CN117990805A - 一种测定氨基丁三醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定生物制品中氨基丁三醇含量的方法，所述方法包括将氨基丁三醇与甲醛衍生化反应得到氨基丁三醇衍生物后，采用气相色谱法对所述氨基丁三醇衍生物进行含量检测，由所述氨基丁三醇衍生物的含量计算氨基丁三醇的含量。本发明方法衍生化反应快、条件温和且能定量衍生，操作计算简单，精密度良好、灵敏度高、重现性良好、线性拟合良好，标准曲线相关系数达到0.9999以上，适合不同型态氨基丁三醇的检测分析和氨基丁三醇生产过程控制。
Description
技术领域
本发明属于生物制品成分分析检测领域，涉及一种测定生物制品中氨基丁三醇含量的方法。
技术背景
氨基丁三醇，别名氨丁三醇、三羟甲基氨基甲烷、缓血酸铵、Trishydroxymethylami-nomethane、Tromethamine、THAM、Tromethane、TRIS。氨基丁三醇广泛应用于急性代谢性及呼吸性酸血症，是一种碱性缓冲剂，对代谢酸中毒和酶活动反应具有良好的缓冲作用，但其也具有可引起低血糖、低血压、恶心、呕吐，亦可抑制呼吸，甚至使呼吸停止，过量摄入或肾功能不全时可引起碱血症等不良反应。
目前关于氨基丁三醇的定量检测中国药典采用酸碱滴定的方法，定量限较高且易受到各种酸碱基团的干扰。而生物制品中由于含有大量的羧基、氨基和阴阳离子，制品中的氨基丁三醇无法通过滴定的方法进行定量检测。且氨基丁三醇通常采用硝基丁三醇加氢制备氨基丁三醇，在制备过程中会有丝氨醇等副产物生成，采用酸碱滴定法检测时丝氨醇同样与盐酸反应，会造成结果偏高，因此酸碱滴定法仅限于对氨基丁三醇纯品检测，对生产过程控制无法定量检测。
CN202110140056.7和《冻干人凝血酶中三羟甲基氨基甲烷含量离子色谱-脉冲安培测定法的建立及验证》(余进，尉小平，沈积慧，等，中国生物制品学杂志，2018，31(6)：4.)均是对药品中氨基丁三醇含量的检测，分别采用高效液相色谱-蒸发光散射法、离子色谱-脉冲安培法，但两种检测仪器结合使用设备更加复杂繁琐，且价格昂贵。氨基丁三醇受热不稳定，使用气相气相色谱检测会出现台阶峰，因此并无使用气相直接检测氨基丁三醇的报道。
因此建立一种更加简单方便、准确可靠的生物制品中氨基丁三醇和合成氨基丁三醇领域中的检测方法，是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术上的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种测定氨基丁三醇含量的方法，方法操作计算简单，检测结果准确可靠，适合不同型态氨基丁三醇的检测分析。
为实现上述目的，本发明提供一种测定氨基丁三醇含量的方法，其包括如下步骤：
将氨基丁三醇与甲醛衍生化反应得到氨基丁三醇衍生物后，采用气相色谱法对所述氨基丁三醇衍生物进行含量检测，由所述氨基丁三醇衍生物的含量计算氨基丁三醇的含量，
所述氨基丁三醇与甲醛衍生化反应的反应式如下：
由所述氨基丁三醇衍生物的含量计算氨基丁三醇的含量的公式为：
其中，M0为氨基丁三醇衍生物的相对分子质量，M1为氨基丁三醇的物相对分子质量。
在一些具体的实施方式中，所述测定氨基丁三醇含量的方法包括以下步骤：
(1)取氨基丁三醇衍生物标样，配制成不同浓度的氨基丁三醇衍生物标准溶液，并分别加入内标物，采用气相色谱法对所述氨基丁三醇衍生物标准溶液进行检测，确定氨基丁三醇衍生物与内标物峰面积比和氨基丁三醇衍生物与内标物含量比的线性关系，建立标准曲线；
(2)将待测样品中氨基丁三醇与甲醛衍生化反应，制得样品溶液，并采用与步骤(1)相同条件的气相色谱法对所述样品溶液进行检测，由标准曲线得到氨基丁三醇衍生物的含量，并进而计算氨基丁三醇的含量。
在一些具体的实施方式中，所述氨基丁三醇与甲醛衍生化的方法包括：取氨基丁三醇，按比例加入甲醛溶液反应，得到氨基丁三醇衍生物；
优选地，氨基丁三醇与甲醛的摩尔比例为1∶2-3。
在一些具体的实施方式中，氨基丁三醇衍生物标样的制备方法包括：取氨基丁三醇标准品，按比例加入甲醛溶液反应，去除甲醇得到白色固体，用甲苯进行重结晶，经干燥得到氨基丁三醇衍生物标样。
优选地，上述衍生化反应可以在超声下进行，超声温度为30-50℃，超声功率为200-500w，，超声时间为0.5-2h；优选地，超声功率为350w，超声温度为40℃，超声时间为1h；超声温度过低时反应不彻底，温度过高时物料损失，定量不准确；超声时间短反应不完全，从经济效益考虑1h最佳。
优选地，甲醛溶液为甲醛甲醇溶液、甲醛乙醇溶液、多聚甲醛甲醇溶液、多聚甲醛乙醇解聚液，更优选为多聚甲醛甲醇解聚液。
在一些具体的实施方式中，所述氨基丁三醇可以为液态或固体的型态。
在一些具体的实施方式中，步骤(1)中，所述内标物选自含氮、含氧化合物，如1，4-二氧六环、三乙胺，优选为1，4-二氧六环。
在一些具体的实施方式中，所述气相色谱法采用的检测器为FID氢火焰检测器，分别以氢气和空气作为辅助气，以极性、中等极性或弱极性色谱柱作为色谱柱。
在一些具体的实施方式中，所述色谱柱选自HP-5毛细管色谱柱、DB-624毛细管色谱柱、DB-WAX毛细管色谱柱，优选为HP-5毛细管色谱柱。
在一些具体的实施方式中，所述气相色谱法的检测条件如下：
色谱柱：极性、中等极性或弱极性色谱柱；
N2载气流速：1.0-5.0mL/min；
进样量：0.1-1μL；
进样口温度：220-300℃；
检测器温度：280-350℃；
氢气流量：30-60mL/min；
空气流量：350-400mL/min，
升温程序：先在50-100℃保持恒温1-10min，再以10-30℃/min的升温速度升温至220-300℃，然后保持恒温10-15min。
在一些具体的实施方式中，气相色谱法采用分流进样。
在一些具体的实施方式中，所述气相色谱法的检测条件如下：
色谱柱：HP-5毛细管色谱或等效色谱柱；
N2载气流速：1.0mL/min；
进样量：1μL；
进样方式：分流进样，分流比100∶1；
进样口温度：280℃；
检测器温度：300℃；
氢气流量：30mL/min；
空气流量：400mL/min；
升温程序：在70℃恒温2min，再以20℃/min的升温速度升温至280℃，恒温12.5min。
在一些具体的实施方式中，所述氨基丁三醇衍生物标准溶液的含量在0.01-0.16g/g范围内；所述样品溶液中，氨基丁三醇衍生物的含量的在1-16wt％范围内。此浓度范围内，氨基丁三醇衍生物与内标物峰面积比和氨基丁三醇衍生物与内标物峰含量比呈现良好线性关系，相关系数R2可达0.9999以上，对氨基丁三醇衍生物测定的加标回收率为100.15％，重复性相对标准偏差RSD为0.1％。
优选地，所述测定氨基丁三醇含量的方法对氨基丁三醇含量为0.8-13.4wt％的溶液进行准确定量分析。
有益效果
本发明方法衍生化反应快、条件温和且能定量衍生(氨基丁三醇衍生转化率在99.5％以上)，操作计算简单，精密度良好、灵敏度高、重现性良好、线性拟合良好，标准曲线相关系数达到0.9999以上，适合不同型态氨基丁三醇的检测分析。
在氨基丁三醇生产过程控制，虽然副产物丝氨醇也与甲醛会发生衍生化反应，但气相色谱检测时丝氨醇衍生物与氨基丁三醇衍生物具有较好的分离度，有效避免丝氨醇对检测的影响。
附图说明
图1为氨基丁三醇衍生物标准溶液色谱图；
图2为以氨基丁三醇衍生物与内标物的含量比为横坐标，氨基丁三醇衍生物与内标物的峰面积比为纵坐标，得到的标准曲线；
图3为固体氨基丁三醇样品衍生化后的待测溶液色谱图；
图4为硝基丁三醇加氢制备氨基丁三醇反应液衍生化后的待测溶液色谱图；
图5为2.3.3部分丝氨醇和氨基丁三醇固体衍生化后待测溶液的色谱图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
气相色谱柱前衍生化需满足以下要求：a.反应能迅速、定量的进行，反应重复性好，反应条件不苛刻，容易操作；b.反应的选择性高，最好只与目标化合物反应，即反应具有专一性；c.衍生化反应产物只有一种，反应的副产物和过量衍生化试剂不干扰目标化合物的分离与检测；d.衍生化试剂方便易得，通用性好。
常见的气相色谱柱前衍生化方法有：针对有机酸的酯化衍生化法(所用的衍生化试剂包括甲醇、重氮甲烷、重氮乙烷、重氮甲苯、三氟乙酸酐等)、针对含羟基、氨基、巯基待检测物的酰化衍生化法(所用衍生化试剂包括乙酸酐、乙酸、三氟乙酰、五氟丙酰、七氟丁酰等)、针对含双键或羟基、烯丙位氢的待检测物的卤化衍生化法(所用的衍生化试剂包括卤素、氯化氢、溴化氢、N-溴代丁二酰亚胺)。本申请选择并不常规的甲醛作为氨基丁三醇的衍生化试剂，该衍生反应衍生化反应快、条件温和且能定量衍生，衍生后产物稳定性大大提高，避免了使用气相色谱直接检测氨基丁三醇出现台阶峰的问题，从气相色谱图上看无其他杂质峰，且无其他杂质干扰。
1、试验
1.1仪器、试剂和材料
氨基丁三醇，分析纯，百灵威科技有限公司
甲醇、1，4-二氧六环，分析纯，天津市科密欧化学试剂
多聚甲醛，镇江李长荣高性能材料有限公司
丝氨醇，分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司
气相色谱仪，Agilent7890B，带氢火焰离子化检测器(FID)
分析天平，BSA224S，赛多利斯
超声波清洗器，KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司
高纯氮气(纯度99.999％)
1.2气相色谱条件
色谱柱：HP-5毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm)，或等效色谱柱
载气流速：1.0mL/min
进样量1μL
升温程序：在70℃恒温2min，再以20℃/min的升温速度升温至280℃，恒温12.5min
进样方式：分流进样，分流比100∶1
进样口温度：280℃
检测器温度：300℃
高纯氢气流量：30mL/min
高纯空气流量：400mL/min
1.3分析步骤
1.3.1标准系列溶液的制备
制备多聚甲醛甲醇解聚液(13％)：将50g(92％)的多聚甲醛中加入甲醇302.85g，同时加入1g三乙胺在55℃条件下解聚1h。氨基丁三醇衍生物样品的制备：将50g氨基丁三醇加入238.40g多聚甲醛甲醇解聚液，在40℃超声反应(350w，1h)，旋蒸反应液除去甲醇得到白色固体，然后用甲苯进行重结晶，经干燥得到氨基丁三醇衍生物样品。气相色谱检测获得的氨基丁三醇衍生物纯度在99.7％以上，通过标准曲线验证实际衍生转化率在99.5％以上。
分别称取0.01、0.02、0.04、0.08、0.16g氨基丁三醇衍生物样品，加入0.1g 1，4-二氧六环内标物及溶剂甲醇得到一系列标准溶液，摇匀，备用。
1.3.2样品制备
按照氨基丁三醇衍生物样品制备方法相同的反应比例，将氨基丁三醇样品加入多聚甲醛甲醇解聚液，在40℃超声反应(350w，1h)，得到衍生化溶液，取1g衍生化溶液和0.1g1，4-二氧六环摇匀，即得样品溶液。
制作标准曲线
在“1.2气相色谱条件”部分所述条件下，将“1.3.1标准系列溶液的制备”部分制得的氨基丁三醇衍生物标准溶液分别进样以进行气相色谱分析，所得气相色谱图之一如图1所示，其中氨基丁三醇衍生物时间为7.3min；
以标准溶液中氨基丁三醇衍生物浓度C1(g/mL)与内标物浓度C0(g/mL)的比为横坐标，氨基丁三醇衍生物峰面积P1与内标物峰面积P0的比为纵坐标，通过色谱工作站得到标准曲线，如图2所示。
标准曲线：
氨基丁三醇含量的计算
在1.2气相色谱条件部分所述条件下，将1.3.2样品制备部分制得的样品溶液进样以进行气相色谱分析，根据标准曲线得出样品中氨基丁三醇衍生物的浓度，然后通过取样质量W(g)和样品溶液体积V(mL)计算氨基丁三醇衍生物的含量B1：
氨基丁三醇的含量，计算如下：
其中，M0为氨基丁三醇衍生物的相对分子质量，M1为氨基丁三醇的物相对分子质量。
2、分析结果和讨论
2.1方法重现性测试及加标回收率试验
在“1.2气相色谱条件”部分所述条件下，选取“1.3.2样品制备”部分制得的样品溶液，重复进样6次，分别计算样品溶液中的氨基丁三醇的含量，结果如表1所示。同时，选取4个样品，分别加标(即加入氨基丁三醇衍生物)，再按“1.3.2样品制备”部分所述方法制得的样品溶液，再在“1.2气相色谱条件”部分所述条件下进样，计算加标的回收率，结果如表2所示。
表1重现性测试时样品溶液中氨基丁三醇的含量
表2加标回收测试结果
2.2精确度及重复性
取同一氨基丁三醇样品，依照“1.3.2样品制备”部分平行配制10份样品溶液，分别在“1.2气相色谱条件”部分所述条件下进样，检测结果如表3所示。
表3重复性结果
由表3可知，该方法精确度及重复性良好。
2.3不同型态氨基丁三醇样品检测
2.3.1固体氨基丁三醇检测
称取0.1515g氨基丁三醇固体，加入0.7231g 13％多聚甲醛解聚液，在40℃下超声1小时，制得氨基丁三醇衍生化溶液。称取1g衍生化溶液加入0.1g 1，4-二氧六环内标物得到待测溶液，之后在“1.2气相色谱条件”部分所述条件下进样，以进行气相色谱测试，色谱图如图3所示，依据内标定量可以计算出衍生化溶液中氨基丁三醇衍生物的浓度为14.20％，进而计算得到固体氨基丁三醇的含量100.13％。
按照《中国药典2020版》四部药用辅料氨丁三醇【含量测定】方法测定氨基丁三醇含量为101.59％，具体方法为：取氨基丁三醇约0.25g，精密称量，加水80mL溶解后，加甲基红指示液2～3滴，用盐酸滴定液(0.1mol/L)滴定，即得。每1ml盐酸滴定液(0.1mol/L)相当于12.11mg的C4H11NO3。
2.3.2反应液中氨基丁三醇含量检测
称取2g硝基丁三醇加氢制备氨基丁三醇反应液，加入2g 13％多聚甲醛解聚液，在40℃下超声1小时，制得氨基丁三醇衍生化溶液。称取1g衍生化溶液加入0.1g 1，4-二氧六环内标物得到待测溶液，之后在“1.2气相色谱条件”部分所述条件下进样，以进行气相色谱测试，色谱图如图4所示，依据内标定量可以计算出衍生化溶液中氨基丁三醇衍生物的浓度为4.55％，进而计算得到加氢反应液中氨基丁三醇的含量7.59％。采用《中国药典2020版》四部药用辅料氨丁三醇【含量测定】的酸碱滴定法测得氨基丁三醇含量为8.02％。
2.3.3酸碱滴定法与衍生化内标定量法对比进行氨基丁三醇含量检测
称取0.075g丝氨醇和1.425g氨基丁三醇固体，加入7.15g 13％多聚甲醛解聚液，在40℃下超声1小时，制得氨基丁三醇衍生化溶液。称取1g衍生化溶液加入0.1g 1，4-二氧六环内标物得到待测溶液，之后在“1.2气相色谱条件”部分所述条件下进样，以进行气相色谱测试，色谱图如图5所示，依据内标定量可以计算出衍生化溶液中氨基丁三醇衍生物的浓度为13.91％，进而计算得到固体氨基丁三醇的含量为95.68％。
同样比例的丝氨醇和氨基丁三醇固体按照《中国药典2020版》四部药用辅料氨丁三醇【含量测定】的酸碱滴定的方式进行滴定，得出氨基丁三醇含量为101.95％。
混合后的丝氨醇与氨基丁三醇经计算氨基丁三醇含量为95.0％，衍生化法与计算值比较接近，而采用酸碱滴定法的结果与计算值偏差较大。
Claims (10)
1.一种测定氨基丁三醇含量的方法，其包括如下步骤：
将氨基丁三醇与甲醛衍生化反应得到氨基丁三醇衍生物后，采用气相色谱法对所述氨基丁三醇衍生物进行含量检测，由所述氨基丁三醇衍生物的含量计算氨基丁三醇的含量，
所述氨基丁三醇与甲醛衍生化反应的反应式如下：
由所述氨基丁三醇衍生物的含量计算氨基丁三醇的含量的公式为：
其中，M0为氨基丁三醇衍生物的相对分子质量，M1为氨基丁三醇的物相对分子质量。
2.根据权利要求1所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述测定氨基丁三醇含量的方法包括以下步骤：
(1)取氨基丁三醇衍生物标样，配制成不同浓度的氨基丁三醇衍生物标准溶液，并分别加入内标物，采用气相色谱法对所述氨基丁三醇衍生物标准溶液进行检测，确定氨基丁三醇衍生物与内标物峰面积比和氨基丁三醇衍生物与内标物含量比的线性关系，建立标准曲线；
(2)将待测样品中氨基丁三醇与甲醛衍生化反应，制得样品溶液，并采用与步骤(1)相同条件的气相色谱法对所述样品溶液进行检测，由标准曲线得到氨基丁三醇衍生物的含量，并进而计算氨基丁三醇的含量。
3.根据权利要求1或2所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述氨基丁三醇与甲醛衍生化的方法包括：取氨基丁三醇，按比例加入甲醛溶液反应，得到氨基丁三醇衍生物；
优选地，氨基丁三醇与甲醛的摩尔比例为1∶2-3；
和/或，氨基丁三醇衍生物标样的制备方法包括：取氨基丁三醇标准品，按比例加入甲醛溶液反应，去除甲醇得到白色固体，用甲苯进行重结晶，经干燥得到氨基丁三醇衍生物标样。
4.根据权利要求1-3任一项所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述衍生化反应在超声下进行，超声温度为30-50℃，超声功率为200-500w，，超声时间为0.5-2h；优选地，超声温度为40℃，超声功率为350w，超声时间为1h。
5.根据权利要求3所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述甲醛溶液为甲醛甲醇溶液、甲醛乙醇溶液、多聚甲醛甲醇解聚液、多聚甲醛乙醇解聚液，更优选为多聚甲醛甲醇解聚液。
6.根据权利要求2所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述氨基丁三醇可以为液态或固体的型态；
和/或，步骤(1)中，所述内标物选自含氮、含氧化合物，如1，4-二氧六环、三乙胺，优选为1，4-二氧六环。
7.根据权利要求1-6任一项所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述气相色谱法采用的检测器为FID氢火焰检测器，分别以氢气和空气作为辅助气，以极性、中等极性或弱极性色谱柱作为色谱柱；
和/或，所述色谱柱选自HP-5毛细管色谱柱、DB-624毛细管色谱柱、DB-WAX毛细管色谱柱，优选为HP-5毛细管色谱柱。
8.根据权利要求7所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述气相色谱法的检测条件如下：
色谱柱：极性、中等极性或弱极性色谱柱；
N2载气流速：1.0-5.0mL/min；
进样量：0.1-1μL；
进样口温度：220-300℃；
检测器温度：280-350℃；
氢气流量：30-60mL/min；
空气流量：350-400mL/min，
升温程序：先在50-100℃保持恒温1-10min，再以10-30℃/min的升温速度升温至220-300℃，然后保持恒温10-15min；
优选地，气相色谱法采用分流进样。
9.根据权利要求8所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述气相色谱法的检测条件如下：
色谱柱：HP-5毛细管色谱或等效色谱柱；
N2载气流速：1.0mL/min；
进样量：1μL；
进样方式：分流进样，分流比100∶1；
进样口温度：280℃；
检测器温度：300℃；
氢气流量：30mL/min；
空气流量：400mL/min；
升温程序：在70℃恒温2min，再以20℃/min的升温速度升温至280℃，恒温12.5min。
10.根据权利要求1所述的测定氨基丁三醇含量的方法，其特征在于，所述氨基丁三醇衍生物标准溶液的含量在0.01-0.16g/g范围内；所述样品溶液中，氨基丁三醇衍生物的含量的在1-16wt％范围内；
优选地，所述测定氨基丁三醇含量的方法对氨基丁三醇含量为0.8-13.4wt％的溶液进行准确定量分析。
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