM-TOPO-S特异性引物菌液PCR鉴定，图中：M为DNA标准DL5000Marker；1～8分别为S基因特异性引物菌液PCR鉴定pFastBacTM/HBM-T OPO-rS-EB-Th-CTL、pFastBacTM/HBM-TOPO-rS-EB-Th、pFastBacTM/HBM-TOPO-rS-EB-CTL、pF astBacTM/HBM-TOPO-rS-ECTL-Th、pFastBacTM/HBM-TOPO-rS-EB、pFastBacTM/HBM-TOPO-r S-ETh、pFastBacTM/HBM-TOPO-rS-ECTL以及pFastBacTM/HBM-TOPO-rS的扩增产物；9为阴性对照；
图4附图为重组杆粒PCR鉴定，图中：(A)为未纯化的重组杆粒PCR鉴定；(B)为纯化的重组杆粒PCR鉴定，M1和M为DL 5000DNA Ladder；M2为DL 500DNA Marker；1为rHBM-rS-EB-Th-CTL；2为rHBM-rS-EB-Th；3为rHBM-rS-EB-CTL；4为rHBM-rS-ECTL-Th；5为rHBM-rS-EB；6为rHBM-rS-ETh；7为rHBM-rS-ECTL；8为rHBM-rS；9为阴性对照；
图5附图为重组杆状病毒PCR鉴定，图中：M为DL5000 DNA Marker；1～8为M13引物鉴定和9～16为特异性引物鉴定rHBM-rS-EB-Th-CTL、rHBM-rS-EB-Th、rHBM-rS-EB-CTL、rHBM-rS-ECTL-Th、rHBM-rS-EB、rHBM-rS-ETh、rHBM-rS-ECTL以及rHBM-rS；17为M13引物鉴定空载体；18为Sf9细胞对照；
图6附图为IFA检测重组蛋白的表达(感染后96h，10×20倍)，图中：A为rS-EB-Th-CTL；B为rS-EB-Th；C为rS-EB-CTL；D为rS-ECTL-Th；E为rS-EB；F为rS-ETh；G为rS-ECTL；H为rS；I为空载体对照；J为Sf9细胞对照；
图7附图为重组rS蛋白的Western blot鉴定，图中：M为蛋白质分子量标准；1为rS-EB-Th-CTL；2为rS-EB-Th；3为rS-EB-CTL；4为rS-ECTL-Th；5为rS-EB；6为rS-ETh；7为rS-ECTL；8为rS；9为空载体对照；
图8附图为气管环中和试验检测免疫多表位嵌合重组S蛋白鸡中和抗体水平；
图9附图为免疫多表位嵌合重组S蛋白鸡外周血T淋巴细胞含量，图中：(A)为CD3+T淋巴细胞含量；(B)为CD4+T淋巴细胞含量；(C)为CD8+T淋巴细胞含量；
图10附图为免疫多表位嵌合重组S蛋白鸡血清中IL-4和IFN-γ含量，图中：(A)为IL-4含量；(B)为IFN-γ含量；
图11附图为纯化rS-EB-Th-CTLME VLPs的Western blot鉴定，图中：1为rS-EB-Th- CTLME-VLPs；2为空载体对照；
图12附图为透射电镜和免疫电镜观察rS-EB-Th-CTLME VLPs的形成，图中：(A)为透射电镜；(B)为免疫电镜；
图13附图为免疫多表位嵌合VLPs鸡的细胞因子检测，图中：(A)为IL-1β；(B)为IL-6；(C)为IL-8；(D)为IL-12；(E)为IFN-α；(F)为IFN-β；
图14附图为免疫多表位嵌合VLPs鸡的ISGs检测，图中：(A)为Mx；(B)为PKR；(C)为OAS；(D)为Viperin；(E)为IFITM3；(F)为IFIT5；
图15附图为免疫多表位嵌合VLPs鸡的IBV中和抗体水平，图中：(A)为GX-YL5毒株；(B)为M41毒株；(C)为QZ181028毒株；
图16附图为免疫多表位嵌合VLPs鸡外周血T淋巴细胞含量；图中：(A)为CD3+T淋巴细胞含量；(B)为CD4+T淋巴细胞含量；(C)CD8+T淋巴细胞含量；
图17附图为免疫多表位嵌合VLPs鸡血清的IL-4和IFN-γ含量，图中：(A)为IL-4含量；(B)为IFN-γ含量；
图18附图为免疫多表位嵌合VLPs鸡泪拭子和咽拭子的sIgA含量，图中：(A)为泪拭子的sIgA含量；(B)为咽拭子的sIgA含量；
图19附图为气管(A)和肾脏(B)病变观察(5dpi，400×)，图中：A、B和C分别为免疫rS-EB-Th-CTLME-VLPs攻毒GX-YL5、M41和GX-QZ181028；D、E和F分别为免疫rSME-VLPs攻毒GX-YL5、M41和GX-QZ181028；G、H和I分别为免疫灭活苗H120攻毒GX-YL5、M41和GX-QZ181028；J、K和L分别为免疫灭活苗GX-YL5攻毒GX-YL5、M41和GX-QZ181028；M、N和O分别为免疫TOPO载体攻毒GX-YL5、M41和GX-QZ181028；P、Q和R为空白对照攻毒GX-YL5、M41和GX-QZ181028；
图20附图为气管和肾脏中的病毒载量(5dpi)，图中：(A)为气管病毒载量；(B)为肾脏病毒载量；
图21附图为攻毒后各观察组咽拭子和肛拭子排毒情况，图中：(A)为3dpi咽拭子病毒载量；(B)为3dpi肛拭子病毒载量；(C)为5dpi咽拭子病毒载量；(D)为5dpi肛拭子病毒载量；(E)为7dpi咽拭子病毒载量；(F)为7dpi肛拭子病毒载量；(G)为14dpi咽拭子病毒载量；(H)为14dpi肛拭子病毒载量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1IBV多表位嵌合重组S蛋白真核表达载体的构建、鉴定及其免疫原性研究
1)多表位嵌合的rHBM-S片段的获取
通过引入柔性肽，将已验证可诱导机体产生较好的细胞免疫及体液免疫水平的IBV H120株3个抗原优势表位串连，并与本发明已发表的IBV毒株GX-YL5的S1基因以及S2基因的TM/CT区域串连形成嵌合多表位的rS-EB-Th-CTL基因片段；
3个抗原优势表位基因序列：
Pep-EB基因序列，如SEQ ID NO:1所示：
GTTAATGCTTCTTCTATAGCTATGACGGCACCGTCATCAGGTATGGCTTGGTCTA GCAGTCAGTTTTGTACTGCATACTGTAACTTTTCAGAT；
Pep-ETh基因序列，如SEQ ID NO:2所示：
GATGGCTTTTATCCTTTTACTAATAGTAGTTTAGTTAAGCAGAAGTTTATTGTC；Pep-ECTL基因序列，如SEQ ID NO:3所示：
AAGAGCGGTGGCTCTCGTATACAAACAGCCACTGAACCGCCAGTTATAACTCA ACA；
rS-EB-Th-CTL基因序列，如SEQ ID NO:4所示：
5'-ATGGTGGGGAAGTCACTGTTTTTAGTGACCATTTTGTTTGCACTGTGTAGTGC AAATTTGTTTCATTCTGGTAATTATGTGTACTACTATCAAAGTGCTTTTAGACCACCAAATGGATGGCATTTGCAAGGGGGTGCTTATGCAGTAGTGAATTCTACTACTAAATATAATAATGCAGGCGCCGCTGGTGAGTGTTCTGTAGGTGTTCTTTTTAATTATACTAACGGAAACGACGTTGGTTATAATAATGGTGCTTCTTCTATAGCCATGACAGCACCGTTGTCTGGTATGTCTTGGTCTAAAGCAGAATTTTGTACTGCCCACTGTAACTTCTCGGATTTTACAGTGTTTGTTACACATTGTTTTGCAAATTCTTGTCCTTTAACAGGTAGGATAGAGCAGAACCATATTCGTATTTCTGCAATGAGAAATGGTTCTTTATTTTATAATTTAACAGTTAGCGTATCTAAATACTCTAGATTTAAATCGTTTCAATGTGTTAACAATTTCACTTCTGTTTATTTAAATGGTGATCTTGTTTTTACTTCTAACGAAACCACTGATGTTACAGGTGCTGGTGTGTATTTTAAAGCAGGTGGGCCTATAACCTACAAAATTATGAAAGAATTTAAGGTTTTGGCTTATTTTGTAAATGGCACTGCGCAAGATGTAATTTTGTGTGATGATACACCTAGAGGCTTGCTTGCGTGTCAATATAATACTGGTAATTTTACGGATGGTTTTTATCCATTTACTAACAGTAGTTCAGTTAACGAAAGATTTATTGTGTACCGTGAAAGTAGTGTTAATACTACTTTGGCGTTAACTAACTTTACTTTTCATAATGAGACTAATGCACAACCTAATTCTCTAGGTGGTGTTCAGTCTATTCAAACTTATCAAACACAAACAGCTCAGAGTGGCTATTATAATTTTAATTTATCATTTCTGAGTAGTTTTGTGTATAGAGAGTCTAATTACATGTATGGGTCTTACCACCGTGCATGTAATTTTAGATTAGAAACTATTAATAATGGCTTGTGGTTTAATTCACTGTCAGTTTCGCTTGCATATGGACCACTTCAAGGTGGGTGTAAGCAGTCGGTCTTTAGTGGTAGAGCCACTTGTTGTTATGCCTATTCATATAATGGCCCTCGCGCTTGTAAAGGTGTTTACGGGGGTGAGTTGTCACAAAGTTTTGAATGTGGTTTGTTGGTTTTTGTTACTAAGAGCGATGGTTCTCGTATACAAACAGCCACCAATCCACCAGTTATAACTCAACACAATTATAATAATATTACTTTAAACACTTGTGTTGATTATAACATATATGGCAGATTTGGCCAAGGGTTTATTACTAATGTAACTGACTCTGCTGCTAGTTATAATTATCTAGCTGATGCAGGGTTGGCTATTTTAGACACTTCTGGTGCCATAGACGTCTTTGTTGTACAAGGCGAATATGGTCTTAATTTTTATAAGGTTAACCCCTGCGAGGATGTCAACCAACAGTTTGTAGTTTCTGGTGGTAACATAGTTGGTGTTCTTACTTCTCGTAATGAAACTGGTTCTCAGTTTATTGGGAACAAATTTTATGTTAAACTCACTAATGAAAGTCGTCGTCACAGACGT+GGAGGATCATCA+GTTAATGCTTCTTCTATAGCTATGACGGCACCGTCATCAGGTATGGCTTGGTCTAGCAGTCAGTTTTGTACTGCATACTGTAACTTTTCAGAT+GGAGGATCATCA+GATGGCTTTTATCCTTTTACTAATAGTAGTTTAGTTAAGCAGAAGTTTATTGTC+GGAGGATCATCA+AAGAGCGGTGGCTCTCGTATACAAACAGCCACTGAACCGCCAGTTATAACTCAACAC+GGAGGATCATCA+跨膜区/胞质尾区+-3'；
同时设计只含双表位的3条片段(rS-EB-Th、rS-EB-CTL和rS-ETh-CTL)；只含单个表位的3条基因片段(rS-EB、rS-ETh和rS-ECTL)以及未嵌合表位rS基因片段(见图1)。将上述8条片段提交武汉金开瑞生物工程有限公司进行合成，获得嵌合相应表位片段的菌液和质粒。
2)多表位嵌合的重组转座载体的构建和鉴定
将本发明保存的pFastBacTM/HBM-TOPO空载体菌液以及获得的8条片段的质粒提交华大基因公司进行测序验证。通过同源重组设计软件CE Design设计2对引物，第一对引物为扩增插入片段的引物，第二对引物为使pFastBacTM/HBM-TOPO载体线性化的引物，引物交由华大基因公司合成，引物序列信息见表1。
表1基因扩增引物序列
注：多表位、双表位、单表位及未嵌合表位的目的片段(8条)长度在2200bp～2100bp之间；小写字母为TOPO载体序列，大写字母为目的片段序列。
通过PCR扩增TOPO空载体质粒以及需要嵌入载体的目的片段。8条目的片段及线性化pFastBacTM/HBM-TOPO载体片段的PCR反应条件如下：
(1)变性：98℃，10s (2)变性：98℃，10s (3)变性：98℃，10s
退火：55℃，5s 退火：55℃，5s 退火：55℃，5s
延伸：72℃，15s 延伸：72℃，10s 延伸：72℃，30s
以上PCR程序均进行30个循环，PCR程序(1)预期可获得rS-EB-Th-CTL、rS-EB、rS-ETh、rS-ECTL、rS-EB-Th扩增片段；PCR程序(2)预期可获得rS-EB-CTL、rS-ETh-CTL、rS扩增片段；PCR程序(3)预期可获得线性化TOPO载体扩增片段。
通过PCR对pFastBacTM/HBM-TOPO载体线性化以及对合成的8条目的片段进行验证，电泳结果显示8条目的条带以及线性化的载体条带大小与预期结果一致(见图2)，回收纯化，送交华大基因公司进行测序，测序结果与预期片段完全一致，证明获得预期的重组片段及线性化载体。将获得的目的片段的纯化产物分别与线性化载体的纯化产物进行同源重组反应，具体步骤如下：
按照上述体系加入管中后混匀，37℃反应35min，置冰上冷却以备转化DH 5α大肠杆菌感受态细胞。每管100μL的DH 5α大肠杆菌感受态细胞加入上述重组产物10μL，轻弹混匀，冰上静置35min；42℃热激45s，立即将其转移至冰上冷却3min；每管加入450μL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃，227r/min摇菌3.5h；每个转化菌取100μL均匀的涂抹至预热的加有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃孵育13h，分别挑取5个白色的单克隆菌落，接种至450μL LB液体培养基(含氨苄青霉素)，37℃，227r/min增殖摇菌4.5h。
参照本发明已验证并保存的IBV S基因引物：
上游引物：5'-AATTTGTTTCATTCTGGTAATTATGTG-3'，如SEQ ID NO:9所示；
下游引物：5'-AGCAGACTTTTTAGGTCTGTATTG-3'，如SEQ ID NO:10所示。
预期扩增片段为2200bp，引物交由华大基因合成。
加入Takara公司的Taq PCRMaster Mix，以上述各目的片段的转化菌菌液作为模板，进行PCR鉴定，PCR体系如下：
将上述反应获得的转化菌菌液进行PCR鉴定，并将鉴定为阳性的单克隆菌液，送往华大基因测序鉴定。PCR的反应条件为：
取上述菌液的PCR产物进行电泳鉴定,并回收纯化产物使用同源重组酶分别连接到线性化的空载体pFastBacTM/HBM-TOPO上，转化DH 5α大肠杆菌感受态细胞，氨苄抗性筛选阳性菌，利用S基因特异性引物扩增菌液PCR和测序鉴定，S基因特异性引物扩增8管转化菌菌液的PCR结果(见图3)。
3)多表位嵌合的重组杆粒的获取与纯化
将上述经PCR反应和测序鉴定均正确无误的阳性菌菌液使用小量质粒抽提试剂盒进行质粒提取，获得相应的重组转座载体，转化本发明保存的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，具体操作步骤如下：
(1)加8μL重组转座载体质粒于50μL DH10Bac，轻轻混匀后，冰上静置35min；
(2)混合物立即置于42℃恒温水浴锅中热激55s；
(3)转至冰上，冷激6min；
(4)加入750μL S.O.C.培养基溶液，混匀；
(5)37℃，225r/min摇菌5h；
(6)取上述菌液50μL涂板，37℃培养箱孵育42h。
用灭菌后的牙签挑取3个白色菌落，轻轻吹打于350μL的LB培养基(含抗生素Kana，Gen以及Tetra)，应用M13通用载体引物和EX进行PCR鉴定，M13引物序列参照本发明已验证并保存的引物：
上游为5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'，如SEQ ID NO:11所示；
下游为5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'，如SEQ ID NO:12所示。
预期扩增片段为2500bp+插入的目的基因片段。
反应体系为：
PCR反应条件如下：
重组杆粒PCR反应结束后，取7.5μL产物上样并进行电泳分析。8个重组杆粒PCR鉴定结果(见图4A)。选取阳性菌，再次在LB固体培养基上划线，37℃，恒温孵育42h。再次挑取白色小菌落，接种于450μL的LB液体培养基上(含抗生素Kana，Gen以及Tetra)，37℃，225r/min摇床摇菌4.5h，再次用M13引物进行菌液PCR鉴定，反复划线以纯化(至少2次以上)，直至PCR反应的结果中不含300bp条带而只含有2500bp+插入基因的目的片段的单一条带，即为纯化完成。采用常规的碱裂解法获取上述8管阳性克隆菌的高纯度Bacmid重组杆粒DNA(8条片段)。
8个重组转座质粒转化后经初步筛选后菌落PCR鉴定可见300bp和约4600bp～4700bp[2500bp+插入目的基因片段(2100bp～2200bp)]的2条片段。重新划线进行纯化筛选后，菌落PCR可见只含有目的条带4600bp～4700bp的单一条带，表明8个重组杆粒纯化并构建成功(见图4B)。
4)重组杆状病毒的产生和鉴定
将本发明保存的Sf9昆虫细胞进行复苏，转染前Sf9细胞需处于对数生长期，且细胞活力＞90％以上。具体操作步骤如下：
(1)在6孔细胞板将Sf9昆虫细胞(2×106cells/mL)进行接种；
(2)取6μLII缓慢加入80μL SFM培养基并混匀，室温放置25min；
(3)将4μL的重组杆粒DNA缓慢加入80μL SFM培养基并混匀；
(4)将步骤(2)及(3)的全部溶液再次混匀于同一管中，孵育40min，转染复合物即可获得；
(5)将步骤(4)的复合物缓慢混进800μL SFM培养基中，接种到步骤(1)的细胞板上，27℃培养箱孵育6h。
(6)弃去细胞板上的混合物，清洗2遍，更换为2％SFM培养液，培养箱孵育96h。
(7)同时设立空载体转染和正常细胞作为对照，操作步骤与上述相同。
重组蛋白的鉴定：将获得的P1代重组杆状病毒细胞液吸取300μL重新感染Sf9昆虫细胞，用P2代重组杆状病毒的细胞液进行DNA提取以鉴定转染是否成功。利用S和M13引物对抽提的DNA进行PCR鉴定，结果显示：S基因特异性引物可扩增出约2200bp大小的特异性条带，M13载体通用引物扩增出约4700bp的特异性条带，空载体转染的M13引物鉴定只有300bp的条带，未感染的细胞M13引物PCR鉴定则没有条带，表明转染成功且已形成重组杆状病毒(见图5)。
间接免疫荧光(IFA)鉴定，具体操作步骤如下：
(1)在细胞12孔板上接种Sf9细胞，27℃培养3h，使用盲传P4代重组杆状病毒接种细胞，培养96h细胞出现明显病变，弃上清，每孔加入PBST洗涤2遍；
(2)利用无水乙醇固定细胞20min，PBST洗涤2遍；
(3)脱脂乳(5％浓度)封闭35min，PBST洗涤2遍；
(4)用本发明制备的IBV GX-YL5株S1蛋白鼠源单克隆抗体进行孵育(1:500稀释度)，37℃孵育4h，PBST洗涤2遍；
(5)稀释FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(1:300稀释度)，37℃孵育1.5h，PBST洗涤2遍，倒置荧光显微镜观察IFA结果。
IFA鉴定结果显示，重组杆状病毒分别感染Sf9细胞96h后，重组蛋白rS-EB-Th-CTL、rS-EB-Th、rS-EB-CTL、rS-ECTL-Th、rS-EB、rS-ETh、rS-ECTL和rS的细胞胞浆中均出现了极强的绿色特异性荧光，表明上述重组蛋白均已获得表达(见图6)。
Westernblot鉴定，操作步骤如下：
(1)制备SDS-PAGE凝胶，每孔上样量为25μL，电泳结束后，进行转膜；
(2)封闭：将PVDF膜置于脱脂奶粉(5％浓度)溶液中，4℃封闭过夜；
(3)一抗孵育：TBST洗涤3遍，3min/遍以清洗封闭液，孵育本发明制备的抗GX-YL5的S1蛋白鼠源单克隆抗体(1:2000)，3.5h；
(4)二抗孵育：TBST洗涤3遍，3min/遍，孵育HRP标记的羊抗鼠抗体(1:2000)，孵育时间为35min；
(5)显色：TBST洗涤3遍，3min/遍，利用eECL显色试剂盒显色，拍照并保存。
Western blot鉴定结果显示，重组蛋白rS-EB-Th-CTL、rS-EB-Th、rS-EB-CTL、rS-ECTL-Th、rS-EB、rS-ETh、rS-ECTL和rS检测到了大小约为77～67KDa的特异性蛋白条带，与预期分子量大小一致，而空载体感染的细胞未检测到条带(见图7)。
5)动物免疫试验
将120只7日龄健康三黄鸡随机分为12组，10只/组。8个不同表位嵌合重组S蛋白组均免疫相对应的含200μg重组S蛋白的疫苗；H120组和GX-YL5组分别免疫灭活的H120疫苗和GX-YL5疫苗，按照1ⅹ105TOC-ID50/0.2mL剂量进行免疫；H120+GX-YL5组免疫灭活的IBVH120+GX-YL5二联疫苗。TOPO空载体组免疫等量的TOPO载体油乳苗，并设立未免疫的观察组。14d后按照首次免疫剂量加强免疫。
7)免疫多表位嵌合重组S蛋白鸡中和抗体的检测
首免后0d，14d，28d各组所有鸡翅下静脉采血，分离血清，参照本发明方法制备气管环进行中和试验检测血清中和抗体水平。结果(见图8)表明所有重组S蛋白组在免疫后28d中和抗体滴度最高(除rS-ETh外)，显著高于TOPO载体组和未免疫组(P<0.05)。首免后28d，多表位嵌合rS-EB-Th-CTL组、双表位嵌合(rS-EB-Th和rS-ECTL-Th)组、单表位rS-EB组以及H120组的中和抗体滴度最高，为1:512。
8)免疫多表位嵌合重组S蛋白鸡外周血特异性T淋巴细胞含量的检测
首免后0d、7d、14d、21d、28d采集鸡抗凝血，使用外周淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，进而应用流式细胞仪检测T淋巴细胞含量。结果显示(见图9)，各重组S蛋白组和灭活疫苗组T淋巴细胞含量从首次免疫后14d开始持续升高，在28d达到最高，与TOPO载体组和未免疫组差异显著(P<0.05)。首免后28d，在所有免疫组中H120+GX-YL5组和rS-EB-CTL组的CD3+T淋巴细胞含量最高，rS-ECTL-Th组、rS-EB组和rS-ECTL组的CD4+和CD8+T淋巴细胞含量高于其它免疫组，但这三组之间差异不显著。因此，在各组中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞含量均较优的组别为rS-ECTL-Th组。
9)免疫多表位嵌合重组S蛋白鸡血清中IL-4和IFN-γ的检测
首免后0d、14d、28d采集鸡翅下静脉血液，分离血清，应用商品ELISA试剂盒检测IL-4和IFN-γ含量。结果显示(见图10)，rS-EB-Th-CTL组的IL-4和IFN-γ含量显著高于TOPO载体组和未免疫组，差异显著(P<0.05)。此外，rS-EB-Th-CTL组的IL-4和IFN-γ含量高于其它免疫组，但差异不显著(P>0.05)。因此，在各组中IL-4和IFN-γ含量均较优的组别为rS-EB-Th-CTL组。
实施例2IBV多表位嵌合VLPs的构建、鉴定及其免疫原性和免疫保护作用的研究
1)多表位嵌合VLPs的形成、制备与纯化
以本发明摸索的最佳MOI即S:M:E＝5:3:3，分别将rHBM-rS-EB-Th-CTL、rHBM-rS重组杆状病毒与rHBM-M、rHBM-E(rHBM-M与rHBM-E的制备方法参考专利202110049762.0)共同感染Sf9细胞，悬浮培养72h后收集Sf9细胞，离心收集沉淀用PBS重悬，-80℃反复冻融3次后超声破碎，离心收集上清备用。将上述上清置于4℃超速离心机80000g离心2h，弃上清保留沉淀，PBS重悬。将超速离心管自下而上铺好蔗糖溶液梯度(60％～40％～20％浓度)，将含VLPs的PBS混悬液缓慢加入至超速离心管最上层，4℃超速离心机80000g离心3h，将蔗糖梯度处的乳白色条吸取后，PBS重悬，4℃超速离心机80000g再离心2h，倒掉溶液，保留管底沉淀，用1mL PBS重悬备用。
rHBM-M序列(795bp)，如SEQ ID NO:13所示：
5'-ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCGGATCGATCCCTTTCGAACGGCACGGAAAATTGCACTCTTAGTACTCAGCAAGCGGCTGAGCTTTTCAAGGAATATAATCTATTTATAACCGCATTCCTATTGTTTCTAACCATACTACTTCAGTATGGATATGCAACTAGGAGTCGTGTTATTTACATACTGAAAATGATAGTGTTGTGGTGCTTTTGGCCACTTAACATTGCAGTAGGTGTAATTTCATGTATATACCCACCAAACACAGGAGGTCTTGTCGCAGCGATAATACTTACAGTGTTTGCGTGTCTTTCTTTTGTAGGGTATTGGATCCAGAGTATTAGACTCTTTAAGCGGTGTAGATCTTGGTGGTCATTCAACCCTGAGAGCAATGCCGTAGGTTCAATACTCCTAACTAATGGTCAACAATGTAATTTTGCTATAGAGAGTGTGCCAATGGTGCTTTCTCCAATTATTAAGAATGGTGCTCTTTATTGTGAAGGTCAGTGGCTTGCTAAGTGTGAACCAGACCACTTGCCTAAAGATATATTTGTTTGCACACCTGATAGGAGAAATATCTATCGTATGGTGCAGAAATACACTGGTGACCAAAGCGGAAATAAGAAAAGGTTTGCTACATTTGTCTATGCCAAACAGTCAGTAGACAGTGGTGAGCTAGAAAGTGTAGCAACGGGAGCAGGTAGTCTTTACACAAAGGGCGAAAACTTGTACTTTCAAGGCCATCACCATCACCATCAC-3'；
rHBM-E序列(444bp)，如SEQ ID NO:14所示：
5'-ATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCGGATCGATCCCTTAATATGTTGAATAAGTCGCTAGAGGAGAATGGTAGTTTTCTAACAGCAGTTTATGTCTTTTGTGGGTTTGTAGCACTCTACTTACTAGGTAGAGCGCTTCAAGCATTTGTACAAGCAGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAGTTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATACAAGCACACATACGGTAGAAAACTTAACAATTCGGAATTAGAACAAGTTATTGTTAACGAGTTCCCGAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCTGCAAATTTTCAAGATGTCGAACGGCACGGAAAATTGCACTCTAAGGGCGAAAACTTGTACTTTCAAGGCCATCACCATCACCATCAC-3'；
2)多表位嵌合VLPs的鉴定
Westernblot鉴定：重组蛋白rS-EB-Th-CTL、M、E蛋白分别为67KDa、26KDa、16KDa，与目的蛋白大小相符(见图11)。
透射电镜鉴定：将纯化后的rS-EB-Th-CTLME-VLPs取15μL于200目铜网上，室温静置10min，滴加8μL 2％磷钨酸，负染1min，马上置于透射电镜下进行观察。结果显示，在电子显微镜视野下可见直径约为120nm的椭圆形粒子(见图12A)。
免疫电镜鉴定：取15μL纯化后的VLPs于200目铜网上，室温静置10min，将本发明制备的GX-YL5株的S蛋白兔多抗血清(作为一抗)按照1：30的浓度进行稀释，吸取8μL滴加到铜网上，孵育1.5h，PBS洗涤3次，15s/次。将纳米金颗粒标记的羊抗兔IgG(10nm)按照1：30稀释(作为二抗)，吸取15μL滴加到铜网上，室温孵育1.5h，PBS洗涤3次，15s/次。用8μL 2％磷钨酸负染1min，马上置于透射电镜下观察。电镜下可见大量的黑色纳米金颗粒围绕在直径约80nm不等的圆形、椭圆形粒子上，表明蛋白rS-EB-Th-CTL已包装在VLPs表面，可以与IBV S蛋白抗体有效结合(见图12B)。
3)动物免疫与攻毒试验
450只14日龄健康三黄鸡随机分为6组，75只/组。rS-EB-Th-CTLME-VLPs和rSME-VLPs组均免疫含50μg总蛋白的疫苗，H120组和GX-YL5组分别免疫灭活的H120疫苗和GX-YL5疫苗，按照1ⅹ105TOC-ID50/0.2mL剂量进行免疫。TOPO载体组免疫等量的TOPO载体油乳苗，并设立未免疫对照组。14d后按照首次免疫剂量加强免疫，加强免疫后14d，分别用IBV GX-YL5、GX-QZ181028和M41毒株进行攻毒，攻毒剂量为1ⅹ105TOC-ID50/0.2mL。攻毒后每天观察发病情况、症状和死亡情况，死亡病鸡及时进行剖解并记录病理变化，统计发病率和死亡率。
4)qRT-PCR检测IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α和IFN-β转录水平
通过qRT-PCR对首免后14d、28d鸡外周血淋巴细胞细胞因子mRNA转录水平进行检测，结果(见图13)显示，免疫后14d，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IFN-α相对表达水平显著高于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.001或P<0.01或P<0.05)，IFN-β相对表达水平高于TOPO载体对照组和空白组，但差异不显著(P>0.05)。rS-EB-Th-CTLME-VLPs组IL-1β和IFN-α相对表达水平显著高于rSME-VLPs组、H120组、GX-YL5组，差异显著(P<0.05或P<0.01)；IL-6、IL-12相对表达水平显著高于rSME-VLPs组、H120组，差异显著(P<0.05)，高于GX-YL5组，但差异不显著(P>0.05)；IL-8相对表达水显著高于GX-YL5组，差异显著(P<0.05)，高于rSME-VLPs组、H120组，但差异不显著(P>0.05)；IFN-β相对表达水平高于rSME-VLPs组、H120组、GX-YL5组，但差异不显著(P>0.05)。免疫后28d，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α和IFN-β相对表达水平显著高于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.001或P<0.01)。rS-EB-Th-CTLME-VLPs组IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-α和IFN-β相对表达水平显著高于rSME-VLPs组、H120组、GX-YL5组，差异显著(P<0.001或P<0.01或P<0.05)，IL-12相对表达水平高于rSME-VLPs组、H120组、GX-YL5组，但差异不显著(P>0.05)。
5)qRT-PCR检测干扰素刺激基因ISGs(Mx、PKR、OAS、Viperin、IFITM3、IFIT5)mRNA转录水平
通过qRT-PCR对首免后14d、28d鸡外周血淋巴细胞干扰素刺激基因ISGs mRNA转录水平进行检测。结果(见图14)显示，免疫后14d，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组Mx和Viperin相对表达水平显著高于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.01)；OAS和IFITM3相对表达水平显著高于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.05)；PKR和IFIT5相对表达水平高于TOPO载体对照组和空白组，但差异不显著(P>0.05)。rS-EB-Th-CTLME-VLPs组Mx、Viperin和IFIT5相对表达水平显著高于rSME-VLPs组和GX-YL5组，差异显著(P<0.05)，Mx和Viperin相对表达水平高于GX-YL5组，但差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组PKR相对表达水平高于rSME-VLPs组和GX-YL5组，但差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组OAS相对表达水平显著高于GX-YL5组，差异显著(P<0.05)，高于rSME-VLPs组，但差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组IFITM3相对表达水平显著高于H120组，差异显著(P<0.05)，高于rSME-VLPs组和GX-YL5组，但差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组IFIT5相对表达水平显著高于rSME-VLPs组和GX-YL5组，差异显著(P<0.05)。免疫后28d，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组Mx、PKR、OAS、IFITM3和IFIT5相对表达水平显著高于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.001)，Viperin相对表达水平显著高于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.01)。rS-EB-Th-CTLME-VLPs组Mx、PKR和IFITM3相对表达水平显著高于rSME-VLPs组、H120组、GX-YL5组，差异显著(P<0.01或P<0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组OAS相对表达水平显著高于GX-YL5组，差异显著(P<0.05)，高于rSME-VLPs组，但差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组Viperin相对表达水平显著高于rSME-VLPs组和GX-YL5组，差异显著(P<0.05)，高于H120组，但差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组IFIT5相对表达水平显著高于rSME-VLPs组和GX-YL5组，差异显著(P<0.05)。
6)免疫多表位嵌合VLPs鸡中和抗体的检测
应用气管环中和试验检测首免后0d、14d、28d的血清中中和抗体水平。结果(见图15)表明所有免疫组在首免后14d中和抗体水平出现升高的趋势，在首免后28d中和抗体滴度最高。使用GX-YL5毒株和QZ181028毒株进行中和试验时，在首免后28d，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组、rSME-VLPs、H120组和GX-YL5组的中和抗体水平均显著高于TOPO组和未免疫组，差异极显著(P<0.01)，这四组之间差异不显著(P>0.05)。使用M41毒株进行中和试验时，在首免后28d，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组、rSME-VLPs组、H120组和GX-YL5组的中和抗体水平均显著高于TOPO组和未免疫组，差异极显著(P<0.01)，H120组显著高于rS-EB-Th-CTLME-VLPs组和rSME-VLPs组，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组和rSME-VLPs组这两组之间差异不显著(P>0.05)。
7)免疫多表位嵌合VLPs鸡外周血特异性T淋巴细胞含量的检测
对各试验组分别在首免后0d、7d、14d、21d、28d分离淋巴细胞进行T淋巴细胞含量的检测。结果显示(见图16)，首免后21d和28d，各免疫组CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞含量出现显著上升的趋势，均显著高于TOPO组和未免疫组，差异极显著(P<0.01)在首免后28d，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组、H120组和GX-YL5组的CD3+T淋巴细胞含量显著高于rSME-VLPs组(P<0.05)，且rS-EB-Th-CTLME-VLPs组、H120组和GX-YL5组之间差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th- CTLME-VLPs组、rSME-VLPs组、H120组和GX-YL5组的CD4+T淋巴细胞含量差异不显著(P>0.05)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组的CD8+T淋巴细胞含量显著高于rSME-VLPs组、H120组和GX-YL5组。
8)免疫多表位嵌合VLPs鸡血清中IL-4和IFN-γ的检测
对首免后0d、7d、14d、21d和28d采集的血清样本进行IL-4和IFN-γ含量的测定。结果显示(见图17)，各免疫组IL-4和IFN-γ含量在首免后14d出现显著上升的趋势，在首免后28d达到最高。首免后14d，各免疫组IL-4含量显著高于TOPO组和未免疫组，差异显著(P<0.05)。首免后28d，各免疫组IL-4和IFN-γ含量均显著高于TOPO组和未免疫组，差异极显著(P<0.01)；rS-EB-Th-CTLME-VLPs组和H120组的IL-4含量显著高于rSME-VLPs组和GX-YL5组(P<0.05)，且rS-EB-Th-CTLME-VLPs组和H120组之间差异不显著(P>0.05)；H120组的IFN-γ含量显著高于GX-YL5组(P<0.05)，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组和rSME-VLPs组IFN-γ含量差异不显著(P>0.05)。
9)免疫多表位嵌合VLPs鸡分泌型IgA(sIgA)的检测
在首免后0d、7d、14d、21d、28d，应用试剂盒对采集的泪拭子和咽拭子进行sIgA抗体水平的检测。结果(见图18)显示，在首免后14d，各免疫组的泪拭子和咽拭子中的sIgA抗体水平出现显著上升的趋势，直至首免后28d，各免疫组的sIgA抗体水平均均显著高于TOPO组和未免疫组，差异极显著(P<0.01)。在首免后28d，各免疫组泪拭子sIgA抗体水平差异不显著(P>0.05)，但rS-EB-Th-CTLME-VLPs组咽拭子sIgA抗体水平显著高于rSME-VLPs组、H120组和GX-YL5组(P<0.05)，rSME-VLPs组、H120组和GX-YL5组咽拭子sIgA抗体水平差异不显著(P>0.05)。
10)多表位嵌合VLPs免疫保护效果的评价
临床症状观察
各试验组鸡只在攻毒后即开始记录各组鸡只的临床症状和发病率、死亡率。攻毒后第3天试验鸡开始出现精神沉郁、羽毛蓬松、甩头、咳嗽、行动迟缓的临床症状，观察14天各鸡只的发病率和死亡率(见表2)。结果显示，各组发病率为0-80％，死亡率为0-60％，各免疫组鸡只的发病率、死亡率均低于TOPO组和未免疫组，表明本研究中4种疫苗在使用3株IBV攻毒时均能为鸡提供一定的免疫保护作用。其中rS-EB-Th-CTLME-VLPs组的发病率为12.5-33％，死亡率为0；rSME-VLPs组的发病率为14.3-20％，死亡率为0-20％；H120免疫组的发病率为37.5-50％，死亡率为12.5-30％；GX-YL5组的发病率为22.2-42.9％，死亡率为11.1-28.6％；TOPO组的发病率为42.9-60％，死亡率为25-40％；未免疫组的发病率为25-80％，死亡率为25-60％。从试验鸡攻毒后临床观察结果来看，各组疫苗的保护效果最好的为rS-EB-Th-CTLME-VLPs组。
表2试验鸡攻毒后临床观察统计结果
病理切片观察
在5dpi时，每组随机选择5只鸡处死后，无菌采集气管和肾脏，委托广州迈科生物科技有限公司采用HE染色制作病理切片。
气管的病理切片结果(见图19A)显示，免疫rS-EB-Th-CTLME-VLPs分别攻毒GX-YL5和GX-QZ181028以及免疫rSME-VLPs分别攻毒GX-YL5和GX-QZ181028的气管黏膜层细胞排列完整，未见明显病变，其它组气管均有不同程度的病变。免疫rS-EB-Th-CTLME-VLPs攻毒M41组：气管黏膜层上皮细胞坏死，伴炎细胞浸润。免疫rSME-VLPs攻毒M41组：局灶性黏膜层少量炎细胞浸润。免疫灭活苗H120攻毒GX-YL5组：气管黏膜层局灶性上皮细胞变性坏死，伴炎细胞浸润；免疫灭活苗H120攻毒M41组：气管黏膜上皮细胞增生，坏死，伴炎细胞浸润，黏膜上皮鳞化；免疫灭活苗H120攻毒GX-QZ181028组：气管黏膜层可见淋巴细胞和异嗜性粒细胞浸润，黏膜下层轻度炎细胞浸润。免疫灭活苗GX-YL5攻毒GX-YL5组：局灶性黏膜层上皮细胞坏死，炎细胞浸润；免疫灭活苗GX-YL5攻毒M41组：气管管腔内可见少量渗出物，黏膜层上皮细胞变性、坏死，伴炎细胞浸润；免疫灭活苗GX-YL5攻毒GX-QZ181028组：气管管腔内可见坏死脱落的上皮细胞，黏膜上皮细胞胞质内可见大量嗜酸性物质。免疫TOPO载体攻毒GX-YL5组：局灶性黏膜层少量炎细胞浸润；免疫TOPO载体攻毒M41组：局灶性黏膜层少量炎细胞浸润；免疫TOPO载体攻毒GX-QZ181028组：气管黏膜层上皮细胞变性坏死，伴炎细胞浸润。空白对照攻毒GX-YL5组：黏膜层上皮细胞变性、坏死，伴大量炎细胞浸润；空白对照攻毒M41组：气管管腔内可见渗出物，黏膜层明显增厚，上皮细胞变性、坏死，伴大量炎细胞浸润；空白对照攻毒GX-QZ181028组：局灶性黏膜层上皮细胞坏死，炎细胞浸润。
肾脏的病理切片结果(见图19B)显示，免疫灭活苗GX-YL5攻毒GX-QZ181028组，肾脏局灶性肾小管坏死、伴出血，其它组肾脏肾小管上皮细胞排列完整，肾小球结构正常，间质未见明显异常变化，未见明显病变。
气管和肾脏病毒载量测定
5dpi时，采集气管和肾脏进行病毒载量检测。结果(见图20)显示，各组鸡气管病毒载量均高于肾脏病毒载量。rS-EB-Th-CTLME-VLPs组气管和肾脏病毒载量均显著低于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。各免疫组的病毒载量均低于未免疫组，表明本实验中所用各疫苗均能为鸡只提供一定的免疫保护作用。免疫rS-EB-Th-CTLME-VLPs分别攻毒这3种毒株后，其气管的病毒载量均低于其它试验组。同样，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组在攻毒GX-YL5和M41毒株后，其肾脏的病毒载量均低于其它试验组，但攻毒GX-QZ181028毒株时，GX-YL5肾病毒载量最低脏。除了免疫灭活苗H120攻毒GX-QZ181028组的肾脏病毒载量低于rS-EB-Th-CTLME-VLPs，差异不显著(P>0.05)，其它免疫组气管和肾脏病毒载量均高于rS-EB-Th-CTLME-VLPs组(P>0.05或P<0.05)，表明rS-EB-Th-CTLME-VLPs组在一定程度较灭活疫苗和未嵌合rSME-VLPs能提供更好的免疫保护作用。
咽拭子和肛拭子病毒载量测定
在3dpi、5dpi、7dpi、14dpi时采集咽拭子和肛拭子进行病毒载量测定，结果(见图21)显示，各组鸡只咽拭子、肛拭子的排毒量均在5dpi时达到峰值，随后开始降低。在5dpi、7dpi、14dpi时咽拭子病毒载量均低于肛拭子病毒载量。
5dpi时，rS-EB-Th-CTLME-VLPs组与TOPO载体对照组和空白组差异显著(P<0.05或P<0.01)，各组中咽拭子病毒载量按照从低到高排序，攻毒GX-YL5：rS-EB-Th-CTLME-VLPs<rSME-VLPs<H120<GX-YL5<空白组<TOPO；攻毒M41：rS-EB-Th-CTLME-VLPs<GX-YL5<H120<rSME-VLPs<空白组<TOPO；攻毒GX-QZ181028：GX-YL5<rS-EB-Th-CTLME-VLPs<rSME-VLPs<H120<TOPO<空白组。各组肛拭子病毒载量从低到高排序，攻毒GX-YL5：rS-EB-Th-CTLME-VLPs<rSME-VLPs<H120<GX-YL5<空白组<TOPO；攻毒M41：rS-EB-Th-CTLME-VLPs<rSME-VLPs<GX-YL5<H120<空白组<TOPO；攻毒GX-QZ181028：rS-EB-Th-CTLME-VLPs<rSME-VLPs<H120<GX-YL5<空白组<TOPO。14dpi时，灭活疫苗组和VLPs组咽拭子和肛拭子较7dpi时病毒载量明显降低，咽拭子拷贝数小于104copies/μL，肛拭子拷贝数小于106copies/μL。各免疫组差异不显著(P>0.05)，各免疫组攻毒GX-YL5和攻毒GX-QZ181028的肛拭子病毒载量均显著低于TOPO载体对照组和空白组，差异显著(P<0.05或P<0.01)。各免疫组咽拭子、肛拭子病毒载量均低于TOPO载体对照组和空白组，表明各组疫苗能为鸡群提供一定的免疫保护作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
将表位多肽Pep-EB表位、Pep-ETh表位和Pep-ECTL表位以多表位与IBV广西优势基因型LX4型和优势血清型血清Ⅰ型代表性毒株GX-YL5的S1基因、S2基因的跨膜区和胞质尾区(TM/CT)以柔性肽串联，并化学合成基因片段rS-EB-Th-CTL，如SEQ ID NO:4所示；
通过同源重组技术克隆到pFastBacTM/HBM-TOPO重组转座载体，构建了pFastBacTM/HBM-TOPO-rS-EB-Th-CTL载体，转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，获得rHBM-rS-EB-Th-CTL重组杆粒；
将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，利用IFA、Westernblot鉴定表达的重组蛋白；
上述构建并获得的分别表达IBV GX-YL5株重组S蛋白、M蛋白和E蛋白的重组杆状病毒rHBM-rS-EB-Th-CTL、rHBM-M和rHBM-E共感染Sf9细胞制备多表位嵌合VLPs(rS-EB-Th-CTLME-VLPs)，纯化后进行Westernblot、透射电镜和免疫电镜鉴定，成功制备IBV多表位嵌合VLPs即rS-EB-Th-CTLME-VLPs。
2.权利要求1所述一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述表位多肽Pep-EB表位，如SEQ ID NO:1所示；
所述表位多肽Pep-ETh表位，如SEQ ID NO:2所示；
所述表位多肽Pep-ECTL表位，如SEQ ID NO:3所示。
3.权利要求1所述一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述rHBM-M，如SEQ ID NO:13所示；
所述rHBM-E，如SEQ ID NO:14所示。
4.一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗在制备防治禽传染性支气管炎药物中的应用。
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