CN118006573A - 一种还原糖氧化酶及其分泌表达菌株的构建和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种还原糖氧化酶及其分泌表达菌株的构建和应用，属于分子生物学和生物技术领域，该还原糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～12任一项所示；本发明还公开了该还原糖氧化酶在面制食品加工中的应用。本发明通过将还原糖氧化酶的编码基因转化到里氏木霉基因组中，依次代替里氏木霉中分泌表达量最高的两个纤维素酶基因——cbh1和cbh2，成功构建了分泌表达还原糖氧化酶的里氏木霉生产菌株。该生产菌株可用于食品级的还原糖氧化酶的生产，生产获得的还原糖氧化酶相较于同等酶活的葡萄糖氧化酶，显著提高烘焙食品的口感和白度。

Description

一种还原糖氧化酶及其分泌表达菌株的构建和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，特别是涉及一种还原糖氧化酶及其分泌表达菌株的构建和应用。
背景技术
还原糖氧化酶可以将末端带有还原性糖残基的单糖和低聚糖氧化成相应的酸，产生过氧化氢，因此比葡萄糖氧化酶具有更加广泛的底物谱，将来会代替葡萄糖氧化酶应用在食品、饲料和动物保护等行业。同时，还原糖氧化酶还能氧化乳糖生产乳糖酸，氧化麦芽糖生产麦芽糖酸，可应用于各种糖酸的生产。Elizabeth J团队最早从Microdochiumnivale中发现还原糖氧化酶，此酶具有分泌肽，可以实现分泌表达。但在野生菌中还原糖氧化酶的表达产量低，酶活低且不易纯化。
毕赤酵母表达系统是目前商业化的真菌表达系统，具有操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低、可以对外源蛋白翻译后修饰等优点。因此将还原糖氧化酶基因导入到载体pPIC9K中，并在毕赤酵母GS115中胞外表达得到重组还原糖氧化酶，可以进行快速的酶活鉴定和筛选工作。
里氏木霉(Trichoderma reesei或Hypocreajecorina)是一种嗜温腐生性的丝状真菌，在二战期间，被驻扎在所罗门群岛上的美军于腐烂的棉衣和帆布帐篷上发现。所分离到的菌株经鉴定为里氏木霉QM6a。从原始菌株QM6a出发，又经过一系列诱变育种，筛选出了一些纤维素酶高产菌株，如RUT-C30。里氏木霉被广泛应用是因为其具有能自然分泌大量的内源蛋白到胞外的能力，且内源性纤维素酶经发酵其产量高达100g/L。里氏木霉因多样的翻译后修饰也让其成为表达同源和异源蛋白的常用宿主。里氏木霉产出的纤维素酶被广泛应用于各行业。如两个表达量最高的纤维素酶cbh1和cbh2启动子，已被成功用于里氏木霉中表达异源蛋白。
为了改善烘焙食品的品质，目前面粉中一般添加真菌α-淀粉酶。在加入真菌α-淀粉酶的情况下，一些破损淀粉颗粒被水解成麦芽糖(淀粉酶能内切直链淀粉成糊精，而糊精又在淀粉内切酶的作用下降解成麦芽糖)。麦芽糖又在酵母本身分泌的麦芽糖酶作用下，水解成葡萄糖供酵母利用，从而为酵母的发酵提供足够的糖源作为营养物质。在面包中添加真菌α-淀粉酶可以使面包变得柔软，能够增强面团的延展性以及持气的能力，麦芽糖能被酵母利用产生CO2，从而使面包体积增大，糊精的存在使得面包纹理疏松，同时对改良面包外皮色泽有良好的效果，能在出炉后制成感觉良好的面包。
面粉中一般会加入葡萄糖氧化酶。在有氧参与的条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成δ-D-葡萄糖内酯，同时产生过氧化氢。过氧化氢是一种很强的氧化剂，能够将面筋分子中的巯氢基(-SH)氧化为二硫键(-S-S-)，从而增强面筋的强度。还原糖和蛋白质在常温或者加热情况下，会发生缩合、聚合反应(美拉德反应)，生成类黑色素、芳香化合物等多种物质。过多的美拉德反应会导致烘焙食品颜色变深，白度降低。因此，葡萄糖氧化酶也能提高烘焙食品的白度。
葡萄糖氧化酶具有高度的专一性，它只对葡萄糖分子C1上的β-羟基起作用，无法氧化麦芽糖和糊精末端的β-羟基。本发明提供一种效果更佳的还原糖氧化酶，可以氧化葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精，能够显著减少氧化酶的用量，提高烘焙食品的白度，将更适合于实际的烘焙需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种还原糖氧化酶及其分泌表达菌株的构建和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的还原糖氧化酶具有氧化葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精的功能，可以显著提高烘焙食品的白度和口感。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种还原糖氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～12任一项所示。
本发明还提供一种上述的还原糖氧化酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～36任一项所示。
本发明还提供一种表达载体，包含上述的编码基因。
本发明还提供一种重组微生物菌株，包含上述的表达载体。
进一步地，所述重组微生物菌株包含重组毕赤酵母或重组里氏木霉；
所述重组毕赤酵母异源表达核苷酸序列如SEQ ID NO.13～24任一项所示的还原糖氧化酶；所述重组里氏木霉异源表达核苷酸序列如SEQ ID NO.25～36任一项所示的还原糖氧化酶。
本发明还提供一种生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉的构建方法，包括如下步骤：
合成还原糖氧化酶的编码基因，构建表达载体；
将所述表达载体转化至里氏木霉中，获得生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉。
进一步地，所述还原糖氧化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.25～36任一项所示；所述表达载体包含里氏木霉纤维素酶编码基因的启动子序列、所述还原糖氧化酶的编码基因序列和里氏木霉纤维素酶编码基因的终止子序列。
本发明还提供一种上述的编码基因或上述的表达载体或上述的重组微生物菌株在生产还原糖氧化酶中的应用。
本发明还提供一种还原糖氧化酶的生产方法，包括将上述的重组微生物菌株发酵培养，收集发酵液的步骤。
本发明还提供一种上述生产方法获得的还原糖氧化酶在面制食品加工中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了12个还原糖氧化酶的氨基酸序列，及其在毕赤酵母和里氏木霉中表达的工程菌株。本发明利用商业化的表达质粒pPIC9K在毕赤酵母中胞外表达还原糖氧化酶，进行酶活力和耐热的筛选，并鉴定了这12个还原糖氧化酶具有氧化葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精的功能；之后利用里氏木霉表达质粒分泌表达还原糖氧化酶，通过将还原糖氧化酶的编码基因转化到里氏木霉基因组中，依次代替里氏木霉中分泌表达量最高的两个纤维素酶基因——cbh1和cbh2，成功构建了分泌表达还原糖氧化酶的里氏木霉生产菌株。该生产菌株可用于食品级的还原糖氧化酶的生产，生产获得的还原糖氧化酶相较于同等酶活的葡萄糖氧化酶可以显著提高烘焙食品(如面包)的口感和白度。
可见，本发明经过对里氏木霉菌进行基因改造后，成功构建了分泌表达还原糖氧化酶的工程菌株，该工程菌株生产的还原糖氧化酶可以应用在食品行业，提高烘焙食品的品质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中毕赤酵母表达质粒构建图(A)和摘抄的商业化质粒pPIC9K的图谱说明(B)；
图2为本发明实施例1中酵母表达的还原糖氧化酶在不同温度下处理5分钟后的相对酶活；
图3为本发明实施例2中里氏木霉表达质粒构建图；
图4为本发明实施例3中里氏木霉表达质粒构建图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
在本发明方法的实施例中，培养基及试剂的配方如下：
(1)Luria Bertani(LB)培养基配方：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，自来水定容到1L，自然pH。
(2)PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖(或木糖)20g，琼脂20g，自来水定容到1L，自然pH。
(3)毕赤酵母发酵培养基的配方(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，KH2PO413.6g，YNB13.4g，生物素0.4mg，甲醇5g。
(4)里氏木霉发酵培养基的配方(1L)：葡萄糖30g，乳糖10g，葡萄糖酸铵14g，纤维素粉末10g，麸皮5g，玉米浆5g，蛋白胨3g，酵母粉2g，KH2PO42.0g，CaCl20.34g，MgSO4·7H2O0.3g，Mandels微量元素液1mL，和吐温80 1mL。
(5)Mandels微量元素液(1000×)的配方：FeSO4·7H2O 5g，CoCl·6H2O 2g，ZnSO4·7H2O1.4g，MnSO4·H2O 1.6g，纯净水定容至1L。
(6)毕赤酵母转化和筛选方案：依据Invitrogen公司关于pPIC9K试剂盒(V175-20)的说明书进行毕赤酵母转化和筛选工作。
(7)农杆菌接合转移里氏木霉方案：将表达模块电转至根瘤农杆菌，然后将电转成功后的农杆菌分别与里氏木霉宿主菌株QM6a(ATCC 13631)，QM9414(ATCC 26921)，RUT-C30(ATCC 56765)，RL-P37(NRRL 15709)，NG14(ATCC 56767)，PC-3-7(ATCC 66589)在IM平板(Covert et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusariumcircinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后，加入头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至长出菌丝和孢子，然后进行PCR验证，证明长出菌体为正确的转化子。
质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司，胶回收试剂盒购自MAGEN公司，无缝克隆试剂盒选用全式金公司，DNA限制性内切酶与连接酶选用NEB公司。也可选用其他公司的同类产品代替。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
以下实施例中的还原糖氧化酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～12所示。
SEQ ID NO.1：
MRSAFILALGLITASADALVTRGAIEACLSAAGVPIDIPGTADYERDVEPFNIRLPYIPTAIAQTQTTAHIQSAVQCAKKLNLKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLMVQLDRMIDVISYNDKTGIAHVEPGARLGHLATVLNDKYGRAISHGTCPGVGISGHFAHGGFGFSSHMHGLAVDSVVGVTVVLADGRIVEASATENADLFWGIKGAGSNFGIVAVWKLATFPAPKVLTRFGVTLNWKNKTSALKGIEAVEDYARWVAPREVNFRIGDYGAGNPGIEGLYYGTPEQWRAAFQPLLDTLPAGYVVNPTTSLNWIESVLSYSNFDHVDFITPQPVENFYAKSLTLKSIKGDAVKNFVDYYFDVSNKVKDRFWFYQLDVHGGKNSQVTKVTNAETAYPHRDKLWLIQFYDRYDNNQTYPETSFKFLDGWVNSVTKALPKSDWGMYINYADPRMDRDYATKVYYGENLARLQKLKAKFDPTDRFYYPQAVRPVK。
SEQ ID NO.2：
MRSALALALGLVAAGADALVTRAAIDACLVSSGVPIDIPGSDDYIRDIAPFNIRLPYIPTAIARPSTTAHIQKSVQCANKLNVKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVIELDRMINVTAYNAKTGVAHVQPGARLGHLATVLYEKYDRAISHGTCPGVGISGHFAHGGFGFSSHMHGLAVDSVVGATVVLADGRIVEASATENADLFWGLKGAGSNFGIVATWKLVTFPAPKLLTRFGITLNWNKTTAVKGIEAVEDYARWVAPREVNFRIGDYGKGNPGIEGLFYGTPEQWRAAFQPLLNTLPAGYVVQTPTTLNWIQSVLSYSNFDHIDFITPQPQENFYAKSLTLKTIKGKAVQNFVDYYFDVANKVVDRFWFYQLDVHGGANSQVWKVTNAETAYPHRDKLWLIQFYDRYENNETYPDTSFKFLDGWVDSVTKVTPKSDWGMYINYADPRMDRDTATKNYYGVNLPKLQKLKAKFDPTDRLYYPQAVRPVK。
SEQ ID NO.3：
MRFINLVSAGLIASTADALVARATIEQCLTDAKVPIDTKNSAEWNEDVAPFNIRLPYLPTAIAAPQTTQHIQSAVNCGRKLAIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLIIELDQLYNVTYDASTNIATVQPGARLGHVATVLYQQYGRAIAHGTCPGVGVSGHFLHGGFGFSSHMHGLALDFVQSVDVVLADGTVKTASSSSNSDLFWGIKGAGSNFGIVASWKLSTFAAPATLTKFGVTLGWNKNNAVAGLQAVENYVKNVQPREVNFRIGDYNKGQPGIEGLYYGTPAQWKTAFQPLLDTLPSGYTVQPTQQLNWIQAVIAYSNYDDVDWIHPSPQENFYAKSLTLKGLNGTAAQAFVNYYFDVANKVTDRFWFFQIDAHGGKNSQIAKVAPDATSYAHRDKLYIIQFYDRYENNQVYPSTSFGFLDGWVNAVTKALPSSDWGAYINYADPRLSRDAAQQQYYGQNLAKLQSLKAKYDPKELFYYPQGVKPSA。
SEQ ID NO.4：
MRAATLLSAGFLASLADALVITRAAIDKCLVDAGVPIDVKGTDDYKRDVAPFNVRLPYTPTAISVPLTTKHIQDSVKCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVVELDRMYNVTYDATKNIATVQPGARLGHVATVLYEQYNRAIAHGTCPGVGVSGHFLHGGFGFSSHMHGLALDFVDSVTVVLADGSVVEASSTENTDLLWGIKGAGSNFGIVAAWKLTTFEAPAVLTRFGLSLGWNKSTAVAGLEAVEKYAKNIQPREVNFRIGDYNKGQPGIEGLYYGTPAQWRKAFQPLLDTLPAGYNVSDPQQLNWIEAVISYSNYDNVDWITPSPQENFYAKSLTLKGLNGTSAQNFVDYYFDVANNVVDRFWFFQLDMHGGKNSQVTKVAPDATSYAHRDKLYIIQFYDRYENNQTYPATSFGFLDGWVDATTKPLPESDWGAYANYADARLSRAVAEDQYYGDHLPRLQKLKAKFDPKQLFYYTQSVQPKA。
SEQ ID NO.5：
MRVATLLFAGSIASITEALVTRAVIDKCLTDAGVPVDIKGSDDWDRDVAPFNVRLPYLPTAISVPLTTKHIQDSVKCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVVELDRMYNVTYDAGKNIATVQPGARLGHVATVLYETYGRAISHGTCPGVGISGHFLHGGFGFSSHMHGLALDFVDSVTVVLADGRVVEASSTENSDLLWGIKGAGSNFGIVASWKLRTFEAPKVLTRFGVSLGWNKSTAVAGLEAVEKYAKNDQPREVNFRIGDYNKGQPGIEGLYYGTPEQWRKAFQPLLDTLPTGYNVSEPQTLNWIQAVISYSNYDNVDWTTPSPPENFYAKSLALKGLNGTAAQNFVDYYFDVANNVVDRFWFFQLDIHGGKTSQIAKVAVDATSYVHRDKLYLVQFYDRYENNETYPATSFGFLDGWVDTVTKPLPKSEWGSYANYADARLSRAVAEDQYYGKHLPKLQKLKAKYDPKQLFYYPQSVEPKA。
SEQ ID NO.6：
MRFESLLVAGSVATIADALVTRANIDKCLVDAGVPIDIKGTSDWNRDVAPFNIRLPYTPTAISVPQTVKHIQDSVKCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGQLVVQLDRMYNVTYDSKKNIATVQPGARLGHVATVLYEKYGRAIAHGTCPGVGISGHFLHGGFGFSSHQHGLALDFVESATVVLADGSVVEASDSENRDLLWGIKGAGSNFGIVASWKLRTFEAPKVLTRFGVVLGWTKENAVKGLEAVEKYAKNIQPREVNFRIGDYGKGNPAIEGLYYGTPEQWRKAFQPLLDTLPTGYNISTPKAMNWIESVISYSNYETVDWIEPSPQENFYAKSLALKGLNGTSAKDFVDYYFDVANKVVDRFWFFQLDVHGGRNSQISKVATDATSYVHRDKLYLVQLYDRYENNETYPSSSFGFLDGFANAVTKSLPKSDWGAYANYADPRLPRGVADELYYGSNLPRLQRLKAKYDPKQVFDYPQGVDPKY。
SEQ ID NO.7：
MRVTSALLAGLVASTADALVAKAAIDKCLTDAGVPIDVKGSDGWNEDVAPFNIRLPYLPTAISVPATTKHIQDSVKCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVVELDQMYNVTYDAKKNIATVQPGARLGHVATVLYEKYGRAIAHGTCPGVGVSGHFLHGGFGFSSHMHGLALDSVQSVTVVLADGTVKEASASTNADLFWGMKGAGSNFGIVASWKLSTFEAPKTLTKFGVALGWTKDTAVAGLEAVENYAKNIMPREVNFRIGDYSKGKPGIEGLYYGTPAQWKKDFQPLLDTLPKGYNISEPQSLTWIQAVIAYSNYDEVDWIHPSPQENFYSKSLTLKGLNGTSAQAFVDYYFDVANNVVDRFWFFQLDMHGGKNSQITKVGKDATSYPHRDKLYIIQFYDRYENNQTYPASSFGFLDGWVDAVTDTIPRSEWGAYINYADSRLPRAEAERQYYGDHLPRLQSLKAKYDPKELFYYPQSVEP。
SEQ ID NO.8：
MRVTTPLFVGLIATAAEALVVTRATIDKCLVDSGVPIDTKGDEGWVRDVAPFNIRLPYLPTAISVPLTTAHIQKSVLCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVIELDRMYNVTLDAKTKIATVQPGARLGHVATVLYEQYNRAIAHGTCPGVGISGHFLHGGFGFSSHMHGLALDFVESVTVVLADGSVVEASSSKNSDLLWAIKGAGSNFGIVASWKLSTFEAPDALTRFGVTLGWNKSTAVAGLEAVEAYAKFKAPREINFRVGDYGKGSPAIEGLYYGTQAQWRKDIAPLLDTLPAGWNISETRTLNWIESVISYSNYDNVDWITPSPQENFYAKSLALKGLNGTSAQNFVNYYFDVANNVVDRFWFFQLDVHGGKTSQITKVSNSETAYAHRDKLYLVQFYDRYENNETYPASSFGFLDGWVDTVTEPLPKSDWGAYANYADARLPRATAEQLYYGVNLPKLQKLKAKYDPKQLFYYPQGLSPAT。
SEQ ID NO.9：
MRVTSTLLAGLVASTADALVAKAVIDKCLTDAGVPIDVKGSEGWNEDVAPFNIRLPYLPTAISVPATTKHIQDSVNCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVVELDQMYNVTYDAKKNIATVQPGARLGHVATVLYEQYGRAIAHGTCPGVGVSGHFLHGGFGFSSHMHGLALDFVQSVTVVLADGSVKEASASSNPDLFWGIKGAGSNFGIVASWKLSTFEAPEKLTKFGVSLGWTKDTAVAGLEAVEKYAKNIQPREVNFRIGDYNKGQPGIEGLYYGTPAQWKKAFQPLLDTLPKGYNVSEPVALNWIQTVIAYSNYDEVDWIHPSPQENFYSKSLTLKGLNGTAAQAFVDYYFDVANKVVDRFWFFQLDMHGGKNSQVAKVPQDATSYAHRDKLYIVQFYDRYENNETYPASSFGFLDGWVDAVTDTIPRSDWGAYINYADARLPRVEAERQYYGEHLPQLQSLKAKYDPKQLFYYPQSVEPKA。
SEQ ID NO.10：
MRVSTICQVGLIATAAEALVITRATIDQCLTDSGVPIDTQGSDGWVRDVTSFNIRLPYLPTAISVPTTIAHIQNSVLCGKKLGIKVSAKSGGHSYASLGFGGENGHLVVELDRMYNVTLDTTTNIATVQPGARLGHVATVLYEQYGRAIAHGICPGVGISGHFAHGGFGFSSHTHGLALDFVESVTVVLADGSIVEASRSENTDLLWGIKGAGSNFGIVASWKLSTFAAPEVLTLFGVDLGWNKSTAVAGLEAVEYYAKNKQPREVNFRIGDYNRGKPGIEGLYYGTPDQWRTAFQPLLDTLPAGYTVSEPKTSNWIEAIINYSNYDNIDWITPSTPENFYAKSLTLKGLNGTSAQNFVDYYFDVANNVVDRFWFYQLDIHGGQNSQVTKVANDATAYAHRDKLYLVQFYDRYETDETYPDSSFGFLDDWVDATTKPLPQSDWGAYANYADPRLSRETAVQLYYGDNLPRLRSLKAKFDPEQLFDFTQGITPA。
SEQ ID NO.11：
MRVVTLLSAGLIASTADALVVTRATIEKCLTDAKVPVDTKGSEDWDEHVAPFNIRLPYLPTAISVPTTTKHIQDSVKCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVVELTDMYNVTYDAAKNLATVQPGARLGHVATVLYEQYGRAIAHGTCPGVGVSGHFLHGGFGFSSHMHGLAVDFIQSVDVVLADGSVKTASSTSNADLFWGLKGAGSNFGIVASYKLSTFAAPQTLTKFGVSLGWTKDTAVAGLEAVEKYAKNIQPREVNFRIGDYNKGQPGIEGLYYGTPAQWRTAFQPLLDTLPKGYTISEPQTLNWIQAVIAYSNYDEVDWIHPSPQENFYTKSLTLKGLNGTAAQAFVDYYFDVANKVVDRFWFFQLDMHGGKYSQVSKVPQDATAYAHRDKLYIIQFYDRYENNQTYPATSFGFLDGWVDAVTDTIPRSDWGAYINYADARLPRAEAVRQYYGEHLDELQALKAKYDPKQLFYYPQSVQPRA。
SEQ ID NO.12：
MRVTSALLAGLVASTADALVAKAAIDKCLTDAGVPIDVKDSEGWNEDAAPFNIRLPYLPTAISVPATTKHIQDSVKCGKKLGIKVSAKSGGHSYASFGFGGENGHLVVELDQMYNVTYDAKKNIATVQPGARLGHVATVLYEQYGRAIAHGTCPGQVAAINYHTFQFLTAFSVGVSGHFLHGGFGFSSHMHGLALDFVQSVTVVLADGTVKEASATVNADLFWGIKGAGSNFGIIASWKLSTFAAPKVLTKFGVSLGWTKDTAVAGLEAVENYAKNIMPREVNFRIGDYSKGQPGIEGLYYGTPAQWKKDFQPLLDTLPKGYNISVPQSLNWIQAVVAYSNYDEVDWIHPSPQENFYSKSLTLKGLNGTSAQAFVDYYFNVANKVVDRFWFFQLDMHGGKNSQITKVGKDATSYPHRDKLYIIQFYDRYENNQTYPASSFGFLDGWVDAVTDTIPRFEWGAYINYADSRLPRAEAERQYYGDHLPRLQSLKAKYDPKELFYYPQSVEPKV。
本发明实施例中所提供的还原糖氧化酶编码基因的合成如下：
获得还原糖氧化酶编码基因的方式为：提供氨基酸序列(SEQ ID NO.1～12)，委托常规的基因公司，合成对应的核苷酸编码序列(SEQ ID NO.13～36)。合成规则依据宿主的密码子偏好性。因为宿主的差异，密码子偏好性也有所不同(SEQ ID NO.13～24为毕赤酵母表达的还原糖氧化酶编码基因，SEQ ID NO.25～36为里氏木霉表达的还原糖氧化酶编码基因)。向基因公司提供未连入基因的空的表达质粒，并告知需要连入表达基因的酶切位点，及酶切位点上下游的DNA序列，避免发生移码突变，基因就可以被直接合成在提供的质粒上，构建出最终用于表达还原糖氧化酶的表达质粒，省去了PCR、酶切、连接等步骤。
需要注意的是：本发明提供的还原糖氧化酶氨基酸序列(SEQ ID NO.1～12)的N端均包含自身的分泌肽序列(如上述阴影标记序列)；在里氏木霉中表达时需要保留分泌肽，利用酶自身的分泌肽进行分泌表达；在毕赤酵母中表达时，需要去除分泌肽序列后再去合成基因，利用商业化质粒自带的分泌肽进行分泌表达。可用SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/)鉴定出酶的分泌肽序列。
以下实施例中合成的DNA序列如SEQ ID NO.13～36所示：
SEQ ID NO.13：
TTGGTGACTCGGGGCGCCATCGAAGCATGCTTATCAGCAGCTGGAGTCCCCATCGACATCCCCGGAACTGCAGATTACGAGCGGGACGTAGAACCCTTTAACATTAGACTGCCCTATATTCCAACAGCCATTGCGCAGACTCAGACAACGGCCCACATCCAGAGTGCAGTGCAGTGTGCGAAGAAACTGAACCTAAAAGTATCGGCTAAGTCCGGTGGACATTCCTATGCTTCTTTCGGATTTGGGGGCGAAAATGGACATCTAATGGTTCAGTTAGACCGCATGATCGACGTCATATCCTATAACGACAAAACCGGGATTGCACACGTTGAGCCGGGAGCTAGGCTCGGCCATCTCGCCACAGTACTTAATGACAAGTACGGCCGGGCTATTTCGCACGGTACATGTCCGGGCGTTGGTATTTCTGGCCACTTTGCGCATGGTGGATTTGGTTTCTCCTCGCATATGCATGGTTTGGCCGTTGATAGCGTGGTAGGTGTGACGGTGGTCCTTGCTGACGGAAGAATTGTTGAAGCTTCAGCCACGGAGAATGCTGACTTATTCTGGGGGATCAAAGGGGCGGGTAGCAATTTCGGGATAGTAGCGGTATGGAAGCTGGCCACATTCCCTGCGCCAAAGGTTCTTACTCGTTTCGGGGTAACGCTAAATTGGAAGAACAAAACTTCAGCGCTCAAGGGCATTGAGGCAGTTGAAGATTATGCAAGGTGGGTAGCGCCGCGTGAAGTGAACTTCAGAATAGGAGATTACGGCGCGGGAAACCCTGGGATAGAAGGCCTTTACTACGGGACTCCTGAACAATGGAGAGCAGCTTTTCAACCACTACTTGATACGTTACCGGCCGGCTACGTTGTCAATCCCACTACTTCATTGAATTGGATCGAGTCCGTGCTCTCTTATAGTAACTTTGATCACGTTGATTTTATAACCCCTCAACCAGTTGAAAATTTCTATGCGAAATCATTGACCCTGAAATCTATAAAAGGGGATGCAGTCAAAAATTTCGTCGATTATTATTTCGATGTGTCGAACAAGGTGAAGGATCGGTTTTGGTTTTATCAACTCGATGTGCACGGCGGGAAGAATAGCCAAGTCACAAAAGTAACAAATGCAGAGACCGCTTATCCACATCGAGACAAACTGTGGTTGATCCAATTTTATGACCGCTACGACAACAACCAAACGTACCCCGAGACCAGTTTCAAGTTTTTAGATGGTTGGGTCAACAGCGTCACCAAAGCCCTGCCGAAAAGTGACTGGGGTATGTACATAAACTATGCCGACCCACGAATGGATAGGGACTACGCGACCAAAGTATATTACGGGGAGAATCTCGCACGCTTACAGAAGCTAAAGGCCAAGTTTGATCCTACGGATCGATTTTACTACCCTCAGGCTGTTCGTCCGGTTAAA。
SEQ ID NO.14：
GCAGCCATTGACGCCTGCTTGGTTTCATCTGGAGTACCCATCGACATTCCAGGTTCGGACGATTATATAAGAGATATCGCACCATTCAACATTAGGTTACCGTATATACCGACGGCCATAGCCCGACCTAGTACGACAGCCCACATACAAAAATCGGTGCAGTGCGCGAACAAACTCAACGTGAAGGTTTCCGCCAAAAGCGGGGGGCATTCCTATGCGAGCTTCGGATTTGGGGGAGAGAACGGTCACCTGGTAATTGAGTTAGATCGAATGATAAACGTCACTGCCTACAACGCTAAGACTGGTGTAGCGCATGTACAGCCCGGAGCCCGCCTTGGTCACTTAGCGACAGTACTATATGAAAAGTACGACCGGGCCATCTCCCATGGGACCTGTCCGGGAGTTGGAATTTCCGGGCACTTTGCTCATGGTGGCTTTGGCTTCTCTTCACATATGCACGGTCTAGCCGTTGACTCAGTCGTCGGAGCAACGGTCGTTTTGGCTGATGGTCGGATCGTGGAAGCGTCTGCTACGGAAAATGCTGACCTCTTTTGGGGGTTGAAAGGCGCAGGGTCTAACTTTGGGATCGTCGCAACTTGGAAACTCGTAACCTTCCCCGCTCCAAAACTACTTACGCGATTCGGTATAACACTCAACTGGAATAAAACAACAGCTGTGAAGGGGATCGAAGCAGTGGAAGACTATGCAAGATGGGTGGCTCCCAGAGAGGTCAATTTCCGGATCGGCGATTATGGAAAGGGCAACCCAGGCATCGAAGGCTTATTTTACGGTACCCCCGAACAGTGGCGCGCTGCGTTTCAGCCATTGCTCAATACTTTGCCGGCAGGTTATGTGGTACAAACTCCCACCACGTTAAATTGGATTCAATCGGTCTTAAGTTACAGCAATTTTGACCATATAGATTTTATAACACCTCAACCACAGGAGAATTTCTATGCCAAATCGCTGACCCTAAAGACAATAAAAGGAAAGGCGGTTCAAAATTTCGTTGATTATTATTTTGACGTAGCGAATAAAGTTGTTGATCGTTTCTGGTTCTATCAGCTGGACGTTCACGGCGGAGCTAATAGTCAAGTGTGGAAAGTGACTAATGCGGAGACGGCATACCCACACCGTGACAAGCTTTGGCTTATTCAATTCTACGATAGGTATGAGAACAATGAGACTTACCCTGATACCAGCTTTAAGTTCCTTGATGGCTGGGTAGACTCAGTTACAAAGGTCACCCCGAAGAGTGATTGGGGCATGTACATTAATTACGCGGACCCGCGTATGGATCGTGATACTGCGACGAAGAACTACTATGGGGTGAACCTGCCTAAACTACAAAAATTGAAGGCTAAGTTTGATCCTACCGATCGGCTGTACTACCCTCAGGCAGTTCGCCCGGTAAAA。
SEQ ID NO.15：
GCAACCATTGAACAATGTCTCACTGACGCAAAGGTCCCCATCGATACAAAAAACTCTGCGGAGTGGAATGAGGACGTTGCTCCTTTTAATATTAGATTACCATATCTCCCGACGGCCATCGCTGCTCCCCAGACTACTCAACACATTCAAAGCGCTGTTAACTGTGGGAGAAAATTGGCAATCAAAGTTTCAGCGAAGTCGGGAGGTCACTCGTACGCCAGCTTCGGTTTTGGAGGCGAAAATGGTCATCTTATCATAGAATTAGATCAGCTATACAACGTCACCTATGATGCCTCGACCAATATAGCTACGGTACAACCTGGAGCCCGGCTAGGCCATGTAGCAACAGTATTGTACCAGCAATATGGGCGTGCTATAGCGCACGGCACCTGCCCCGGTGTGGGTGTGTCAGGGCATTTCCTGCATGGGGGTTTCGGATTCAGCTCGCATATGCACGGCCTGGCCTTAGACTTCGTACAGTCTGTGGACGTGGTCCTGGCTGATGGCACAGTGAAAACGGCATCATCCAGTTCTAATAGCGACTTATTTTGGGGGATCAAGGGCGCGGGATCTAACTTCGGGATTGTCGCATCCTGGAAACTCTCCACTTTTGCTGCACCTGCCACTTTAACAAAATTTGGCGTAACGTTGGGATGGAACAAGAACAATGCCGTAGCCGGATTGCAAGCGGTAGAAAACTACGTTAAAAATGTTCAACCACGAGAAGTCAATTTTAGGATCGGTGACTATAATAAGGGTCAACCTGGAATCGAAGGGTTGTACTATGGAACGCCGGCGCAATGGAAGACAGCTTTCCAGCCGCTACTTGACACTCTCCCCTCTGGCTATACCGTCCAGCCGACACAGCAGCTGAACTGGATACAGGCGGTTATTGCTTACTCAAATTACGATGACGTGGACTGGATCCACCCGAGTCCCCAGGAGAATTTTTACGCAAAGTCCTTAACACTTAAGGGACTTAATGGGACGGCGGCTCAAGCGTTTGTTAACTACTATTTTGATGTTGCCAACAAAGTGACGGACAGGTTTTGGTTCTTCCAGATAGATGCCCACGGGGGTAAAAACAGTCAAATTGCAAAAGTCGCGCCTGACGCAACTTCATACGCACATCGAGACAAGCTTTACATAATACAGTTTTATGATCGCTACGAAAACAACCAGGTATACCCCTCGACCTCCTTCGGTTTCCTAGATGGCTGGGTCAATGCAGTGACCAAGGCACTACCAAGTAGTGATTGGGGCGCTTATATTAATTATGCGGATCCTCGCCTCAGCCGGGATGCGGCCCAACAGCAATATTATGGGCAGAACCTTGCTAAATTACAAAGTCTGAAGGCCAAGTATGACCCAAAGGAGCTATTCTACTATCCACAAGGGGTAAAACCGTCGGCC。
SEQ ID NO.16：
CTAGTTATAACCCGGGCAGCAATAGATAAATGTTTGGTGGATGCGGGCGTGCCTATAGATGTAAAAGGCACCGATGATTACAAGAGGGATGTCGCACCATTCAACGTTCGGCTGCCGTACACCCCAACTGCGATTTCTGTACCTCTAACTACCAAACATATACAAGATTCTGTAAAGTGCGGTAAAAAACTAGGTATCAAGGTGTCCGCGAAGTCGGGAGGTCACTCTTACGCGTCCTTCGGCTTTGGAGGAGAAAACGGCCACTTGGTTGTCGAGTTAGACCGTATGTATAACGTTACTTACGACGCGACGAAAAACATAGCAACAGTACAACCGGGTGCTAGATTGGGACACGTAGCAACCGTATTATATGAACAATATAACCGTGCTATTGCTCATGGAACGTGCCCTGGGGTCGGCGTTAGTGGCCATTTCCTGCACGGAGGTTTTGGATTCAGCTCTCATATGCATGGACTTGCACTGGACTTCGTGGATTCAGTCACAGTAGTACTCGCGGACGGGTCTGTCGTGGAGGCAAGTTCCACCGAAAACACGGATCTACTCTGGGGCATCAAGGGTGCTGGTTCCAACTTTGGAATTGTAGCAGCGTGGAAACTGACAACTTTTGAAGCCCCGGCAGTTTTAACAAGATTTGGCTTAAGTTTGGGGTGGAATAAGAGTACTGCGGTGGCTGGGTTAGAAGCCGTTGAGAAGTATGCAAAAAATATTCAGCCTCGTGAGGTTAACTTCAGAATCGGTGACTATAATAAGGGTCAGCCAGGCATCGAGGGACTTTACTATGGGACTCCGGCCCAGTGGCGGAAGGCGTTCCAGCCCCTCCTAGACACGCTCCCGGCTGGGTACAATGTGTCGGATCCTCAGCAACTTAACTGGATCGAGGCCGTCATCTCATACAGCAATTATGACAACGTGGACTGGATTACCCCCAGCCCACAAGAAAATTTTTACGCCAAATCACTAACATTGAAAGGGTTAAACGGCACGTCGGCCCAAAATTTCGTTGATTATTACTTTGATGTGGCTAATAATGTCGTAGATCGCTTCTGGTTTTTCCAGCTTGACATGCATGGTGGCAAGAACAGTCAAGTCACGAAGGTGGCCCCTGATGCAACATCGTATGCTCACAGGGACAAATTGTATATTATACAATTTTACGACCGATACGAGAATAATCAGACGTATCCCGCAACTTCATTTGGGTTTCTCGACGGATGGGTTGATGCTACCACAAAGCCCTTACCGGAGAGCGATTGGGGGGCCTACGCGAATTATGCTGATGCCCGACTTAGCCGCGCGGTTGCCGAAGACCAATATTACGGGGACCACCTTCCACGACTGCAGAAGCTCAAAGCCAAATTTGACCCCAAACAGCTGTTCTACTATACGCAGTCAGTCCAACCAAAGGCT。
SEQ ID NO.17：
TTGGTGACCAGGGCAGTTATCGATAAGTGTCTAACGGACGCAGGGGTTCCGGTGGACATAAAAGGAAGCGATGATTGGGACAGAGACGTCGCTCCTTTTAATGTCCGCTTGCCCTATTTGCCTACCGCTATATCCGTTCCGCTCACAACAAAACACATTCAAGATTCGGTCAAGTGCGGAAAAAAGCTTGGGATTAAAGTGTCGGCGAAAAGTGGAGGGCACTCTTACGCGTCTTTCGGCTTTGGCGGCGAAAACGGCCATCTAGTTGTAGAATTGGATCGGATGTATAATGTGACTTATGACGCCGGGAAGAACATAGCGACGGTCCAGCCCGGTGCCCGGTTAGGTCATGTTGCTACAGTTCTTTACGAGACGTACGGTCGTGCAATTAGTCACGGGACTTGTCCGGGTGTCGGTATCTCCGGACATTTCCTTCACGGAGGTTTTGGTTTCAGTTCGCATATGCACGGGTTAGCTCTCGACTTCGTGGACTCAGTCACTGTGGTATTGGCCGACGGACGCGTAGTTGAGGCATCATCCACAGAGAACTCCGATCTGCTTTGGGGCATTAAGGGAGCAGGGTCCAATTTTGGCATCGTAGCTTCTTGGAAGTTACGAACCTTCGAAGCGCCTAAAGTGTTAACACGGTTCGGGGTTAGCCTGGGTTGGAATAAATCAACCGCGGTGGCTGGCCTAGAGGCAGTGGAGAAGTATGCGAAAAATGATCAACCAAGGGAGGTTAATTTCCGTATTGGGGACTACAATAAAGGTCAACCGGGGATAGAAGGACTTTATTATGGCACGCCGGAGCAGTGGAGAAAAGCCTTCCAACCACTCCTAGACACCCTGCCAACTGGATACAACGTAAGCGAACCCCAGACTTTAAACTGGATCCAAGCAGTAATTAGCTACTCTAATTATGATAACGTTGATTGGACCACTCCATCACCCCCTGAGAACTTTTACGCCAAATCACTTGCTCTGAAAGGACTCAATGGCACCGCGGCGCAGAACTTCGTCGATTATTATTTTGATGTAGCTAACAACGTCGTTGATCGCTTTTGGTTTTTCCAACTAGACATCCATGGTGGTAAGACTTCACAGATAGCGAAAGTTGCTGTGGATGCCACGTCTTACGTCCACCGAGACAAGTTGTACCTCGTCCAGTTTTATGATAGGTATGAAAATAATGAGACATACCCTGCTACGTCGTTCGGCTTTCTGGACGGCTGGGTAGATACGGTAACAAAGCCTTTACCCAAAAGTGAATGGGGCTCGTACGCAAACTACGCCGATGCACGTCTGAGTAGAGCCGTAGCCGAAGACCAGTATTACGGAAAGCATCTCCCAAAACTACAAAAGTTAAAGGCGAAGTATGATCCAAAACAACTGTTTTACTATCCCCAGAGCGTGGAACCGAAGGCA。
SEQ ID NO.18：
CTTGTCACTCGCGCTAATATAGACAAGTGCCTTGTAGATGCTGGCGTACCTATAGACATAAAAGGGACCTCGGATTGGAACCGAGACGTAGCTCCTTTTAACATACGTCTGCCGTATACACCCACGGCAATCTCCGTTCCCCAGACCGTGAAACATATCCAGGACTCTGTAAAATGCGGAAAGAAATTAGGAATTAAGGTGTCGGCTAAGAGCGGAGGCCACAGTTACGCAAGCTTCGGGTTCGGTGGAGAAAATGGGCAGCTCGTCGTGCAGCTCGATCGGATGTACAATGTTACATATGATTCGAAAAAAAATATAGCCACGGTTCAACCGGGCGCGAGGTTAGGACATGTTGCTACTGTTCTATACGAGAAGTATGGACGGGCCATTGCTCACGGGACGTGTCCTGGTGTCGGGATCTCTGGCCACTTCTTGCACGGGGGCTTCGGTTTTTCAAGCCATCAACACGGGTTGGCTCTGGACTTTGTCGAGTCTGCAACTGTAGTACTAGCGGATGGCTCCGTCGTGGAGGCCTCGGATTCAGAAAACCGAGACTTGCTATGGGGAATCAAGGGCGCCGGTTCAAACTTTGGGATTGTCGCGTCCTGGAAACTTCGTACTTTTGAGGCGCCGAAGGTGCTGACGCGCTTTGGAGTGGTCCTCGGCTGGACTAAAGAGAATGCGGTAAAAGGCCTAGAGGCGGTTGAAAAGTATGCAAAAAACATCCAGCCCCGCGAAGTCAATTTTAGGATTGGCGATTATGGAAAGGGTAATCCGGCGATAGAAGGACTCTATTACGGAACACCCGAACAATGGCGCAAGGCCTTCCAGCCCCTTCTTGATACCCTGCCAACCGGCTATAACATCAGTACACCAAAAGCCATGAACTGGATTGAGTCTGTTATTAGCTACAGTAACTACGAGACCGTAGACTGGATAGAACCTTCACCACAAGAGAATTTTTATGCAAAGAGTCTCGCCTTAAAAGGTCTAAACGGTACGTCAGCAAAGGATTTCGTGGATTACTACTTTGACGTTGCAAACAAAGTTGTTGATAGATTCTGGTTCTTTCAACTAGACGTCCATGGGGGGCGAAATAGTCAAATCTCAAAAGTGGCTACTGATGCTACATCCTACGTGCATAGGGACAAGTTGTATTTGGTACAACTCTACGACAGATACGAAAATAACGAGACGTATCCGTCGTCTTCCTTCGGTTTCTTAGATGGTTTCGCCAACGCCGTAACCAAGTCTCTGCCCAAATCCGACTGGGGTGCATATGCGAATTATGCGGACCCGAGGTTACCAAGAGGGGTCGCAGACGAATTATACTATGGAAGCAATCTGCCTCGGTTGCAGCGTCTTAAAGCCAAGTACGATCCAAAGCAGGTTTTTGACTATCCTCAAGGTGTGGATCCAAAGTAC。
SEQ ID NO.19：
GCTATTGACAAATGTCTAACTGACGCAGGGGTGCCGATCGACGTAAAAGGTAGCGATGGATGGAATGAAGATGTTGCGCCATTCAATATACGCTTGCCCTATCTCCCCACAGCGATTTCAGTTCCGGCCACAACGAAACACATCCAAGACTCGGTCAAATGCGGTAAAAAGTTAGGTATAAAAGTGAGTGCAAAGAGTGGCGGGCATAGTTATGCGAGCTTCGGGTTTGGCGGAGAGAACGGACATCTAGTGGTCGAACTCGACCAGATGTATAATGTGACGTATGACGCAAAAAAAAATATTGCGACAGTTCAGCCAGGAGCCCGGCTGGGGCATGTAGCCACCGTCTTATACGAGAAATACGGTAGAGCGATCGCTCACGGAACGTGCCCTGGCGTAGGGGTATCTGGGCATTTCCTACATGGGGGGTTTGGTTTCAGCTCACACATGCACGGTCTCGCATTAGATTCCGTGCAGTCGGTAACAGTAGTGTTGGCTGACGGCACTGTAAAAGAGGCATCGGCTTCGACTAACGCCGATTTGTTTTGGGGAATGAAGGGCGCAGGGAGTAATTTTGGAATTGTCGCCTCTTGGAAGCTGTCCACTTTTGAGGCCCCAAAAACACTCACTAAGTTCGGTGTCGCCTTGGGCTGGACGAAGGACACTGCTGTTGCTGGCCTGGAAGCGGTCGAGAACTACGCCAAGAATATCATGCCTCGAGAGGTCAATTTCCGAATTGGCGACTATTCTAAGGGAAAACCTGGCATTGAAGGCCTGTATTATGGAACCCCAGCTCAATGGAAGAAAGACTTTCAACCGCTTCTAGATACCCTTCCGAAAGGATACAACATATCCGAACCTCAGAGCCTCACATGGATCCAAGCAGTAATAGCTTATTCAAACTATGACGAGGTGGATTGGATACACCCCTCGCCGCAGGAAAACTTTTACTCTAAGAGTCTTACTCTAAAGGGCCTGAACGGTACCAGTGCTCAAGCATTTGTGGATTACTATTTTGACGTTGCAAATAATGTTGTTGATCGATTCTGGTTCTTTCAACTTGATATGCATGGAGGTAAGAACTCACAGATAACGAAGGTAGGGAAGGACGCCACAAGCTATCCACACAGAGATAAACTATACATCATTCAGTTTTATGATAGGTATGAGAATAACCAAACCTACCCGGCGTCTTCATTCGGTTTCCTGGATGGCTGGGTTGATGCTGTTACCGACACGATCCCCCGTTCGGAATGGGGTGCATACATAAACTACGCGGATTCCAGGCTTCCCCGGGCGGAAGCGGAGCGTCAATACTACGGGGATCATCTTCCTCGCTTACAATCTTTAAAGGCCAAGTATGATCCAAAAGAATTGTTCTACTACCCCCAGTCCGTCGAGCCT。
SEQ ID NO.20：
CTTGTCGTTACACGAGCAACCATCGACAAGTGCCTGGTCGATAGCGGCGTACCTATCGACACTAAAGGCGATGAGGGTTGGGTTAGGGACGTAGCGCCATTTAACATCCGGTTACCTTACCTACCTACAGCTATTTCCGTACCCCTCACCACTGCACACATCCAAAAGAGTGTTCTTTGTGGCAAAAAGCTCGGTATAAAGGTGTCGGCTAAGTCTGGCGGTCATTCGTATGCAAGTTTCGGTTTTGGAGGTGAAAACGGGCACTTGGTAATAGAACTGGACAGAATGTACAATGTGACTCTCGATGCGAAAACAAAAATCGCAACCGTACAGCCAGGTGCCCGCCTTGGGCACGTCGCTACGGTCTTGTATGAACAATACAATCGTGCTATAGCACACGGTACCTGTCCCGGAGTTGGAATATCGGGACATTTCCTGCATGGGGGGTTTGGATTCTCATCACATATGCATGGCCTGGCGCTTGATTTCGTGGAGTCTGTGACAGTGGTGTTGGCGGATGGAAGCGTGGTGGAGGCATCCTCCTCTAAAAACTCAGATCTATTATGGGCCATTAAAGGGGCTGGTTCCAACTTTGGGATTGTTGCCAGTTGGAAACTTAGCACTTTCGAAGCTCCTGATGCACTCACTCGATTTGGGGTGACTCTAGGATGGAATAAAAGTACGGCTGTGGCCGGTTTAGAGGCCGTTGAGGCGTACGCCAAGTTCAAAGCACCCCGCGAGATAAATTTTCGGGTCGGGGACTACGGAAAGGGTTCGCCTGCCATAGAAGGCTTGTATTATGGCACGCAAGCTCAATGGCGTAAAGACATCGCGCCCTTGCTGGACACGCTACCCGCTGGTTGGAATATTTCAGAAACGAGAACCCTCAACTGGATTGAATCAGTAATCAGCTATAGCAATTATGATAACGTAGACTGGATTACACCCTCCCCGCAGGAGAATTTTTATGCGAAGTCGCTTGCGTTGAAGGGCTTAAACGGAACATCGGCGCAGAATTTTGTAAATTATTACTTTGACGTAGCAAACAATGTCGTTGATAGATTCTGGTTTTTCCAACTTGATGTTCATGGGGGAAAGACGTCACAGATTACCAAAGTCAGTAACTCTGAAACCGCCTACGCACACCGAGACAAGCTGTATTTAGTCCAATTCTATGACCGTTACGAGAACAACGAAACATATCCGGCCAGTAGCTTTGGCTTCCTAGATGGATGGGTTGATACCGTAACGGAGCCACTCCCAAAATCTGACTGGGGCGCCTACGCTAATTACGCCGATGCAAGGCTTCCGAGGGCCACAGCGGAGCAGCTGTATTATGGGGTCAACTTACCGAAGCTACAGAAACTAAAAGCGAAGTACGACCCGAAGCAACTCTTCTACTACCCACAGGGGTTATCCCCAGCAACT。
SEQ ID NO.21：
CTCGTTGCCAAAGCAGTGATTGATAAATGCCTCACGGATGCAGGCGTTCCCATCGACGTTAAAGGTAGTGAGGGTTGGAACGAGGACGTCGCACCTTTCAACATTCGTCTACCCTACCTTCCCACCGCAATCAGTGTCCCAGCGACTACAAAGCACATACAAGATTCCGTAAATTGTGGAAAGAAACTGGGTATAAAGGTCTCGGCGAAGAGCGGTGGCCATTCGTATGCAAGTTTTGGGTTCGGCGGCGAAAACGGACATTTAGTAGTGGAACTGGACCAAATGTACAACGTTACATACGACGCCAAAAAAAATATAGCTACGGTACAACCAGGTGCTAGACTAGGGCATGTGGCTACTGTCTTATATGAGCAATATGGACGGGCGATAGCCCATGGGACCTGTCCGGGCGTTGGAGTGTCAGGTCATTTTTTGCACGGTGGATTCGGGTTCTCTAGCCACATGCATGGCCTCGCCCTGGACTTCGTTCAGTCTGTTACAGTAGTCCTCGCAGACGGATCAGTGAAGGAGGCATCCGCCTCTTCTAACCCGGACTTGTTTTGGGGTATCAAAGGGGCAGGATCAAACTTTGGCATTGTGGCCAGCTGGAAATTATCTACTTTTGAAGCCCCTGAGAAACTCACCAAGTTCGGTGTATCATTGGGGTGGACAAAGGATACAGCTGTGGCTGGCTTGGAGGCGGTCGAAAAATATGCAAAGAATATTCAGCCGCGTGAGGTCAATTTCAGAATTGGGGACTATAACAAAGGACAGCCAGGAATAGAGGGACTATACTATGGTACCCCGGCGCAATGGAAGAAGGCGTTCCAGCCACTGCTTGATACCCTACCTAAAGGTTATAATGTAAGTGAACCGGTTGCATTAAATTGGATTCAGACGGTAATCGCCTACAGCAATTACGATGAAGTTGACTGGATCCATCCCTCCCCTCAAGAAAATTTCTATTCAAAGTCGTTGACTCTCAAAGGCTTAAACGGGACTGCTGCGCAAGCGTTTGTAGACTATTATTTTGACGTGGCTAACAAAGTGGTAGACAGGTTTTGGTTCTTTCAACTAGATATGCACGGGGGCAAGAATTCCCAGGTCGCGAAGGTTCCCCAAGATGCAACTAGTTACGCGCACCGAGACAAGCTTTATATCGTCCAGTTTTACGATCGCTACGAAAACAATGAGACCTATCCTGCTTCCTCGTTTGGCTTTCTAGACGGGTGGGTCGATGCGGTAACGGATACGATTCCAAGGAGTGATTGGGGGGCTTATATAAACTACGCCGATGCCCGCCTGCCGCGAGTGGAAGCTGAGCGGCAATACTACGGAGAGCACTTACCACAGCTTCAGTCTCTTAAGGCCAAATACGATCCCAAGCAATTATTCTACTATCCCCAGAGCGTGGAACCTAAAGCT。
SEQ ID NO.22：
CTGGTAATCACGCGGGCCACGATCGACCAATGCTTGACAGATAGTGGGGTTCCGATAGACACGCAGGGAAGTGACGGTTGGGTTCGAGATGTAACCAGCTTTAATATTAGGCTACCGTACCTCCCCACCGCCATATCGGTGCCAACGACTATCGCGCATATTCAGAATAGCGTCTTGTGTGGCAAGAAACTGGGTATAAAAGTATCTGCGAAGTCGGGTGGGCATAGTTACGCATCACTCGGATTCGGCGGAGAGAACGGCCACCTAGTCGTAGAACTTGACCGGATGTATAACGTGACCCTCGATACAACAACAAATATCGCGACCGTACAGCCAGGAGCGCGCTTAGGCCATGTTGCCACTGTGCTATACGAGCAATATGGTAGAGCTATTGCGCACGGGATATGTCCTGGTGTTGGTATTTCGGGTCACTTCGCTCATGGCGGGTTTGGGTTCAGTTCTCACACCCATGGATTAGCATTAGATTTCGTAGAGTCCGTTACCGTAGTTCTGGCAGATGGTAGCATCGTCGAGGCTTCACGTTCCGAGAATACAGATCTTTTATGGGGAATAAAGGGAGCAGGATCGAACTTTGGTATTGTCGCTTCCTGGAAATTATCAACTTTCGCCGCCCCCGAAGTGCTAACTCTCTTTGGGGTTGATTTAGGGTGGAACAAAAGCACGGCAGTGGCTGGTCTTGAAGCTGTGGAGTATTATGCTAAGAACAAACAACCAAGGGAAGTAAACTTCAGGATTGGCGATTATAATCGAGGAAAGCCGGGGATCGAAGGATTGTACTACGGCACCCCGGATCAGTGGCGGACGGCTTTTCAACCTCTGCTTGATACCCTACCCGCGGGCTATACAGTGTCTGAGCCAAAGACTAGCAATTGGATCGAAGCCATAATAAATTATTCTAATTATGACAATATCGACTGGATTACGCCTTCCACTCCGGAAAACTTTTACGCGAAGAGTCTGACTTTGAAAGGGTTGAATGGCACGTCAGCTCAAAACTTCGTGGACTACTACTTTGATGTCGCGAATAACGTTGTCGATAGATTTTGGTTCTACCAGCTCGATATACACGGTGGTCAAAACTCGCAGGTCACTAAGGTGGCAAACGATGCCACCGCATACGCACACCGCGACAAACTTTATCTCGTACAATTCTATGATCGTTATGAAACGGACGAGACATACCCAGATTCTAGCTTTGGCTTTCTAGACGACTGGGTCGATGCGACAACAAAGCCATTGCCTCAGTCAGACTGGGGGGCCTACGCGAATTATGCCGACCCTCGTCTATCCCGAGAGACGGCAGTTCAGTTGTACTATGGGGATAACCTGCCTCGCCTTAGATCTCTGAAAGCAAAATTTGACCCCGAACAACTCTTCGACTTCACCCAAGGCATTACTCCCGCC。
SEQ ID NO.23：
CTAGTGGTTACTCGTGCGACAATTGAGAAGTGCCTCACTGATGCTAAGGTACCTGTGGACACTAAGGGTTCCGAAGACTGGGACGAACACGTCGCACCATTCAACATCAGGTTACCTTACCTGCCGACGGCTATCAGTGTCCCAACTACCACCAAACACATCCAAGACTCGGTCAAATGCGGGAAGAAGCTCGGAATAAAAGTTAGCGCTAAATCAGGAGGACATAGCTACGCTAGTTTTGGTTTCGGCGGTGAAAATGGTCATCTAGTCGTGGAGCTAACGGACATGTATAACGTGACGTACGATGCCGCCAAAAATCTTGCAACCGTACAACCCGGCGCCCGCCTTGGACACGTTGCGACCGTACTCTACGAGCAGTATGGCCGAGCAATCGCGCACGGTACGTGTCCCGGGGTCGGCGTTTCCGGACATTTCCTTCATGGAGGTTTCGGGTTTTCTTCACACATGCACGGGCTGGCAGTAGACTTCATACAATCTGTAGATGTAGTGCTTGCAGATGGTTCGGTCAAGACGGCTAGTAGTACGTCGAACGCAGATTTATTTTGGGGACTCAAAGGCGCGGGGTCTAATTTCGGCATTGTTGCAAGTTATAAGTTATCCACATTTGCGGCTCCACAAACACTGACCAAATTCGGCGTGTCGCTTGGGTGGACTAAAGACACTGCAGTCGCGGGGTTGGAAGCAGTTGAGAAATACGCGAAGAACATTCAGCCTCGGGAAGTTAACTTTCGCATAGGCGATTATAACAAGGGACAACCCGGGATTGAAGGATTATACTACGGTACGCCGGCCCAGTGGAGAACTGCGTTTCAGCCACTGTTAGACACTCTACCCAAAGGGTATACCATATCTGAGCCGCAAACACTAAACTGGATTCAAGCCGTAATAGCTTATTCCAATTATGACGAAGTGGACTGGATTCATCCCAGCCCTCAAGAGAATTTCTACACGAAATCGCTGACCTTGAAGGGTCTCAACGGGACAGCGGCCCAAGCTTTTGTTGATTATTACTTTGATGTGGCTAATAAAGTAGTTGACCGGTTTTGGTTCTTTCAGCTGGATATGCATGGTGGAAAGTACTCACAGGTCAGCAAGGTACCCCAGGACGCCACAGCTTACGCACATAGAGACAAGTTGTATATAATACAGTTCTACGACCGTTACGAGAACAATCAAACATATCCGGCCACGTCTTTTGGCTTCCTCGATGGCTGGGTGGATGCTGTGACCGATACAATCCCTCGATCAGATTGGGGCGCGTATATCAATTACGCGGATGCCAGGCTTCCAAGAGCCGAAGCTGTCCGCCAATATTACGGGGAGCACTTGGATGAATTGCAGGCACTAAAAGCCAAGTATGATCCGAAACAGTTGTTTTATTATCCGCAGAGCGTTCAGCCTAGGGCC。
SEQ ID NO.24：
GCCATAGACAAATGCCTCACAGACGCGGGTGTGCCTATAGATGTGAAGGATTCGGAGGGTTGGAACGAGGACGCAGCGCCTTTTAATATCAGATTACCCTATTTACCGACGGCCATAAGTGTCCCCGCGACCACTAAGCATATCCAAGACTCTGTGAAGTGTGGGAAAAAATTGGGAATCAAGGTTTCAGCTAAGTCTGGGGGACATAGCTACGCTTCATTCGGTTTTGGGGGAGAGAATGGTCATCTCGTTGTAGAGCTAGACCAAATGTACAACGTCACGTATGATGCAAAAAAGAACATCGCTACCGTACAACCAGGAGCGCGGTTAGGCCATGTTGCAACAGTCCTCTATGAACAGTATGGACGCGCTATAGCCCACGGCACCTGCCCGGGTCAGGTTGCAGCCATAAACTACCACACATTTCAGTTCCTCACAGCTTTTTCCGTGGGTGTAAGCGGCCACTTTCTTCATGGGGGATTCGGTTTTTCCAGTCACATGCATGGCCTTGCACTTGATTTTGTGCAGAGCGTCACTGTCGTACTGGCAGATGGCACAGTTAAGGAAGCATCGGCGACGGTAAACGCAGACCTATTTTGGGGAATTAAAGGCGCCGGGTCGAATTTCGGGATCATAGCGTCTTGGAAGTTGTCCACGTTCGCCGCTCCCAAAGTATTGACGAAATTCGGAGTCTCATTAGGATGGACAAAGGACACTGCCGTAGCCGGGCTTGAAGCGGTCGAAAACTACGCTAAGAACATTATGCCGCGTGAAGTCAATTTTCGAATTGGCGACTACAGTAAGGGACAGCCGGGCATTGAGGGGCTTTATTATGGTACGCCAGCTCAGTGGAAGAAGGATTTCCAGCCGTTGCTAGACACCCTGCCCAAAGGGTATAACATCTCCGTTCCCCAGTCGTTAAATTGGATCCAAGCGGTAGTTGCCTACTCAAATTACGACGAGGTTGATTGGATTCATCCAAGCCCACAAGAAAATTTTTACTCCAAAAGTCTGACCCTGAAGGGTCTAAATGGTACCTCTGCGCAAGCTTTCGTGGATTATTATTTCAACGTGGCAAATAAAGTAGTCGATCGGTTTTGGTTCTTTCAGCTTGACATGCACGGAGGCAAAAACTCGCAGATTACTAAGGTCGGGAAAGATGCGACCAGTTACCCTCACCGTGACAAGTTATATATAATCCAATTCTACGATAGGTATGAGAATAATCAAACTTATCCCGCTAGTAGCTTTGGTTTCCTGGACGGCTGGGTTGATGCAGTAACTGATACGATTCCTCGATTCGAATGGGGGGCGTACATAAACTACGCAGACTCCAGGCTACCACGCGCTGAGGCCGAGCGGCAATATTACGGCGATCACCTACCAAGATTGCAATCTCTGAAAGCCAAATACGATCCTAAAGAACTCTTCTATTATCCTCAGTCAGTGGAACCGAAAGTG。
SEQ ID NO.25：
ATGCGATCCGCTTTCATCCTCGCCCTGGGCCTCATCACCGCTTCTGCTGATGCCCTCGTCACCCGAGGCGCTATTGAGGCTTGCCTGAGCGCTGCTGGCGTCCCTATTGACATCCCCGGCACTGCTGACTACGAGCGAGACGTCGAGCCCTTCAACATCCGCCTCCCTTACATCCCCACCGCCATCGCTCAGACCCAGACTACTGCCCACATCCAGAGCGCCGTCCAGTGCGCTAAGAAGCTCAACCTGAAGGTCTCCGCCAAGAGCGGCGGCCACAGCTACGCTAGCTTCGGCTTTGGCGGCGAGAACGGCCACCTCATGGTCCAGCTCGACCGAATGATCGACGTCATCTCCTACAACGACAAGACCGGCATCGCCCACGTCGAGCCTGGCGCTCGACTCGGCCACCTCGCTACCGTCCTCAACGATAAGTACGGCCGCGCCATCAGCCACGGCACCTGCCCTGGCGTCGGCATCAGCGGCCACTTCGCTCACGGCGGCTTTGGCTTTTCCTCCCACATGCACGGCCTCGCTGTCGATAGCGTCGTCGGCGTCACTGTCGTCCTGGCTGATGGCCGAATCGTCGAGGCTAGCGCTACCGAGAACGCCGATCTCTTCTGGGGCATCAAGGGCGCTGGCTCTAACTTCGGCATCGTCGCTGTCTGGAAGCTGGCCACTTTCCCCGCTCCTAAGGTCCTGACCCGCTTCGGCGTCACTCTCAACTGGAAGAACAAGACCAGCGCCCTCAAGGGCATCGAGGCTGTCGAGGATTACGCCCGATGGGTCGCTCCTCGAGAGGTCAACTTCCGCATCGGCGACTACGGCGCTGGCAACCCTGGCATCGAGGGCCTCTACTACGGCACTCCTGAGCAGTGGCGCGCTGCTTTTCAGCCTCTGCTCGACACCCTCCCCGCTGGCTACGTCGTCAACCCTACTACCAGCCTGAACTGGATCGAGAGCGTCCTGTCCTACTCCAACTTCGACCACGTCGACTTCATCACCCCCCAGCCTGTCGAGAACTTCTACGCCAAGAGCCTCACCCTCAAGAGCATCAAGGGCGACGCCGTCAAGAACTTCGTCGACTACTACTTCGACGTCTCCAACAAGGTCAAGGACCGCTTCTGGTTCTACCAGCTGGACGTCCACGGCGGCAAGAACTCTCAGGTCACCAAGGTCACCAACGCCGAGACCGCTTACCCCCACCGAGATAAGCTCTGGCTCATCCAGTTCTACGACCGCTACGACAACAACCAGACCTACCCCGAGACCAGCTTCAAGTTCCTCGACGGCTGGGTCAACTCCGTCACCAAGGCTCTGCCCAAGTCCGACTGGGGCATGTACATCAACTACGCCGACCCCCGCATGGACCGAGATTACGCTACCAAGGTCTACTACGGCGAGAACCTGGCCCGCCTCCAGAAGCTCAAGGCTAAGTTCGACCCCACCGACCGCTTCTACTACCCCCAGGCTGTCCGACCTGTCAAG。
SEQ ID NO.26：
ATGCGCAGTGCCCTGGCGTTGGCTCTCGGCCTAGTGGCGGCTGGCGCGGACGCCCTTGTTACACGTGCTGCCATTGATGCCTGTCTCGTCAGCAGTGGTGTTCCCATCGACATCCCGGGTTCTGACGACTACATCCGCGATATTGCCCCGTTTAACATCCGCTTGCCCTACATCCCTACGGCCATCGCCAGACCTTCAACAACCGCCCACATCCAGAAGAGCGTTCAGTGCGCCAACAAGCTAAACGTCAAAGTCTCGGCGAAATCAGGAGGGCATTCCTACGCGAGCTTCGGATTTGGCGGGGAGAACGGCCACCTGGTTATCGAGCTGGATCGGATGATCAACGTGACTGCCTACAACGCCAAGACGGGGGTTGCGCACGTCCAACCAGGTGCTCGTCTTGGCCATTTGGCAACAGTGCTGTACGAGAAGTACGATCGAGCAATTTCCCACGGAACTTGCCCTGGCGTGGGCATCTCCGGCCACTTTGCTCATGGAGGATTTGGCTTCTCTTCCCATATGCACGGTCTGGCTGTCGACAGCGTAGTCGGCGCAACCGTCGTCTTGGCCGATGGGCGAATTGTCGAGGCCTCGGCAACCGAGAACGCTGATCTCTTCTGGGGGTTGAAGGGAGCCGGTAGCAACTTTGGAATAGTCGCCACGTGGAAACTCGTCACCTTCCCCGCACCAAAGCTGCTGACGAGGTTCGGCATAACGCTTAACTGGAACAAGACGACGGCGGTCAAGGGGATCGAAGCAGTGGAAGACTATGCTCGATGGGTGGCGCCGAGAGAAGTGAACTTCCGGATCGGGGACTATGGAAAAGGCAACCCCGGCATTGAGGGCCTCTTCTATGGCACCCCCGAGCAGTGGAGGGCGGCCTTCCAGCCTCTCTTGAACACCCTGCCGGCTGGCTATGTCGTACAGACGCCGACTACGCTCAACTGGATCCAATCGGTGCTCAGCTACTCCAATTTCGACCACATTGACTTCATCACCCCACAGCCGCAGGAGAATTTCTATGCGAAGTCTCTCACACTGAAGACCATCAAGGGCAAGGCCGTCCAGAACTTTGTCGATTACTACTTTGATGTTGCCAATAAGGTCGTGGACCGCTTTTGGTTCTACCAGCTGGACGTCCACGGCGGCGCCAACTCGCAAGTCTGGAAGGTGACCAATGCCGAGACGGCATATCCACATAGAGACAAGCTGTGGCTTATTCAGTTCTACGACCGCTACGAAAACAACGAGACCTACCCCGACACCTCCTTCAAGTTCCTCGACGGCTGGGTTGATTCTGTCACAAAGGTAACTCCCAAGTCGGACTGGGGCATGTACATTAATTATGCTGATCCTCGCATGGACAGGGATACGGCCACCAAGAACTACTACGGCGTCAATCTGCCCAAACTGCAAAAGCTCAAGGCAAAGTTTGACCCGACGGACCGGCTCTACTATCCCCAGGCCGTGCGCCCCGTTAAG。
SEQ ID NO.27：
ATGAGGTTCATCAACCTCGTCAGCGCGGGCCTCATTGCCTCCACTGCAGACGCTCTGGTGGCCAGGGCCACCATCGAACAGTGCCTGACGGACGCAAAAGTGCCCATCGATACAAAAAACTCTGCCGAGTGGAACGAAGACGTGGCGCCCTTCAACATCCGGTTGCCGTATCTACCAACGGCCATCGCTGCTCCCCAGACGACGCAGCACATTCAATCCGCCGTCAATTGCGGCCGCAAGCTGGCGATCAAGGTCAGTGCTAAATCGGGGGGCCATTCCTATGCATCCTTTGGCTTTGGTGGTGAAAACGGCCATCTCATTATCGAGCTGGATCAGCTGTACAACGTCACCTACGATGCATCGACCAACATAGCAACTGTGCAACCTGGTGCGAGACTGGGTCACGTTGCGACGGTCCTATACCAGCAGTATGGGCGAGCAATAGCGCATGGCACATGTCCCGGCGTTGGCGTGTCTGGCCACTTCCTCCATGGTGGCTTCGGATTTTCATCTCACATGCACGGTCTGGCCCTCGACTTTGTCCAATCGGTCGATGTCGTTCTCGCCGACGGCACCGTGAAGACGGCCTCTTCTTCCAGCAATTCGGACCTCTTCTGGGGAATCAAGGGAGCCGGGAGCAACTTTGGCATTGTGGCAAGCTGGAAGTTGTCCACCTTTGCCGCCCCTGCCACTTTGACCAAGTTCGGCGTGACCCTCGGGTGGAACAAGAACAACGCGGTAGCGGGACTGCAAGCTGTCGAGAATTACGTCAAGAACGTTCAACCGCGTGAGGTGAATTTCCGCATCGGCGACTACAACAAAGGACAGCCGGGCATCGAGGGCCTTTACTATGGAACTCCGGCCCAGTGGAAAACAGCTTTCCAGCCACTGCTCGATACGCTCCCTAGTGGCTACACCGTCCAACCTACCCAGCAGCTCAACTGGATACAGGCGGTCATCGCCTACTCCAACTACGACGACGTCGACTGGATCCACCCCAGCCCCCAGGAGAACTTCTACGCCAAGAGCCTGACCCTCAAGGGCCTGAATGGGACGGCCGCTCAGGCCTTTGTCAACTACTACTTTGACGTTGCCAACAAGGTGACAGACCGCTTCTGGTTCTTCCAAATTGATGCACACGGCGGCAAGAATTCGCAGATTGCGAAGGTTGCACCCGATGCCACGAGCTATGCGCACCGCGACAAGCTATACATTATCCAGTTCTATGACAGATACGAGAACAATCAGGTCTACCCATCGACGAGCTTTGGATTCTTGGATGGCTGGGTCAACGCCGTAACAAAGGCCCTGCCGTCAAGTGACTGGGGCGCCTATATCAATTATGCCGATCCGCGGCTTTCGCGAGACGCTGCGCAGCAACAGTACTACGGGCAGAACTTGGCCAAGCTTCAGTCCCTGAAGGCTAAGTACGACCCCAAGGAGCTCTTCTACTATCCACAGGGCGTCAAGCCCAGCGCT。
SEQ ID NO.28：
ATGCGAGCTGCTACCCTGCTCTCCGCTGGCTTTCTGGCTAGCCTCGCTGACGCTCTCGTCATCACCCGAGCTGCTATCGACAAGTGCCTCGTCGACGCCGGCGTCCCTATTGATGTCAAGGGCACCGACGACTACAAGCGCGACGTCGCTCCTTTCAACGTCCGCCTCCCTTACACCCCCACCGCTATTTCCGTCCCCCTCACTACCAAGCACATCCAGGACTCCGTCAAGTGCGGCAAGAAGCTCGGCATCAAGGTCTCCGCCAAGAGCGGCGGCCACAGCTACGCTAGCTTCGGCTTTGGCGGCGAGAACGGCCACCTCGTCGTCGAGCTCGATCGAATGTACAACGTCACCTACGACGCCACCAAGAACATCGCCACCGTCCAGCCTGGCGCTCGACTCGGCCACGTCGCTACCGTCCTCTACGAGCAGTACAACCGCGCCATCGCCCACGGCACCTGCCCTGGCGTCGGCGTCAGCGGCCACTTCCTCCACGGCGGCTTCGGCTTCTCTAGCCACATGCACGGCCTCGCTCTGGACTTCGTCGACTCTGTCACCGTCGTCCTCGCCGATGGCTCTGTCGTCGAGGCTTCTAGCACCGAGAACACCGACCTGCTCTGGGGCATCAAGGGCGCTGGCAGCAACTTCGGCATCGTCGCTGCTTGGAAGCTGACCACCTTCGAGGCCCCTGCTGTCCTCACTCGATTCGGCCTCTCCCTGGGCTGGAACAAGTCCACTGCCGTCGCTGGCCTCGAGGCTGTCGAGAAGTACGCTAAGAACATCCAGCCCCGCGAGGTCAACTTCCGCATCGGCGACTACAACAAGGGCCAGCCTGGCATCGAGGGCCTCTACTACGGCACTCCTGCCCAGTGGCGAAAGGCTTTCCAGCCTCTCCTGGACACCCTGCCTGCTGGCTACAACGTCTCCGACCCTCAGCAGCTCAACTGGATCGAGGCCGTCATCTCCTACAGCAACTACGACAACGTCGACTGGATCACCCCCAGCCCTCAGGAGAACTTCTACGCCAAGAGCCTGACCCTGAAGGGCCTCAACGGCACTTCCGCTCAGAACTTCGTCGACTACTACTTCGACGTCGCCAACAACGTCGTCGACCGCTTCTGGTTCTTCCAGCTGGACATGCACGGCGGCAAGAACTCCCAGGTCACCAAGGTCGCCCCCGATGCTACTAGCTACGCCCACCGAGACAAGCTCTACATCATCCAGTTCTACGACCGCTACGAGAACAACCAGACCTACCCCGCCACCAGCTTCGGCTTCCTCGATGGCTGGGTCGACGCTACTACCAAGCCCCTCCCTGAGAGCGACTGGGGCGCTTACGCTAACTACGCCGACGCTCGACTCAGCCGAGCTGTCGCTGAGGATCAGTACTACGGCGACCACCTCCCCCGACTCCAGAAGCTCAAGGCTAAGTTCGACCCCAAGCAGCTGTTCTACTACACCCAGAGCGTCCAGCCCAAGGCC。
SEQ ID NO.29：
ATGCGCGTAGCCACTCTCCTCTTTGCCGGCAGTATAGCTTCCATAACCGAAGCGCTCGTCACCCGAGCCGTCATCGACAAGTGCCTCACCGACGCGGGGGTGCCCGTGGATATCAAGGGAAGCGACGACTGGGACCGGGATGTCGCACCCTTCAACGTGCGACTGCCGTACTTGCCGACGGCTATTAGCGTGCCACTGACAACAAAGCACATCCAAGACTCCGTCAAGTGTGGCAAGAAGCTTGGCATCAAGGTCTCTGCCAAGTCTGGAGGTCATTCGTACGCTAGCTTCGGATTTGGTGGCGAGAACGGCCATCTTGTGGTCGAGCTGGACCGCATGTACAACGTCACGTATGACGCTGGCAAAAACATTGCTACCGTGCAGCCCGGTGCCAGATTGGGTCACGTCGCAACAGTCCTCTACGAGACCTACGGACGGGCCATCTCGCACGGGACTTGCCCCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACTTCCTTCATGGGGGATTTGGCTTCTCCAGCCACATGCACGGCCTGGCGCTGGACTTCGTCGATTCAGTTACCGTTGTACTGGCCGACGGCCGCGTCGTGGAAGCCAGCTCTACCGAAAATTCCGACCTGCTGTGGGGAATCAAAGGCGCCGGTTCCAACTTTGGTATTGTCGCGTCGTGGAAGCTACGGACGTTTGAAGCACCTAAGGTGCTGACCCGCTTCGGCGTGTCGCTGGGCTGGAACAAGTCGACTGCCGTCGCCGGGTTGGAAGCTGTCGAGAAGTATGCGAAAAACGACCAGCCTCGCGAGGTCAACTTCCGCATCGGCGACTACAACAAGGGCCAGCCTGGCATTGAGGGCTTGTATTACGGCACACCCGAGCAGTGGAGGAAGGCCTTCCAGCCGTTGCTGGACACGTTGCCAACGGGCTACAATGTGTCCGAGCCTCAGACGCTCAACTGGATCCAAGCCGTGATTAGTTACTCTAACTACGACAATGTCGACTGGACGACGCCGTCGCCGCCGGAAAATTTCTATGCTAAGTCACTAGCGCTCAAAGGCCTCAATGGCACCGCCGCGCAGAACTTTGTCGATTACTACTTTGACGTTGCGAACAATGTCGTCGATAGGTTCTGGTTCTTCCAACTTGACATCCACGGCGGAAAGACGAGCCAGATTGCCAAGGTTGCGGTTGATGCCACCAGCTACGTCCACAGAGACAAGCTGTACCTCGTCCAGTTCTACGATAGGTATGAGAACAACGAGACGTACCCGGCTACTTCCTTTGGGTTTCTTGATGGATGGGTCGATACAGTGACCAAACCTCTGCCCAAGAGCGAGTGGGGCTCGTATGCCAACTATGCAGATGCCCGTCTCTCCCGAGCAGTTGCCGAGGACCAATACTACGGCAAGCATCTCCCAAAGCTGCAGAAGCTCAAGGCAAAGTATGACCCCAAGCAGCTCTTCTACTATCCCCAGAGCGTTGAGCCCAAAGCG。
SEQ ID NO.30：
ATGCGATTCGAGTCCCTCCTGGTCGCCGGCAGCGTCGCTACCATCGCTGACGCTCTCGTCACCCGAGCTAACATCGACAAGTGCCTGGTCGACGCCGGCGTCCCTATTGATATCAAGGGCACCTCCGACTGGAACCGCGACGTCGCTCCTTTCAACATCCGCCTGCCCTACACCCCCACCGCTATTTCTGTCCCCCAGACCGTCAAGCACATCCAGGACAGCGTCAAGTGCGGCAAGAAGCTCGGCATCAAGGTCAGCGCCAAGTCCGGCGGCCACAGCTACGCTAGCTTCGGCTTTGGCGGCGAGAACGGCCAGCTCGTCGTCCAGCTCGATCGAATGTACAACGTCACCTACGACAGCAAGAAGAACATCGCCACCGTCCAGCCCGGCGCTCGACTCGGCCACGTCGCTACCGTCCTCTACGAGAAGTACGGCCGCGCTATCGCCCACGGCACCTGCCCTGGCGTCGGCATCAGCGGCCACTTCCTCCACGGCGGCTTTGGCTTTTCCAGCCACCAGCACGGCCTCGCTCTGGACTTTGTCGAGTCCGCTACCGTCGTCCTCGCCGACGGCAGCGTCGTCGAGGCTAGCGACAGCGAGAACCGAGACCTCCTGTGGGGCATCAAGGGCGCTGGCAGCAACTTCGGCATCGTCGCTTCCTGGAAGCTGCGCACTTTCGAGGCCCCTAAGGTCCTCACCCGCTTCGGCGTCGTCCTCGGCTGGACCAAGGAGAACGCTGTCAAGGGCCTCGAGGCCGTCGAGAAGTACGCTAAGAACATCCAGCCCCGCGAGGTCAACTTCCGCATCGGCGACTACGGCAAGGGCAACCCTGCTATCGAGGGCCTCTACTACGGCACCCCTGAGCAGTGGCGAAAGGCTTTCCAGCCCCTCCTCGACACCCTCCCTACTGGCTACAACATCAGCACCCCCAAGGCCATGAACTGGATCGAGTCCGTCATCTCCTACTCCAACTACGAGACCGTCGACTGGATCGAGCCCTCCCCTCAGGAGAACTTCTACGCCAAGTCCCTCGCCCTGAAGGGCCTCAACGGCACCAGCGCTAAGGACTTCGTCGACTACTACTTCGACGTCGCCAACAAGGTCGTCGACCGCTTCTGGTTCTTCCAGCTGGACGTCCACGGCGGCCGAAACAGCCAGATTTCCAAGGTCGCCACCGACGCCACCAGCTACGTCCACCGAGATAAGCTCTACCTGGTCCAGCTCTACGACCGCTACGAGAACAACGAGACCTACCCCTCCAGCAGCTTCGGCTTCCTCGACGGCTTCGCTAACGCCGTCACCAAGAGCCTGCCCAAGTCCGATTGGGGCGCTTACGCTAACTACGCCGACCCTCGACTCCCCCGAGGCGTCGCTGACGAGCTCTACTACGGCTCTAACCTCCCCCGCCTCCAGCGACTCAAGGCTAAGTACGACCCCAAGCAGGTCTTCGACTACCCCCAGGGCGTCGATCCTAAGTAC。
SEQ ID NO.31：
ATGCGAGTCACCAGCGCTCTGCTCGCTGGCCTCGTCGCTAGCACCGCTGACGCTCTCGTCGCTAAGGCTGCTATCGACAAGTGCCTGACCGACGCCGGCGTCCCTATTGATGTCAAGGGCAGCGACGGCTGGAACGAGGATGTCGCTCCTTTCAACATCCGCCTCCCCTACCTGCCCACCGCTATTTCTGTCCCCGCCACTACCAAGCACATCCAGGACTCCGTCAAGTGCGGCAAGAAGCTGGGCATCAAGGTCTCCGCCAAGAGCGGCGGCCACAGCTACGCTAGCTTCGGCTTTGGCGGCGAGAACGGCCACCTCGTCGTCGAGCTCGATCAGATGTACAACGTCACCTACGACGCCAAGAAGAACATCGCCACCGTCCAGCCCGGCGCTCGACTCGGCCACGTCGCTACCGTCCTCTACGAGAAGTACGGCCGCGCTATCGCCCACGGCACCTGCCCTGGCGTCGGCGTCAGCGGCCACTTCCTCCACGGCGGCTTCGGCTTCTCTAGCCACATGCACGGCCTCGCTCTCGACTCTGTCCAGTCTGTCACCGTCGTCCTCGCCGATGGCACTGTCAAGGAGGCTTCCGCTAGCACCAACGCCGACCTCTTCTGGGGCATGAAGGGCGCTGGCTCTAACTTCGGCATCGTCGCTTCCTGGAAGCTGAGCACCTTCGAGGCCCCTAAGACCCTCACCAAGTTCGGCGTCGCCCTGGGCTGGACCAAGGACACCGCTGTCGCTGGCCTCGAGGCTGTCGAGAACTACGCTAAGAACATCATGCCCCGCGAGGTCAACTTCCGCATCGGCGACTACTCCAAGGGCAAGCCTGGCATCGAGGGCCTCTACTACGGCACTCCTGCCCAGTGGAAGAAGGACTTCCAGCCCCTCCTCGACACCCTGCCTAAGGGCTACAACATCTCCGAGCCCCAGAGCCTCACCTGGATCCAGGCTGTCATCGCCTACTCCAACTACGACGAGGTCGACTGGATCCACCCCAGCCCTCAGGAGAACTTCTACTCCAAGTCCCTCACCCTGAAGGGCCTGAACGGCACTTCCGCTCAGGCTTTCGTCGACTACTACTTCGACGTCGCCAACAACGTCGTCGACCGCTTCTGGTTCTTCCAGCTGGACATGCACGGCGGCAAGAACAGCCAGATCACCAAGGTCGGCAAGGACGCCACCAGCTACCCTCACCGAGACAAGCTCTACATCATCCAGTTCTACGACCGCTACGAGAACAACCAGACCTACCCCGCCAGCTCCTTCGGCTTTCTCGACGGCTGGGTCGACGCTGTCACCGACACCATTCCCCGAAGCGAGTGGGGCGCTTACATCAACTACGCCGACAGCCGCCTGCCCCGAGCTGAGGCTGAGCGACAGTACTACGGCGACCACCTGCCTCGACTCCAGTCTCTCAAGGCCAAGTACGACCCCAAGGAGCTCTTCTACTACCCCCAGTCCGTCGAGCCC。
SEQ ID NO.32：
ATGCGAGTCACCACCCCTCTGTTCGTCGGCCTCATCGCTACCGCTGCTGAGGCTCTCGTCGTCACTCGAGCTACCATCGACAAGTGCCTGGTCGACAGCGGCGTCCCTATCGATACCAAGGGCGACGAGGGCTGGGTCCGAGACGTCGCTCCTTTTAACATCCGCCTGCCCTACCTGCCCACCGCTATTTCTGTCCCCCTCACCACCGCCCACATCCAGAAGTCTGTCCTGTGCGGCAAGAAGCTCGGCATCAAGGTCTCCGCCAAGTCCGGCGGCCACAGCTACGCTAGCTTCGGCTTTGGCGGCGAGAACGGCCACCTCGTCATCGAGCTCGACCGAATGTACAACGTCACCCTCGACGCCAAGACCAAGATCGCCACCGTCCAGCCTGGCGCTCGACTCGGCCACGTCGCTACCGTCCTCTACGAGCAGTACAACCGCGCCATCGCCCACGGCACCTGCCCTGGCGTCGGCATCAGCGGCCACTTCCTCCACGGCGGCTTTGGCTTTTCCAGCCACATGCACGGCCTCGCTCTGGATTTCGTCGAGAGCGTCACCGTCGTCCTGGCTGATGGCTCTGTCGTCGAGGCTAGCAGCTCCAAGAACTCCGACCTCCTCTGGGCCATCAAGGGCGCTGGCAGCAACTTCGGCATCGTCGCTTCCTGGAAGCTCAGCACCTTCGAGGCCCCTGACGCTCTCACTCGATTCGGCGTCACCCTGGGCTGGAACAAGTCCACTGCCGTCGCTGGCCTCGAGGCTGTCGAGGCTTACGCTAAGTTCAAGGCCCCCCGCGAGATCAACTTCCGCGTCGGCGACTACGGCAAGGGCAGCCCTGCTATTGAGGGCCTCTACTACGGCACCCAGGCCCAGTGGCGAAAGGATATCGCCCCTCTCCTGGACACCCTGCCTGCTGGCTGGAACATCAGCGAGACCCGAACCCTCAACTGGATCGAGTCCGTCATCTCCTACAGCAACTACGACAACGTCGACTGGATCACCCCCAGCCCTCAGGAGAACTTCTACGCCAAGAGCCTCGCCCTGAAGGGCCTCAACGGCACCAGCGCTCAGAACTTCGTCAACTACTACTTCGACGTCGCCAACAACGTCGTCGACCGCTTCTGGTTCTTCCAGCTCGACGTCCACGGCGGCAAGACTTCTCAGATCACCAAGGTCTCCAACAGCGAGACCGCCTACGCCCACCGAGATAAGCTGTACCTGGTCCAGTTCTACGACCGCTACGAGAACAACGAGACCTACCCCGCCAGCTCCTTCGGCTTTCTGGACGGCTGGGTCGACACCGTCACCGAGCCTCTCCCTAAGAGCGACTGGGGCGCTTACGCTAACTACGCCGACGCTCGACTGCCCCGAGCTACCGCTGAGCAGCTCTACTACGGCGTCAACCTGCCCAAGCTGCAGAAGCTGAAGGCCAAGTACGACCCCAAGCAGCTGTTCTACTACCCCCAGGGCCTCAGCCCTGCTACT。
SEQ ID NO.33：
ATGCGAGTGACGTCAACTCTCTTGGCGGGACTGGTGGCATCGACAGCGGATGCTTTGGTAGCTAAAGCTGTCATCGACAAGTGCCTCACGGACGCCGGAGTTCCCATCGATGTCAAGGGTTCGGAAGGCTGGAACGAAGATGTCGCGCCGTTCAACATTCGGCTGCCGTACCTGCCCACGGCGATTTCCGTGCCTGCGACAACAAAGCACATCCAGGACAGCGTTAACTGCGGCAAGAAGCTGGGCATCAAGGTCTCGGCCAAGAGCGGAGGGCACAGCTACGCGTCGTTTGGCTTTGGCGGAGAGAATGGGCATCTCGTCGTCGAGCTGGACCAGATGTACAACGTCACGTACGATGCCAAGAAGAATATTGCTACAGTCCAACCAGGCGCAAGGCTCGGCCACGTCGCAACCGTCCTCTACGAGCAGTACGGCCGTGCCATCGCCCATGGCACCTGTCCGGGCGTCGGCGTGTCTGGTCACTTCCTCCATGGAGGATTTGGCTTCAGCAGTCACATGCACGGGCTGGCCCTCGACTTCGTCCAGTCGGTGACCGTTGTCTTGGCAGACGGCTCCGTCAAGGAGGCATCTGCTTCCAGTAATCCCGACCTTTTTTGGGGCATCAAGGGCGCCGGCTCCAACTTCGGGATCGTCGCCAGCTGGAAGCTGAGCACGTTCGAGGCGCCCGAGAAGCTCACCAAGTTTGGGGTTTCATTGGGATGGACGAAGGACACAGCTGTTGCCGGGCTCGAGGCCGTTGAAAAGTATGCAAAGAACATCCAACCTCGCGAGGTCAATTTCCGCATCGGCGACTACAACAAGGGTCAGCCCGGAATTGAGGGCCTGTATTATGGCACTCCAGCACAGTGGAAAAAGGCATTTCAGCCGCTGCTTGATACTCTTCCAAAGGGCTACAATGTCTCCGAGCCCGTCGCTCTCAACTGGATACAGACGGTGATTGCCTATAGCAACTACGACGAGGTGGATTGGATCCACCCATCTCCGCAGGAGAACTTTTACTCCAAGTCCCTGACTCTGAAAGGTCTGAACGGCACCGCCGCCCAGGCCTTTGTCGACTATTACTTTGACGTGGCCAACAAAGTGGTTGACCGCTTCTGGTTCTTCCAGCTAGACATGCATGGCGGCAAGAACAGCCAGGTTGCGAAAGTGCCGCAAGACGCCACCTCGTACGCGCACAGAGACAAGTTGTACATTGTGCAGTTCTATGATCGCTACGAAAACAACGAGACGTATCCCGCCTCTTCATTCGGCTTCCTGGATGGCTGGGTAGATGCCGTTACCGACACCATACCTAGGTCCGACTGGGGAGCCTACATCAACTATGCCGACGCTCGGCTTCCTCGAGTGGAAGCCGAGAGACAATACTACGGTGAGCACCTCCCCCAACTGCAATCTCTCAAGGCCAAGTACGATCCCAAGCAGCTCTTCTACTACCCTCAGAGCGTCGAACCGAAGGCG。
SEQ ID NO.34：
ATGAGAGTATCAACCATCTGCCAGGTGGGGCTCATCGCCACAGCAGCCGAGGCTCTCGTCATTACCCGAGCCACAATAGATCAGTGCCTGACAGACAGCGGTGTTCCCATCGACACGCAGGGCTCCGACGGATGGGTGCGTGACGTCACTAGCTTCAACATCAGGCTCCCCTATCTGCCCACCGCCATCAGCGTGCCCACAACCATCGCTCACATCCAAAACAGCGTTCTCTGTGGAAAGAAGCTCGGTATCAAGGTATCGGCGAAATCTGGGGGTCATTCGTACGCCTCGCTTGGCTTCGGGGGCGAGAACGGCCATTTGGTGGTTGAGTTAGATCGAATGTACAATGTGACGCTGGACACGACGACGAACATCGCTACCGTGCAACCTGGAGCGCGTCTAGGCCACGTCGCGACCGTTTTGTACGAGCAGTACGGCCGCGCTATTGCGCACGGCATTTGCCCCGGCGTCGGTATCTCTGGGCACTTCGCGCATGGAGGCTTCGGTTTCTCGTCACATACGCACGGGTTGGCGCTTGACTTTGTCGAGTCGGTCACGGTTGTGCTCGCCGATGGATCAATTGTCGAAGCCTCTCGGTCTGAAAACACAGACCTCCTCTGGGGAATTAAGGGCGCTGGCAGTAATTTTGGCATCGTCGCTTCCTGGAAGCTGTCGACCTTCGCCGCACCGGAGGTCCTCACACTGTTTGGAGTCGACCTGGGCTGGAACAAGTCCACTGCCGTGGCCGGCCTGGAAGCCGTGGAGTACTACGCCAAGAACAAGCAGCCGCGGGAAGTCAACTTCCGGATTGGCGACTACAACAGGGGCAAACCAGGTATAGAGGGCCTCTACTACGGAACCCCTGACCAGTGGCGCACGGCGTTCCAGCCTCTCTTGGATACTCTTCCGGCCGGCTACACCGTCTCTGAGCCCAAGACGTCCAACTGGATTGAAGCGATCATCAACTACAGCAACTACGACAACATTGACTGGATAACCCCTAGCACGCCGGAGAATTTTTATGCTAAAAGCCTGACCCTCAAGGGCCTCAATGGCACTAGTGCCCAGAATTTTGTAGACTATTACTTCGATGTTGCTAACAACGTCGTCGATAGGTTCTGGTTCTACCAACTGGACATCCACGGCGGCCAGAACTCCCAGGTTACCAAGGTCGCCAACGACGCAACTGCTTATGCACACCGCGATAAGCTCTATCTCGTCCAGTTCTACGATCGCTACGAAACCGACGAGACGTACCCAGATTCCTCCTTTGGGTTTCTTGACGACTGGGTCGACGCCACCACCAAGCCGCTGCCCCAAAGTGATTGGGGCGCCTATGCAAATTATGCCGACCCTCGCTTAAGCAGAGAGACCGCAGTGCAGCTCTACTATGGCGATAACCTGCCGCGCCTGCGATCGCTGAAGGCCAAGTTCGACCCCGAGCAATTGTTTGACTTCACGCAGGGCATCACTCCAGCG。
SEQ ID NO.35：
ATGCGCGTCGTGACCCTTCTGTCCGCCGGGTTGATTGCCAGCACGGCAGACGCTTTGGTCGTTACAAGGGCAACCATTGAGAAATGCCTCACGGACGCAAAAGTTCCTGTTGATACGAAGGGCAGCGAGGATTGGGATGAGCATGTCGCTCCCTTCAACATTCGTCTGCCCTACCTGCCGACGGCCATCTCCGTGCCGACTACTACCAAGCACATTCAGGACAGCGTGAAGTGCGGCAAGAAGCTCGGAATCAAGGTTAGTGCCAAGTCAGGCGGCCATAGCTATGCATCATTCGGCTTTGGAGGAGAAAATGGCCATTTAGTTGTCGAGCTCACAGACATGTACAACGTCACCTACGACGCCGCAAAGAATTTGGCTACAGTCCAGCCTGGTGCGAGGTTGGGTCACGTCGCCACCGTCCTGTACGAGCAGTACGGACGAGCCATAGCTCATGGAACATGTCCTGGCGTCGGCGTGTCGGGCCACTTCCTGCACGGGGGATTTGGCTTCTCCTCGCACATGCACGGCCTCGCAGTCGACTTCATCCAGAGCGTAGATGTGGTGCTCGCCGATGGGTCGGTGAAGACGGCATCATCCACCAGCAATGCCGACCTCTTCTGGGGACTCAAGGGCGCGGGTTCCAACTTCGGCATTGTCGCGTCGTACAAGCTGTCCACGTTTGCCGCTCCGCAGACACTTACAAAGTTCGGTGTTTCACTTGGTTGGACCAAGGACACGGCCGTGGCGGGTCTCGAGGCCGTTGAGAAGTATGCGAAGAACATCCAACCGAGAGAAGTCAACTTTCGAATTGGCGACTACAACAAGGGCCAGCCCGGCATCGAGGGCCTTTATTACGGGACCCCCGCGCAGTGGCGCACCGCCTTTCAGCCATTGCTTGACACGCTCCCCAAAGGCTACACGATATCTGAACCGCAAACGCTGAACTGGATCCAAGCCGTCATCGCTTATAGCAACTATGACGAGGTCGACTGGATCCACCCCAGTCCCCAGGAGAATTTCTACACCAAATCTCTGACGCTCAAGGGACTCAACGGCACTGCGGCTCAGGCGTTCGTCGATTACTACTTTGACGTGGCCAACAAGGTCGTCGACCGGTTTTGGTTCTTCCAGCTGGATATGCATGGAGGCAAATATTCGCAAGTATCCAAGGTGCCACAAGATGCCACTGCGTACGCCCACCGCGACAAGCTCTATATCATCCAGTTCTACGATCGGTATGAAAACAACCAGACTTACCCGGCCACGTCTTTTGGCTTCCTCGACGGCTGGGTCGATGCGGTAACCGACACCATCCCGCGAAGCGACTGGGGCGCCTACATCAACTACGCTGATGCCCGCCTACCTAGAGCCGAGGCTGTCCGCCAATACTACGGCGAGCACCTGGACGAACTGCAGGCGCTGAAGGCTAAGTACGACCCCAAGCAGCTGTTTTACTATCCTCAGTCGGTGCAGCCACGGGCC。
SEQ ID NO.36：
ATGCGCGTCACCTCGGCTCTGCTGGCGGGCCTCGTCGCGTCTACTGCGGATGCGTTGGTCGCAAAGGCGGCCATTGACAAGTGCCTCACCGATGCCGGTGTCCCCATCGACGTCAAGGATTCGGAAGGATGGAACGAGGATGCTGCGCCCTTCAACATTCGTCTACCATACCTCCCCACGGCCATTAGTGTGCCCGCAACAACAAAGCACATACAGGACTCCGTCAAGTGTGGCAAAAAACTTGGCATCAAGGTGAGCGCAAAAAGTGGGGGGCATTCGTACGCGAGCTTTGGCTTCGGAGGCGAGAACGGGCACCTCGTGGTTGAGCTTGACCAGATGTACAACGTTACGTACGACGCCAAGAAGAATATCGCCACGGTGCAGCCTGGGGCGCGACTGGGCCACGTCGCAACGGTGCTGTACGAGCAGTATGGACGGGCCATTGCCCATGGAACCTGCCCCGGCCAGGTCGCTGCCATCAACTACCACACCTTCCAATTCCTCACGGCCTTTTCCGTGGGAGTGTCCGGCCATTTTCTGCATGGCGGCTTTGGCTTCTCCTCGCACATGCACGGCCTCGCGCTGGACTTTGTTCAGTCCGTTACGGTCGTGCTTGCTGATGGTACAGTTAAGGAAGCTTCTGCCACCGTCAACGCGGATCTGTTCTGGGGCATCAAGGGCGCCGGTAGCAACTTCGGTATCATTGCATCCTGGAAGCTGAGCACATTCGCCGCTCCGAAGGTATTGACGAAGTTCGGCGTCAGTCTGGGCTGGACCAAGGACACTGCCGTGGCTGGGCTCGAAGCAGTCGAGAATTATGCCAAGAACATCATGCCGAGGGAAGTCAATTTCCGCATCGGCGACTACAGCAAGGGTCAACCCGGCATTGAGGGCCTTTACTATGGGACGCCTGCCCAGTGGAAGAAGGACTTCCAGCCGCTTCTTGACACGCTGCCAAAGGGATACAATATCAGCGTCCCACAGAGCCTGAACTGGATTCAGGCCGTTGTTGCCTACTCCAACTATGACGAGGTGGACTGGATCCACCCTTCGCCGCAGGAGAACTTTTATTCCAAGTCTCTCACCCTCAAGGGCCTGAATGGCACTTCGGCTCAAGCATTTGTCGACTACTACTTCAACGTCGCCAACAAGGTCGTCGATCGTTTTTGGTTCTTCCAGCTCGACATGCATGGTGGCAAGAACTCGCAAATCACCAAAGTCGGCAAAGATGCCACTAGCTACCCGCACCGCGACAAGCTCTACATCATCCAGTTCTACGATAGATACGAAAACAACCAGACGTATCCGGCCTCTTCATTTGGTTTCCTGGACGGCTGGGTCGACGCCGTCACAGACACCATACCTCGGTTTGAGTGGGGAGCTTATATCAACTACGCCGATAGCCGCCTGCCAAGGGCGGAGGCCGAGCGCCAGTACTACGGCGACCACTTGCCCCGACTCCAATCACTAAAGGCCAAGTACGACCCCAAAGAGCTCTTCTATTACCCGCAATCAGTAGAGCCCAAGGTG。
SEQ ID NO.37：
TTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACTAGAGAAGTTCCTATACTTTTTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCACTAGAGATATCAAGCAACTACGTAAAACTCCATGAGATTGCAGATGCGGCCCACTGGAATACAACATCCTCCGCAAGTCCGA。
SEQ ID NO.38：
TTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGNNNNNTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACTAGAGAAGTTCCTATACTTTTTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCACTAGAGATATCAAGCAACTACGTAAAACTCCATGAGATTGCAGATGCGGCCCACTGGAATACAACATCCTCCGCAAGTCCGA。
在下述实施例中，采用的还原糖氧化酶活力测定方法如下：
酶活单位与定义：在pH6.0、30℃的条件下，每分钟能把1.0μmol的还原糖氧化成相应的糖酸和过氧化氢的酶量为一个单位。检测原理为：在还原糖氧化酶的作用下，还原糖和氧气反应，生成糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。
(1)磷酸盐缓冲液(pH6.0)
称取16.61g NaH2PO4·2H2O和35.82g Na2HPO4·12H2O溶于无CO2水中，稀释到1000mL。
(2)邻联茴香胺甲醇缓冲液
称取1g邻联茴香胺加在100mL甲醇中搅拌溶解备用。临用时：取0.1mL(2)液加入到12mL(1)液中混匀。
(3)180g/L葡萄糖水溶液
18g葡萄糖加在100mL蒸馏水中搅拌溶解。
(4)辣根过氧化物酶溶液
用无菌水配成0.5mg/mL溶液。
取2支干净试管，按顺序分别加入以下试剂：
表1
酶活计算：X＝[△A÷(11.3×1×0.1÷3.0)]×n
X—样品酶活；
1—测定时间，1min；
0.1—样品体积，mL；
3.0—反应液体积，mL；
11.3—消光系数；
n—稀释倍数，将待测酶样做适当稀释后进行试验，使得测定A1值控制在0.1～0.3之间。
实施例1还原糖氧化酶毕赤酵母表达菌株的构建
一般基因公司都会备有多种著名的商业化表达质粒，也接受客户向它提供的质粒，并可以提供直接将基因合成在这些质粒上的服务。本研究委托上海捷瑞基因公司，将12条还原糖氧化酶编码基因序列直接合成在毕赤酵母商用的表达质粒pPIC9K(赛默飞V175-20)的EcoRI和NotI酶切位点之间，构建成对应的毕赤酵母表达质粒pPIC9K-CO1～12(图1中A)。为了更好地理解实验操作，本发明附上赛默飞公司关于pPIC9K质粒图谱(图1中B)。12条毕赤酵母表达的还原糖氧化酶编码基因序列如SEQ ID NO.13～24所示。以pPIC9K-CO1举例说明：SEQ ID NO.1序列的编码基因(SEQ ID NO.13)合成在pPIC9K质粒上，可用于SEQ IDNO.1氨基酸序列的还原糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。
将上述毕赤酵母表达质粒pPIC9K-CO1～12电转化毕赤酵母GS115菌株。根据试剂盒提供的方案可完成转化并获得里氏木霉转化菌株。以pPIC9K-CO1工程菌株举例说明：毕赤酵母表达质粒pPIC9K-CO1转化毕赤酵母GS115，成功构建的表达SEQ ID NO.1氨基酸序列的还原糖氧化酶的毕赤酵母工程菌株。
将pPIC9K-CO1～12工程菌株在毕赤酵母发酵培养基发酵4天，诱导还原糖氧化酶的分泌表达。离心收集发酵液上清，即为还原糖氧化酶的粗酶液，进行活力检测，检测的底物为葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精。检测结果如表2所示。对部分活力较高的酶液，采用不同的60、70、75、80℃高温处理5min后，测量对麦芽糖氧化的酶活，图2为酵母表达的还原糖氧化酶在不同温度下处理5分钟后的相对酶活。通过酶活力和耐热筛选，选取酶活力和耐热活力较高还原糖氧化酶对应的编码基因进行后续研究。
表2pPIC9K-CO1～12工程菌株表达的还原糖氧化酶的酶活检测结果
实施例2还原糖氧化酶里氏木霉工程菌株的构建
本研究利用先前构建的里氏木霉质粒CBH1T1.0和CBH2T1.0(记载在专利文献“202211596367.5一种木聚糖酶及其分泌表达菌株的构建和应用”中)，将还原糖氧化酶在里氏木霉中分泌表达。
本研究委托上海捷瑞基因合成公司，将12条还原糖氧化酶编码基因序列直接合成在CBH1T1.0质粒的XbaI酶切位点(TCTAGA)处，即构建成对应的里氏木霉表达质粒(图3)。本发明将CBH1T1.0质粒合成还原糖氧化酶编码基因附近的上下游序列公开在SEQ ID NO.37，DNA合成位点TCTAGA用下划线标出。合成12条还原糖氧化酶编码基因序列后，质粒序列应该如SEQ ID NO.38所示——合成公司将CBH1T1.0质粒在XbaI酶切位点(TCTAGA)处切开；分别合成上12条里氏木霉表达的还原糖氧化酶编码基因，序列如SEQ ID NO.25～36；还原糖氧化酶编码基因序列用波浪线表示，ATG是还原糖氧化酶编码基因的起始密码子，NNNNN代表编码基因除了ATG外的其他序列，XbaI酶切位点(TCTAGA)后半段的TAG构成终止密码子。将实施例1中酶活力和耐热活力较高的5条还原糖氧化酶编码基因序列(依次为SEQ IDNO.26，30，32，31，28)对应的里氏木霉表达质粒CBH1T1.0-COa～e(图3)用于详细说明。
将上述里氏木霉表达质粒利用根瘤农杆菌介导法(Covert et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation ofFusarium circinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)转化里氏木霉菌株QM6a(ATCC 13631)，QM9414(ATCC 26921)，RUT-C30(ATCC56765)，RL-P37(NRRL 15709)，NG14(ATCC 56767)，PC-3-7(ATCC 66589)中的一种或多种，获得里氏木霉工程菌株。其中，里氏木霉RUT-C30(ATCC 56765)为宿主菌株时，表达活力最高，因此，以活力最高的CBH1T1.0-COa～e工程菌株举例说明：里氏木霉表达质粒CBH1T1.0-COa～e转化里氏木霉RUT-C30，替代内源纤维素酶基因cbh1，成功构建的表达还原糖氧化酶的里氏木霉工程菌株。工程菌株依据文献方案(Zhang et al.Light-inducible geneticengineering and control of non-homologous end-joining in industrialeukaryotic microorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)消除潮霉素抗性标记。
将实施例1中酶活力和耐热活力较高的5条还原糖氧化酶编码基因序列对应的里氏木霉工程菌株CBH1T1.0-COa～e用于详细说明。将里氏木霉工程菌株在里氏木霉发酵培养基发酵8天，诱导还原糖氧化酶的分泌表达。离心收集发酵液上清，即为还原糖氧化酶的粗酶液，进行活力检测，如表3所示。检测的底物为：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精。
表3里氏木霉工程菌株表达的还原糖氧化酶的酶活
实施例3还原糖氧化酶里氏木霉生产菌株的构建
1、表达质粒CBH2T1.0-COb的构建
(1)利用引物C2COb-F和C2COb-R，以CBH1T1.0-COb质粒中的酶序列(SEQ IDNO.30)为模板扩增还原糖氧化酶基因片段COb，1516bp。
C2COb-F(SEQ ID NO.39)：
5’-TCTGTGTATTGCACCATGCGATTCGAGTCCCTCCT-3’；
C2COb-R(SEQ ID NO.40)：
5’-CATTATACGAAGTTATCTATTAGTACTTAGGATCGACGCCCTG-3’。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；引物(10μM each)1.5μL；CBH1T1.0-COa质粒模板1ng；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。
(2)在已有质粒CBH2T1.0上的限制性内切酶SwaI进行单酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行同源重组，连入PCR扩增获得的还原糖氧化酶基因片段COb，得到表达质粒CBH2T1.0-COb(图4)。
2.还原糖氧化酶里氏木霉生产菌株的构建
将上述里氏木霉表达质粒CBH2T1.0-COb利用根瘤农杆菌介导法(Covert etal.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusariumcircinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)分别转化里氏木霉菌株工程菌株CBH1T1.0-COa～e，获得里氏木霉生产菌株Tr-COa～e。以Tr-COa工程菌株举例说明：里氏木霉表达质粒CBH1T1.0-COa、CBH2T1.0-COb依次转化里氏木霉RUT-C30，分别替代内源纤维素酶基因cbh1和cbh2，成功构建的过表达还原糖氧化酶的里氏木霉生产菌株。生产菌株依据文献方案(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering and control of non-homologous end-joining in industrial eukaryotic microorganisms:LML 3.0and OFN1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)消除潮霉素抗性标记。
将里氏木霉生产菌株在里氏木霉发酵培养基发酵，诱导还原糖氧化酶的分泌表达。发酵罐培养方法参照文献“Chen et al.Engineering ofTrichoderma reesei forenhanced degradation of lignocellulosic biomass by truncation ofthe cellulaseactivatorACE3.Biotechnol Biofuels.2020,13:62”。发酵结束后，取发酵液，12500rpm转离心10min，取上清，即为还原糖氧化酶粗酶液。将所述粗酶液进行喷雾干燥，加入通用的保护剂(淀粉或环糊精)，制成固体还原糖氧化酶粉，酶粉活力达500～1000U/g(葡萄糖作为底物测量)。
实施例4还原糖氧化酶的应用
利用实施例3中制备得到的还原糖氧化酶粉进行面包烘焙实验，以两款商业葡萄糖氧化酶粉(黑曲霉，酶活8000U/g；青霉，酶活3000U/g)作为对照。
本实施例中制作面包的面团配方为：小麦粉(面粉)1000g、酵母粉10g、盐16g、水580g、糖60g和植物油30g，氧化酶的添加量分别为30、60、120、240U。。
面包制备步骤为：将上述配方的面团各成分加入到和面钵中，搅拌18min，使其形成均匀的面团。将和好的面团置于天平上，分成50g/个，揉成圆形，至于38℃发酵60min，发酵好的面团放入180℃烤箱中焙烤10min，得到面包成品。
将制得的面包室温下冷却2h，分别测定各实验组面包的质量和体积。比容为面包的体积/面包的质量(mL/g)，感官测量面包的咀嚼强度和白度。结果表明(表4)，本方法提供的还原糖氧化酶相较葡萄糖氧化酶，在更少的添加量上具有更佳的表现。
表4酶制剂对烘焙食品口感和白度的影响
注：*代表口感软，**代表口感适中，***代表口感较强，+代表色深白度低，++代表色中白度中；+++代表色浅白度高。
由上述实施例的结果可知：本发明公开的分泌表达还原糖氧化酶工程菌株生产的还原糖氧化酶可代替葡萄糖氧化酶应用于食品行业中的面团处理过程，提高面包的品质。
综上所述，本发明经过对里氏木霉菌进行基因改造后，成功构建了分泌表达还原糖氧化酶的工程菌株，该工程菌株生产的还原糖氧化酶可以应用在食品行业，提高烘焙食品的品质。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种还原糖氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～12任一项所示。
2.一种如权利要求1所述的还原糖氧化酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～36任一项所示。
3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。
4.一种重组微生物菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组微生物菌株，其特征在于，所述重组微生物菌株包含重组毕赤酵母或重组里氏木霉；
所述重组毕赤酵母异源表达核苷酸序列如SEQ ID NO.13～24任一项所示的还原糖氧化酶；所述重组里氏木霉异源表达核苷酸序列如SEQ ID NO.25～36任一项所示的还原糖氧化酶。
6.一种生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
合成还原糖氧化酶的编码基因，构建表达载体；
将所述表达载体转化至里氏木霉中，获得生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述还原糖氧化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.25～36任一项所示；所述表达载体包含里氏木霉纤维素酶编码基因的启动子序列、所述还原糖氧化酶的编码基因序列和里氏木霉纤维素酶编码基因的终止子序列。
8.一种如权利要求1所述的编码基因或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的重组微生物菌株在生产还原糖氧化酶中的应用。
9.一种还原糖氧化酶的生产方法，其特征在于，包括将权利要求4所述的重组微生物菌株发酵培养，收集发酵液的步骤。
10.一种如权利要求9所述生产方法获得的还原糖氧化酶在面制食品加工中的应用。
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