CN118001309A - 白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗肠道疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗肠道疾病药物中的应用。本发明创造性地提取纯化中药白术衍生的细胞外囊泡，并对其生理功效进行了研究，发现其能充分被巨噬细胞内化吸收，能够降低巨噬细胞中炎症因子的表达水平，并且具有体内肠靶向性，动物试验证明了其可以降低溃疡性结肠炎小鼠模型的疾病活动指数，缓解结肠组织的隐窝腺体破坏及萎缩，降低小鼠结肠组织中炎症因子的表达水平，其用于制备预防或治疗肠道疾病的药物具有潜力，为预防或治疗肠道疾病尤其是肠炎、溃疡性肠炎、溃疡性结肠炎提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种预防或治疗肠道疾病的药物新策略，具体涉及白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗肠道疾病药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种以结肠粘膜弥漫性病变为特征的炎症性肠病。目前西医临床常用治疗药物有氨基水杨酸酯、皮质类固醇和免疫抑制剂等，种类繁多但副作用大，易反复发作，出现药物依赖等不良情况。白术，首载于《神农本草经卷二·上品》，味苦，温，归脾、胃经，可补气健脾、燥湿利水、止汗安胎，临床应用广泛，药学价值颇高，白术因药食同源、价格低廉及丰富的药理特性，现已针对多种疾病的临床应用进行开发。
囊泡样纳米颗粒(vesicle-like nanoparticles,VLNs)含有多种蛋白质、脂质和核酸，可通过介导细胞与细胞之间的通讯发挥重要的生理功能，几乎所有类型的真核和原核细胞都分泌VLNs。植物VLNs在形态方面与哺乳动物VLNs相似，但其组成和功能等方面研究较少。有研究发现植物VLNs是植物先天免疫系统的组成成分，具有抗真菌作用。此外，植物VLNs具有跨物种调节功能，不仅可以调节哺乳动物细胞的生理功能，还可以干预和预防疾病进程，对疾病起到治疗作用。这些研究结论证明植物VLNs作为一种新型的天然产物有可能成为新药开发的良好候选来源。
中药多为植物，成本低，副作用小，但中药源性的EVs却很少有人研究。从中药白术中提取细胞外囊泡是否可行，提取出的白术源性细胞外囊泡样纳米颗粒是否具有生物活性还未可知。因此，如何提供一种从中药白术中提取高纯度、高质量的细胞外囊泡的方法，并深入研究提取到的细胞外囊泡样纳米颗粒的功能，以发掘其在治疗疾病方面的应用潜力，是具有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防或治疗肠道疾病的药物新策略，具体提供白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗肠道疾病药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗肠道疾病药物中的应用。
本发明创造性地提取纯化中药白术衍生的细胞外囊泡，并对其生理功效进行了研究，发现其能充分被巨噬细胞内化吸收，能够降低巨噬细胞中炎症因子例如IL-1β、IL-6以及COX-2的表达水平，发挥抗炎和抗氧化作用，并且具有体内肠靶向性，动物试验证明了其可以降低溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠模型的疾病活动指数，缓解结肠组织的隐窝腺体破坏及萎缩，降低小鼠结肠组织中炎症因子的表达水平。其用于制备预防或治疗肠道疾病的药物具有潜力，为预防或治疗肠道疾病尤其是肠炎、溃疡性肠炎、溃疡性结肠炎提供了新的策略。
优选地，所述肠道疾病的类型包括肠炎，优选为溃疡性肠炎，进一步优选为溃疡性结肠炎。
本发明所涉及的白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒可以通过本领域技术人员公知的任何方法制备得到，更优选下述提取方法，该方法得到的白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒纯度更高，具有更优异的防治肠道疾病的效果。
优选地，所述白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒是由包括如下步骤的提取方法制得的：
(1)将白术原料的汁液过滤，滤液进行离心并收集上清液；
(2)将上清液过滤后进行超速离心后收集沉淀并重悬，即得。
优选地，步骤(1)所述进行离心并收集上清液包括至少四次，离心的速度依次为300-800g(例如300g、350g、400g、450g、500g、600g、700g、800g等)、1000-4000g(例如1000g、1200g、1500g、1700g、2000g、2500g、3000g、3500g、4000g等)、5000-8000g(例如5000g、5500g、6000g、6500g、7000g、7500g、8000g等)、9000-15000g(例如9000g、9500g、10000g、10500g、11000g、11500g、12000g、15000g等)，且每次离心的时间各自独立地选择5-70min(例如5min、10min、15min、20min、30min、40min、50min、60min、70min等)。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
进一步优选地，步骤(1)所述进行离心并收集上清液共进行四次，第一次离心的速度为400-600g(例如400g、450g、500g、550g、600g等)，时间为5-15min(例如5min、8min、10min、12min、15min等)；第二次离心的速度为1000-3000g(例如1000g、1500g、2000g、2500g、3000g等)，时间为15-25min(例如15min、18min、20min、22min、25min等)；第三次离心的速度为5000-7000g(例如5000g、5500g、6000g、6500g、7000g等)，时间为20-40min(例如20min、25min、30min、35min、40min等)；第四次离心的速度为9000-12000g(例如9000g、10000g、11000g、12000g等)，时间为50-70min(例如50min、55min、60min、65min、70min等)。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述超速离心的速度为90000-150000g(例如90000g、100000g、110000g、120000g、130000g、140000g、150000g等)，时间为50-100min(例如50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min等)。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述重悬后还使用0.22μm过滤器进行过滤。
在本发明中，所述药物的剂型包括分散片、缓释片、泡腾片、肠溶片、缓释胶囊、肠溶胶囊、颗粒剂、滴丸剂或溶液剂中的任意一种。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、分散剂、粘合剂、填充剂、增稠剂、润滑剂、pH调节剂、掩味剂、着色剂、抗氧化剂或抑菌剂中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备肠靶向制剂中的应用。
本发明还创造性地发现白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在体内具有肠靶向性，这一发现可进一步应用于肠靶向制剂的制备中，以进行肠道疾病发病机制的研究和相关病症的治疗。
优选地，所述肠靶向制剂还包括负载于所述白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒中的其他预防或治疗肠道疾病的药物。
第三方面，本发明还提供白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备炎症因子表达抑制剂中的应用。
第四方面，本发明还提供白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒以非治疗目的地在制备炎症因子表达抑制剂中的应用。
根据本发明的研究结果，白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒能够在细胞水平(体外水平)降低炎症因子的表达，即白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒能被制成一种单纯的试验用制剂，用于探究巨噬细胞炎症因子表达行为、肠道组织中炎症因子变化机制等相关领域。本发明所要求保护的炎症因子表达抑制剂并不是用于消除病因或病灶，即是一种以非治疗为目的地在制备炎症因子表达抑制剂中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地提取纯化中药白术衍生的细胞外囊泡，并对其生理功效进行了研究，发现其能充分被巨噬细胞内化吸收，能够降低巨噬细胞中炎症因子例如IL-1β、IL-6以及COX-2的表达水平，发挥抗炎和抗氧化作用，并且具有体内肠靶向性，动物试验证明了其可以降低溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠模型的疾病活动指数，缓解结肠组织的隐窝腺体破坏及萎缩，降低小鼠结肠组织中炎症因子的表达水平。其用于制备预防或治疗肠道疾病的药物具有潜力，为预防或治疗肠道疾病尤其是肠炎、溃疡性肠炎、溃疡性结肠炎提供了新的策略。
附图说明
图1是白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的透射电子显微镜图；
图2是白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的粒径分布图；
图3是白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的纯度检测结果图；
图4是白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)内核酸的检测结果图；
图5是白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)内脂质的检测结果图；
图6是荧光显微镜检测AMVLNs被RAW264.7内化吸收的结果图；
图7是细胞流式仪检测AMVLNs被RAW264.7内化吸收的结果图；
图8是白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)干预RAW264.7后对炎症因子表达水平的影响结果图；
图9是流式细胞仪检测AMVLNs对RAW264.7抗炎作用的影响结果图；
图10是流式细胞仪检测AMVLNs对RAW264.7抗氧化作用的影响结果图；
图11是白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)在小鼠心、肝、脾、肺、肾、股骨、结肠的分布情况图；
图12是体内治疗试验中各组小鼠的结肠组织解剖图；
图13是体内治疗试验中各组小鼠的结肠长度统计结果图；
图14是体内治疗试验中各组小鼠的体重统计结果图；
图15是体内治疗试验中各组小鼠的疾病活动指数统计结果图；
图16是体内治疗试验中各组小鼠的结肠组织HE染色结果图；
图17是体内预防试验中各组小鼠的结肠组织解剖图；
图18是体内预防试验中各组小鼠的结肠长度统计结果图；
图19是体内预防试验中各组小鼠的体重统计结果图；
图20是体内预防试验中各组小鼠的疾病活动指数统计结果图；
图21是体内预防试验中各组小鼠的结肠组织HE染色结果图；
图22是体内预防试验中各组小鼠结肠组织中炎症因子表达水平结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所涉及的白术原料购自至信药业，原产地浙江。经广州中医药大学第三附属医院中药房鉴定为白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎。
实施例1
白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的提取：
(1)取50g白术进行榨汁，过滤后取上清液收集于干净的50mL离心管中并灭菌；
(2)在4℃条件下以500g离心10min；使用50mL离心管收集上清后，在4℃条件下以2000g离心20min；使用50mL离心管收集上清后，在4℃条件下以5000g离心30min；使用50mL离心管收集上清后，在4℃条件下以10000g离心60min；
(3)将上清过滤后收集于超高速离心机专用离心管中，在4℃条件下以100000g离心70min，弃上清，用已预冷的1×PBS缓冲液重悬沉淀后，使用0.22μm一次性针头过滤器进行过滤；用已灭菌的EP管收集AMVLNs，保存于-80℃冰箱内备用。
实施例2
白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的表征：
对实施例1提取到的AMVLNs的形态、粒径、纯度、化学组成进行表征。
(1)在透射电子显微镜下观察AMVLNs的形态，如图1所示：表面凹陷，呈现典型的杯托状及圆盘状的囊泡结构，胞膜结构清晰可见，膜边界清楚锐利，染色背景干净，反差明显。
(2)利用纳米粒子示踪分析仪对AMVLNs的粒径分布进行分析，如图2所示：粒径大小为77.23±18.08nm，在0-300nm之间，符合文献报道的细胞外囊泡粒径范围，浓度为6.27×1011粒子/mL。
(3)利用Triton X-100破膜实验检测AMVLNs纯度：使用不同浓度的Triton X-100对AMVLNs进行膜溶解后，用纳米流式检测仪测试粒子数变化，结果如图3所示，结果显示所提取的AMVLNs纯度高达78％。
(4)采用琼脂糖凝胶电泳以及薄层色谱的方法分别对AMVLNs内DNA、RNA和脂质进行检测。结果如图4和图5所示(其中图4为核酸结果，图5为脂质结果)，显示AMVLNs含有丰富的核酸和脂质。
以上结果证明我们所提取的AMVLNs不但具有典型的EVs形态、粒径、化学组成，还具有纯度高的特点。
实施例3
白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的内化吸收试验：
AMVLNs被RAW264.7充分内化吸收是后续AMVLNs作用于RAW264.7的前提基础，因此在做后续实验之前先验证AMVLNs是否能被RAW264.7内化吸收。实验所用RAW264.7细胞由南方医科大学检验系实验室惠赠。
(1)BCA试剂盒检测AMVLNs的蛋白含量：蛋白浓度为1700μg/mL。后续研究过程中我们均以蛋白浓度来衡量AMVLNs的使用量。
(2)Dil-AMVLNs溶液制备：取适量的AMVLNs并用1×PBS缓冲液补充至1mL，混合均匀后加入10μL DiI染料，在37℃下避光标记30min。取出在4℃，135000×g下离心70分钟，弃上清，用1×PBS缓冲液重悬沉淀并同等离心条件离心3次进行洗涤未被标记的AMVLNs和多余的DiI染液。最后以100μL PBS缓冲液重悬沉淀并收集于EP管中，即使用或暂存于-80℃冰箱，为避免荧光淬灭需尽快使用。
(3)流式细胞仪及荧光显微镜检测AMVLNs被RAW264.7内化吸收情况：
将Dil-AMVLNs以不同浓度(2.5μg/mL、25μg/mL)与RAW264.7进行共培养2h、4h和8h。然后使用流式细胞仪和荧光显微镜检测AMVLNs被RAW264.7内化吸收情况。荧光显微镜检测结果如图6所述(25μg/mL)，流式检测结果如图7所示，结果显示，Dil-AMVLNs可被RAW264.7内化吸收且内化程度随共孵育时间的延长而增加。
实施例4
白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的体外抗炎试验：
为了验证AMVLNs的生物活性，首先进行了体外细胞水平的研究，探讨了AMVLNs对RAW264.7的抗炎效果。
(1)CCK-8法检测AMVLNs对RAW264.7的增殖情况的影响：RAW264.7按细胞密度为1×104个/cm2接种于96孔板中。取不同浓度的AMVLNs(0.25ng/mL、2.5ng/mL、2.5μg/mL和25μg/mL)与RAW264.7细胞共培养，分别于培养12h、24h、48h和72h后在450nm处测定各组细胞的吸光度值。结果显示，所选浓度的AMVLNs对RAW264.7既没有抑制也没有促增殖的作用。
(2)qRT-PCR检测AMVLNs对RAW264.7抗炎作用的影响：用小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)模拟体外炎症模型，以1×106/ml接种RAW264.7细胞于培养瓶中，用含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基培养细胞，加入1％双抗(链霉素和青霉素)后于5％ CO2、37℃恒温培养，每2天换1次液，待细胞达90％融合时进行传代。将巨噬细胞以1×106/mL接种到六孔板，培养过夜。
将巨噬细胞随机分为正常对照组、模型对照组(LPS组)、AMVLNs给药组。正常对照组和模型对照组加入高糖DMEM完全培养基，AMVLNs组用不同浓度的(0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL)AMVLNs预处理巨噬细胞24h。随后吸出完全培养液，除正常对照组外用PBS洗涤后换上1μg/mL的LPS溶液，置于37℃含5％ CO2培养箱内24h，收集各组细胞上清，离心，-80℃保存备用。使用TRIzol裂解液分别收集细胞放于已灭菌的EP管中，做好标记，并进行qRT-PCR检测炎症因子相关基因(IL-1β、IL-6以及COX-2)的表达。
结果如图8所示，结果显示0.5μg/mL AMVLNs可以明显降低IL-1β、IL-6以及COX-2mRNA的表达。
(3)流式细胞仪检测AMVLNs对RAW264.7抗炎作用的影响：细胞培养与(2)相同。
将巨噬细胞随机分为正常对照组、模型对照组(LPS组)、AMVLNs给药组。正常对照组和模型对照组加入高糖DMEM完全培养基，AMVLNs组用不同浓度的(0.25ng/mL、2.5ng/mL)AMVLNs预处理巨噬细胞24h。随后吸出完全培养液，除正常对照组外用PBS洗涤后换上1μg/mL的LPS溶液，置于37℃含5％CO2培养箱内24h，收集各组细胞上清，离心，-80℃保存备用。使用活性氧检测试剂盒(碧云天S0033)，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/mL。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后用流式细胞仪检测。
结果如图9所示，由图可知，LPS成功诱导了炎症模型，AMVLPs降低了LPS产生的活性氧，AMVLPs在细胞水平上有良好的抗炎作用。
(4)流式细胞仪检测AMVLNs对RAW264.7抗氧化作用的影响：细胞培养与(2)相同。
将巨噬细胞随机分为正常对照组、模型对照组(H2O2组)、AMVLNs给药组。正常对照组和模型对照组加入高糖DMEM完全培养基，AMVLNs组用不同浓度的(0.25ng/mL、2.5ng/mL)AMVLNs预处理巨噬细胞24h。随后吸出完全培养液，除正常对照组外用PBS洗涤后换上0.5mM的H2O2溶液，置于37℃含5％CO2培养箱内24h，收集各组细胞上清，离心，-80℃保存备用。使用活性氧检测试剂盒，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/mL。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。收集细胞后用流式细胞仪检测。
结果如图10所示，由图可知，H2O2成功诱导了抗氧化模型，AMVLNs降低了H2O2产生的活性氧，AMVLNs在细胞水平上有良好的抗氧化作用。
实施例5
白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)的肠靶向性试验：
体内靶向性研究是后续研究AMVLNs体内生物活性的前提，因此在验证AMVLNs体内作用效果及机制之前检测了AMVLNs在体内的靶向分布。
(1)Dil-AMVLNs溶液制备：取适量的AMVLNs并用1×PBS缓冲液补充至1mL，混合均匀后加入10μL DiI染料，在37℃下避光标记30min。取出在4℃，135000×g下离心70分钟，弃上清，用1×PBS缓冲液重悬沉淀并同等离心条件离心3次进行洗涤未被标记的AMVLNs和多余的DiI染液。最后以100μL PBS缓冲液重悬沉淀并收集于EP管中，即使用或暂存于-80℃冰箱，为避免荧光淬灭需尽快使用。
(2)动物活体成像：尾静脉注射100μL DiI-AMVLNs溶液到雌性C57BL/6小鼠体内，同时设空白对照(给予100μl PBS)和阳性对照(给予100μl DiI染液(DiI:PBS＝1:200))。给药后12h、24h和48h进行荧光成像。
各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾、股骨和结肠组织的成像结果如图11所示(右侧箭头所指为48h下各组小鼠的脾组织的单独成像对比图)，由图可知，PBS组小鼠器官无论在任何时间点均未能检测到荧光信号，DiI组小鼠荧光信号主要分布于肝和肺脏，而在心脏、肾脏及脾内未能检测到信号，DiI-AMVLNs组小鼠荧光信号除分布于DiI组分布的器官以外，结肠组织和脾组织中也出现了较强的荧光信号，并且随时间的延长有加强的趋势。
实施例6
白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)体内治疗溃疡性结肠炎的试验：
(1)溃疡性结肠炎小鼠模型的建立及分组：
48只8周龄雌性C57BL/6小鼠均购自广州中医药大学实验动物中心。小鼠以每笼5只为一组，自由获取食物和水。适应性喂养1周后开始实验。随机分为正常对照组、2.5％DSS组、AMVLNs高浓度组(2.5μg/mL)和低浓度组(0.5μg/mL)，每组12只。硫酸葡聚糖硫酸钠DSS溶于蒸馏水，配制成浓度为2.5％的DSS溶液。正常对照组自由饮用纯净水，其他组自由饮用2.5％DSS溶液5天，5mL/天/只。然后高低浓度AMVLNs药物组灌胃5天。
(2)样本的获取：
灌胃结束后24h，用戊巴比妥钠麻醉小鼠以获取样本，取直肠上方约1cm的结肠作组织切片，测量并拍摄各组小鼠的结肠长度，结果如图12和图13所示，由图可知，DSS模型组结肠长度明显缩短，AMVLNs可恢复结肠长度。
并记录小鼠每天的体重、大便性状及血便情况，其中各组小鼠的体重变化情况如图14所示，由图可知，DSS组体重下降明显，AMVLNs可恢复经DSS给药后的体重。
(3)疾病活动指数(DAI)的评估：
疾病活动指数(DAI)为小鼠体重、大便性状和出血情况等指标的综合评分，用于评估溃疡性结肠炎的严重程度。根据0-4的评分系统，每天观察动物体重、大便性状和隐血情况，将各项评分相加，得出每只动物的DAI，以评估疾病活动情况，最高分为12分。每日观察，记录小鼠的小鼠体重、大便性状和出血情况。成型大便为正常大便，糊状大便不粘附肛门的为松散大便，粘附于肛门的为稀水样便。DAI分值评价标准：0分：体重无下降，正常大便，大便无隐血；1分：体重下降1-5％，正常大便，大便无隐血；2分：体重下降5-10％，半稀便，大便隐血阳性；3分：体重下降10-15％，半稀便，大便隐血阳性；4分：体重下降大于等于15％，稀便，便血肉眼可见。结果如图15所示，结果显示：AMVLNs高浓度组疾病活动指数相比DSS组显著降低。
(4)HE染色观察结肠组织：
处死小鼠后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗结肠组织，将结肠组织固定在10％中性甲醛溶液中，然后脱水并包埋石蜡。取5μm厚切片进行HE染色，石蜡切片染色前进行脱蜡，结肠组织石蜡切片加入二甲苯中脱蜡两次，每次15min，再以二甲苯：无水乙醇为1:1的溶液脱蜡5min，然后无水乙醇脱蜡两次，每次5min，再以95％、85％、75％的乙醇分别脱蜡5min，最后以蒸馏水脱蜡5min。脱蜡完成后，以苏木精溶液染色20min，1％盐酸酒精浸泡5s，用自来水洗10s，浸入饱和碳酸锂水溶液中，切片返蓝10s。以70％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡5min，1％伊红酒精溶液浸泡1min，无水乙醇浸泡两次各5min，无水乙醇：二甲苯为1:1的溶液浸泡5min，二甲苯浸泡两次各5min，完成染色，中性树脂封片，生物光学显微镜观察结肠组织病理变化。HE染色结果如图16所述，结果显示：DSS组有明显的隐窝腺体破坏及萎缩，高浓度组治疗效果好。以上结果都显示AMVLNs可治疗溃疡性结肠炎，且高浓度组效果更优。
以上结果显示，溃疡性结肠炎小鼠模型建造成功，AMVLNs具有治疗溃疡性结肠炎的作用。
实施例7
白术衍生的细胞外囊泡(AMVLNs)体内预防溃疡性结肠炎的试验：
(1)溃疡性结肠炎小鼠模型的建立及分组：
48只8周龄雌性C57BL/6小鼠均购自广州中医药大学实验动物中心。小鼠以每笼5只为一组，自由获取食物和水。适应性喂养1周后开始实验。随机分为正常对照组、2.5％DSS组、AMVLNs高浓度组(2.5μg/mL)和低浓度组(0.5μg/mL)，每组12只。硫酸葡聚糖硫酸钠DSS溶于蒸馏水，配制成浓度为2.5％的DSS溶液。正常对照组自由饮用纯净水，高低浓度AMVLNs药物组先连续灌胃7天，5mL/天/只。灌胃结束后除正常对照组外其他组自由饮用2.5％DSS溶液5天。
(2)样本的获取：
灌胃结束后24h，用戊巴比妥钠麻醉小鼠以获取样本，取直肠上方约1cm的结肠作组织切片，测量并拍摄各组小鼠的结肠长度，结果如图17和图18所示，由图可知，DSS模型组结肠长度明显缩短，AMVLNs可预防结肠长度变化。
并记录小鼠每天的体重、大便性状及血便情况，其中各组小鼠的体重变化情况如图19所示，由图可知，DSS组体重下降明显，AMVLNs可预防经DSS给药后的体重下降。
(3)疾病活动指数(DAI)的评估：
疾病活动指数(DAI)为小鼠体重、大便性状和出血情况等指标的综合评分，用于评估溃疡性结肠炎的严重程度。根据0-4的评分系统，每天观察动物体重、大便性状和隐血情况，将各项评分相加，得出每只动物的DAI，以评估疾病活动情况，最高分为12分。每日观察，记录小鼠的小鼠体重、大便性状和出血情况。成型大便为正常大便，糊状大便不粘附肛门的为松散大便，粘附于肛门的为稀水样便。DAI分值评价标准：0分：体重无下降，正常大便，大便无隐血；1分：体重下降1-5％，正常大便，大便无隐血；2分：体重下降5-10％，半稀便，大便隐血阳性；3分：体重下降10-15％，半稀便，大便隐血阳性；4分：体重下降大于等于15％，稀便，便血肉眼可见。结果如图20所示，结果显示：AMVLNs高浓度组疾病活动指数相比DSS组显著降低。
(4)HE染色观察结肠组织：
处死小鼠后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗结肠组织，将结肠组织固定在10％中性甲醛溶液中，然后脱水并包埋石蜡。取5μm厚切片进行HE染色，石蜡切片染色前进行脱蜡，结肠组织石蜡切片加入二甲苯中脱蜡两次，每次15min，再以二甲苯：无水乙醇为1:1的溶液脱蜡5min，然后无水乙醇脱蜡两次，每次5min，再以95％、85％、75％的乙醇分别脱蜡5min，最后以蒸馏水脱蜡5min。脱蜡完成后，以苏木精溶液染色20min，1％盐酸酒精浸泡5s，用自来水洗10s，浸入饱和碳酸锂水溶液中，切片返蓝10s。以70％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡5min，1％伊红酒精溶液浸泡1min，无水乙醇浸泡两次各5min，无水乙醇：二甲苯为1:1的溶液浸泡5min，二甲苯浸泡两次各5min，完成染色，中性树脂封片，生物光学显微镜观察结肠组织病理变化。HE染色结果如图21所述，结果显示：DSS组有明显的隐窝腺体破坏及萎缩，高浓度组治疗效果好。以上结果都显示AMVLNs可预防溃疡性结肠炎，且高浓度组效果更优。
(5)qRT-PCR检测小鼠结肠组织中炎症因子的表达水平：
用Trizol法提取组织总RNA，经反转录试剂盒合成cDNA，进行实时定量PCR反应，检测IL-10、IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α的mRNA，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt分析mRNA相对表达量。结果如图22所示，结果显示：AMVLNs可显著降低促炎因子的表达，升高抑炎因子的表达。
以上结果显示，溃疡性结肠炎小鼠模型建造成功，AMVLNs具有预防溃疡性结肠炎的作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗肠道疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠道疾病的类型包括肠炎，优选为溃疡性肠炎，进一步优选为溃疡性结肠炎。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒是由包括如下步骤的提取方法制得的：
(1)将白术原料的汁液过滤，滤液进行离心并收集上清液；
(2)将上清液过滤后进行超速离心后收集沉淀并重悬，即得。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述进行离心并收集上清液包括至少四次，离心的速度依次为300-800g、1000-4000g、5000-8000g、9000-15000g，且每次离心的时间各自独立地选择5-70min。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述进行离心并收集上清液共进行四次，第一次离心的速度为400-600g，时间为5-15min；第二次离心的速度为1000-3000g，时间为15-25min；第三次离心的速度为5000-7000g，时间为20-40min；第四次离心的速度为9000-12000g，时间为50-70min。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述超速离心的速度为90000-150000g，时间为50-100min；
优选地，所述重悬后还使用0.22μm过滤器进行过滤。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括分散片、缓释片、泡腾片、肠溶片、缓释胶囊、肠溶胶囊、颗粒剂、滴丸剂或溶液剂中的任意一种；
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、分散剂、粘合剂、填充剂、增稠剂、润滑剂、pH调节剂、掩味剂、着色剂、抗氧化剂或抑菌剂中的任意一种或至少两种的组合。
8.白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备肠靶向制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肠靶向制剂还包括负载于所述白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒中的其他预防或治疗肠道疾病的药物。
10.白术衍生的细胞外囊泡样纳米颗粒在制备炎症因子表达抑制剂中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
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