CN118001378A - 过表达mocs1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的疾病的产品中的应用 - Google Patents

过表达mocs1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的疾病的产品中的应用 Download PDF

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CN118001378A CN202410410631.4A CN202410410631A CN118001378A CN 118001378 A CN118001378 A CN 118001378A CN 202410410631 A CN202410410631 A CN 202410410631A CN 118001378 A CN118001378 A CN 118001378A
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Abstract

本发明提供了过表达MOCS1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的疾病的产品中的应用，涉及生物医药技术领域，本发明的发明人通过细胞实验证明，过表达MOCS1可降低幽门螺杆菌感染所诱导的生物学效应，例如幽门螺杆菌感染诱导的氧化应激、炎症反应和细胞增殖等，提示MOCS1有望成为抗幽门螺杆菌感染所致胃炎、胃癌的新的作用靶点。针对MOCS1可以开发出不同的产品，例如以MOCS1为靶点的药物以治疗幽门螺杆菌感染导致的疾病等等，对于幽门螺杆菌感染导致的疾病的治疗具有重要的影响。

Description

过表达MOCS1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的疾病 的产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及过表达MOCS1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的疾病的产品中的应用。
背景技术
慢性胃炎是常见的消化系统疾病，进一步发展可导致萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生甚至胃癌。幽门螺杆菌感染（Helicobacter pylori, H. pylori）引起的氧化应激和炎症反应是导致慢性胃炎的主要原因之一。钼辅因子合成1（molybdenum cofactorsynthesis 1, MOCS1）是合成钼辅因子（molybdenum cofactor, MoCo）的关键基因，已知MOCS1突变引起的辅助因子缺乏症（Molybdenum cofactor deficiency , MoCD）主要表现为新生儿癫痫和进行性脑病，其与胃炎、胃癌及幽门螺杆菌感染的关系尚未见报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
胃癌是危害人类生命健康的重大疾病，根据国际癌症研究中心的报告显示，在全球范围内，胃癌在癌症发病率方面排第五，在死亡率方面排第四。尽管研究人员不断努力寻找胃癌的有效治病方法，但胃癌在2020年还是有769万新病例。此外，大多数胃癌患者表现为晚期疾病，临床结局较差。因此，识别胃癌中的有效治疗靶点非常重要。
幽门螺杆菌感染所致慢性炎症是人类胃癌发展中的主要病因。一旦幽门螺杆菌附着到宿主细胞上，幽门螺杆菌诱导的胃炎症信号转导立即启动，幽门螺杆菌可以通过激活肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-8等炎性细胞因子诱发胃炎，被证明是胃疾病发生的危险因素之一。因此，探索幽门螺杆菌在诱导胃炎及胃肿瘤中的作用机制对进一步探索新的抗癌策略具有指导意义。
基于此，本发明的目的之一在于提供过表达MOCS1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的疾病的产品中的应用，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了过表达MOCS1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的生物学效应和/或疾病的产品中的应用。
MOCS1是一类新型的生长因子，MOCS1与MOCS2、MOCS3和GPHN基因介导钼辅酶的合成，钼辅酶对黄嘌呤氧化酶、亚硫酸氧化酶、醛氧化酶、线粒体相关酶的活性至关重要，影响尿酸、亚硫酸的代谢。因此，MOCS1参与细胞内酶的代谢过程。本发明首次验证了MOCS1在临床胃癌组织中的表达低于癌旁组织。利用TIMER（Tumor Immune Estimation Resource），采用ESTIMA算法评估MOCS1在胃癌中的作用，肿瘤浸润免疫细胞分析显示，MOCS1的低表达与肿瘤中CD8+ T细胞、B细胞、中性粒细胞和树突状细胞的数量呈负相关，与CD4+ T细胞和巨噬细胞的数量呈正相关，而CD4+ T细胞和巨噬细胞在幽门螺杆菌感染诱导的免疫性损伤和抗感染免疫中发挥着重要作用。
幽门螺杆菌在感染所致癌症负担中居首位（占35.4%），90%的非贲门癌与幽门螺杆菌感染相关。幽门螺杆菌是胃相关疾病的始动因素，可以调控相关基因的表达进一步影响疾病进展。在发明人的研究中，幽门螺杆菌感染可以降低胃黏膜上皮细胞MOCS1的表达，并且在一定范围内具有时间和浓度依赖性。而不同幽门螺杆菌菌株感染胃黏膜上皮细胞都可以下调MOCS1。CagA作为幽门螺杆菌的一个重要毒力因子，它并不参与调控MOCS1的表达。本发明首次报道了幽门螺杆菌感染和胃黏膜上皮细胞MOCS1表达的关系。
在一些可选的实施方式中，所述幽门螺杆菌感染诱导的生物学效应包括氧化应激、炎症反应或胃黏膜细胞增殖。
在一些可选的实施方式中，所述幽门螺杆菌感染诱导的疾病包括胃炎或胃癌。
幽门螺旋杆菌感染刺激细胞因子的释放和炎症介质的激活，尤其是炎症趋化因子IL-8在幽门螺杆菌感染患者中明显升高。胃黏膜中IL-8的升高与慢性胃炎和胃癌的进展称正相关。NF-κB信号通路在调控微生物感染后黏膜炎症反应发生中起着核心作用。幽门螺杆菌感染激活细胞表面相应受体，随后激活IκB激酶（IKK）复合物，可以磷酸化IκBα。IκBα磷酸化并进一步引起泛素化和蛋白体降解，从而导致NF-κB二聚体核易位，与下游靶基因上的特异性位点结合，诱导其转录。这是NF-κB的经典激活途径，也是激活多种炎性因子，如IL-6、IL-8、TNF-α的主要途径。本发明实验中发现幽门螺杆菌可通过抑制MOCS1的表达活化NF-κB信号通路，干扰MOCS1可提高炎性因子IL-8的表达以及细胞增殖的速度。这提示MOCS1在幽门螺杆菌感染的胃黏膜上皮细胞的中具有抑炎、抑增殖作用。
慢性炎症诱导ROS（reactive oxygen species，ROS）生成。幽门螺杆菌感染后诱导胃黏膜上皮细胞分泌IL-8，IL-8将中性粒细胞招募到感染部位，并刺激ROS的产生。也有研究表明，ROS是幽门螺杆菌感染促进IL-8产生的信号介质，幽门螺杆菌感染产生过量的ROS，进而诱导IL-8的表达。总之，在幽门螺杆菌感染的胃黏膜上皮细胞中NF-κB信号通路被激活，ROS和IL-8水平随之升高。过量的ROS在感染宿主细胞中促进DNA损伤并启动若干致癌事件。因此，ROS是胃炎、胃癌发生发展的关键因素。在对MOCS1功能分析中，显示MOCS1与GTP合成及氧化应激有关，这提示MOCS1可能参与了细胞内的能量代谢。在本发明的研究中，幽门螺杆菌感染促进胃黏膜上皮细胞ROS的生成，而过表达MOCS1抑制ROS的产生，且与幽门螺杆菌共培养中，过表达MOCS1逆转了幽门螺杆菌对ROS的促进作用。这也证实了在胃黏膜组织中MOCS1具有抑制幽门螺杆菌感染诱导细胞氧化应激的作用。其机制如图7所示。
在一些可选的实施方式中，所述过表达MOCS1的物质包括：
Ⅰ）MOCS1；
Ⅱ）含有MOCS1的编码基因的重组载体；
Ⅲ）含有MOCS1的编码基因的重组病毒；
Ⅳ）含有MOCS1的编码基因的重组病毒载体。
第二方面，本发明提供了一种用于治疗或辅助治疗幽门螺杆菌感染诱导的生物学效应和/或疾病的药物，所述产品包括过表达MOCS1的物质。
需要说明的是，本发明提供的用于治疗或辅助治疗幽门螺杆菌感染诱导的生物学效应和/或疾病的药物，可以包括MOCS1、含有MOCS1的编码基因的重组病毒、含有MOCS1的编码基因的重组病毒或含有MOCS1的编码基因的重组病毒载体中的一种或两种或以上，例如仅包括MOCS1，或者仅包括含有MOCS1的编码基因的重组载体，或者包括MOCS1和含有MOCS1的编码基因的重组病毒载体，或者包括含有MOCS1的编码基因的重组载体、含有MOCS1的编码基因的重组病毒和含有MOCS1的编码基因的重组病毒载体，或者同时包括MOCS1、含有MOCS1的编码基因的重组病毒、含有MOCS1的编码基因的重组病毒和含有MOCS1的编码基因的重组病毒载体。
在一些可选的实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载剂。
优选地，所述载剂包括壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。
上述载剂均能够有效包裹MOCS1、含有MOCS1的编码基因的重组病毒、含有MOCS1的编码基因的重组病毒或含有MOCS1的编码基因的重组病毒载体中的一种或多种，并携上述活性成分进入体内并释放，以起到给药治疗的目的。优选地，通过对上述载体进行进一步修饰，如连接结合位点等，还能够进一步起到靶向给药的作用。
在一些可选的实施方式中，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。
当口服用药时，上述药物可制成任意口服可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。
任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当以注射的形式给药时，上述药物可制成任意注射可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于注射液或粉针剂。
其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的发明人通过细胞实验证明，过表达MOCS1可降低幽门螺杆菌感染所诱导的生物学效应，例如幽门螺杆菌感染诱导的氧化应激、炎症反应和细胞增殖等。提示MOCS1有望成为抗幽门螺杆菌感染导致的胃炎、胃癌的新的作用靶点。针对MOCS1可以开发出不同的产品，例如以MOCS1为靶点的药物以治疗幽门螺杆菌感染导致的疾病等等，对于幽门螺杆菌感染导致的疾病的治疗具有重要的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的胃黏膜组织中MOCS1的表达的结果图；其中，（A）通过GEPIA网站获得MOCS1在多种肿瘤组织和正常组织中的表达情况；（B）通过GEPIA网站获得408例胃癌组织和211正常组织中MOCS1的表达情况，T代表胃癌组织，N代表正常胃黏膜上皮组织；（C）人胃组织切片应用MOCS1鼠源单克隆抗体进行免疫组化染色（×400）；（D）通过TCGA数据库获得MOCS1在幽门螺杆菌感染胃组织和未感染胃组织中的表达情况；（E）分析幽门螺杆菌阳性、阴性胃炎组织中MOCS1的表达变化。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图2为本发明实施例提供的幽门螺杆菌抑制胃黏膜上皮细胞MOCS1的表达的结果图；其中，（A）幽门螺杆菌感染抑制MGC-803和GES-1细胞中MOCS1的mRNA表达，MGC-803细胞和GES-1细胞与幽门螺杆菌以MOI为100:1时作用6、12、24 h，收集细胞后提取RNA进行qRT-PCR检测；（B）幽门螺杆菌感染抑制MGC-803和GES-1细胞中MOCS1的蛋白表达，将幽门螺杆菌以MOI 100:1感染MGC-803和GES-1细胞6、12、24 h，提取细胞蛋白进行Western blot实验；（C）在一定范围内，随着幽门螺杆菌MOI增加MOCS1表达逐渐降低，MGC-803细胞和GES-1细胞与幽门螺杆菌在MOI为200:1、100:1、50:1时作用12 h，收集细胞中总蛋白进行Westernblot实验；（D）三种菌株感染都可以降低胃黏膜上皮细胞MOCS1的表达，三株幽门螺杆菌26695、11637和SS1都以MOI 100:1与MGC-803和GES-1细胞作用12 h，收集细胞，提取细胞中的蛋白，进行Western blot检测；（E）MOCS1表达降低不依赖于CagA，MGC-803细胞、GES-1细胞与幽门螺杆菌26695cagA+、26695cagA-以MOI为100:1作用12 h，收集细胞后提取蛋白，采用Western blot分析细胞内MOCS1蛋白水平变化；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图3为本发明实施例提供的幽门螺杆菌感染后小鼠胃黏膜细胞MOCS1的表达变化结果图；其中，（A）通过快速脲酶实验和16S rRNA PCR扩增验证幽门螺杆菌在C57BL/6小鼠胃黏膜中定植；（B）收集幽门螺杆菌感染小鼠组织进行Western blot实验验证MOCS1；（C）将实验组和对照组两组小鼠胃组织用多聚甲醛固定、石蜡包埋后免疫组织化学染色检测MOCS1（×400）；***P<0.001；
图4为本发明实施例提供的MOCS1干扰、过表达效果验证结果图；其中，（A）筛选MOCS1过表达稳定细胞株，将MOCS1过表达慢病毒及其对照感染MGC-803和GES-1细胞后用嘌呤霉素筛选稳定细胞株，并通过免疫荧光显微镜观察感染效果（×200）；（B）qRT-PCR验证MOCS1过表达细胞株过表达效率，收集稳定过表达MOSC1细胞株，提取RNA进行qRT-PCR实验验证过表达效率；（C）qRT-PCR验证MOCS1 siRNA转染细胞后其干扰效率；（D）Western blot验证MOCS1过表达细胞株过表达效率；（E）Western blot验证MOCS1 siRNA转染细胞后其干扰效率；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图5为本发明实施例提供的MOCS1调控幽门螺杆菌感染诱导的氧化应激，炎症反应和细胞增殖的结果图；其中，（A）利用DAVID数据库分析MOCS1参与的生物学过程；（B）免疫荧光检测幽门螺杆菌与MGC-803细胞作用3 h、6 h、12 h和24 h细胞内ROS水平（×400）；（C）利用流式细胞术分析MGC-803细胞、MOCS1过表达、干扰及其对照组分别与幽门螺杆菌作用12h后细胞中ROS水平；（D）利用TIMER （Tumor IMmune Estimation Resource）分析胃癌中MOCS1表达与免疫细胞的相关性；（E）利用qRT-PCR分析MGC-803细胞、MOCS1过表达、干扰及其对照组分别与幽门螺杆菌作用12 h后细胞中IL-8 mRNA水平；（F）MTT检测过表达MOCS1影响幽门螺杆菌感染促进细胞增殖。幽门螺杆菌感染MGC-803细胞、MOCS1过表达、干扰及其对照组3 h后，计数2000个细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后检测一次记为第0天，第1、3和5天于酶标仪检测OD490值；（G）利用EdU检测MGC-803细胞、MOCS1过表达、干扰及其对照组分别与幽门螺杆菌作用12 h，荧光显微镜下观察细胞增殖（×400）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图6为本发明实施例提供的MOCS1抑制幽门螺杆菌感染中增殖和炎症的结果图；其中，（A）MGC-803细胞、MOCS1过表达、干扰及其对照与幽门螺杆菌共培养30 min后，提取细胞总蛋白，检测NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化水平；（B）MGC-803细胞、MOCS1过表达、干扰及其对照与幽门螺杆菌共培养30 min后，免疫荧光检测p65核转位（×400）；（C）MGC-803细胞、MOCS1干扰及其对照与BAY11-7082孵育2 h后，流式细胞术分析细胞中ROS水平；（D）MGC-803细胞、MOCS1干扰及其对照与BAY11-7082抑制剂孵育2 h后，利用qRT-PCR分析细胞中IL-8mRNA水平；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图7为本发明提供的MOCS1在幽门螺杆菌感染的胃黏膜上皮细胞中对氧化应激、炎症和增殖的作用及机制。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
本实施例所用的实验材料如下：
1.1 细胞株和菌株来源
MGC-803，GES-1细胞株为本实验室储存；幽门螺杆菌菌株 26695，SS1，11637均为本实验室储存。
1.2 实验动物及临床样本
SPF级C57BL/6小鼠购自于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK（京）2019-0008，所有动物实验符合伦理道德要求，且经过潍坊医学院伦理委员会审核通过，受理编号：2021SDL555；收集43例浅表性胃炎、萎缩性胃（幽门螺杆菌感染阳性患者24例，幽门螺杆菌感染阴性患者19）炎以及35例癌旁组织和50例胃癌组织临床样本，样本随机选取自潍坊医学院附属医院经胃镜或胃癌手术患者，本研究所收集的临床样本经资料分析后在各层次均无明显区别，且经过潍坊医学院伦理委员会审核通过，受理编号：2022YX045。408例胃癌组织和211例正常胃黏膜组织的测序结果来源于GEPIA数据库。
1.3 主要仪器和器材
二氧化碳培养箱 美国赛默飞世尔科技有限公司
HH-2水浴锅 常州市金坛博科实验设备研究所
微波炉 韩国乐金公司
-80 ℃冰箱 德国Eppendorf公司
4 ℃和-20 ℃冰箱 中国海尔集团
SC-1610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器
Centrifuge 5427R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司
Centrifuge 5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司
生化恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司
离子纯水机 四川优普超纯科技有限公司
Mili-QA10超纯水系统 美国密理博公司
高压灭菌锅 日本三洋公司
超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司
Heal Force生物安全柜 力康生物医疗科技控股有限公司
医用恒温全自动摇床 深圳华瑞同康生物科技有限公司
梯度PCR仪 德国Eppendorf公司
微型离心机 杭州有米欧仪器有限公司
荧光定量PCR仪 德国Roche公司
AL-204电子天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司
可调式移液器 德国Eppendorf公司
制冰机 先BiLON仪器有限公司
DHG-9101-3A型恒温鼓风干燥箱 江苏荣华义器械制造有限公司
电泳仪 美国伯乐公司
多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司
Multiskan MK3型酶标仪 美国赛默飞世尔科技有限公司
DNA凝胶成像系统 以色列DNA生物影像系统有限公司
蛋白电泳装置 美国Bio-tek公司
正置荧光显微镜 日本奥林巴斯公司
倒置荧光显微镜 日本尼康公司
胃幽门螺杆菌检测试剂盒（脲酶法） 三明市安信生物技术有限公司
1.4 试剂及药品
细胞DMEM培养基 美国Gibico公司
NBS 加拿大Wisent公司
胰酶 北京索莱宝生物科技有限公司
DMSO 北京索莱宝生物科技有限公司
Lipofectamine 2000 美国Invitrogen公司
Opti-MEM培养基 美国Gibico公司
质粒提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司
Trizol 湖南艾科瑞生物工程有限公司
氯仿，异丙醇，无水乙醇 国产分析纯
DEPC 上海生工生物工程有限公司
RT试剂盒 湖南艾科瑞生物工程有限公司
PCR引物 铂尚生物技术（上海）有限公司
qRT-PCR试剂盒 湖南艾科瑞生物工程有限公司
高效RIPA组织/细胞裂解液 北京索莱宝生物科技有限公司
PVDF膜 美国GE公司
脱脂奶粉 美国BD公司
MOCS1抗体 美国Santa cruz公司
Akt抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
p-Akt抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
p65抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
p-p65抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
p44/42MAPK（Erk1/2）抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
p-p44/42MAPK（Erk1/2）抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
IKKα抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
p-IKKα/β抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
IκBα抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
p-IκBα抗体 美国Cell Singnaling Technology公司
GAPDH抗体 英国Abcam公司
TEMED 美国Sigma公司
30%丙烯酰胺 北京索莱宝生物科技有限公司
过硫酸铵 美国Sigma公司
SDS 德国Biofroxx公司
甘氨酸 上海生工生物工程有限公司
Tween-20 北京索莱宝生物科技有限公司
蛋白marker 美国Thermo Fisher公司
辣根过氧化物酶标记的IgG二抗 碧云天生物技术公司
化学发光检测试剂盒（ECL） 美国Millpore公司
BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型） 碧云天生物技术公司
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（6×） 碧云天生物技术公司
兔SP试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司
BSA 北京中杉金桥生物技术有限公司
嘌呤霉素 北京索莱宝生物科技有限公司
活性氧检测试剂盒 北京普利莱基因技术有限公司
MOCS1siRNA及对照 上海吉玛制药技术有限公司
MOCS1过表达慢病毒及对照 上海吉凯基因有限公司
1.5 主要试剂的配制
1.5.1 细菌和细胞培养相关试剂
（1）布氏肉汤固体培养基（g/L）
胰蛋白胨 20 g
酵母提取物 5 g
NaCl 5 g
葡萄糖 2 g
每90 mL布氏肉汤液体培养基中加入2 g琼脂粉配制成固体培养基，混合均匀，高压灭菌。
（2）细胞冻存液
NBS 9 mL
DMSO 1 mL
（3）1×PBS缓冲液
KCl 0.2 g
KH2PO4 0.24 g
Na2HPO4·12H2O 3.58 g
NaCl 8 g
加ddH2O定容至1 L且pH值调至7.4，高压灭菌后使用。
（4）D-Hanks溶液
KCl 0.4 g
KH2PO4 0.06 g
NaCl 8 g
NaHCO3 0.35 g
Na2HPO4·12H2O 0.132 g
加ddH2O定容至1 L，混匀后备用。
（5）胰酶（0.25%）
胰酶（固体） 1.5 g
EDTA（乙二胺四乙酸） 0.1 g
加D-Hanks溶液0.5 L，充分混匀，通过0.22 μm滤器进行除菌，放在4 ℃环境中。
（6）0.1‰DEPC水
DEPC 1 mL
ddH2O 999 mL
配置操作在通风橱内进行，配制比例为的1‰的DEPC溶液，使DEPC与双蒸水充分混合并进行高压处理。
1.5.2 免疫印迹实验相关试剂
（1）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（1000 mL）
甘氨酸 94 g
Tris-HCl 15.1 g
SDS 5 g
（2）5×转膜缓冲液（1000 mL）
甘氨酸 94 g
Tris-HCl 15.1 g
甲醇 200 mL
（3）1×TBST
Tris-HCl 2.42 g
NaCl 8.8 g
Tween-20 0.5 mL
（4）10%APS（1 mL）
APS 0.1 g
ddH2O 1 mL
（5）10%SDS（10 mL）
电泳级SDS 1 g
ddH2O 9 mL
（6）5%脱脂奶粉封闭液
添加1×TBST使体积为100 mL
（7）5%浓缩胶（5 mL）
ddH2O 3.4 mL
30%丙烯酰胺 0.83 mL
Tris-HCl（1 mol/L，pH6.8） 0.63 mL
10%SDS 50 μL
10%过硫酸铵 50 μL
TEMED 5 μL
（8）10%分离胶
ddH2O 4 mL
30%丙烯酰胺 3.3 mL
Tris-HCl（1.5 mol/L，pH8.8） 2.5 mL
10%SDS 100 μL
10%过硫酸铵 100 μL
TEMED 4 μL
1.5.3 免疫组化相关
（1）柠檬酸钠抗原修复液
柠檬酸三钠 3 g
柠檬酸 0.4 g
（2）0.2%氨水
氨水 200 μL
ddH2O 99.8 mL
（3）1%盐酸酒精
浓盐酸 1 mL
70%乙醇 99 mL
（4）1%BSA溶液
BSA固体 0.01 g
ddH2O 1 mL
实施例1 细胞培养
1 培养条件
人源的胃黏膜上皮细胞GES-1和MGC-803细胞培养的营养条件为含有10 %NBS的DMEM培养基，环境条件为，5%CO2，37 ℃。在细胞培养实验操作前，将无菌培养基、1×PBS缓冲液和胰酶恢复至室温。
2 细胞复苏
（1）在实验开始前用紫外灯将生物安全柜照射30 min，将培养GES-1和MGC-803细胞的含有10%NBS的DMEM培养基放置于常温中复温。
（2）用电磁炉将水加热至37 ℃后，将冻存的细胞取出，立即放入其中并快速搅动，使管中液体迅速解冻。
（3）将细胞悬液以800 rpm的转速离心5 min。倒掉上清，加入1 mL含有10%NBS的DMEM细胞培养基混为悬液，用移液器将细胞悬液加入至细胞培养瓶中，再加入4 mL新鲜培养基培养。
（4）在细胞培养瓶瓶身做好标记，置入细胞培养箱中培养，按时更换培养基。
（5）培养次日或第三日时查看细胞情况，更换新鲜培养基。
3 细胞传代
（1）实验开始前紫外线照射生物安全柜30 min，同时将培养细胞需要的含有10%NBS的DMEM培养基恢复至室温。
（2）当细胞状态良好、数量达标时进行传代。吸走旧培养基，用高压的1×PBS缓冲液处理细胞两次。
（3）将1 mL胰酶加入到细胞培养瓶中，在37 ℃细胞培养箱中静置3-5 min，细胞间接触不再紧密时用与胰酶等比例完全培养基终止消化，并制成悬液。
（4）将细胞悬液离心处理，直至细胞沉淀至离心管底。
（5）将细胞悬液缓慢吸取至无菌离心管中，以800 rpm的转速离心5 min，将细胞沉淀至离心管底。
（6）倒掉上清，加入适量新鲜培养基将细胞重悬，然后将细胞按实验所需按1:2或1:3分别吸取至培养瓶中，每个培养瓶中的培养基量加至5 mL，将细胞混匀后置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养。
4 细胞冻存
（1）实验开始前用紫外灯将生物安全柜照射30 min，细胞培养需要的含有10%NBS的DMEM细胞培养基、胰酶和1×PBS缓冲液放置于常温复温。
（2）将数量达到80%-90%、状态良好的细胞放置到冰箱或液氮中，用1 mL的胰酶消化，转移至离心管，使用离心机以800 rpm的转速离心5 min，直至细胞沉淀到离心管底。
（3）小心弃去上清，加入1 mL配置好的细胞冻存液，用冻存液重悬细胞，吸取细胞悬液放入冻存管中。
（4）记录细胞信息，放入-80 ℃冰箱的周转盒内储存。
实施例2 幽门螺杆菌菌株培养
1 幽门螺杆菌的复苏
（1）用紫外灯照射生物安全柜30 min，将培养幽门螺杆菌使用的固体培养基置于室温中恢复室温。
（2）取出幽门螺杆菌菌种并室温融化，后吸取50 μL菌液均匀涂在固体培养基上。
（3）将培养皿正置几分钟后倒置放入气体罐中，罐中充入的混合气体比例为5%O2、10%CO2、85%N2，放入37 ℃的培养箱中培养。
2 幽门螺杆菌的传代
（1）将固体培养基在室温环境中复温，生物安全柜紫外照射30 min。
（2）幽门螺杆菌处于对数生长阶段时进行传代。将幽门螺杆菌培养皿取出，用灭菌的玻璃涂布棒从固体培养基上刮取少量生长状态良好的幽门螺杆菌，涂布在新的固体培养基上。
（3）将培养皿正置几分钟后倒置放入气体密封罐中，密封罐中充入比例为5%O2，10%CO2，85%N2的混合气体，置于37 ℃的培养箱中培养。
3 幽门螺杆菌菌种的冻存
（1）冻存幽门螺杆菌选取生长状态良好的，处于生长对数期的菌株进行。
（2）将培养幽门螺杆菌使用的固体培养基置于室温复温，生物安全柜使用前用紫外灯照射30 min。
（3）在幽门螺杆菌固体培养基上加入2 mL布氏肉汤液体培养基，玻璃涂布棒提前灭菌后将培养基上的幽门螺杆菌刮下并混匀。菌液与灭菌后的纯甘油的比例为7:3，吸入经过灭菌的EP管中。
（4）做好标记，置于-80 ℃冰箱中冻存，备用。
4 幽门螺杆菌菌液的取用
（1）选择状态良好、位于对数期的菌株。
（3）将幽门螺杆菌固定于载玻片上后进行革兰染色，在显微镜下观察幽门螺杆菌的形态。
（4）取2 mL布氏肉汤液体培养基加入到幽门螺杆菌培养皿上，用灭菌的玻璃涂布棒谨慎地将幽门螺杆菌刮下，得到幽门螺杆菌菌液。
（5）测定菌液浓度，对照组使用同批次的培养基，并测定OD值。按照OD600=1时对应的细菌浓度为2.2×108 CFU/mL计算菌量。
实施例3 慢病毒感染
1 慢病毒制备
慢病毒颗粒的包装 MOCS1靶向过表达慢病毒载体（LV-MOCS1-OE），MOCS1靶向过表达慢病毒对照载体，编号为CON335，购于上海吉凯基因公司并与本实验室保存。
2 细胞铺板
（1）将DMEM培养基、胰酶、1×PBS缓冲液恢复至室温，用紫外灯照射生物安全柜30min。
（2）光学显微镜下观察细胞分布密度和生长状态。
（3）去除细胞培养瓶中的培养基，用1×PBS缓冲液洗涤2遍后弃掉。
（4）向培养瓶中加入1 mL胰酶，显微镜下实时观察细胞状态。
（5）倒掉胰酶，向细胞培养瓶中加入含10%NBS的细胞培养基终止消化，用移液器谨慎吹打，待瓶壁上的细胞进入培养基，构成细胞悬液。
（6）将细胞悬液吸取至无菌的15 mL离心管中，离心机以800 rpm的转速离心5min。
（7）弃掉上清，重悬处理。
（8）细胞计数，依照实验要求接种细胞数量。
3 细胞感染
（1）将培养细胞所用的DMEM培养基、1×PBS缓冲液、胰酶复温，使用器材全部高压灭菌或紫外照射30 min后方可使用，生物安全柜在紫外线照射30 min后进行操作。
（2）取对数生长期的MGC-803细胞、GES-1细胞悬液，以3×105个细胞/每孔接种于六孔板中，当细胞增殖至密度达60%时开始感染病毒。
（3）用制备的慢病毒以MOI为10的感染率感染MGC-803细胞和GES-1细胞，使病毒液、感染增强剂（HiTransG P）与完全培养基总体积为1 mL。
（4）8字摇匀后放入37 ℃恒温细胞培养箱培养。12 h后补液至2 mL，第48-72 h时加入嘌呤霉素4.00 μg/ml筛选稳定表达细胞株，检测感染效率。
4 筛选稳定表达细胞株
（1）慢病毒感染方法同上，分为对照组和感染组。
（2）慢病毒感染48-72 h后，将细胞继续培养于含2.00 μg/ml嘌呤霉素的完全DMEM培养基中。
（3）未感染病毒的对照组细胞被嘌呤霉素杀灭，而感染病毒的组再无细胞死亡视为感染结束。
（4）将感染并筛选后的细胞转移至培养瓶中继续培养，以获得表达稳定的细胞株。
实施例4 细胞RNA的提取（参照RNAex Pro RNA提取试剂的使用说明，按如下方法操作）
（1）所用器材均无RNA酶，离心机进行预冷处理。
（2）取出六孔板，吸出培养基，用1×PBS缓冲液清洗一遍。
（3）吸出1×PBS缓冲液，每孔加入1 mL的RNAex，确保裂解液均匀分布于细胞表面。使用移液器吹打器壁。
（4）将裂解液转至EP管中，室温静置5 min。
（5）向裂解液中加入200 μL的氯仿，充分混匀，室温静置5 min。
（6）12000 g，4 ℃离心15 min，匀浆液变为含RNA的上清液层、蛋白层、有机层。
（7）小心吸取上清液400-500 μL至新的1.5 mL EP管中。
（8）向上清中加入500 μL的异丙醇，充分混匀，室温静置10 min。
（9）12000 g，4 ℃离心10 min，离心后弃掉上清，严禁碰触RNA沉淀。
（10）加入1 mL -20 ℃预冷的80%的乙醇，7500 g，4 ℃离心5 min，小心弃去上清，严禁碰触RNA沉淀。
（11）打开EP管盖，室温干燥沉淀，加入适量DEPC水，充分溶解RNA，放入-80 ℃保存。
实施例5 RNA逆转录反应
（1）将0.2 mL的EP管置于冰上，按如下的反应体系配制混合液：
逆转录引物 1 μL
RNA模板 2 μg
ddH2O 补至14 μL
混匀后离心，65 ℃反应5 min，立即置于冰上冷却。
然后配制如下混合液，加入反应管中：
5×RT Buffer 4 μL
RT Enzyme Mix 1 μL
混匀后离心，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min反应，cDNA放在-20 ℃环境存放。
实施例6 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）
（1）引物由铂尚生物技术（上海）有限公司设计合成。引物序列如下：
MOCS1 forward primer: 5’-TGAACTGTGTGGTGATGCGA-3’（SEQ ID NO.1）；
MOCS1 reverse primer: 5’-TATGAAGCGCACATCCAGGG-3’ （SEQ ID NO.2）；
IL-8 forward primer: 5’-AAACTTCTCCACAACCCTCTG-3’ （SEQ ID NO.3）；
IL-8 reverse primer: 5’-ATACTCCAAACCTTTCCACCC-3’ （SEQ ID NO.4）；
β-actin forward primer: 5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’ （SEQ ID NO.5）；
β-actin reverse primer: 5’-CACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’ （SEQ ID NO.6）；
（2）每个基因做3个复孔，反应体系如下：
2×SYBR Green Pro Taq 10 μL
Forward Primer（5 μM） 0.8 μL
Reverse Primer（5 μM） 0.8 μL
cDNA（＜100 ng） 2 μL
RNase free ddH2O 6.4 μL
（3）反应程序如下：
第一步 95 ℃ 30 s
第二步（×40个循环） 95 ℃ 5 s
60 ℃ 30 s
实施例7 Western blot检测（蛋白质免疫印迹）
1 细胞蛋白的提取
（1）提前打开制冰机，离心机预冷至4 ℃，在冰上进行所有操作。
（2）收集细胞，弃掉培养基，加入1×PBS缓冲液润洗，然后再加入1 mL 1×PBS缓冲液，用细胞刮谨慎刮取细胞，尽量将全部细胞收集到1.5 mL EP管中。离心机以2000 rpm 4℃离心5 min。
（3）加入适量裂解液，冰上裂解20-30 min。
（4）12000 rpm，4 ℃离心20 min。吸取上清至新的EP管中。
（5）按比例加入6×Loading buffer，置于100 ℃水浴中加热使蛋白变性，分装，保存于-20 ℃。
2 BCA法测蛋白浓度
（1）配制BCA工作液，工作液的配置比例为：BCA试剂A/BCA试剂B=50/1，充分混匀备用。
（4）96孔板的标准品孔中，将标准品按照0，1，2，4，8，12，16，20 μL的顺序加入，1×PBS缓冲液的加入量为20、19、18、16、12、8、4、0 μL。
（5）1×PBS缓冲液稀释蛋白待测样品，使样本体积为20 μL，加到96孔板中，待测样品为3复孔。
（6）标准孔和样品孔每孔加入200 μL BCA工作液，置于37 ℃孵育20-30 min。
（7）提前预热酶标仪，随后用酶标仪测定蛋白样本在562 nm处的OD值，保存数据，根据数据制作标准曲线，计算待测样品的浓度。
3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE电泳）
（1）清洗玻璃板，烘干后组装制胶架，验漏。
（2）配制10%分离胶，将分离胶缓慢加入制胶架中，加入ddH2O压平胶面。
（3）静置30 min，倒掉ddH2O，制备浓缩胶，缓慢加入浓缩胶，插梳子，静置。
（4）组装电泳装置，电泳槽中加入电泳缓冲液。
（5）拔梳子，加样本，加蛋白指示Marker，加1×loading buffer-RIPA压胶。
（6）先80 V/cm的电压电泳，后将电压调至120 V/cm电泳，当蛋白样品电泳至凝胶下端时停止电泳。
4 蛋白印迹
（1）电泳完成后，取出凝胶并根据目的蛋白位置进行修剪，置于1×转膜缓冲液中，裁剪PVDF膜，使用甲醇将其激活。
（2）根据转膜“三明治”结构放置海绵、滤纸、凝胶。
（3）安装好转膜装置置于冰上，设置电流160 mA，时间1 h。
（4）配制5%的脱脂牛奶封闭液。PVDF膜放入封闭液中，室温摇床封闭1.5 h。
（5）按照抗体说明书要求，封闭液配制一抗稀释液，GAPDH（1：5000）、MOCS1（1：200）、p65（1：1000）、和p-p65（1：1000），将膜放入一抗稀释液中，注意不要有起泡，室温摇床孵育1 h后4 ℃冰箱孵育过夜。
（6）膜取出，回收一抗，1×TBST洗膜10 min，共3次。
（7）用5脱脂奶粉%配制二抗稀释液，二抗浓度参照抗体说明书，将 PVDF膜放到二抗稀释液中，室温孵育1 h。
（8）取出PVDF膜，1×TBST洗膜10 min，共3次。
5 化学发光显色
配制显影液，A液和B液按照1：1的比例充分混合，打开凝胶成像仪然后化学发光显影液均匀滴在PVDF膜上，使用成像仪进行检测。
实施例8 免疫组织化学染色（SP法）
（1）切片已完成。
（2）将切片放在60 ℃烘箱中，烘2 h，使切片上的蜡尽量化开。
（3）将切片脱蜡和水化：二甲苯Ⅰ15 min→二甲苯Ⅱ15 min→无水乙醇Ⅰ5 min→无水乙醇Ⅱ5 min→95%乙醇Ⅰ3 min→95%乙醇Ⅱ3 min→80%乙醇2 min→75%乙醇2 min→单蒸水1 min。
（4）抗原修复：配制抗原修复液。抗原修复液煮沸后倒入烧杯中，在微波炉中加热10 min（实时观察不能沸腾，防止脱片）。待温度稍降后，置于1×PBS缓冲液中，在摇床上摇5min。
（5）消除内源性过氧化物酶：阻断剂滴在玻片上，随后将玻片置于湿盒内孵育，1×PBS缓冲液洗3 min，共3次。
（6）封闭：山羊血清封闭液封闭样品，孵育30min，倾去血清，勿洗。
（7）一抗孵育：利用1%BSA配置MOCS1（1：100）一抗稀释液， 4 ℃过夜。
（8）一抗洗涤：1×PBS缓冲液洗涤 3 min，共3次。
（9）二抗孵育：二抗浓度参照抗体说明书，室温避光孵育10-15min
（10）二抗洗涤：1×PBS缓冲液洗涤3 min，共3次。
（11）滴加工作液，室温孵育，1×PBS缓冲液洗涤3 min，共3次。
（12）DAB显色：DAB显色液按照A液：B液为1:50的比例进行配制，现用现配。用配制好的DAB显色液对组织样品进行染色，随后用显微镜观察组织样品，控制显色时间，镜下观看，及时终止显色。
（13）细胞核复染：苏木素染色1min，水中冲洗。1%的盐酸酒精溶液，分色3-4 s，水中冲洗。0.2%的氨水返蓝，具体染色时间根据实验过程中颜色变化调整，摇床上洗3 min。
（14）切片脱水：70%乙醇2 min→80%乙醇2 min→95%乙醇Ⅰ2 min→95%乙醇Ⅱ2min→无水乙醇Ⅰ2 min→无水乙醇Ⅱ2 min→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min。
（15）封片：滴加中性树胶封片，不能封入气泡，晾干后观察结果。
实施例9 免疫荧光检测p65核转位
（1）制备玻片：盖玻片泡酸，流水冲洗处理，置于95%的乙醇环境中存放。
（2）接种细胞：取出玻片，烘干，铺在六孔板中，每孔接种3.5×105个细胞，培养箱中培养。
（3）幽门螺杆菌感染：将幽门螺杆菌（MOI=100：1）感染细胞30 min，舍去培养基，1×PBS缓冲液洗3次。
（4）固定：冷甲醇固定，1×PBS缓冲液洗涤，共3次。
（5）通透：0.5%Triton X-100通透，1×PBS缓冲液洗涤5 min，共3次。
（6）封闭：滴加1%BSA室温下封闭30 min 。
（7）孵育一抗：按比例稀释一抗， 4 ℃过夜。1×PBS缓冲液洗涤5 min，共 3次。
（8）洗涤一抗：1×PBS缓冲液洗涤5 min，共3次。
（9）孵育二抗：按照抗体说明书稀释二抗，37 ℃孵育1 h，
（10）洗涤二抗：1×PBS缓冲液洗涤5 min，共3次。
（11）细胞核染色：DAPI染色，1×PBS缓冲液洗涤5 min，共3次。
（12）封片：利用防荧光淬灭封片剂封片，置于荧光显微镜下查看。
实施例10 MTT检测细胞增殖
（1）将生物安全柜用紫外等照射30 min，使用实验器材全部经过高压灭菌或紫外照射30 min，将培养细胞所用的试剂如：培养基、1×PBS缓冲液和胰酶等置于室温复温，或者在水浴锅中37 ℃复温。
（2）选用细胞状态良好的对数生长期细胞，用如上所述的实验方法制取细胞悬液。
（3）在96孔板中，按照每孔含2000个细胞的密度分别接种。8字摇匀，使细胞均匀铺满孔的底部。
（4）将96孔板放在37 ℃细胞培养箱中。
（5）在细胞铺板的次日，当细胞贴壁后（此为第0天），加入MTT试剂10 μL，置于37℃培养箱继续培养4 h。
（6）4 h后轻轻倒掉96孔板中的液体，每孔加入150 uL DMSO溶液。充分混匀后，用酶标仪在490 nm处检测吸光度值。
（7）用如上所述的实验方法继续检测第1、3和第5天的96孔板的吸光度值。
实施例11 EdU掺入实验
（1）培养并处理细胞：将适量的细胞铺入带有盖玻片的六孔板中，每孔加入2 mL含10%NBS的DMEM培养基中进行培养过夜，待细胞贴壁并长为正常形状时，用处于对数生长期的幽门螺杆菌以MOI为100:1感染细胞12 h。
（2）EdU标记细胞：终止幽门螺杆菌感染，吸出1 mL培养基，将提前37 ℃预热的2×（20 μM）的EdU工作液（用无血清的细胞培养液1:500稀释EdU（10 mM））加入到六孔板中标记，每孔加入1 mL，继续放入37 °C温箱孵育2 h。
（3）固定细胞：吸去孔内的培养液，每孔加入1 ml固定液（4%的多聚甲醛），室温固定0.25 h。
（4）洗涤细胞：吸去孔内的固定液，每孔加入1 mL洗涤液（3%BSA的PBS），洗涤3次，每次5 min。
（5）通透细胞：吸去孔内的洗涤液，每孔加入1 mL通透液 （0.3%Triton X-100的PBS），室温通透0.25 h。
（6）洗涤细胞：吸去孔内的通透液，每孔加入1 mL洗涤液，洗涤2次，每次5 min。
（7）EdU染色：每孔加入500 μL 的Click反应液（430 μL Click Reaction Buffer，20 μL CuSO4，1 μL Azide647，50 μL Click Additive Solution），轻晃，使反应液均匀覆盖板底，室温避光孵育30 min。
（8）洗涤细胞：吸去孔内的Click反应液，每孔加入1 mL洗涤液，洗涤3次，每次5min。
（9）细胞核染色：吸去孔内的洗涤液，每孔加入1× Hoechst33342溶液（用PBS1:1000稀释Hoechst33342溶液），室温避光孵育10 min。
（10）洗涤细胞: 吸去孔内的染液，每孔加入1 mL洗涤液，洗涤3次，每次5 min。
（11）封闭玻片：取出孔内玻片，并用封片剂封闭。
（12）检测：用荧光显微镜检测Azide647的红色荧光（最大激发波长为650 nm，最大发射波长为670 nm）和Hoechst33342的蓝色荧光（最大激发波长为346 nm，最大发射波长为460 nm）。
实施例12 流式细胞术检测ROS
（1）培养并处理细胞：将适量的细胞铺入六孔板中，每孔加入2 mL含10%NBS的DMEM培养基中进行培养过夜，待细胞贴壁并长为正常形状时，用处于对数生长期的幽门螺杆菌以MOI为100:1感染细胞12 h。
（2）收集细胞：弃掉培养基，用1 mL预热的1×PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2次。用细胞刮子轻轻刮取细胞，尽量将全部细胞收集到流式管中。
（3）洗涤细胞：用4 ℃离心机以1000 g的转速离心5 min，将细胞离心至流式管底。倒掉上清后，用1×PBS缓冲液重悬细胞，再次离心，共离心两次。
（4）染色孵育：ROS染色工作液用DMEM配置，以每管200 uL、10 μM的浓度加入到流式管中。流式管置于37 ℃培养箱中孵育30 min，每隔5-10 min弹一弹管底，使染液与细胞充分混匀。
（5）洗涤细胞：以1000 g离心5 min，弃掉染液。1×PBS缓冲液重悬细胞，以1000rpm离心5 min，共两次。
（6）细胞重悬：弃掉上清，用300 uL 1×PBS缓冲液重悬细胞。
（7）过滤细胞并检测：准备并标记好足量的流式管，将染色好的细胞悬液通过300目滤网过滤到流式管中，并及时上机检测。
实施例13 构建幽门螺杆菌感染小鼠模型
（1）SPF级C57BL/6雌性小鼠，在特定环境下适应一周，给予正常饮食和水供应。
（2）小鼠在灌胃开始前8-12 h禁食。
（3）将灌胃实验所需器材全部高压蒸汽灭菌或紫外照射30 min，紫外照射生物安全柜30 min后进行实验操作。
（4）实验组给予0.5 mL密度为2.2×108/ CFU的SS1菌液灌胃，对照组给予0.5 mLPBS灌胃。灌胃时使小鼠不能晃动，灌胃针经食管进入胃部。灌胃结束后小鼠暂停饮食2-4h。
（5）第二次灌胃前8-12 h禁食。
（6）重复步骤3、4，共进行8次灌胃。
（7）灌胃12周后处死小鼠获得胃上皮组织样本。
实施例16 统计学分析
所有实验数据均使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析，使用student’st检验进行两组样本均数间的比较，使用one-way ANOVA进行多组数据间比较。所有数据均采用均值±标准差（mean±SD）的形式表示，P＜0.05时表示数据存在统计学差异。
结果：
1、MOCS1在人胃癌组织中低表达
Gene Expression Profiling Interactive Analysis （GEPIA）是利用癌症基因组图谱和基因型-组织表达中的测序数据来分析基因表达谱的网页工具。为了分析MOCS1在人组织中的基因表达谱，本发明利用GEPIA数据库分析了MOCS1在人体多种肿瘤组织和正常组织中的表达情况。结果显示，MOCS1在肾上腺皮质癌、乳腺癌、胆管癌、胶质细胞瘤和肺癌等多种肿瘤组织中的表达均低于其正常组织。为了分析MOCS1在人胃组织中的基因表达谱，本发明通过GEPIA数据库分析了408例胃癌组织和211例正常胃黏膜组织中MOCS1的表达情况。结果显示，在胃癌组织中MOCS1的表达水平明显低于正常胃黏膜组织（P<0.05）（如图1A，B）。本发明同时利用免疫组织化学染色检测了临床标本胃癌及癌旁组织中MOCS1的表达变化，图中所示MOCS1主要在细胞质中表达呈棕色，细胞核染色为蓝色。通过Image-Pro Plus6.0软件分析处理后可知，癌旁组织中的MOCS1的IOD值（126.095±1.60×103）显著高于胃癌组织（25.607±0.65×103），说明在临床标本中胃癌组织MOCS1的表达明显低于癌旁组织（如图1C）。为了分析MOCS1在幽门螺杆菌感染胃组织中的表达变化，本发明通过（TheCancer Genome Atlas, TCGA）癌症基因组图谱分析了34例正常组织和20例幽门螺杆菌感染组织中MOCS1的表达情况，并进一步通过收集幽门螺杆菌阳性和阴性胃炎临床标本进行验证。结果显示，在幽门螺杆菌感染胃组织中MOCS1的表达水平低于正常胃黏膜组织及未感染组（如图1D、E）。
2、幽门螺杆菌感染抑制胃黏膜上皮细胞MOCS1表达
为了验证幽门螺杆菌感染是否可以调控胃黏膜上皮细胞中MOCS1的表达，本发明将幽门螺杆菌26695以MOI 100:1分别感染MGC-803细胞和GES-1 细胞6 h、12 h和24 h，并通过qRT-PCR和Western blot分析MOCS1 mRNA和蛋白表达变化。实验结果表明，与对照组相比，幽门螺杆菌感染后可显著抑制胃黏膜上皮细胞MOCS1 mRNA和蛋白的表达，且该抑制作用具有时间依赖性，当感染24 h时MOCS1表达量比对照组时降低了78.907±0.2%（P<0.001）（如图2A,B）。同时，本发明将幽门螺杆菌以MOI 200:1、100:1、50：1分别与MGC-803细胞和GES-1细胞作用12 h，Western blot验证幽门螺杆菌对MOCS1的调控作用是否与浓度有关。结果表明，随着MOI的增加MOCS1表达随之降低（P<0.01）。因此，幽门螺杆菌感染诱导MOCS1表达降低具有明显的浓度依赖性（如图2C）。为了进一步分析幽门螺杆菌对MOCS1的调控作用是否存在菌株特异性，本发明选取了幽门螺杆菌26695、11637和SS1三个菌株分别与胃黏膜上皮细胞GES-1和MGC-803作用12 h，提取细胞中的总蛋白进行Western blot实验。结果发现，与未感染细胞相比，三种菌株与胃黏膜上皮细胞作用后都可以降低MOCS1的蛋白水平（如图2D）。CagA是幽门螺杆菌一个重要的致病因子，为了分析CagA是否参与调控MOCS1表达，本发明构建了26695cagA-菌株，并将幽门螺杆菌26695cagA + 、26695cagA - 分别感染MGC-803和GES-1细胞。如图2E所示，与对照组相比较，26695cagA - 感染人胃癌细胞后仍然可以抑制MOCS1的表达，且与26695cagA + 作用无明显差异，因此幽门螺杆菌感染诱导胃黏膜上皮细胞MOCS1表达降低不依赖于CagA。
3、幽门螺杆菌感染后小鼠胃黏膜细胞MOCS1表达降低
幽门螺杆菌SS1菌株是定植能力最强的菌株，在体内研究幽门螺杆菌感染胃黏膜的实验中多次使用。为了验证MOCS1在幽门螺杆菌感染小鼠中的表达变化，本发明采用12只6周龄C57BL/6雌性小鼠，对照组和实验组各6只。实验组给予0.5 mL菌液灌胃（密度为2.2×108/CFU），对照组给予0.5 mL PBS灌胃，每两天灌胃一次，共8次，灌胃12周后处死小鼠获得胃上皮组织样本并进行分析。为了验证实验组小鼠胃黏膜幽门螺杆菌定植是否成功，通过小鼠胃组织快速脲酶实验和PCR扩增幽门螺杆菌管家基因16S rRNA实验验证。结果可见，脲酶法幽门螺杆菌感染组呈阳性，凝胶成像系统下可见16S rRNA条带扩增成功，说明幽门螺杆菌在小鼠胃黏膜定植成功（如图3A）。进一步通过收集幽门螺杆菌感染小鼠组织进行Western blot实验验证MOCS1的蛋白表达，结果可见在幽门螺杆菌感染的小鼠胃组织中MOCS1表达降低（如图3B）。将两组小鼠胃组织用多聚甲醛固定、石蜡包埋后进行免疫组织化学染色，利用Image J分析可见，在幽门螺杆菌感染的小鼠胃黏膜上皮组织中MOCS1表达明显低于对照组（如图3C）。
4、干扰、过表达胃黏膜上皮细胞中MOCS1效果评价
为了进一步验证MOCS1在幽门螺杆菌感染胃黏膜上皮细胞中的作用，本发明从上海吉凯基因科技有限公司购入了MOCS1过表达慢病毒及其对照组，分别将慢病毒和对照组感染MGC-803细胞和GES-1细胞，感染72 h后用含嘌呤霉素的DMEM完全培养基培养筛选出稳定过表达株，并在荧光下观察其感染效果（如图4A），并通过qRT-PCR和Western blot的方法验证感染效率（如图4B、D）。过表达MOCS1组MOCS1mRNA和蛋白水平均高于对照组，提示过表达MOCS1细胞株构建成功。
同时，本发明设计了三组MOCS1 siRNA：MOCS1-578；MOCS1-690和MOCS1-863，利用qRT-PCR和Western blot检测MOCS1干扰效率，结果显示，MOCS1-690和MOCS1-863 两种siRNA能降低MOCS1的表达，后续干扰实验选择MOCS1-863 siRNA（如图4C、E）（P<0.01）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
5、MOCS1抑制幽门螺杆菌感染诱导氧化应激、炎症反应和胃黏膜细胞增殖
为了探讨MOCS1在幽门螺杆菌感染的细胞中发挥何种作用，本发明使用GO数据库分析MOCS1的生物学功能。如图所示，MOCS1作为钼辅助因子合成的关键基因除了具有参与钼辅因子生物合成过程和钼离子结合的功能外，MOCS1还与GTP结合有关（如图5A）。由此发明人推测MOCS1是否与细胞中能量代谢过程有关。线粒体是细胞内产生能量代谢、氧化应激的场所，是ROS产生的重要位置。为了进一步验证MOCS1在幽门螺杆菌诱导胃黏膜上皮细胞中氧化应激中的作用，利用荧光显微镜检测幽门螺杆菌感染MGC-803细胞3 h、6 h、12 h和24 h时ROS产生的变化，发现在幽门螺杆菌感染12 h时细胞内ROS水平增高最明显（如图5B），因此将幽门螺杆菌分别感染MGC-803细胞、MOCS1过表达、干扰细胞及其对照12 h，利用流式细胞术检测ROS的水平。结果显示，与未感染组相比，幽门螺杆菌感染可显著提高胞内ROS水平，从而提示幽门螺杆菌感染可刺激细胞氧化应激。过表达MOCS1 细胞内ROS水平明显低于对照组，而干扰MOCS1作用相反。且与幽门螺杆菌感染组比较，MOCS1过表达抑制了幽门螺杆菌诱导的ROS水平，而干扰MOCS1则促进了细菌感染诱导ROS的产生（如图5C）。说明MOCS1可抑制幽门螺杆菌感染诱导的氧化应激。
肿瘤微环境中常伴有免疫细胞浸润，为了分析MOCS1与肿瘤微环境浸润的免疫细胞的关系，本发明利用TIMER（Tumor IMmune Estimation Resource），采用ESTIMA算法（https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/）来评估MOCS1在胃癌中的作用。肿瘤浸润免疫细胞分析显示，MOCS1的低表达与肿瘤中CD8+ T细胞、B细胞、中性粒细胞和树突状细胞的数量呈负相关，然而与CD4+T细胞和巨噬细胞的数量呈正相关（如图5D）。
幽门螺杆菌在胃黏膜定植后，刺激机体产生炎症反应。IL-8作为一种趋化因子，可通过趋化作用促进炎细胞向炎症部位聚集，在炎性反应中起重要作用，是一种常见的炎症指标。为了研究幽门螺杆菌抑制MOCS1表达的过程中是否会影响炎症进展，本发明将MOCS1过表达细胞和干扰细胞及其对照组分别与幽门螺杆菌26695共孵育12 h后，采用qRT-PCR的方法检测IL-8的表达变化。结果所示，幽门螺杆菌感染可显著提高细胞IL-8 mRNA水平。MOCS1过表达后IL-8的表达明显低于其对照组，而干扰MOCS1可显著提高IL-8的表达。且与幽门螺杆菌共培养后，过表达MOCS1显著降低了幽门螺杆菌诱导的IL-8 mRNA水平，而干扰MOCS1则提高了细菌感染诱导的IL-8 mRNA水平。说明MOCS1在幽门螺杆菌感染的胃黏膜上皮细胞中可抑制IL-8生成。提示MOCS1可以抑制幽门螺杆菌感染诱导胃黏膜上皮细胞的炎症反应（如图5E）。
为了验证幽门螺杆菌感染抑制MOCS1表达能否影响胃黏膜上皮细胞的增殖，本发明用MTT和EdU检测分析了过表达和干扰MOCS1对幽门螺杆菌感染诱导细胞增殖作用的影响。本发明将MOCS1过表达细胞和干扰细胞及其对照组与分别幽门螺杆菌26695共孵育3 h后，以每孔2000个细胞接种于96孔板，在细胞贴壁后的第0、1、3和5天检测OD490值，并通过GraphPad Prism软件分析数据。结果所示，幽门螺杆菌感染后细胞增殖显著加快。MOCS1过表达组与其对照组相比细胞增殖速度明显减慢，与幽门螺杆菌共培养后，MOCS1过表达组细胞增殖速度低于其感染组，MOCS1逆转了幽门螺杆菌对细胞增殖的促进作用。干扰降低MOCS1表达后得到相反的结果（如图5F）。结果提示，MOCS1可以抑制幽门螺杆菌感染诱导胃黏膜上皮细胞的增殖作用。EdU检测也得到了一致结果。本发明在MGC-803细胞中干扰、过表达MOCS1后，与幽门螺杆菌共培养12 h，EdU染色后利用荧光显微镜检测。结果可见，干扰MOCS1可促进细胞增殖显著加快，并可增强幽门螺杆菌诱导的增殖作用，而过表达MOCS1结果相反（如图5G）。这进一步证明了MOCS1具有抑制细胞增殖的作用。
6、MOCS1通过抑制NF-κB途径调控幽门螺杆菌诱导氧化应激和炎症反应
核转录因子（NF-κB），是细胞内参与机体的炎症反应、免疫应答，调节应激反应和细胞凋亡等过程的关键因子。为了验证MOCS1对NF-κB的调控作用，将MGC-803细胞株、MOCS1过表达、干扰细胞株及其对照组与幽门螺杆菌共孵育30 min，Western blot验证NF-κB信号通路相关蛋白，免疫荧光检测p65核转位。结果显示，幽门螺杆菌感染可明显促进NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化，过表达MOCS1可显著降低相关蛋白磷酸化，与幽门螺杆菌共培养后，过表达MOCS1逆转了幽门螺杆菌对信号通路蛋白磷酸化的促进作用。而干扰MOCS1作用相反，具有明显的促进作用（如图6A）。免疫荧光检测p65核转位也得到了一致结果（如图6B）。证明MOCS1可抑制p65磷酸化及p65核转位发挥其调节作用。
为了进一步验证NF-κB在MOCS1调控氧化应激和炎症反应中作用，本发明将MGC-803细胞株、干扰MOCS1细胞及其对照组与NF-κB抑制剂BAY11-7082孵育2 h，分别检测细胞内ROS水平和IL-8 mRNA的表达变化。结果显示，干扰MOCS1可以诱导细胞内ROS的产生，促进IL-8的表达，而BAY11-7082可以显著抑制该作用，与干扰组比较，差异具有显著性（如图6C、D）。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.过表达MOCS1的物质在制备治疗幽门螺杆菌感染诱导的生物学效应和/或疾病的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述幽门螺杆菌感染诱导的生物学效应包括氧化应激、炎症反应或胃黏膜细胞增殖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述幽门螺杆菌感染诱导的疾病包括胃炎或胃癌。
4.根据权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，所述过表达MOCS1的物质包括：
Ⅰ）MOCS1；
Ⅱ）含有MOCS1的编码基因的重组载体；
Ⅲ）含有MOCS1的编码基因的重组病毒；
Ⅳ）含有MOCS1的编码基因的重组病毒载体。
5.一种用于治疗或辅助治疗幽门螺杆菌感染诱导的生物学效应和/或疾病的药物，其特征在于，所述药物包括过表达MOCS1的物质。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载剂。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。
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