JPH07503860A - キシラナーゼｂのクローニング及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キシラナーゼＢのクローニング及び発現本発明は分子生物学の分野に関する。特 に、本発明はアスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕｂ ｉｇｅｎｓｉｓ）キシラナーゼＢ（ＸＹＬＢ）タンパク質の活性を有するタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列のクローニング及び過剰発現に関する。また、本発 明は、その他のキシラナーゼを含まない形態で得ることができ、カリ実際に一般 にその他の酵素から得ることができる単一キシラナーゼの生産方法及び使用方法 を提供する。

発明の背景 植物細胞壁の組成は複雑かつ多様である。多糖は主として長鎖のセルロース（植 物細胞壁の主構造成分）、ヘミセルロース（種々のβ−キシラン鎖を含む）及び ペクチンの形態で見られる。植物細胞壁多糖の発生、分布及び構造上の特徴は、 （１）植物種、（２）品種、（３）組織の型、（４）生育条件、（５）エージン グ及び（６）摂食前の植物物質の加工により決定される。

基本的な相違が単子葉植物（例えば、穀物及びイネ科牧草類）と双子葉植物（例 えば、クローバ−、ナタネ及び大豆）の間、また植物の種子と栄養部分の間にあ る（Ｃｈｅｓｓｏｎ、　１９８７；　Ｃａｒｒｅ及びＢｒ１ｌｌｏｕｅｔ、　１ ９８６）。単子葉植物は、主要なヘミセルロー久主鎖としてのアラビノキシラン 複合体の存在を特徴としている。双子葉植物中のヘミセルロースの主要構造はキ シログルカン複合体である。更に、高ペクチン濃度が単子葉植物よりも双子葉植 物に見られる。種子は一般にペクチン物質中に非常に多くあるが、セルロース物 質中では比較的少ない。３種の多少相互作用する多糖構造が細胞壁中で区別し得 る。

（＋）中間ラメラが外部の細胞壁を形成する。また、それは個々の細胞が植物組 織マトリックス中で互いに付着する位置として利用できる。中間ラメラは主とし て高度にエステル化されたペクチンのカルシウム塩からなる。

（２）−次壁が中間ラメラの丁度内側に配置される。それは、ペクチン、ヘミセ ルロース、フェノールエステル及びタンパク質の無定形マトリックス中に埋め込 まれたセルロースミクロフィブリルの良く組織化された構造である。

（３）二次壁は、植物が成熟する際に形成される。植物の生育及びニー２２グ期 中に、セルロースミクロフィブリル、ヘミセルロース及びリグニンが付着する。

成熟した代謝活性な植物細胞（例えば、葉肉及び表皮）の−次細胞壁は、二次細 胞壁（これはこの段階までに高度にリグニン化している）よりも酵素的加水分解 を受け易い。

細胞壁中にはセルロース、ヘミセルロース及びペクチンの間に高度の相互作用が ある。これらのかなり強く架橋された多糖構造の酵素的分解は簡単なプロセスで はない。少なくとも５種の異なる酵素が、例えば、アラビノキシランを完全に分 解するのに必要とされる。内部開裂はエンド−β（ｌ→４）−Ｄ−キシラナーゼ の使用により影響を受ける。エキソ−（ｌ→４）−Ｄ−キシラナーゼは多糖の非 還元性末端でキシロース単位を遊離する。これらのその他の酵素（α−グルクロ ニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ及びアセチルエステラーゼ）はキシ ラン主鎖上の置換基を攻撃するのに使用される。特定の酵素の選択は、勿論、分 解される特定のヘミセルロースに依存する（ＭＣＣ＋ｅａｒｙ及びＭａｔｈｅｓ ｏｎ、　１９８６）。

しかしながら、成る用途については、モノマーへの全ヘミセルロースの完全分解 は必要ではなく、また望ましくない。アラビノキシランの液化において、例えば 、主要なキンラン主鎖を更に短い単位に開裂することを単に必要とする。これは エンド−キシラナーゼの作用により達成でき、これは最終的にキンロースモノマ ー単位とオリゴマー、例えば、キシロビオース及びキシロトリオースの混合物を 生じる。次いで、これらのより短いサブユニットは所望の用途のために充分に可 溶性である。更に、特定のキシラナーゼ酵素の作用は、アラビノキシラン基質に 対するこれらの特定の酵素の作用により生じるキシロースモノマー単位及びオリ ゴマー単位の種々のパターンにより見られるように、互いに異なることが実証さ れた（Ｋｏｒｍｅｌｉｎｋ、　Ｆ、、１９９２）。

糸状菌類が、多量の種々の加水分解酵素、例えば、α−アミラーゼ、プロテアー ゼ及びアミログルコシダーゼ並びに種々の植物細胞壁分解酵素、例えば、セルラ ーゼ、ヘミセルラーゼ、及びペクチナーゼを分泌するそれらの能力につき広く知 られている。これらの中でも、多くのキシラン分解酵素が認められており、それ らは種々の生化学的性質及び物理学的性質を有することが示されていた。キシラ ナーゼ機能のこの不均一性は、所望の用途に最適である関係するキシラナーゼの 選択を可能にする（ｌｏｎｇら（１９８８）　、Ｗｏｏｄｗａｒｄ　（１９８４ ）並びにＤｅｋｋｅｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓ（１９７７）を参照のこと）。

・テルモセルム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｌｈｅｒ＋１１０ｃｅｌ１ｗ＋）、 トリコデル？−リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｒｅｅｓｅｉ）　、ペニシリウ ム・ジャンシネルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）、 並びにバチルス及びストレプトミセスの種により生産されることが知られている 。

例えば、アスペルギルス・ツビゲンシス中で、３種の異なるキシラナーゼ（ＸＹ Ｌ　Ａ。

Ｂ及びＣ）が同定された。

自然では、微生物キシラナーゼは常に多糖分解活性を有するその他の酵素、例え ば、エキソーアラビナナーゼ、アセチルエステラーゼ及びセルラーゼと一緒に産 生される。幾つかの用途、例えば、リグノセルロースパルプの漂白に関して、こ れらの酵素活性の幾つかが必要とされず、また所望されない。

醗酵条件が問題の酵素の産生を有利にするように変え得ることが知られている。

また、所望の酵素をコードする遺伝子のクローニング及びそれをその天然宿主、 またはその他の適合性発現宿主中で過剰発現することが問題の酵素の産生を特異 的に増進することが知られている。問題の酵素が望ましくない酵素活性を含まな い形態で得られるべきである場合、この後者の方法が特に有益である。

キシラナーゼＡ（ＸＹＬ　Ａ）酵素をコードするアスペルギルス・ツビゲンシス 遺伝子のクローニングがＶａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋら（１９９２）により記 載されていた。その記載が参考として本明細書に含まれる。

しかしながら、アスペルギルス・ツビゲンシスＸＹＬ　Ｂ酵素はＸＹＬＡ酵素よ りもわずかに高いｐ＋＋最適値及び温度最適値を有することがわかった。リグノ セルロースバルブの漂白のような一定の用途に関しては、更に高いｐＨ最適値及 び温度最適。

値を有するキシラナーゼ、特にセルラーゼ活性を殆ど有しないか、または全く有 しないキシラナーゼ酵素調製物が好ましい。

不運なことに、アスペルギルス・ツビゲンシスはＸＹＬＡタンパク質またはＸＹ Ｌという事実と結びついて、古典的醗酵技術及び精製技術によるＸＹＬＢの生産 を経済的に実施不能にする。

Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋら（１９９２）により記載されたようなｘｙｌＡ ｉｌ伝子へのハイブリダイゼーションのためのプロトコルを使用してアスペルギ ルス・ツビゲンシスからｘｌｎＢ遺伝子（これはＸＹＬ　Ｂ酵素をコードする） をクローン化しようとする努力は陽性シグナルを生じさせなかった。これは、ｘ ｌｎＢ遺伝子をｘｙｌＡＩｌ伝子への異種ハイブリダイゼーションにより単離す ることが不可能であることを暗示する。

それにもかかわらず、その他の高生産性の微生物発現宿主中で発現させられ得い ている）の生産及び使用が工業用途につき経済的に実施可能になり得る。

を有するタンパク質をコードする菌類起源の精製され、単離されたＤＮＡ配列を 提供する。これらのＤＮＡ配列はキシラナーゼをコードする配列を含み、好まし くはその他に隣接の５′調節配列及び３°調節配列を含む。

また、本発明の目的は、天然の調節配列または、別の実施態様において、選択さ れた調節領域、例えば、プロモーター、分泌リーダー及びターミネータ−シグナ ル（これらは適当な発現宿主中でＸＹＬＢタンパク質の過剰発現を誘導し得る） に操作により連結されたキシラナーゼをコードする配列を使用するＸＹＬ　Ｂを コードする配列の微生物過剰発現のための構築物（ｃｏｎｓｌｒｕｃｔｓ）を提 供することである。

本発明の更に別の目的は、ＸＹＬ　Ｂタンパク質を過剰発現でき、また所望によ り、分泌できる本発明の発現構築物で形質転換された微生物発現宿主を提供する ことである。

本発明の更に別の目的は、ＸＹＬ　Ｂ酵素の生産方法（これは今度は工業方法で 有利かつ経済的に使用し得る）を提供することである。

図面の簡単な説明 図１＝ ９１Ｍ１７０の部分制限地図。太線はＩＩＥ）ｌｌＢＬ１８中にサブクローン化 されたＢｉｎ　ＤＩｌ＋フラグメントを表す。Ｘ１ｎＢ遺伝子の位置及び方向が 示されている。

図２： アスペルギルス・ツビゲンシスｘｌｎＢ遺伝子のヌクレオチド配列及びそれから 誘導されたアミノ酸配列。その酵素から決定されたようなＮ末端アミノ酸配列が 枠ｌ中のヌクレオチド配列中の位置１２４〜位置１８０に見られる。この配列中 に、一つの推定イントロンが認められ、これは位置２９０〜３５７に配置され、 （ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ）として示される。

を有するタンパク質をコードする精製され、単離されたＤＮＡ配列を記載する。

そのＤＮＡ配列はＸＹＬ　Ｂをコードする配列と隣接の５゛調節配列及び３′調 節配列とを含むことが好ましい。遺伝変異体は、同種生物または異種生物に由来 する調節領域、例えば、プロモーター、分泌シグナル及びターミネータ−シグナ ルに結合したｎＬＢをコードする配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列を含む。ま た、遺伝変異体は、コドン選択が選択された発現宿主による最適の認識のために 選ばれたＸＹＬ　Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。また、本発明は 、ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　）条件下でＸＹＬ　Ｂをコードする ＤＮＡ配列及び上記のその遺伝変異体にハイブリダイズし得るが、遺伝暗号の縮 重または種間変異のためにコドン配列を異にし得るＤＮＡ配列を含む。

また、本発明は、所望の発現宿主中のＸＹＬ　Ｂタンパク質をコードする遺伝子 の発現のためのＤＮＡ構築物を提供する。これらの発現構築物は、同種生物また は異種生物に由来する調節領域、例えば、プロモーター、分泌シグナル及びター ミネータ−シグナルに操作により連結されたＸＹＬ　Ｂをコードする領域を含み 、これらの調節領域は適当な宿主中でＸＹＬ　Ｂ酵素をコードする遺伝子の過剰 発現を誘導し得る。発現構築物は選択された発現宿主のゲノム中に組み込まれる ことが好ましい。

更に、本発明は、ＸＹＬ　Ｂタンパク質をコードする遺伝子の発現のためのＤＮ Ａ構築物の微生物宿主への導入による微生物宿主のクローニング及び／または形 質転換のためのベクター、好ましくはプラスミドを提供する。

加えて、本発明は、上記のＤＮＡ構築物により形質転換された同種宿主または異 本発明の文脈内で、“同種”という用語は、ＸＹＬＢタンパク質をコードするＤ ＮＡ配列（その調節領域を含む）につき自生（ｎａｔｉｖｅ）である全てのもの を意図するものと理解される。同種宿主は、このようなりＭ配列が単離し得る種 と定義される。

従って、“異種”という用語は、ＸＹＬＢタンパク質それ自体をコードする　Ｄ ＮＡ配列（その調節領域を含む）につき自生ではない全てのものと定義される。

“異種”宿主は、ＸＹＬ　Ｂをコードする遺伝子が単離されたちの以外のあらゆ る微生物種と定義される。

本発明の範囲内で、ＸＹＬＢ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列は 、アスペルギルス種、特に、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモ リ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗｕｃｒｉ）　、アスペルギルス・アクレアラ ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａ−Ｌｕｓ）、及びアスペルギルス・ ツビゲンシスから得ることができる。アスペルギルスを有するタンパク質をコー ドするがコドンが選択された発現宿主における最適認識のために選択されている ＤＮＡ配列が最も好ましい。

本発明によれば、ストリンジェント条件下でアスペルギルス・ツビゲンシスｘｌ ｎＢ遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡ配列は、少なくとも下記のハイブリダイ ゼーションプロトコルと同程度はストリンジェントであるハイブリダイゼーショ ン状態として定義される： ６　Ｘ　ＳＳＣ，０，５％のＳＯ５，５Ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液 、及び１００　μｇ／ｍｌの熱変性サケ精子ＤＮＡ中で６０℃で２時間にわたる プレーハイブリダイゼーション。欧州特許出願箱９１２０５９４４．５号（公開 番号０４６３７０６　Ａ２、実施例２．１及び７．１）にＶａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒ ｏｅｃｋらにより記載されたような６０℃で１８時間にわたるハイブリダイゼー ション。ハイブリダイゼーション後、フィルターは４ｘｓｓｃ、０．５％のＳＤ Ｓ　、　０．１％のビロリン酸ナトリウム中で６０℃で３０分間にわたって２回 洗浄され、２ＸＳＳＣ１０，１％のＳＤＳ中で６０℃で３０分間にわたって２回 洗浄される。

問題のエンド−キシラナーゼは、本発明に重要ではないアッセイ方法、例えば、 スポット試験アッセイにより同定し得る。この方法によれば、エンド−キシラナ ーゼを産生ずるように（例えば、エンバクスベルトキシランで）誘導された微生 物の培養から得られた濾液が、エンド−キシラナーゼ活性の存在につき試験し得 る。溶離画分の液滴が、クエン酸−リン酸緩衝液（下記の実施例１．１を参照の こと）及びエンバクスベルトキシランを含む寒天フィルムの上に個々に置かれる 。

次いでフィルムがインキュベートされる。エンド−キシラナーゼ活性が存在する 場合、寒天フィルムの個々の液滴の位置が目視により明らかである。

問題のキシラナーゼが一旦同定されると、このようなキシラナーゼをコードする ＤＮＡ配列が、糸状菌類（これはそれを自然に産生ずる）から、その菌類をキシ ランを含む培地中で培養し、既知の方法、例えば、カラムクロマトグラフィーを 使用して所望のキシラナーゼを単離し、精製されたタンパク質のアミノ酸配列の 少なくとも一部を決定することにより得ることができる。

本発明によれば、アスペルギルス・ツビゲンシスを３％のエンバクスベルトキシ ラン培地中で増殖させてキシラナーゼ＋ｎＲＮＡの合成を誘導した。このポリＡ 　＋ｍＲＮＡから、ＺＡＰ（商標）−ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡを 合成した。ベクターアーム中のｃＤＮＡの連結そしてＥ、ｃｏｌｉの形質転換後 に約３・１０’の組換えファージを得た。

このｃＤＮ＾ライブラリーから、ｘｌｎＢ−特異的クローンをＰＣＲ技術により 得た。オリゴヌクレオチドをＮ末端アミノ酸配列から誘導し、ポリ＾１特異的オ リゴヌクレオチドと組み合わせてＰＣＲ反応に使用した。０．７ｋｂのＤＮＡフ ラグメントを得、これはＸＹＬＢタンパク質の分子量に基いて予想された長さで あった。その０．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを使用して、アスペルギルス・ツ ビゲンシスからのゲノムライブラリーをスクリーニングした。６の陽性ハイブリ ッド形成プラークを得、制限酵素消化により分析した。ｘｌｎＢ遺伝子を含む５ ．５ｋｂのＨｔｎ　ｄｌｌｌゲノムＤＮＡフラグメントをベクターｐＥＭＢＬＩ Ｂ中にサブクローン化した。得られるプラスミドを９１Ｍ１７０と称し、ネザー ランド、バーンにあるザ・センＩ・ラル・ビューロウ・フォア−・シメルカルチ ャーズ（ｔｈｅ　ＣｅｎＬｒｕｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　８ｃｈｉｍｍｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に１９９２年１２月１４Ｂｌこ寄託しく堕些其中）、受理番 号ＣＢＳ　６２９．９２を得た。

一つ以上の異種調節領域を含む発現構築物へのキシラナーゼをコードする配列を 含むＤＮＡフラグメントの挿入を促進するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）（Ｅｈｒｌ　ｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、（編集）、１９８９）が、キシラナーゼを コードする配列の５′末端及び３°末端中の適当な制限酵素部位の導入に使用し 得る。制限部位の選択は、発現ベクターのＤＮＡ配列、即ち、ＤＮＡ分子中のそ の他の制限部位の存在に依存する。

起源（同種）生産種、またはその他の菌類株中のＸＹＬＢタンパク質の過剰発現 を得るために、その５°調節領域及び３゛調節領域を含む完全なＸＹＬＢをコー ドする遺伝子、またはその他の遺伝子の調節領域に融合された成熟ＸＹＬ　Ｂタ ンパク質をコードする配列が選択された発現宿主に導入され、遺伝子のコピー数 が増加し、そしてその結果、タンパク質発現が増加する。

異種発現宿主が好ましく、カリ酵母またはバクテリア株が選択される場合、ゲノ ムフラグメント上にあるスプライスシグナルが異種宿主により認識されないとい う可能性を避けるために、中断されていない（無イントロン）　ＤＮＡ配列が異 種発現ベクターの構築に使用される。この中断されていないＤＮＡ配列は、キシ ラナーゼの合成のために誘導された細胞から単離されたｍＲＮＡから構築された ｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。このライブラリーは前記のように して得られたオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡプローブでスクリーニングし得 る。また、中断されていないＤＮＡ配列は、キシラン誘導細胞のＲＮＡから合成 された第−鎖ｃＤＮＡに関して適当な５′オリゴヌクレオチド及び３′オリゴヌ クレオチドを使用してポリメラーゼ連鎖反応を適用することにより得ることがで きる。

本発明の文脈内で、過剰発現は、同種の野生型生物中に最初に見られるレベルを 越えるレベルにおけるＸＹＬＢタンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現と定義 される。同じ文脈内で、過剰発現はまた異種発現宿主へのＸＹＬ　Ｂタンパク質 をコードするＤＮＡ配列の導入以外はその酵素を通常産生しない異種生物中のｍ Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現を意図している。また、これらの発 現宿主の子孫が、勿論、本発明により包含されるものと理解されるべきである。

また、成熟ＸＹＬＢタンパク質の過剰発現は、異種調節領域、例えば、プロモー ター、分泌リーダー領域及びターミネータ−領域の選択により達成でき、これら の領域は、選択された発現宿主からの関係するタンパク質の発現、そして所望に より分泌レベルを増強し、および／または遺伝子の発現の誘導調節を与えるのに 利用できる。

ｘｌｎＢ遺伝子の天然プロモーターは別として、その他のプロモーターがその発 現を誘導するのに使用し得る。そのプロモーターは所望の発現宿主中でＸＹＬＢ の発現を誘導する際のその有効性につき選択し得る。

別の実施態様において、構成的プロモーターは、その他の望ましくない酵素活性 を比較釣合まないで、ＸＹＬ　Ｂの発現を誘導するように選択し得る。このよう な発現構築物が更に有利であるのは、それは発現宿主を誘導基質として固体キシ ランを含む培地上で培養する必要を回避するからである。

菌類発現宿主に使用するのに好ましい強力な構成的および／または誘導性プロモ ーターの例は、ＡＴＰ−シンテターゼ、サブユニット９　（ｏｌ　ｉＣ）、トリ オースホスフェートイソメラーゼ（ｔｐｉ）　、アルコールデヒドロゲナーゼ（ ａｄＭ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）　、アミログルコシダーゼ（ＡＣ）、アセ トアミダーゼ（ａｕｘｌｓ）及びグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド ロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターである。

強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３ 〜ホスホグリセレートキナーゼ及びトリオースホスフエートイソメラーゼプロモ ーターである。

強力なバクテリアプロモーターの例は、α−アミラーゼ及びＳｐｏ　２プロモー ター、並びに、細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターである。

また、ハイブリッドプロモーターが発現構築物の誘導調節を改良するのに有利に 使用し得る。

本発明の好ましいプロモーターは、アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子に由来 するプロモーター及び天然キシラナーゼプロモーターである。

成熟ＸＹＬＢタンパク質を発現宿主から培養培地（そこからその酵素が容易に回 収し得る）中に分泌させることが望ましいことが多い。

本発明によれば、ｘｌｎＢ遺伝子に自生の分泌リーダー配列が成熟タンパク質の 分泌を行うのに使用し得る。

しかしながら、キシラナーゼの発現の増大は、所定のレベル（そのレベルを越え ると、発現宿主が細胞壁中のタンパク質の輸送におけるびん首効果のために細胞 内でタンパク質生産物をプロセシングし、そして分泌でき、その蓄積を生じるこ とができる）でタンパク質の生産をもたらす場合もある。それ故、本発明はまた 選択された発現宿主からのキシラナーゼの最も有効な分泌に備えるための異種リ ーダー配列を提供する。

本発明によれば、分泌リーダーは所望の発現宿主に基いて選択し得る。発現構築 物のその他の調節領域と同種である異種分泌リーダーが選択し得る。例えば、高 度に分泌されたアミログルコシダーゼタンパク質のリーダーがアミログルコシダ ーゼプロモーターそれ自体と組み合わせて使用し得るだけでなく、その他のプロ モーターと組み合わせて使用し得る。また、ハイブリッドシグナル配列が本発明 の文脈内で有利に使用し得る。

好ましい異種分泌リーダー配列の例は、アミログルコシダーゼ遺伝子（菌類）、 α−因子遺伝子（酵母）またはα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）に由来する分 泌リーダー配列である。

本発明の最も好ましい分泌リーダー配列は、アミログルコシダーゼ（Ａの遺伝子 に由来する分泌リーダー配列及び天然キシラナーゼリーダー配列である。

一般に、ターミネータ−は遺伝子の過剰発現に重要な要素であるとは考えられな い。所望により、ターミネータ−はプロモーターと同じ遺伝子から選択されても よく、または同種ターミネータ−が使用し得る。

上記のゲノムフラグメントの他に、形質転換ＤＮＡは、形質転換されていない細 胞の本体からの所望の遺伝子をとり込んだ細胞を区別するための選択マーカーを 含んでいてもよい。この選択マーカーは、適当な５゛調節配列及び３′調節配列 が与えられると、所望の遺伝子を含む同じＤＮＡ分子上に存在してもよく、また は別の分子上に存在してもよい。後者の場合、同時形質転換が行われる必要があ る。発現ベクター／選択ベクターの比は、高比率（％）の選択された形質転換体 もまたＸＹＬＢをコードする発現構築物を含むベクターをとり込むように調節さ れる必要がある。

工業用微生物に最適の選択系は、宿主生物中で突然変異を必要としない選択マー カーの群により形成された選択系である。菌類選択マーカーの例は、アセトアミ ダーゼ（ａｍ＋ｄｓ）、ＡＴＰシンテターゼ、サブユニット９　（ｏｌｉｃ）及 びベノミル耐性（ｂｅｎｏｍｙｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（ｂｅｎＡ）の遺伝 子である。非菌類選択マーカーの例はＧ４１８耐ニング宿主に形質転換されて構 築物を増殖させる。その後、発現構築物が適当な発現宿主に導入され、この場合 、発現構築物はゲノムに組み込まれることが好ましい。バチルス種の如き成る種 の宿主が、クローニング宿主及び発現宿主の両方として使用でき、こうして余計 な形質転換工程を避けることができる。

本発明によれば、種々の発現宿主がＸＹＬ　Ｂタンパク質を過剰発現するのに使 用し得る。一つの実施態様において、同種発現宿主が使用し得る。これは、ＸＹ ＬＢをコードするＤＮＡ配列が増大された遺伝子コピー数で単離され、もしくは 上記の異種調節領域の制御下で単離され、またはその両方で単離された株への逆 の所望の発現構築物の導入を伴う。別の実施態様において、ＸＹＬ　Ｂは、異種 宿主、例えば、バクテリア、酵母または菌類中で適当な調節領域の制御下で成熟 ＸＹＬ　Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を導入し、発現することにより 過剰発現し得る。

その目的のために、ＸＹＬＢをコードするＤＮＡ配列は、異種宿主に由来するプ ロモーター配列及びターミネータ−配列の制御下で発現されることが好ましい。

加えて、生産物の最も有効な発現及び分泌を得るために、ｘｌｎＢ遺伝子に自生 の分泌リーダー配列を発現宿主に同種のリーダー配列で置換することが必要なこ とがある。

グラム陰性バクテリアＥ、ｅｏｌｉが異種遺伝子発現の宿主として広く使用され るが、質の本体からの所望のタンパク質のその後の精製が時として困難であるこ とがある。

Ｅ、ｃｏｌｉとは対照的に、属バチルスからのバクテリアが、タンパク質を培養 培地に分泌するそれらの能力のために異種宿主として非常に適している。

また、酵母または菌類の群から選ばれた異種宿主が好ましいことがある。一般に 、酵母細胞が菌類細胞よりも好ましいのは、それらは操作し易いからである。

しかしながら、幾つかのタンパク質は酵母細胞から不十分に分泌さね、または幾 つかの場合に適当に処理されない（例えば、酵母中の過剰グリコジル化）。これ らの場合に、菌類宿主生物が選択されるべきである。

ることによりＸＹＬＢを発現するために選択し得る。

号及び同第３０１．６７０号明細書に記載されている）及びサツカロミセス種で ある。

ら選択し得る。

ＸＹＬ　Ｂの過剰発現は通常の栄養醗酵培地中の発現宿主（これらはＸＹＬＢを コードする発現構築物で形質転換されていた）の培養により行われる。

醗酵培地は、炭素源（例えば、グルコース、マルトース、糖みつ、等）、窒素源 （例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、等）、有 機窒素源（例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、等）及び無機栄養源（ 例えば、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、等）を含む通常の培地 からなる。必要により、インデューサー（例えば、エンバクスベルトキシラン） が含まれていてもよい。

適当な培地の選択は、発現宿主の選択に基いてもよく、および／または発現構築 物の調節要件に基いてもよい。このような培地は当業者に公知である。培地は、 必要により、その他の潜在的に汚染性の微生物に対して形質転換発現宿主に有利 な付加的な成分を含んでいてもよい。

醗酵は０〜４５℃の範囲の温度及び２〜ｌＯのｐｌで回分法または流加回分法で ０．５〜２日の期間にわたって行われる。好ましい醗酵条件は２０〜３７℃の範 囲の温度及び３〜９のｐｌ＋である。適当な条件は発現宿主の選択に基いて選択 される。

醗酵後、細胞が遠心分離または濾過により醗酵肉汁から除去される。細胞の除去 後に、ＸＹＬ　Ｂタンパク質が回収でき、所望により、通常の手段により精製さ れ、単離し得る。

生産物は液体形態または乾燥形態で安定に製剤化される。成る用途に関して、固 体マトリックス上の酵素の固定化が好ましいことがある。

本発明により生産されたＸＹＬ　Ｂ酵素は、キシラン分解酵素の作用を必要とす る種々のプロセスで単独で、またはその他の選択された酵素と一緒に適用し得る 。

ＸＹＬ　Ｂ（またはエンドキシラナーゼ１１）酵素を、紙及びバルブ工業に通常 使用される二つの試験系に使用した。これらは全塩素不含（ＴＣＰ）系及び元素 状塩素不含（ＥＣＦ）系である。驚くことに、ＸＹＩ、　Ｂ酵素は針葉樹バルブ の白色度を特に増大することが示された。また、軟葉樹に対するこの酵素の効果 は、エンドキシラナーゼＩ及びＬｙｘ−６８（即ち、エンドキシラナーゼＩとエ ンドキシラナーゼＩＩの混合物）の効果よりも良好であることがわかった。更に 、粘度は著しく影響されなかった。

こうして、ＸＹＬ　Ｂ酵素は、特に、ＸＹＬ　Ｂのわずかに高い温度最適値及び ｐＨ最適値のためにその他のアスペルギルスキシラナーゼ、例えば、ＸＹＬ　Ａ （エンドキシラナーゼＩ）酵素と比較して、クラフトバルブからリグニンを除去 し、こうして紙製品の調製に必要とされる塩素の皿を減少することにより漂白を 促進するのに有利に使用し得る。

本発明によれば、本発明により生産されたＸＹＬ　Ｂ酵素は、ドウの品質を改良 するためにパンのベーキングに使用でき、またはアラビノキシラン及びグルコキ シランに富む動物飼料組成物に添加し得ることがわかった。穀物、例えば、オオ ムギ、コムギ、トウモロコシ、ライ麦もしくはエンバクまたは穀物副産物、例え ば、コムギフスマもしくはトウモロコシフスマを含む単胃動物（例えば、家禽ま たはブタ）用の飼料（サイレージ（ｓｉｌａｇｅ）　）に添加される場合、その 酵素は植物細胞壁の分解をかなり改善し、これが動物による植物栄養物の更に良 好な利用をもたらす。その結果として、成長速度および／または飼料転化が改良 される。更に、ＸＹＬ　Ｂタンパク質はキシランを含む飼料の粘度を低下するの に使用し得る。

ＸＹＬＢ酵素は、ブレーソーキングダイエツトまたは湿ったダイエツトが好まし い場合に、飼料またはサイレージに前もって添加し得る。しかしながら、更に有 利には、本発明により生産されたＸＹＬＢ酵素は、飼料に添加された場合に、生 体内で飼料中のキシランを加水分解し続ける。

また、本発明により生産されたＸＹＬ　Ｂ酵素は、濾過を改良し、リンゴ蒸留廃 棄物が微生物バイオマスに生物変換される方法で肉汁から溶解有機物質を除去す るのに有効である。

また、本発明によれば、改良された濾過性および／または低粘度を有するグルコ ースシロップが、最初に不純な穀物澱粉をα−アミラーゼの作用にかけ、次いで 本発明により生産されたＸＹＬ　Ｂにかけ、最後に加水分解にかけることにより 不純な穀物澱粉から生産される。同様に、ＸＹＬＢはビール醸造に使用されて麦 芽汁の濾過性を改良し得る。

加えて、本発明により生産されたＸＹＬ　Ｂは、フルーツジュースまたは野菜ジ ュースの調製；糖ビートバルブの酵素加水分解（得られる加水分解画分は微生物 培養培地中で使用し得る）；農業残渣、例えば、トウモロコシ穂軸、コムギわら 及び粉砕された堅果殻の酵素加水分解；及び成る種のリサイクル材料、例えば、 古紙の酵素加水分解の歩留りを増大するようなその他の方法に使用し得る。

以下の実施例は、当業者に本発明の実施及び使用方法の完全な開示及び説明を与 えるために示されるものであり、本発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を 限定することを目的とするものではない。使用した数（例えば、量、温度、ｐＨ １等）に関する正確さを確実するように努めたが、幾つかの実験誤差及び偏差が 考慮されるべきである。特に示されない限り、温度は℃であり、また圧力は大気 圧付近である。

ントラル・ビューロウ・フォア−・シメルカルチャーズに寄託され、名称ＣＢ５ ３２３、９０を指定された）を増殖させ、タンパク質を欧州特許出願第９１２０ ５９４４．５号（公開番号０４６３７０６　Ａｌ）の実施例１．１に記載された ようにして精製した。その特許の開示がそのまま参考として本明細書に含まれる 。

３種のエンド−キシラナーゼは、ピークに中の精製ＸＹＬＡ、ピークＦ中のＸＹ Ｌ２と最初に称されたＸＹＬＢ及びピークＢ中のＸＹＬＣであった。

約１〜２０モルのＸＹＬ　Ｂを１２．５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに よる電気泳動にかけ、続いて１ｍｔｓｕｄａｉｒａ　（１９８７）により記載さ れた方法に従ってイモピロン（Ｉｍｍｂｉｌｏｎ）−Ｐ膜（ミリボア（Ｍｉ　Ｉ Ｉ　１ｐｏｒｅ））に電気プロッティングにがけた。見掛分子量（ＳＯ３−ｐａ ｇｅ）２２　ｋＤａを有する主バンドを含む膜フラグメントを気相配列決定にお ける配列分析（Ａｍｏｎｓ、　１９８７Ｘソン・ファシリティ（ＳＯＮ　ｆａｃ ｉ　ｌｉ　ｔｙ）、ライデン）にかけた。下記の配列を決定した。

（Ｓ）−Ｔ−Ｐ−３−５−Ｔｍ〇−Ｅ−Ｎ−（Ｎ）−Ｇ−Ｆ−Ｙ−Ｙ−（Ｓ）− （Ｆ）−（Ｗ？ＸＴ）−（Ｄ）（式ｌ） このＮ末端配列決定を１回繰り返して得られた配列を確かめ、次いで下記の配列 を決定した。

（Ｇ）／Ｓ−Ｔ／（Ｇ）−Ｐ／（Ｇ）−３−３−Ｔ−Ｇ／（Ｔ）　−Ｅ−Ｎ−（ Ｎ）−Ｘ−Ｆ−Ｙ−Ｙ−（Ｓ　）−Ｆ−Ｘ−（Ｔ）−（Ｄ）|（Ｇ） （式２） により回収し、次いで無菌食塩水で洗浄した。続いて菌糸体を液体窒素中で凍結 し、その後、ミクロディスメンブレーター（Ｍｉｃｒｏｄｉｓ＋ｏｅｍｂｒａｔ ｏｒ）（ブラウン（Ｂｒａｕｎ））を使用してそれを粉末にした。ＳＤＳを可溶 化緩衝液から省いた以外は、Ｃａｔｈａｌａら（１９８３）のグアニジンモノチ オシアネート／ＬｉＣ１プロトコルに従って、全脆を菌糸体粉末から単離した。

ポリＡ′″ＲＮＡを、下記の変更でもって、オリゴ（ｄＴ）−セルロースフ０フ トグラ７　イー（Ａｖｆｖ及びＬｅｄｅｒ　１９７２、Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９ ８９）により全ＲＮＡ　１ｍｇ力ら単離シタ。ＩＯ＋ｏＭノＨＥＰＥｓ　ｐＨ７ ，６を緩衝液として使用し、ＳＯ３を全ての溶液から省き、装填緩衝液に９％（ Ｖ／Ｖ）ジメチルスルホキシドを補給した。

実施例３．１．２： ｃＤＮＡライブラリーの構築 ｃＤＮＡをポリＡ　”　ＲＮＡ　５ｇｇから合成し、製造業者の指示に従ってＺ ＡＰ（商標）−ＣＤＮＡ合成キット（ストシタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） 　）を使用してバクテリオファージラムダλＵｎｉ−ＺＡＰ　ＸＲにつないだ。

Ｕｎｉ−ＺＡＰ　ＸＲベクターアームへのｃＤＮＡの連結後に、パッケージング ファージＤＮＡをパッケージングした。ベクターアーム１８ｇ中のｃＤＮＡ２０ ０ｎｇの連結及びその後のその反応混合物の１１５のパッケージングは３　ｔ　 １０’の組換えファージからなる一次ライブラリーを生じた。Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ 　ＰＬＫ−Ｆ’　を使用して、この−次ライブラリーを増幅し、滴定し、４℃で 貯蔵した。

実施例３．２：　ＰＣＲによるｃＤＮＡフラグメントの生成Ｎ末端アミノ酸配列 （それらはＸＹＬ　Ｂにつき決定されていた）を使用してオリゴヌクレオチド混 合物を設計した。ＸＹＬ　Ｂから下記の混合物を誘導した。

５’　ＡＣｌ　ＧＧＩ　ＧＡＲＡＡＹ　ＧＧＩ　ｍ　ＴＡ　３°（式３）（式中 、ＲはＡまたはＧを表し、ＹはＣまたはＴを表し、■はイノシンを表し、かつＮ はＡ、Ｇ、ＣまたはＴを表す）　このオリゴヌクレオチドをＸＹＬ　ＢのＮ末端 アミノ酸配列からアミノ酸６（Ｔ）からアミノ酸１３Ｙまでを誘導した。位置１ ０のＮのコドンを、その不確定性のためにこの配列から排除した。

オリゴ５’　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＡＣｍ　ｍ 　ｍ　ｍ　ｍ　ｍ　３’　（式５）を使用して第−鎖を開始した以外は、実施例 ３．１に記載されたようにして合成されたｃＤＮＡを使用して、このオリゴヌク レオチド混合物をオリゴヌクレオチド５’　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　 ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＡＣ３°（式４）と組み合わせてＰＣＨに使用した。

ＰＣＨに関して、得られるｃＤＮＡ　］μｌを１００μｍの最終容積中のｌＯμ ｌの１０×反応緩衝液（１００−のトリス（Ｔｒｉｓ）−ｆ（Ｃ１、ｐＨ８，３ ：　５００−のＫＣＩ；　１５−のＭｇＣＩｚ；　０．０１％のゼラチン）、１ ６μｌの４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの夫々１．２５−及びオ リゴヌクレオチドの夫々１μｇと合わせた。その反応混合物を混合し、ｌμｌの ＴＡＱポリメラーゼ（５Ｕ／ｍ１ＸＨＴバイオテクノロジー）を添加した。

そのＤＮＡを９０℃で３分間のインキュベーションによって熱変性し、続いて９ ０℃で１分間、３６℃で１分間そして７２℃で１分間のサイクルを２５回行った 。これらの２５サイクル後にその混合物を７２℃で５分間インキュベートする。

反応生成物の分析は、ＸＹＬ　Ｂから誘導したオリゴ（式３）を使用して約０． ７ｋｂのフラグメントを明らかにした。ｍＢにつき２２　ｋＤａの見掛分子量に 基いて、約０、７ｋｂのフラグメントを予測した。

実施例３゜３： ＸＹＬＢをコードする遺伝子ｘｌｎＢに関するアスペルギルス・ニガー変種ツビ ゲンｘｌｎＢ遺伝子に関するアスペルギルス・ニガー変種ツビゲンシスゲノムラ イブラリーのスクリーニング ｘｌｎＢ遺伝子に関して欧州特許出願第９１２０５９４４．５号（公開番号０４ ６３７０６　Ａｔ）の実施例２に記載されたようにして構築されたアスペルギル ス・ツビゲンシスゲノムライブラリーをスクリーニングするために、１０’ｐｒ ｕ／プレートを、Ｍａｎｉａｔｉｓら。

１９８２、６４頁に記載された直径８５ｏｎのＮＺＹＣＭ　（１，２％の寒天） プレート上の０．７％のアガロースを含むＮＺＹＣＭ　）ツブアガロース中に塗 布した。

ニトロセルロースフィルター（シュライゲル＆シュル（Ｓｃｈｌｅｉｇｅｒ＆５ ｃｈｕｌｌ））レプリカを使用するプラークハイブリダイゼーションを、以下の ようにして行った。

１０’ｐｆｕを０．６％のトップアガロース中にＥ、　ｃｏｔ　ｉ　ＬＥ３９２ 細胞とともに塗布した。そのプレートを３７℃で一夜インキユベートした後、夫 々のプレートの二つのレプリカを、Ｍａｎ−ｉａｔｉｓら、　１９８２　（３２ ０−３２１頁）により記載されたようにしてニトロセルロースフィルター上でつ くった。フィルターを湿らせ、その後、それらを、６ｘＳＳＣ、０，５％のＳＯ ３、５にデンハルト溶液（（１００ｘデンハルト溶液は５０１１１当たりフィコ ール−４００ｌｏｇ　、ポリビニルピロリドン１０ｇ、ウシ血清アルブミンｌＯ ｇ（ペンタックス・フラクションＶ）（２０ｘＳＳＣは１０１００Ｏ当たり：　 ＮａＣ１１７５，３ｇ、クエン酸ナトリウム・５．５１（，０１０７，Ｉｇ、　 ｐＨ７，０を含む））及びｉｏｏμｇ１０１の熱変性されたニシン精子ＤＮＡ（ ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ顯ｎｎｈｅｉｍ）遷含むプレ ハイブリダイゼーション緩衝液中で６８℃で２時間プレハイブリダイズさせた。

２時間のプレハイブリダイゼーション後に、そのプレハイブリダイゼーション緩 衝液を、ハイブリダイゼーション緩衝液（この緩衝液は欧州特許出願第９１２０ ５９４４．５号（公開番号０４６３７０６　ＡＩ）（実施例２．１及び７．１） に記載されたようにしてＰＣＨにより得られ、単離され、標識されたＳＩＰ標識 フラグメントを含んでいた以外は、ブレハイブリダイゼーション緩衝液と同じで あった）により交換した。フィルターを６８℃で１８時間にわたってハイブリダ イズさせた。ハイブリダイゼーション後に、フィルターを５　Ｘ５ＳＣ１０，５ ％のＳＯ３、０，１％のピロリン酸ナトリウム中で６８℃で３０分間にわたって ２回洗浄し、続いて３０分間６８℃で２　Ｘ５ＳＣ１０，１％のＳＤＳ中で２回 洗浄した。空気乾燥したフィルターをワットマン（Ｗｈａｔｍｎ）３ＭＭペーパ ーのシートにテープで止め、識別マークを放射性インキでつくり、ワットマンペ ーパー及びフィルターをサランラップで覆った。ハイブリダイズしているプラー クを室温で４時間にわたってコダックＸＡＲＸ線フィルムの露出により同定した 。

レプリカフィルター上に二重に現れるハイブリダイズしているプラークを同定し た。６の陽性プラークを拾った。パスツールピペットを使用して夫々の陽性プジ ーンをプレートから拾い、Ｍａｎｉａｔｉｓら、　１９８２．６４頁に記載され たようにしてファージを、クロロホルム２０μＩを含むＳＭＪ１衝液（ｌｏｏｈ ＋１当たりのＳ緩衝液：５．８ｇのＮａＣｌ、２．０ｇのＭｇ５Ｏ，−７１１， ０，５０ｍ１のＩＭのトリス／１（ＣＩ　ｐＨ７，５，５ｍｌの２０％のゼラチ ン）１ｍｌ中に寒天プラグから溶離した。得られたファージを、単離ファージの ５０〜１００のプラークを含むプレートからのフィルターレプリカを使用して上 記の操作を繰り返すことにより精製した。

精製後に、５ｘｌＯ”のファージをＮＺＹＣＭ培地（１０００ｍｌ当たりのＮＺ ＹＣＭ培地：　１０ｇのＮＺアミン、５ｇのＮａＣＩ、５ｇの酵母エキス、Ｉｇ のカザミノ酸、２ｇのＭｇ５Ｏ１・７ＨｔＯｐｌ＋７．５　；プレート用には寒 天１２ｇを添加し、トップアガロース用にはアガロース７ｇを添加する）に塗布 することによりファージを増殖させた。３７℃で一夜インキユベートした後、集 密プレートを得、それから５Ｍ１ｔ衝液５ｍｌを添加し、プレートを間欠的に振 とうしながら４℃で２時間貯蔵することによりファージを溶離した。

ピペットを使用して上澄みを回収した後、バクテリアを４．０００　Ｘｇで４℃ で１０分間の遠心分離により溶液から除去した。上澄みに、０．３％のクロロホ ルムを添加し、ｐｆｕの数を欧州特許出願第９１２０５９４４．５号（公開番号 ０４６３７０６八ｌ）の実施例２゜４に記載されたようにして滴定により測定す る。これらのファージ株は約ｔｏ”ｐｒｕ／ｍｌを含む。

実施例３．３．２＋ ファージを含むｘｌｎＢの制限分析 欧州特許出願第９１２０５９４４．５号（公開番号０４６３７０６　Ａｌ）の実 施例３．３に記載されたようにして単離された陽性ファージのＤＮＡをサザン分 析により分析した。そのＤＮＡを、下記の溶液から成る反応混合物中で３７℃で ３時間消化した。５μｍ　（約１、ｃｚｇ）のＤＮＡ溶液；２μｌの適当なＩＯ Ｘリアクト（Ｒｅａｃｔ）緩衝液（ＢＲＬ）；　１０υの制限酵素（ＢＲＬ）及 び５０μｍの最終容積を与える無菌蒸留水。消化後に、ＤＮＡを０゜！容積の鵠 のＮａＡｃ及び２容積のエタノールの添加により沈殿させた。ＤＮＡを室温で１ ０分間の遠心分離（１４，０００ｘｇ）により回収した。上澄みをアスピレーシ ョンにより除去し、残りのペレットを真空中で素早く乾燥させ、２０μｍの無菌 蒸留水に再度懸濁させた。４μｍのＤＮＡローディング緩衝液（■２０中０．２ ５％（Ｗ／Ｖ）のブロモフェノールブルー、０．２５％（Ｗ／Ｖ）のキシレンシ アツール、１５％（Ｗ／Ｖ）のフィコール型４０のの添加後に、試料を６５℃で １０分間インキュベートし、氷で急冷し、その後、試料をＴＡＢ緩衝液（１００ ０ｍｌ当たりの５０ｘＴＡＥ緩衝液：　２４２．Ｏｇのトリズｖ（Ｔｒｉｚ＋ｏ ａ）塩基（ジグｖ（Ｓｉｇｍ））、５７．１＋ｏｌの氷酢酸、１００　ｍｌの０ ．５ＭのＥＤＴＡ　ｐＨ８，ｏ）中の０．６％のアガロースゲルに装填した。Ｄ ＮＡフラグメントを２５Ｖで１５〜１８時間にわたって電気泳動により分離した 。

電気泳動後、ＤＮＡを指示マニュアル（２５〜２６頁）に記載されたようにして ナイロン膜（ジーン・バインド（Ｇｅｎｅ　Ｂｉｎｄ）４５　、ファルマシア（ Ｐｈａｒｍｃｉａ）ＬＫＢ）に移し、アルカリ真空プロッティング（バクジーン （ＶａｃｕＧｅｎｅ）ＸＬ、ファルマシアＬＫＢ）により変性し、続いてプレハ イブリダイスさせ、実施例３．３．１に記載されたようにして″ｆｆＰ標識フラ グメント及びハイブリダイゼーション条件を使用してハイブリダイズさせた。ハ イブリダイゼーションパターンを室温で２時間にわたるコダックＸＡＲ−５Ｘ線 フィルムの露出により得た。

得られた制限パターンを使用してｘｌｎＢ遺伝子のゲノム領域の部分制限地図を 誘アスペルギルス・ツビゲンシスｘｌｎＢ遺伝子のサブクローニングｘｌｎＢに 関して、５．５ｋｂのＨｉｎ　ＤＩｌｌフラグメントを選択し、サブクローン化 して発現において選択遺伝子を同定した。そのフラグメントを、ファージＤＮＡ を消化し、続いてアガロース電気泳動にかけることにより単離した。フラグメン トをアガロースゲルから切断し、その後、欧州特許出願第９１２０５９４４．５ 号（公開番号０４６３７０６　Ａｔ）の実施例３．５に記載されたようにしてｌ ５ＣＤカツプを使用してそれを電気溶離によりアガロース片から回収した。

得られたフラグメントを、以下のようにして調製されたＨｉｎ　Ｄｌｌｌで消化 されたベクターｐＥＭＢＬ１Ｂ中でつないだ。１μｌ　（１μｇ／μｍ）のｐＥ ＭＢＬ１８を２μｌのＩＯＸリアクト２　（ＢＲＬ）、ｌμｌ　（１０υ／μｌ ）のＮｓｉ　Ｉ、ｌμｌ　（１０Ｕ＃ｚ＋）のＸｂａ　Ｉ及び１６μｍの無菌蒸 留水と混合した。そのＤＮＡを３７℃で１時間消化する。そのベクターを上記の ようにして０．６％のアガロースゲルから単離した。

５、５ｋｂのＨｉｎ　ＤＩｌ＋フラグメントを、下記の操作によりプラスミド９ １Ｍ１７０中に生じるベクター中でつないだ。ｌｏＯｎｇのｐＥＭＢＬ１８フラ グメントを１１００ｎの５．５ｋｂのＨｉｎ　Ｄｌｌｌ／　Ｘｂａ　Ｉフラグメ ント及び４μｌの５×連結緩衝液（組成；５００−のトリス−ＩＣＩ、　ｐｌ＋ ７．６；　１００＋ｎＭのＭｇｃｌ、；　１０ｍＭのＡＴＰ、　ＩＯ＋＋＋ＩＪ のジチオトレイトール：２５％のＰＥＧ−６０００）と混合し、１μ１．２Ｕ／ μＩ）のＴ、ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）をこの混合物に添加して２０μＩの最終 容積を得た。１４℃で１６時間のインキュベーション後に、その混合物を無菌水 で１００μｍに希釈した。希釈混合物ｌＯμｌを使用して、地（１０００＋ｎｌ 当たりのしＢ培地：　１０ｇのトリブチカーゼＱｒｙｐｔ＋ｃａｓｅ）ペプトン （ＢＢＬ）、５ｇの酵母エキス（ＢＢＬ）　、１０ｇのＮａＣｌ、０．５ｄＪの トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５）２００ｍｌに接種した。この培養物を、その密度 が０．１５〜０．２の０．０．ａｅｅに一致するまでオービタルシェーカー中で ３７℃でインキュベートした。次いでそのバクテリアを５０００ｒｐｍで４℃で 遠心分離することにより回収した。上澄みを捨てた後、細胞を氷上に置いた。バ クテリアペレットを、１００　ｍｌの１００−のＭｇＣｌ２．５ｍ１Ｊのトリス −ＨＣｌ　ｐＨ７，４中でこれらの細胞を再度懸濁させることにより洗浄し、続 いて上記のようにして遠心分離した。これを１００ｍ１のｌ１００ＩＩＩのＣａ Ｃ１，、５＋＋＋Ｍのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４で繰り返した。最後に細胞を ２ｍｌの１００−のＣａＣ１ｔ、　５−のトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４，１４％ のグリセロール中に再度懸濁させた。試料の一部（５０μｌ）を直ちに形質転換 に使用するかまたは一７０℃で凍結した。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５αコンピテント細胞を、細胞懸濁液５０μｍを連結混合物 １０７ｚｌと合わせることにより形質転換実験に使用した。氷上での３０分のイ ンキュベーション期間後に、細胞を４２℃で３〜５分間インキュベートした。次 いでＬ８培地１ｎｌを添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。細胞 を短時間遠心分離し、細胞を１．Ｂ培地２００１１１に再度懸濁させることによ り濃縮した。得られるバクテリア懸濁液を、２００７ｇｇ／ｍ１（７）アンピシ リン、５０ｇｇ／ｍｌノＸ−ｇａｌ及び６０ｇｇ／ｍ１（１）ｌｐ”ｒｅを含む ＬＢ培地に塗布した。

得られるコロニーの６の選択物を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ 培地中で一夜増殖させた。培養液から、プラスミドＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓら （１９８２，３６８−３６９頁）により記載されたようなアルカリ溶解方法によ り単離し、これを制限分析に使用して所望のプラスミドｐ１Ｍ１７０を宿すクロ ーンを選択する。プラスミドＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む ＬＢ培地中で増殖させた９１Ｍ１７０を含む５００ｍ１の培養物１：、Ｃ０１ｉ 　ＤＨ５（Ｚから大規模で単離した（ＭａｌｉａＬｉｓら、　１９８２．８６頁 ）。そのプラスミドをＣｓＣ１遠心分離により精製し、フェノール処理し、エタ ノールで沈殿させ、４００μｌのＴＥ（ＴＥ溶液＝ＩＯ−のトリス／ＨＣＩ　ｐ ｌ＋８．０、ｌ−のピＤＴＡ）に溶解した。収量は約５００μｇであった。

更に、制限酵素を使用してプラスミド＋１［Ｍ１７０を分析し、図１に示される ような部分制限地図を得た。

９１Ｍ１７０を含むＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５αは、ネザーランド、バーンにあるセ ントラル・ビューロウ・フォア−・シメルカルチャーズに１９９２年１２月１４ 日に寄託され、受理番号ＣＢＳ　６２９．９２を与えられた。

遺伝子のコード部分及び終止領域の一次構造を、配列決定反応におけるプライマ ーとしての特定のオリゴヌクレオチドの使用と組み合わせて、９１Ｍ１７０から の５．５ｋｂのＨｉｎ　Ｄｌｌｌのフラグメントを配列決定することにより決定 した。

ヌクレオチド配列分析に関して、制限フラグメントを実施例２．２．４に記載さ れたようにして単離し、次いで適当な制限酵素で消化された９２ＭＢ１１８／＋ ９ベクター（Ｄｅｎｔｅら、　１９８３）中にクローン化した。ヌクレオチド配 列を、ファルマシア社の１７　Ｉ）ＮＡポリメラーゼ配列決定キットを使用して ジデオキシヌクレオチドチェインターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒら、　１９７ ７）により決定した。コンピューター分析をＰＣ／ＧＥＮ［！プログラムを使用 して行う。

完全ヌクレオチド配列を決定し、図２に示す（式４、配列番号７）。

実施例３．４．２： ｘｌｎＢ遺伝子の説明 得られた配列は、１５８１ｂｐ、５°非コード領域中の２６３ｂｌ）−及び３° 非コード領域中の５７６ｂｐを含む。５°上流領域中に、推定ＴＡＴＡ−ボック スが位置１３８〜１４５及び１７ｘ−”ｙ４ゲンシスｘｌｎＡ遺伝子（欧州特許 出願第９１２０５９４４．５号（公開番号０４６３７０ＢＡＩ）　、実施例４． ２）の−次構造中に見られた三重反復配列の一部である。位置８６〜９７ニ、１ ２ｂｐ配列（ＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣ、式６）が見ら札コれは位置１１１から 位置１２２まで反復される。

ｘｌｎＢ遺伝子のコード部分は７４２ｂｐの長さであり、単一推定イントロン６ ７ｂｐの長さにより中断される。コード配列から誘導されたポリペプチドは２２ ５のアミノ酸の長さである。実施例２．２に記載されたようにして決定されたＮ 末端配列は３７のアミノ酸の長さのプレブトペプチドにより先行される。成熟タ ンパク質は１８７のアミノ酸のサイズであり、２０ｋＤａの予想分子量及び４． ３の理論ＩＩ！Ｐを有する。

実施例４ アスペルギルス・ニガー中のクローン化されたｘｌｎＢ遺伝子の発現プラスミド ｐ１Ｍ１７０を、選択マーカーとしてのプラスミドｐＧＷ６３５ｃＧｏｏｓｅｎ ら。

＋０８７）に配置されたアスペルギルス・ニガーｐｙｒＡＩＩ伝子及び同時形質 転換プラスミドとしてのプラスミドｐ１ＭＩ７０を使用してアスペルギルス・ニ ガーＮ５９３の同時形質転換によりアスペルギルス・ニガー中に導入した。

プロトプラストを、０．５％の酵母エキス、０．２％のカザミノ酸、５０ＩＩＩ Ｍのグルコース及びＩＯｆｆｌＭのウリジンを補給した最小培地上での３０℃で ２０時間の増殖後に得られた菌糸体から調製した。プロトプラストの調製及び形 質転換操作を、１ｇｇのｐＧＷ６３５及び５０．ｃｚｇの０１Ｍ１７０を使用し てＧｏｏｓｅｎら（１９８７）により記載されたようにして行った（１０００＋ ｎｌ当たりの最小培地＋６．０ｇのＮＰＬＮＯｓ　、１．５ｇのＫＨ＊ＰＯｔ、 ０．５ｇのＭｇ５Ｏ，’７ＨｚＯ１０，５ｇのにＣ１，１ｍｌのビスニアツク（ ｖｉｓｎｉａｃ）溶液、示されたような炭素源、ｐａｔｅ、　０　；ビスニアツ ク溶液（１／１ｓｎｉａｃ及び５ａｎｔｅｒ、　１９５７）：　１０ｇのＥ［ｌ ＴＡ、４．４ｇのＺｎ５Ｏ，−７Ｈ，０，１，０ｇの１ｉｃＩ！　−４８，０， ０，３２ｇのＣｏＣ１，・６ｔ−ｔ、ｃｌ、０．３２ｇのＣｕ５Ｏｔ　ｌ　５Ｈ ２０，０，２２ｇの（Ｎｌ−１＋）＋Ｍｏ＋Ｏａ＋　”　４ＨｓＯ１１，４７ｇ のＣａＣ１！　”　２ＯｇＯ１１，０■■ Ｆｅ５（Ｌ　−ａＯ１ｐＨ４，０゜ 次いで、得られたＰＹＲ“形質転換体を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、炭素源とし て３％のエンバクスベルトキシランを含む最小培地上での形質転換体の３０時間 の増殖後に培養濾液の分析によりｘｌｎＢ遺伝子の発現につき分析した。培養濾 液中の全タンパク質を５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブリリアント ブルーにより検出し、一方、欧州特許出願第９１２０５９４４．５号（公開番号 ０４６３７０Ｂ　ＡＩ）に記載されたようなウェスタンブロッティング後に部分 精製ｍＢに対して生じた抗体を使用してηｔＢを視覚化した。

濾液の分析及びクーマシーブリリアントブルー染色は、分析した多数の形質転換 体でｘｌｎＢ遺伝子の明らかな過剰発現を明らかにした。これらの形質転換体中 に届、Ｂタンパク質に相当する見掛分子量を有し、かつ野生型アスペルギルス・ 二〃二株Ｎ４０２と比較して強く増大されたレベルで産生されるタンパク質が見 られる。

形質転換体Ｎ５９３　：１７０−２は最高レベルのＸＹＬ　Ｂを産生じ、一方、 形質転換体Ｎ５９３　：１７０−７；８；９；１０及びＩＩにより強く増大され たレベルが産生される。

実施例５ ＴＣＰ及びＥＣＦ順序におけるキシラナーゼによる酸素前説リグニン化クラフト バルブの脱リグニン化 この実験に使用したバルブの性質： 広葉樹　針葉樹 カバ８０％　トウヒ、２０％のマツ 白色度、％ＩｓＯ５０，８３５，８ 力ツパー価　１１．０　１６．７ 粘度、ｄが／ｋｇ　９７９　１００３ カルシウム、ｐｐｍ　１９００　２６００銅、ｐｐｍ　Ｏ，３０，６ 鉄、ｐｐｔｒ　５．Ｉ　ＩＩ マグネシウム、ｐｐｒａ　２１０　２７０マンガン、ｐｐｍ　２５　７０ アスペルギルス・ニガーからの３種の酵素製剤、キシラナーゼエンド！（欧州特 許出願第４６３７０６号）、キシラナーゼエンド１１（＝キシラナーゼＢ）及び キシラナーゼエンド■とエンド１１の両方を含む市販の製剤であるＬＹＸ６８を 、下記の工程を示すＸ　ＩＩ　ＱＰにより表される全塩素不含（ＴＣＰ）漂白順 序で試験した。

酵素インキュベーション（Ｘ）、 洗浄（Ｗ）、 キレート化（Ｑ）及び 過酸化物漂白ＣＰ’ｌ。

性能白色度を測定するためのパラメーターとして、カッパー低下及び粘度を測定 した。白色度は重要な目安である。何となれば、紙が“更に白い”場合には、そ れは更に貴重であるからである。カッパー低下は、成る種の化合物の放出の目安 であり、必ずしも白色度と関係しない。バルブの粘度は、バルブから得られる紙 の強度の目安である。

上記の漂白順序の順序ＱＰ形成部分は欧州特許出願４０２２３５号（エカ・ノー プル（Ｅｋａ　Ｎｏｂｅｌ）の名義）に既に記載されていたことが注目されるべ きである。

下記のインキュベーションを行った。

酵素工程、温度、℃５０ Ｘ　時間、分　１２０ コンンステンシー、％　１０ ｐＨ４±０．５（エンドＩ） ５±０．５（エンド１１） ４．５±０．５（Ｌｙｘ６８） 用量、単位７ｇバルブ　５０ 洗浄工程、温度、℃　周囲温度 Ｗ　時間、分　１０ ０段階、　温度、’Ｃ９０ 時間、分　６０ コンシスチンシー、％　１０ ｐＨ５−７ Ｐ工程、　温度、℃９０ 時間、分　２４０ コンシスチンシー、％　ｌＯ 実験を針葉樹及び広葉樹につき行った。ブランクにおいては、酵素を添加しない で同等の操作を行った。操作後に、バルブ粘度を測定し、手すきシートを製造し 、カッパー低下、白色度及び粘度を測定した。下記の結果を得た。

針葉樹： ％ＩＳＯ白色度　カッパー低下　粘度 ブランク　８１．１　３８　８９１ エンドｌ　８３゜３　５０　９６８ エンドＩ＋　８３．９　４３　８９１ Ｌｙｘ　６８　８２．２　４８　８８５広葉樹： ％１３０白色度　カッパー低下　粘度 ブランク　７１．７　５５　９００ エンド１　７３．０　５９　９１４ エンドＩＩ　７５．７　６１　８５９ ＬＶ１６８　７４．６　６２　８８８ 上記の結果は、ＴＣＰ方法におけるエンドＨの使用が、広葉樹バルブ及び針葉樹 バルブを使用する場合の両方で白色度のかなりの増大をもたらすことを示す。そ の効果は、広葉樹２．８％よりも針葉樹４．０％で更に大きい。更に、その効果 は、エンド■またはり、ｙｘ　６８を使用する場合よりも大きい。

色度を測定し、酵素を省いた漂白順序と比較した。下記の酵素濃度を使用した。

０；　１００；　１７５；　２５０；　４００；　５５０；　１１００　Ｕ／ｇ ／＜ルブ。

使用したバルブは２２，４のカッパー価及び２１．２　ｍＰａ、　ｓの粘度を有 していた。

下記のプロトコルを使用した。

酵素工程、温度、℃５１ Ｘ　時間、分　１２０ 洗浄工程、温度、℃　周囲温度 Ｗ　時間、分　ｌ０ ＤＩ　１１０段階、温度、’Ｃ５０ 時間、分　４０ コンシステンンー、％　３．５ ｐ１１（最終）２．２ 用量、バルブに対するＣｌＯ２％　１．８７Ｅ段階、　温度、℃７０ 時間、分　６０ コンシスチン／−１％　１０ ｐＨ１０，６−１１，８ 用量、ＮａＯＨ（バルブに対する％）０．８Ｄ段階、　温度、℃７０ 時間・分　１８０ コンシスチンシー、％　１Ｏ ｐＨ（最終）３．７ 用量、バルブに対するＣＩＯ，％　２．０１００　８３、１ １７５　８３、５ ２５０　８４、０ ４００　８４、０ ５５０　８３、６ １１００　８４．７ エンド■１はバルブの白色度に対してかなりの効果を有するものと再度結論し得 る。最適の用量は１７５〜５５０υ／ｇバルブの範囲である。

引用文献 Ａｍｏｎｓ、Ｒ，（１９８７）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ、ｔ、、　２１２．６８−７ ２Ａｖｉｖ、１１．及びＬｅｄｅｒ、Ｐ、　（１９７２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　６９．１４０８−１４１２Ｂｉｅｌｙ、Ｐ、、 　Ｍｉｓｌｏｖｉｃｏｖａ、Ｄ、及びＴｏｍｎ、Ｒ，（１９８５ａ）　Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｒ、ｈｅ＆１４４．１４２−１S６ １３ｉｃｌｙ、Ｐ、、　Ｍａｒｋｏｖｉｃ、０．及ｎ１ｓｌｏｖｉｃｏｖａ、Ｄ 、　（１９８５ｂ）　Ａｎａｌ、ＢｉｏｃｈｅＢ　１４４．P４７− Ｂｏｅｌ、　Ｅら（１９８４１）　ＥＭＢＯＪ、、　３．１０９７−１１０２Ｂ ｏｅｌ、Ｅ、ら（１９８４ｂ）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　４．２３０ ６−２３１５Ｃａｒｒｅ、　Ｂ、及びＢｒ１ｌｌｏｕｅｔ、Ｊ、ｌｔ　（１９８ ６）　Ｊ、５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、、　３７．R４１ −３５１ Ｃａｔｈａｌａ、Ｇ、、　５ａｖｏｕｒｅｔｊ−Ｆ、、　Ｍｅｎｄｅｚ、Ｂ、、 　Ｗｅｓｔ、Ｂ、Ｌ、、にａｒｉｎ、に、　ＭａｒｔｉａｌAＪ、Ａ、。

Ｂａｘｊｅｒｊ、Ｄ、（１９８３）　ＤＮＡ、２．　３２９−３３５Ｃｈｅｓｓ ｏｎ、ん　（１９８７）　Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　八ｎ１ｍ１ ａｌ　Ｆｏｏｄ　Ｎｕけ１ｔｉｏｎ、ｌ（ａｒｅ唐奄■氏AＷ。

及びＣｏ１ｅ、　Ｄ、　Ｊ、九編集、　Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｌｈ、　Ｌｏｎｄｏ ｎ、　７ｌ−８９Ｃｏｖｅ、Ｄ、　（１９６６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、Ａｃｔａ、１１３．５ｌ−５６Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｒ，Ｆ、ん及びＲｉｃｈ ａｒｄｓ、ＧｊＬ　（＋９７７）　Ａｄｖ、Ｃａｒｂ、Ｃｈｅｉａｎｄ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、、　３Q゜ Ｅｈｒｌ　ｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、、編集（１９８９）　ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ盾獅刀@ｆｏｒ ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ ｅｗ　ＹｏｒｋＧｏｏｓｅｎ、Ｔ、、　ＢＩｏｅｍｈｅｕｖｅｌ、Ｇ、、　Ｇｙ ｓｌｅｒ、Ｃ，、ｄｅ　Ｂｉｅ、Ｄ、Ａ、、　ｖａｎ　ｄｅｎ　ＢｒｏｅｋAＨ ，Ｗ、Ｊ。

及びＳｗａｒｔ、に、（１９８７）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、、　１１．４９９ −５０３Ｇａａｓｅｎ、Ｔ、、　ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌｅｎｂｕｒｇ、Ｆ、、　Ｄ ｅｂｅｔｓ、Ｆ、、　Ｓｗ；ｓｒｔ、に、、　Ｂｏｓ、に、及びｖａ氏@ｄｅｎ 　Ｂ− ｒｏｅｋ、ｌ（、Ｗ、Ｊ、　（１９８９）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、、　 ２１９．２８２−２８８ｄｃＧｒａａｆｆ、Ｌ、Ｈ，、ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏ ｅｋ、ＩＬＷ、Ｊ、及びＶｉｓｓｅｒｊ、　（１９８８）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅ ｔ、A　１３゜ Ｇｕｒｒ、Ｓ、Ｊ、、　Ｕｎｋｌｅｓ、Ｓ、Ｅ、及びＫｉｎｇｈｏｒｎ　Ｊ、Ｒ ，（１９８７）　Ｇｅｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ｌIｕｋａｒｙ− ｏｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｅｓ、　２２巻、　Ｋｉｎｇｈｏｒｎ、Ｊ、Ｒ，、編集 、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　９３−１３９１１ａｎａｈａｎ、Ｄ 、（１９８３）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、！６（ｉ、５５７Ｋｃｌｌｙ、Ｊ、 及びＨｙｎｅｓＪＬ　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、　４．４７５−４７９Ｋｏｒ ｍｅｌｉｎｋ、Ｆ、Ｊ、＆Ｌ（１９９２）ＤｏｃｔｏｒａｌＴｈｅｓｉｓ、Ａｇ ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗａｇ■氏| ｉｎｇｅｎ、ｔｈｅ　ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＫｕｓｔｅｒｓ−ｖａｎ　Ｓｏｍ ｅｒｅｎ、Ｍ、Ａ、、　Ｓａｍｓｏｎ、えん及びＶｉｓｓｅｒ、Ｊ、　（１９９ １）　Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅ煤A。

１９、　２１ Ｌａｅ＋ｍｌｉ、Ｕ、に、　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０− ６８５Ｌｅａｔｈｅｒｓ、Ｔ、Ｄ、、　Ｋｕｒｔｚｍａｎ、Ｃ，Ｐ、、　Ｄｅｔ ｒｏｙ、Ｒ，Ｗ、　（１９８４）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｂｉｏ■獅■AＳｙ ｍｐ、。

１４、２２５ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｈ，Ｆ、、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 Ｊ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇA＾Ｌａｂｏ− ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＭａｔｓｕｄａｉｒａ、Ｐ、　（１９８ ７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅｌＬ、　２６２．１００３５−１０１０Ｏ３５−１ ００３８，Ｂ、　Ｖ、及びＭａｔｈｅｓｏｎ、Ｎ、に−（１９８６）　Ａｄｖ、 Ｃａｒｂ、Ｃｈｅａａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｕ、　４S゜ Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［！ｎｚｙ＋Ｉ ＩＯ１ｏｇｙ、　ｌ０ＩＣ，２０−７８Ｍｏｏｎｅｎ、　Ｊ、　）Ｌ　Ｅ、、　 ５ｃｈｅｅｐｓｔｒＬＡ、　、　Ｇｒａｖｅｌａｎｄ、ん（１９８２）　Ｅｕｐ ｈｉｔｉｃａ、　３P．６７７ Ｍｕｒｒａ、ｙ、Ｎ、　（２９７７）　Ｍｏ１．ＧｅｒｔＧｅｎｅｔ、、　２５ ０．５３−５８Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、　、　Ｋｅｍｐｅ、　Ｔ、及麹ｅｓ ｓｉｎｇ、Ｊ、　（１９８３）　Ｇｅｎｅ、　２６．１０１−１０６Ｐｏｕｔａ ｎｅｎ、　Ｋ、及びＰｕ１ｓ、Ｊ、　（１９８８）　Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　２８．４２５Ｓａｆｋｉ、　Ｒ，Ｋ、ら（１ ９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９．４１３７−４９１Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ 、、　Ｆｒ［ｔｓｃｈ、Ｒ，Ｆ、、　ｉ！ａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　（１９８９） 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ■F　ａ　Ｌａｂｏ− ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、−第二編、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　臂Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、　Ｎ１ｃ ｋｅｌｅｎ、Ｓ、及びＣｏｕｌｓｏｎ、んＲ，（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ■V４゜ Ｔｉ　１ｂｕｒｎ、　Ｊら（１９８３）　Ｇｅｎｅ、　２６．２０５−２２１Ｖ ａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏａｃｋ、　ＬＣ，ら（１９９２）欧州特許出願第９１２０ ５９４４．５号、公開番号０４６３７０６ｔ Ｖｉｅｉｒｒａ、　Ｊ、及′ＣｆＭｅｓｓ　ｉｎｇｌ　Ｊ、（１９８２）　Ｇｅ ｎｅ、　１９．２５９−２６８Ｖｉｓｎｉａｃ、Ｗ、及びＳａ、ｎｔｅｒ、１ｔ （１９５７）　［１ａｃｔ、Ｒｅｖ、、　２ｆ、　１９５−２１３Ｗｅｒｎａｒ ｓ、に、　（４９８６）　Ｔｈｅｓｉｓ、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＵｎＩ ｖｅｒｓｊｔｙ、　Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、　狽■■@Ｎｅｔｈ− ｅｒｌａｎｄｓ Ｗｏｎｇ、　Ｋ、に、　Ｙ、ら（１９８８）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、、 　５２．３０５−３１７ｆｏｏｄｗａｒｄ、Ｇ、　（１９８４）　Ｔｏｐｉｃｓ 　ｉｎ　ｆ’ｎｚｙ＋ｏｅ　Ｆｅｒｍｎｔ、８ｉｏＬｅｃｈｎｏ１．、８．９− ３０Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、及ｎｅｓｓｉ ｎｇ、Ｊ、　（１９８５）　Ｇｅｎｅ、　３３．１０３−１゜配列表 ０９　（１）一般情報： （ｉ）出願人： （＾）名称：ギストーブロヵデスＢ、　Ｖ。

（Ｂ）通り：ワーテリングセウェーグｌ（の都市：デルフト （１１）国：オランダ （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ　）　：　２６１１　ＸＴ（１、発明の名称：キシラナ ーゼＢのクローニング及び発現（ｉｉｉ）配列の数＝８ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形態：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（の操作システム：　ＰＣ −ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ５ＣＤ）ソフトウェア：パテントイン　リリーズ旺０、バ ージジン旺２５（ＢＰＯ）（２）配列番号Ｉの情報： （Ｄ配列の特徴： （Ａ）長さ＋１９のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状（ｌｉｎｅａｒ）（ｉ　＋）分子の型：ペプチド （ｉｉｉ）仮定（ｌｆｆＰＯＴＨＥＴｌｃＡＬ）　：　Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：式１ ％式％）： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）位置：　（１，１０，Ｉｓ、　１６．１７．１８．１９）　ノーッ（Ｄ） その他の情報：／標識＝Ｘ ／注＝“Ｘは下記の最も可能な帰属を有する：　］＝Ｓｅｒ　、］０＝Ａｓｎ、 １５＝ｓｅｒ、　１６＝Ｐｈｅ、　１７＝Ｔｒｐ、１８＝Ｔｈｒ、　１９＝Ａｓ ｐ”（ｘｊ）配列の記載：配列番号ｌ： Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　 Ｘａａ　Ｇａｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　ＸｕＸａａ　Ｘａａ　Ｘａ ａ （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＋２０のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （の鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｉｉｉ）仮定二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：Ｎ末端 （ｖｉ［）直接の起源： （Ｂ）クローン：式２ ％式％）： （Ａ）名称／記号：ペプチド （Ｂ）位置：　（１，２，３，７，１０，１，５，１８，１９，２０）の一つ（ Ｄ）その他の情報：／標識＝Ｘ ／注＝“位置に関するオルタナティブ帰属１：ＧＩｙ　、２：Ｇｌｙ、３：Ｇｌ ｙ　、　７：Ｔｈｒ　ＱＸに関する可能な帰属：　１ｏ＝Ａｓｎ。

１５＝ｓｅｒ、１８４ｈｒ、１９：＾ｓｐ、　２０＝ＧＩｙ”（ｘｉ）配列の記 載、配列番号２： Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　 Ｘｕ　Ｘｕ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｐｈｅｌ　５　１０　１５ Ｘｕ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ （２）配列番号３の情報。

（＋）配列の特徴： （Ａ）長さ＋２０の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （の鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二車線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮定二Ｎ。

（ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：式３ ％式％）： （Ｄ）その他の情報：／標識−Ｎ ／注＝“位置３．６、及び１５のＮはイノシンである２（ｘｉ）配列の記載：配 列番号３： ＡＣＮＧＧＮＧＡＲＡ　ＡＹＧＧＮＴＴＹＴＡ（２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＋２１の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （の鎖の数コー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）分子の型二ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定：Ｎ。

（ｖｉ　ｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：式４ （ｘｉ）配列の記載：配列番号４； ＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴ　ＣＧＡＣＴＡＣＴＧＡ　Ｃ（２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝３９の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮定：Ｎｏ （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン二式５ （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： ＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴ　ＣＧＡＣＴＡＣＴＧＡ　Ｃ刊−”ｒｒｒｒｒ百ηＴ了■ （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の型：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮定、Ｎｏ （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン：式６ （ｘｉ）配列の記載：配列番号６： ＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣ （２）配列番号７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＋　２２２２の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）分子の型・ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮定：Ｎｏ （ｖｉ）起源・ （Ａ）生物・アスペルギルス・ツビゲンシス（Ｂ）株：　ＤＳ１６８１３ （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／記号：エキソン （Ｂ）位置：　９０５．　、１１８２ （１ｘ）特徴 （Ａ）名称／記号　イントロン （Ｂ）位置：　］　１８３．　、　＋２４９（ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／記号・エキソン （Ｂ）位置：　１２５０．　、１６４６（ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／記号：　Ｃ０５ （Ｂ）位置：接合点（９０５，，１ｌＢ２．１２５０．．１６４６）（Ｄ）その 他の情報：／コドン開始＝９０５／生産物＝“前駆体キシラナーゼＢ″ ／遺伝子＝“ｘｌｎＢ″ （ｘｉ）配列の記載、配列番号７： Ｃ，＝ン、ＬｒＣ；：Ｃ−Ｚ工てλごこニミ　、　スズ＝６λｃ：τＡＴλｃ＝ ：、ｃ＝、ｃ　ｃｒ；：ｒｃ；こａこ３α＝スＩ口：ｏλ３@ε０ ＣυＪＣス；ＪでＴ＝−−λ−に＝ＡＯｗζｚ　λＰシー函Ａｃλｃｍ　−￥χ ＝：ｒｃｒｒ　ｔ−（２）配列番号８の情報： （１）配列の特徴。

（Ａ）長さ・２２５のアミノ酸 ＣＢ）型二アミノ酸 （Ｏ）トポロジー二車線状 （ｉ　ｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載二配列番号８： Ｐｉｑｚに０１ ？ｉ廖ぼＯコ ＡＴＣＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣＧＡＣ４ＣＧＣＡＣＣＡＣＴＡＴＣＣ５ＡＧＧＧＡ ＴＡＣＣＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＴＴＧ７ＡＧＣフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｎ　９／２４ Ｃ１２Ｒ１：６８５） （Ｃ１２Ｎ　９／２４ Ｃ１２Ｒ１：６６） （７２）発明者　ド　グラーフ　レーンデルドヘンドリック オランダ国　エフエル−６８６２セーカー　オースチルベーク　コルネリス　コ ーニングストラード　８ Ｉ （７２）発明者　ファン　デン　ブルーフ　へンリエツテカタリーナ オランダ国　エフエル−６フ１３エヌカー　エーゾ　アンチ　ファン　プレンラ ーン４８（７２）発明者　フィッセル　ヤコブ オランダ国　エフエル−６フ０３セーカー　ワ一へニンゲン　ヒンケロールドセ ウェーグ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ配列が ａ）図２に記載された菌類源のＤＮＡ…配列；ｂ）パートａ）の配列の遺伝変異 体； ｃ）上記のパートａ）及びｂ）の配列のいずれか一つにハイブリダイズし得るＤ ＮＡ配列 ｄ）図２に記載されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列ｅ）アスペルギルス ・ツビゲンシスに由来するＸＹＬＢをコードするＤＮＡ配列からなる群から選ば れることを特徴とするアスペルギルス・ツピゲンシスＸＹＬＢ酵素の活性を有す るポリペプチドをコードする精製され、単離されたＤＮＡ配列。
2. ２．適当な発現宿主中でキシラナーゼ活性を有するポリペプチドの過剰発現を誘 導し得る調節領域に操作により連結された請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列 を含むことを特徴とするＤＮＡ構築物。
3. ３．調節領域が下記の特徴：アミログルコシダーゼ遺伝子に由来するプロモータ ー及びキシラナーゼ遺伝子に自生のプロモーターからなる群から選ばれたプロモ ーター；アミログルコシダーゼ遺伝子に由来する分泌リーダー配列及びキシラナ ーゼ遺伝子に自生の分泌リーダー配列からなる群から選ばれた分泌リーダー配列 の一つ以上を含むことを更に特徴とする請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ構築物 。
4. ４．微生物宿主が請求の範囲第２項に記載の発現構築物を含むことを特徴とする アスペルギルス・ツビゲンシスＸＹＬＢ酵素の活性を有するポリペプチドを過剰 発現できる形質転換された微生物宿主。
5. ５．微生物宿主がアスペルギルス、クルイベロセス、トリコデルマ、サッカロミ セス及びバチルスからなる属から選ばれることを更に特徴とする請求の範囲第４ 項に記載の形質転換された微生物宿主。
6. ６．ａ）ＸＹＬＢ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導す る条件下で請求の範囲第４項に記載の微生物宿主を培養する工程、及びｂ）ＸＹ ＬＢ活性を有するポリペプチドを回収する工程を特徴とするキシラナーゼ活性を 有するポリペプチドの過剰発現方法。
7. ７．ポリペプチドが請求の範囲第６項に記載の方法により産生されることを特徴 とするＸＹＬＢ活性を有するポリペプチド。
8. ８．キシランを含む基質の分解における請求の範囲第７項に記載のＸＹＬＢ活性 を有するポリペプチドの使用。
9. ９．ｐＩＭ１７０（ＣＢＳ６２９．９２）。
10. １０．アスペルギルス・ツビゲンシスｘｌｎＢ遺伝子の５′非コード配列中に見 られる精製され、単離された発現及び転写調節領域。
11. １１．請求の範囲第１項に記載のＤＮＭ配列によりコードされた酵素を使用する 酸素工程が使用されることを特徴とする全塩素不含パルプ漂白順序。
12. １２．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列によりコードされた酵素を使用する 酵素工程が使用されることを特徴とする元素状塩素不含パルプ漂白順序。
13. １３．下記の工程： 酵素インキュベーション（Ｘ）、洗浄（Ｗ）、キレート化（Ｑ）及び過酸化物漂 白（Ｐ）を表すＸ■ＱＰにより表される全塩素不含（ＴＣＦ）漂白順序であって 、工程Ｘで使用される酵素が請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列によりコード されることを特徴とする全塩素不含漂白順序。
14. １４．酵素インキュベーション（Ｘ）、二酸化塩素（Ｄ）及びアルカリ抽出（Ｅ ）を表すＸＤ１００ＥＤにより表される元素状塩素不含（ＥＣＦ）漂白順序であ って、工程Ｘで使用される酵素が請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ配列によりコ ードされることを特徴とする元素状塩素不含漂白順序。