CN118002097A - 一种用于去除脂蛋白a的吸附剂及其制备方法和灌流器 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂及其制备方法和灌流器，该用于去除脂蛋白a的吸附剂以聚丙烯酸树脂作为载体，通过在载体上引入胺基，并由胺基与肝素通过酰胺化反应而形成；肝素设置在吸附剂的外层，聚丙烯酸树脂设置在吸附剂的内层，胺基作为连接臂，连接肝素和聚丙烯酸树脂。本发明提供的吸附剂通过双重吸附作用对脂蛋白a进行特异性吸附，对脂蛋白a的吸附率高，能够有效降低血液中的脂蛋白a。
Description
技术领域
本发明涉及体外血液净化技术领域，具体而言，涉及一种用于去除脂蛋白a的吸附剂及其制备方法和灌流器。
背景技术
脂蛋白a(lipoprotein(a),简称Lp(a))是一种在肝脏合成的脂蛋白颗粒，电镜下呈圆球型，密度为1.006g/mL至1.125g/mL，直径为25nm至30nm。理想化的Lp(a)颗粒主要由一个被载脂蛋白B-100(ApoB-100)所包绕的低密度脂蛋(low density lipoprotein,简称LDL)样脂质核心组成，并通过一个二硫键与特异性的载脂蛋白(a)(apolipoprotein(a)，简称Apo(a))相连。与LDL不同，Lp(a)不能由极低密度脂蛋白(VLDL)转化而来，也不能转化为其他脂蛋白，是一类独立的由肝脏合成的脂蛋白。
Lp(a)水平主要由遗传决定，并受LPA基因变异大小的影响，较小的同工型导致载脂蛋白a的合成速率更高，最终导致Lp(a)水平升高。因此，血清Lp(a)水平可能从极低到极高变化很大，浓度可分布在0.1mg/dL至300mg/dL(即0.2nmol/L至750nmol/L)之间，在正常情况下，其浓度水平保持相对稳定，小于30mg/dL或75nmol/L为正常水平，高于30mg/dL或75nmol/L水平ASCVD风险增加。大量的研究证实了Lp(a)升高会促进局部炎症，并且Lp(a)值升高与IL-6和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平升高相关；此外，Lp(a)通过促进单核细胞组织因子(tissue factor,TF)的表达进而激活凝血酶、抑制组织因子通路抑制剂、促进血栓形成前蛋白表达增强凝血酶受体激活肽SFLLRN介导的血小板聚集和颗粒释放等途径发挥促血栓的作用。并且随着研究的深入，国内、外大量的专家共识及指南均表明，与LDL-C相比，血浆Lp(a)浓度与ASCVD(动脉粥样硬化性心血管疾病)，脑卒中及AVS(主动脉瓣狭窄)等疾病发生率之间存在显著的关系，血浆Lp(a)浓度升高是ASCVD、脑卒中及AVS等疾病的独立危险因素。
但是现有技术中，尚无有效降低血液中Lp(a)的药物或方法，导致临床对高Lp(a)患者束手无策。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中尚无有效手段降低血液中Lp(a)的问题。
为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂，所述吸附剂以聚丙烯酸树脂作为载体，通过在所述载体上引入胺基，并由胺基与肝素通过酰胺化反应而形成；
所述肝素设置在所述吸附剂的外层，所述聚丙烯酸树脂设置在所述吸附剂的内层，所述胺基作为连接臂，连接所述肝素和所述聚丙烯酸树脂。
进一步地，所述吸附剂上所述肝素的固定率为0.05mg/mL至1mg/mL。
本发明第二方面提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，用于制备如第一方面所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂，所述制备方法包括如下步骤：
对载体进行活化反应，制得活化后的载体，所述载体为聚丙烯酸树脂；
对所述活化后的载体进行胺化反应，在所述载体上引入胺基，制得胺化后的载体；
将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上，制得所述吸附剂。
进一步地，所述对载体进行活化反应，制得活化后的载体，包括：
将聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜混合均匀，在25℃至50℃下进行活化反应，制得活化后的载体；
所述聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的体积比为10:(1至2):(2至4):(3至6)，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L至5mol/L。
进一步地，所述对所述活化后的载体进行胺化反应，在所述载体上引入胺基，制得胺化后的载体，包括：
依次向所述活化后的载体中加入纯化水和胺化试剂，在25℃至50℃下进行胺化反应，在所述载体上引入胺基，制得胺化后的载体；
所述活化后的载体和所述胺化试剂的体积比为10:(2至5)，所述胺化试剂为乙二胺、己二胺、甲基丙烯酰氧乙基、聚乙烯亚胺和N-甲基二乙醇胺中的至少一种。
进一步地，所述制得胺化后的载体之后，将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应之前，还包括：
用纯化水反复清洗所述胺化后的载体，直至清洗液的pH值小于或等于8。
进一步地，将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上，包括：
将胺化后的载体和肝素盐，在活化剂的作用下，于缓冲液中进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上，所述胺化后的载体和所述缓冲液的体积比为1:1，所述酰胺化反应的温度为4℃至37℃，所述酰胺化反应的时间为12h至24h，所述缓冲液的pH值为2至5。
进一步地，所述活化剂用于对所述肝素盐进行活化，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，所述肝素盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:(1至4):(1至8)，所述肝素盐的浓度为5mg/mL至20mg/mL；
所述吸附剂上所述肝素的固定率为0.05mg/mL至1mg/mL。
进一步地，所述将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上之后，制得所述吸附剂之前，还包括：
用95％酒精清洗酰胺化反应产物后，再用纯化水清洗酰胺化反应产物，制得所述吸附剂。
本发明第三方面提供了一种灌流器，包括如第一方面所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂，或者包括由第二方面所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法所制备的吸附剂，所述灌流器用于血液体外循环去除脂蛋白a。
本发明所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂及其制备方法和灌流器，以聚丙烯酸树脂作为载体，聚丙烯酸树脂表面具有大量的活性基团羧基，便于对载体进行胺化，在载体上引入胺基，通过酰胺化反应将胺基与肝素连接，使聚丙烯酸树脂和肝素两者结合牢固，有利于保证吸附剂的使用安全性，并且聚丙烯酸树脂具有较好的血液相容性和较高的机械强度，有利于该吸附剂与血液中的脂蛋白a结合，提高该吸附剂的吸附性能；肝素接枝在聚丙烯酸树脂的外层，肝素中含有大量的羧基和磺酸基，羧基和磺酸基带负电荷，与带正电荷的Lp(a)通过静电相互作用结合，实现对Lp(a)的吸附，并且肝素中的羧基和磺酸基还可以通过特异性结合ApoB-100三维结构中独有的肝素结合区域，从而提供更大的空间实现对Lp(a)的吸附。本发明提供的吸附剂通过双重吸附作用对Lp(a)进行特异性吸附，对Lp(a)的吸附率高，能够有效降低血液中的Lp(a)；此外，本发明提供的吸附剂还能够吸附LDL，有效降低LDL在血液中的浓度。
本发明提供的制备方法，反应步骤较少，制备过程简单，反应条件温和，反应过程中的安全性较高，生产成本较低，适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例提供的制备用于去除脂蛋白a的吸附剂的工艺流程图。
具体实施方式
现有技术中，尚无有效降低血液中Lp(a)的药物或方法，虽然有些吸附剂能够吸附脂蛋白a(Lp(a))，如专利CN109248668A中提供的用于血液体外循环去除LDL的吸附剂，但是该吸附剂无法对Lp(a)进行特异性吸附，仅对LDL有较好地吸附效果，对Lp(a)的吸附率不佳，对血液中的Lp(a)的降低作用有限。这是因为Lp(a)和LDL的结构不同：Lp(a)的密度为1.006g/mL至1.125g/mL，直径在25nm至30nm，主要由一个被ApoB-100所包绕的LDL样脂质核心组成，并通过一个二硫键与特异性的Apo(a)相连，其中，Apo(a)几乎完全在肝细胞内合成，Lp(a)可能在肝细胞内、狄氏间隙或血液循环中进行组装，组装过程包括Apo(a)对接至LDL，然后在Apo(a)的KⅣ9和LDL的ApoB之间形成共价二硫键，此过程是否可逆尚不清楚。而LDL密度范围为1.019g/mL至1.063g/mL，直径在22.0nm至28.5nm,是由蛋白质成分(主要成分为一分子ApoB-100)和脂质成分相互镶嵌和缠绕所构成。
为了解决现有技术中尚无有效手段降低血液中Lp(a)的问题，本发明提出了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂及其制备方法和灌流器，该吸附剂能够用于血液体外循环去除Lp(a)，且该吸附剂能够特异性吸附Lp(a)，对Lp(a)的吸附率高，能够有效降低血液中的Lp(a)。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
另外，术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。
此外，本发明虽然对制备中的各步骤进行了如S110、S120、S130等形式的描述，但此描述方式仅为了便于理解，如S110、S120、S130等形式并不表示对各步骤先后顺序的限定。
本申请的实施例第一方面提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂，该吸附剂以聚丙烯酸树脂作为载体，通过在载体上引入胺基，并由胺基与肝素通过酰胺化反应而形成；该吸附剂的外层设置为肝素，内层设置为聚丙烯酸树脂，胺基作为连接臂，连接肝素和聚丙烯酸树脂。
本实施例提供的吸附剂，以聚丙烯酸树脂作为载体，聚丙烯酸树脂表面具有大量的活性基团羧基，便于对载体进行胺化，在载体上引入胺基，通过酰胺化反应将胺基与肝素连接，使聚丙烯酸树脂和肝素两者结合牢固，有利于保证吸附剂的使用安全性，并且聚丙烯酸树脂具有较好的血液相容性和较高的机械强度，有利于该吸附剂与血液中的脂蛋白a结合，提高该吸附剂的吸附性能；肝素接枝在聚丙烯酸树脂的外层，肝素中含有大量的羧基和磺酸基，羧基和磺酸基带负电荷，与带正电荷的Lp(a)通过静电相互作用结合，实现对Lp(a)的吸附，并且肝素中的羧基和磺酸基还可以通过特异性结合ApoB-100三维结构中独有的肝素结合区域，从而提供更大的空间实现对Lp(a)的吸附。本实施例提供的吸附剂通过双重吸附作用对Lp(a)进行特异性吸附，对Lp(a)的吸附率高，能够有效降低血液中的Lp(a)。此外，本实施例中提供的吸附剂还能够吸附LDL，降低LDL在血液中的浓度。
本实施例中，聚丙烯酸树脂的粒径为70μm至100μm，孔径范围为30nm至40nm，而Lp(a)分子尺寸为25nm至30nm，由此，聚丙烯酸树脂的稳定性好，选择尺寸合适且可控的聚丙烯酸树脂能够将大分子物质如高密度脂蛋白、球蛋白和白蛋白等阻挡在载体之外，只有大小合适的目标物质才能通过载体，从而能够实现对Lp(a)的特异性吸附；并且聚丙烯酸酯具有良好地稳定性，有利于提高吸附剂的稳定性，从而确保吸附剂对Lp(a)吸附的稳定性。
本实施例中，该吸附剂上肝素的固定率为0.05mg/mL至1mg/mL，即每1mL吸附剂的肝素表面固定量为0.05mg至1mg。由此，能够确保吸附剂上接枝有较多的肝素，有利于提高对Lp(a)的吸附率，从而进一步有效降低血液中的Lp(a)。
图1为本申请的实施例中提供的制备用于去除脂蛋白a的吸附剂的工艺流程图。结合图1所示，本申请的实施例第二方面提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110、对载体进行活化反应，制得活化后的载体，载体为聚丙烯酸树脂。
具体地，将聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜混合，加热搅拌均匀，进行活化反应，制得活化后的载体，活化反应的温度为25℃至50℃，活化反应的时间为2h至4h。由此，在25℃至50℃的恒温环境下进行活化反应，有利于提高聚丙烯酸树脂的反应活性，使聚丙烯酸树脂上具有更多的活性基团。
其中，聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的体积比为10:(1至2):(2至4):(3至6)，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L至5mol/L，由此，通过控制氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的用量，有利于对聚丙烯酸树脂进行充分活化，有利于后续接枝肝素；并且环氧氯丙烷的用量较少，有利于提高吸附剂在后续使用过程中的安全性。
在步骤S110之前还包括对聚丙烯酸树脂进行清洗，具体地，用95％的酒精搅拌清洗聚丙烯酸树脂，重复两次后，再用纯化水清洗聚丙烯酸树脂，重复清洗五次后，得到清洗后的聚丙烯酸树脂。由此，避免聚丙烯酸树脂表面或孔内的杂质影响聚丙烯酸树脂接枝肝素，以及影响吸附剂的使用安全性。
步骤S120、对活化后的载体进行胺化反应，在载体上引入胺基，制得胺化后的载体。
具体地，依次向活化后的载体中加入纯化水和胺化试剂，加热搅拌均匀，进行胺化反应，在载体上引入胺基，制得胺化后的载体，胺化反应的温度为25℃至50℃，胺化反应的时间为1h至2h。由此，在25℃至50℃的恒温环境下进行胺化反应，有利于对胺化试剂对载体上的活性基团进行胺化，提高载体上胺基的接枝率，便于后续接枝肝素。
其中，活化后的载体和胺化试剂的体积比为10:(2至5)，胺化试剂为乙二胺、己二胺、甲基丙烯酰氧乙基、聚乙烯亚胺和N-甲基二乙醇胺中的至少一种。由此，通过胺化试剂的用量，有利于对聚丙烯酸树脂上的活性基团充分胺化，有利于载体上胺基的接枝率。
在步骤S120制得胺化后的载体之后，还包括：胺化反应结束后，将反应液排空，用纯化水反复清洗胺化后的载体，直至清洗液的pH值小于或等于8。由此，能够避免胺化试剂残留，后续影响胺化后的载体接枝肝素，或者影响肝素的反应活性。
步骤S130、将胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至聚丙烯酸树脂上，制得吸附剂。
具体地，将胺化后的载体和肝素盐，在活化剂的作用下，于缓冲液中进行酰胺化反应，使肝素接枝至聚丙烯酸树脂上，酰胺化反应的温度为4℃至37℃，酰胺化反应的时间为12h至24h。由此，通过活化剂对肝素盐进行活化后，得到具有活性的肝素，肝素与载体表面的胺基通过酰胺化反应连接在一起，从而在聚丙烯酸树脂表面接枝肝素，得到以聚丙烯酸树脂为载体，表面接枝肝素的阳离子交换树脂；在4℃至37℃下进行酰胺化反应，能够保证肝素具有较高的反应活性，有利于载体表面的胺基接枝肝素的接枝率。
其中，活化剂用于对肝素盐进行活化，活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(简称EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)，且肝素盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:(1至4):(1至8)，由此，能够保证活化剂具有较好地活化性能。
缓冲液为酸性缓冲液，较佳地，缓冲液的pH值为2至5，胺化后的载体和缓冲液体积比为1:1，由此，能够保证接枝肝素时具有较高的反应活性，且缓冲液设置在该pH值范围内，还能够避免破坏肝素的活性，使肝素保持较高的活性，有利于提高肝素对Lp(a)的吸附率。作为一种可选实施方式，缓冲液为柠檬酸钠缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种。
肝素盐溶于胺化后的载体和缓冲液的混合液中，且混合液中肝素盐的浓度为5mg/mL至20mg/mL，肝素盐为肝素钠、肝素钙、肝素钾和肝素锂中的至少一种，作为一种可选实施方式，肝素盐为肝素钠，肝素钠可以为市售的药用级低分子肝素钠或市售的药用级普通肝素钠。
在步骤S130中将胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至聚丙烯酸树脂上之后，制得吸附剂之前，还包括：用95％酒精清洗酰胺化反应产物，重复2至5次后，再用纯化水清洗酰胺化反应产物，重复3至6次，制得吸附剂。由此将吸附剂表面的杂质清洗干净，避免影响吸附剂的吸附性能。
本实施例的吸附剂通过甲苯胺蓝比色法测定肝素固定率，即将步骤S130中制得的吸附剂用甲苯胺蓝染色后，在625nm处检测紫外吸光度，并经过定量计算后，得到该吸附剂上肝素的固定率，也即，每1mL吸附剂的肝素表面固定量。
具体地，通过甲苯胺蓝比色法测定将0.01g甲苯胺蓝溶于250mL生理盐水得到浓度为0.004％甲苯胺蓝TB溶液。取已知量的2mL肝素溶液加入3mL上述TB溶液中混合均匀，然后加入3mL正己烷，充分涡旋将络合物萃取至有机相，未络合TB留在水相并检测波长630nm处的吸光度，绘制标准曲线。随后将1mL吸附剂在2mL生理盐水、3mLTB溶液中浸泡30分钟，加入3mL正己烷涡旋萃取，测水相630nm处吸光度，根据标准曲线计算得到1mL吸附剂的肝素表面固定量。
本实施例中，依次通过活化、胺化和酰胺化反应，在聚丙烯酸树脂表面接枝肝素，得到以聚丙烯酸树脂为载体，表面接枝肝素的阳离子交换树脂，聚丙烯酸树脂具有较好的血液相容性和较高的机械强度，有利于该吸附剂与血液中的脂蛋白a结合，提高该吸附剂的吸附性能；肝素接枝在聚丙烯酸树脂的外层，肝素中含有大量的羧基和磺酸基，羧基和磺酸基带负电荷，与带正电荷的Lp(a)通过静电相互作用结合，实现对Lp(a)的吸附，并且肝素中的羧基和磺酸基还可以通过特异性结合ApoB-100三维结构中独有的肝素结合区域，从而提供更大的空间实现对Lp(a)的吸附。本实施例制备得到的吸附剂通过双重吸附作用对Lp(a)进行吸附，对Lp(a)的吸附率高，能够有效降低血液中的Lp(a)，并且该吸附剂还能够吸附LDL，降低LDL在血液中的浓度；此外，本实施例中提供的制备方法，反应步骤较少，制备过程简单，反应条件温和，反应过程中的安全性较高，生产成本较低，适合工业化生产。
本申请的第三方面提供一种灌流器，该灌流器包括如上所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂，或者包括如上所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法所制备的吸附剂，本实施例中提供的灌流器用于血液体外循环去除脂蛋白a，有效降低血液中的Lp(a)，可对临床急需降低Lp(a)的患者进行治疗，从而有效降低ASCVD、脑卒中及AVS等疾病的危害。
为了对本发明进行进一步详细说明，下面将结合具体实施例对本发明进行进一步说明。本发明中的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；本发明中的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为市场购买所得。
实施例1
本实施例提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取40mL聚丙烯酸树脂放入1L烧杯中，用5倍95％的酒精搅拌洗涤15min，重复清洗2次后，再用聚丙烯酸树脂体积10倍的纯化水清洗聚丙烯酸树脂，重复清洗5次后，得到清洗后的聚丙烯酸树脂；将清洗后的聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜加入三口烧瓶中，并以120rpm的转速在50℃下进行活化反应，活化反应时间为3h，制得活化后的载体，其中，聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的体积比为5:1:2:3，氢氧化钠溶液的浓度为4mol/L。
(2)将活化后的载体加入三口烧瓶中，依次向三口烧瓶中加入纯化水和乙二胺，活化后的载体、乙二胺和纯化水的体积比为10:3:7，并以120rpm的转速在50℃下进行胺化反应，胺化反应时间为1.5h，载体上引入胺基，胺化反应结束后，将反应液排空，向三口烧瓶中加入纯化水至三口烧瓶容积的2/3，反复清洗胺化后的载体，直至清洗液的pH值≤8，制得胺化后的载体。
(3)将胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.7)加入三口烧瓶中，胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液的体积比为1:1，再按照10mg/mL的浓度向三口烧瓶中加入肝素钠，并向三口烧瓶中加入EDAC和NHS，肝素钠、EDAC和NHS的质量比为1:1:1，以120rpm的转速在4℃下进行酰胺化反应，酰胺化反应时间为24h，酰胺化反应结束后，用酰胺化反应产物体积5倍的95％酒精清洗酰胺化反应产物15min，重复2次后，再用酰胺化反应产物体积10倍的纯化水清洗酰胺化反应产物，重复5次，制得Lp(a)吸附剂，通过甲苯胺蓝比色法测得Lp(a)吸附剂上肝素固定率为0.48mg/mL。
实施例2
本实施例提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取40mL聚丙烯酸树脂放入1L烧杯中，用5倍95％的酒精搅拌洗涤15min，重复清洗2次后，再用聚丙烯酸树脂体积10倍的纯化水清洗聚丙烯酸树脂，重复清洗5次后，得到清洗后的聚丙烯酸树脂；将清洗后的聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜加入三口烧瓶中，并以120rpm的转速在50℃下进行活化反应，活化反应时间为3h，制得活化后的载体，其中，聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的体积比为5:1:2:3，氢氧化钠溶液的浓度为4mol/L。
(2)将活化后的载体加入三口烧瓶中，依次向三口烧瓶中加入纯化水和乙二胺，活化后的载体、乙二胺和纯化水的体积比为10:3:7，并以120rpm的转速在50℃下进行胺化反应，胺化反应时间为1.5h，载体上引入胺基，胺化反应结束后，将反应液排空，向三口烧瓶中加入纯化水至三口烧瓶容积的2/3，反复清洗胺化后的载体，直至清洗液的pH值≤8，制得胺化后的载体。
(3)将胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.7)加入三口烧瓶中，胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液的体积比为1:1，再按照10mg/mL的浓度向三口烧瓶中加入肝素钠，并向三口烧瓶中加入EDAC和NHS，肝素钠、EDAC和NHS的质量比为1:1:1，以120rpm的转速在37℃下进行酰胺化反应，酰胺化反应时间为24h，酰胺化反应结束后，用酰胺化反应产物质量5倍的95％酒精清洗酰胺化反应产物15min，重复2次后，再用酰胺化反应产物质量10倍的纯化水清洗酰胺化反应产物，重复5次，制得Lp(a)吸附剂，通过甲苯胺蓝比色法测得Lp(a)吸附剂上肝素固定率为0.46mg/mL。
实施例3
本实施例提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取40mL聚丙烯酸树脂放入1L烧杯中，用5倍95％的酒精搅拌洗涤15min，重复清洗2次后，再用聚丙烯酸树脂体积10倍的纯化水清洗聚丙烯酸树脂，重复清洗5次后，得到清洗后的聚丙烯酸树脂；将清洗后的聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜加入三口烧瓶中，并以120rpm的转速在50℃下进行活化反应，活化反应时间为3h，制得活化后的载体，其中，聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的体积比为5:1:2:3，氢氧化钠溶液的浓度为4mol/L。
(2)将活化后的载体加入三口烧瓶中，依次向三口烧瓶中加入纯化水和聚乙烯亚胺，活化后的载体、聚乙烯亚胺和纯化水的体积比为10:1:9，并以120rpm的转速在50℃下进行胺化反应，胺化反应时间为1.5h，载体上引入胺基，胺化反应结束后，将反应液排空，向三口烧瓶中加入纯化水至三口烧瓶容积的2/3，反复清洗胺化后的载体，直至清洗液的pH值≤8，制得胺化后的载体。
(3)将胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.7)加入三口烧瓶中，胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液的体积比为1:1，再按照10mg/mL的浓度向三口烧瓶中加入肝素钠，并向三口烧瓶中加入EDAC和NHS，肝素钠、EDAC和NHS的质量比为1:1:1，以120rpm的转速在4℃下进行酰胺化反应，酰胺化反应时间为24h，酰胺化反应结束后，用酰胺化反应产物质量5倍的95％酒精清洗酰胺化反应产物15min，重复2次后，再用酰胺化反应产物质量10倍的纯化水清洗酰胺化反应产物，重复5次，制得Lp(a)吸附剂，通过甲苯胺蓝比色法测得Lp(a)吸附剂上肝素固定率为0.51mg/mL。
实施例4
本实施例提供了一种用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取40mL聚丙烯酸树脂放入1L烧杯中，用5倍95％的酒精搅拌洗涤15min，重复清洗2次后，再用聚丙烯酸树脂体积10倍的纯化水清洗聚丙烯酸树脂，重复清洗5次后，得到清洗后的聚丙烯酸树脂；将清洗后的聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜加入三口烧瓶中，并以120rpm的转速在50℃下进行活化反应，活化反应时间为3h，制得活化后的载体，其中，聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的体积比为5:1:2:3，氢氧化钠溶液的浓度为4mol/L。
(2)将活化后的载体加入三口烧瓶中，依次向三口烧瓶中加入纯化水和聚乙烯亚胺，活化后的载体、聚乙烯亚胺和纯化水的体积比为10:1:9，并以120rpm的转速在50℃下进行胺化反应，胺化反应时间为1.5h，载体上引入胺基，胺化反应结束后，将反应液排空，向三口烧瓶中加入纯化水至三口烧瓶容积的2/3，反复清洗胺化后的载体，直至清洗液的pH值≤8，制得胺化后的载体。
(3)将胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.7)加入三口烧瓶中，胺化后的载体和柠檬酸钠缓冲液的体积比为1:1，再按照10mg/mL的浓度向三口烧瓶中加入肝素钠，并向三口烧瓶中加入EDAC和NHS，肝素钠、EDAC和NHS的质量比为1:1:1，以120rpm的转速在37℃下进行酰胺化反应，酰胺化反应时间为24h，酰胺化反应结束后，用酰胺化反应产物质量5倍的95％酒精清洗酰胺化反应产物15min，重复2次后，再用酰胺化反应产物质量10倍的纯化水清洗酰胺化反应产物，重复5次，制得Lp(a)吸附剂，通过甲苯胺蓝比色法测得Lp(a)吸附剂上肝素固定率为0.53mg/mL。
对比例1
以市售的健帆生物科技集团股份有限公司生产的LDL吸附剂，即专利CN109248668A中提供的用于血液体外循环去除LDL的吸附剂，作为对照组。
试验例1
分别取实施例1至实施例4中制得的Lp(a)吸附剂1mL，以及对比例1中的吸附剂1mL，分别加入到10mL高Lp(a)患者血浆(血浆中Lp(a)的浓度为46.73nmol/L)中，在恒温37℃下避光振荡吸附2h，吸取上层清液测定Lp(a)浓度，并计算各实施案例中吸附剂的吸附率，吸附率的计算公式为：吸附率＝[(m1-m2)/m1]×100％，其中，m1为吸附前血浆中Lp(a)的浓度，m2为血浆用吸附剂吸附后Lp(a)的浓度。各实施例和对比例中的吸附剂对Lp(a)的吸附率如表1所示。
表1
各实施例和对比例中的吸附剂对血浆进行吸附前，血浆中Lp(a)的浓度为46.73nmol/L，由表1可知，实施例1至实施例4中的吸附剂对血浆吸附后，血浆中Lp(a)的浓度均降低至9nmol/L以下，而对比例1中的吸附剂对血浆吸附后，血浆中Lp(a)的浓度维持在30nmol/L以上，由此可知，实施例1至实施例4中制得的吸附剂对血浆中Lp(a)具有较好的吸附能力，能够有效降低血浆中Lp(a)的浓度，而对比例1中的吸附剂虽然能够吸附Lp(a)，但是对Lp(a)的吸附效果较差。
试验例2
分别取实施例1至实施例4中制得的Lp(a)吸附剂1mL，以及对比例1中的吸附剂1mL，分别加入到10mL高LDL-C患者血浆(血浆中LDL-C的浓度为18.62nmol/L)中，在恒温37℃下避光振荡吸附2h，吸取上层清液测定LDL-C浓度，并计算各实施案例中吸附剂的吸附率，吸附率的计算公式为：吸附率＝[(m1-m2)/m1]×100％，其中，m1为吸附前血浆中LDL-C的浓度，m2为血浆用吸附剂吸附后LDL-C的浓度。各实施例和对比例中的吸附剂对LDL-C的吸附率如表2所示。
表2
各实施例和对比例中的吸附剂对血浆进行吸附前，血浆中LDL-C的浓度为18.62nmol/L，由表2可知，实施例1至实施例4中的吸附剂对血浆吸附后，血浆中LDL-C的浓度仍维持在17nmol/L以上，而对比例1中的吸附剂对血浆吸附后，血浆中LDL-C的浓度可降低至7nmol/L以下，由此可知，实施例1至实施例4中制得的吸附剂对血浆中LDL-C的吸附能力较差，而对比例1中的吸附剂对血浆中的LDL-C具有良好的吸附能力。
由试验例1和试验例2可知，现有的吸附剂(即专利CN109248668A中提供的用于血液体外循环去除LDL的吸附剂)虽然能够吸附Lp(a)，但是该吸附剂无法对Lp(a)进行特异性吸附，对Lp(a)的吸附率不佳，对血液中的Lp(a)的降低作用有限，而本发明中提供的吸附剂能够对Lp(a)进行特异性吸附，使该吸附剂对Lp(a)具有较好的吸附能力，该吸附剂对Lp(a)的吸附率可达到80％以上，能够有效降低血浆中Lp(a)的浓度，并且由表1和表2的结果可以看出，本发明中提供的吸附剂还能够对血浆中的LDL-C进行吸附，虽然该吸附剂无法对LDL-C进行特异性吸附，但是能够在一定程度上降低血浆中LDL-C的浓度。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于去除脂蛋白a的吸附剂，其特征在于，所述吸附剂以聚丙烯酸树脂作为载体，通过在所述载体上引入胺基，并由胺基与肝素通过酰胺化反应而形成；
所述肝素设置在所述吸附剂的外层，所述聚丙烯酸树脂设置在所述吸附剂的内层，所述胺基作为连接臂，连接所述肝素和所述聚丙烯酸树脂。
2.根据权利要求1所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂，其特征在于，所述吸附剂上所述肝素的固定率为0.05mg/mL至1mg/mL。
3.一种用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，其特征在于，用于制备如权利要求1或2所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂，所述制备方法包括如下步骤：
对载体进行活化反应，制得活化后的载体，所述载体为聚丙烯酸树脂；
对所述活化后的载体进行胺化反应，在所述载体上引入胺基，制得胺化后的载体；
将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上，制得所述吸附剂。
4.根据权利要求3所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，其特征在于，所述对载体进行活化反应，制得活化后的载体，包括：
将聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜混合均匀，在25℃至50℃下进行活化反应，制得活化后的载体；
所述聚丙烯酸树脂、氢氧化钠溶液、环氧氯丙烷和二甲基亚砜的体积比为10:(1至2):(2至4):(3至6)，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L至5mol/L。
5.根据权利要求3所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，其特征在于，所述对所述活化后的载体进行胺化反应，在所述载体上引入胺基，制得胺化后的载体，包括：
依次向所述活化后的载体中加入纯化水和胺化试剂，在25℃至50℃下进行胺化反应，在所述载体上引入胺基，制得胺化后的载体；
所述活化后的载体和所述胺化试剂的体积比为10:(2至5)，所述胺化试剂为乙二胺、己二胺、甲基丙烯酰氧乙基、聚乙烯亚胺和N-甲基二乙醇胺中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，其特征在于，所述制得胺化后的载体之后，将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应之前，还包括：
用纯化水反复清洗所述胺化后的载体，直至清洗液的pH值小于或等于8。
7.根据权利要求3所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，其特征在于，将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上，包括：
将胺化后的载体和肝素盐，在活化剂的作用下，于缓冲液中进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上，所述胺化后的载体和所述缓冲液的体积比为1:1，所述酰胺化反应的温度为4℃至37℃，所述酰胺化反应的时间为12h至24h，所述缓冲液的pH值为2至5。
8.根据权利要求7所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，其特征在于，
所述活化剂用于对所述肝素盐进行活化，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，所述肝素盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:(1至4):(1至8)，所述肝素盐的浓度为5mg/mL至20mg/mL；
所述吸附剂上所述肝素的固定率为0.05mg/mL至1mg/mL。
9.根据权利要求3所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法，其特征在于，所述将所述胺化后的载体与肝素盐进行酰胺化反应，使肝素接枝至所述聚丙烯酸树脂上之后，制得所述吸附剂之前，还包括：
用95％酒精清洗酰胺化反应产物后，再用纯化水清洗酰胺化反应产物，制得所述吸附剂。
10.一种灌流器，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂，或者包括由权利要求3至9任一项所述的用于去除脂蛋白a的吸附剂的制备方法所制备的吸附剂，所述灌流器用于血液体外循环去除脂蛋白a。
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