CN117986368A - 抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物科学技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体及其制备方法与应用。提供了一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体VHH02‑8D，其中，纳米抗体VHH02‑8D的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示；该纳米抗体VHH02‑8D能够特异性针对与肿瘤和炎症相关蛋白MMP9结合，能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，并且，提供的纳米抗体VHH02‑8D在小鼠乳腺癌、结肠癌以及炎症性肠病模型中均发挥出良好的治疗作用，还能通过抑制MMP9酶的活性从而很好的缓解结肠炎的炎症反应，可用于制备抗肿瘤抗炎症相关的药物，应用范围广泛。

Description

抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体及其制备方法与应用
技术领域
本申请属于生物科学技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体及其制备方法与应用。
背景技术
基质金属蛋白酶可以通过降解细胞外基质促进肿瘤转移侵袭及对肠道上皮细胞屏障的破坏有着重要作用，因此基质金属蛋白酶一直是抗肿瘤和抑制肠炎疾病的主要靶点。基质金属蛋白酶9(MMP9)是基质金属蛋白酶家族重要的一员，已证明在乳腺癌、结肠癌和肠道炎症中高表达；并且已有研究证明其在血管生成、肿瘤转移和侵袭以及肠道炎症中对组织损伤起关键作用。因此，阻断MMP9为肿瘤和炎症疾病提供新的策略。
然而，大多数MMP9抑制剂都为小分子广谱抑制剂，因选择性不高引起严重的副作用最终止步于临床研究。此外，MMP9单克隆抗体虽弥补了小分子抑制剂的部分功能缺陷，但因其难以进入MMP9凹槽结构的酶活性中心在临床试验中也宣告失败。虽然在治疗癌症和炎症性肠病中，大多MMP9抑制剂均止步于临床试验。但由于在其中发挥的重要作用，迫切需要选择性更高且能作用与催化域的MMP9抑制剂。
首先，纳米抗体具有分子量小、亲和力高、特异性强和免疫原性低的优势，使其易于穿透组织屏障靶向病灶与酶活性位点结合，大大降低副作用；其次，由于其结构相对简单，易于改造和修饰，可以与小分子或蛋白药物偶联，更有效杀伤肿瘤或治疗相关的疾病；并且还具有良好的稳定性，可以在原核或真核系统中高表达，使其在运输和生产过程中可以降低成本，更有利于应用。纳米抗体作为抗肿瘤抗炎症药物有望提高治疗的特异性和效力，同时减少副作用，为患者带来更有效和更安全的治疗选择。因此，亟需提供一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体用于制备具有广谱性的抗肿瘤抗炎症的药物进行应用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏一种具有广谱性的能够同时抗肿瘤抗炎症的纳米抗体的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体VHH02-8D，其中，纳米抗体VHH02-8D的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
在一些实施例中，纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，纳米抗体VHH02-8D中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一些实施例中，纳米抗体VHH02-8D的碱基序列如Seq.ID NO.9所示。
第二方面，本申请提供一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
提供抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原进行羊驼免疫，收集羊驼血液并进行cDNA提取，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段；
将目的DNA片段连接至载体中进行转化得到目的DNA-载体文库；
将目的DNA-载体文库进行扩增得到噬菌体文库，再进行富集筛选，并进行单克隆抗体表达和纯化，得到抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体序列。
在一些实施例中，抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原为MMP9催化域。
在一些实施例中，载体细胞选自噬菌粒pComb3X。
在一些实施例中，富集筛选的步骤中，进行2～3轮富集筛选。
第三方面，本申请提供抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备防治肿瘤或炎症相关的药物中的应用。
第四方面，本申请提供抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备检测肿瘤或炎症的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
第五方面，本申请提供一种治疗肿瘤或炎症的药物，药物包括抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体；其中，肿瘤包括乳腺肿瘤或结肠肿瘤，炎症包括肠炎。
本申请第一方面提供的一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体VHH02-8D，其中，纳米抗体VHH02-8D的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示；该纳米抗体VHH02-8D能够特异性针对与肿瘤和炎症相关蛋白MMP9结合，能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，并且，提供的纳米抗体VHH02-8D在小鼠乳腺癌、结肠癌以及炎症性肠病模型中均发挥出良好的治疗作用，能够明显的抑制乳腺癌的转移，以及乳腺癌和结肠癌的发发展，还能通过抑制MMP9酶的活性从而很好的缓解结肠炎的炎症反应，可用于制备抗肿瘤抗炎症相关的药物，应用范围广泛。
本申请第二方面提供的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，该制备方法使用抗肿瘤抗炎症相关的目的蛋白抗原对羊驼进行免疫来获得免疫文库，通过筛选获得针对MMP9催化域的特异性纳米抗体，该制备方法简单方便，有利于广泛应用。
本申请第三方面提供的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备防治肿瘤或炎症相关的药物中的应用；由于抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，因此，有利于在制备防治肿瘤或炎症相关的药物中的应用。
本申请第四方面提供的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备检测肿瘤或炎症的检测试剂或检测试剂盒中的应用；由于抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，因此，有利于在制备检测肿瘤或炎症的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请第五方面提供的治疗肿瘤或炎症的药物，药物包括抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体；其中，肿瘤包括乳腺肿瘤或结肠肿瘤，炎症包括肠炎；由于提供的纳米抗体能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，因此，该纳米抗体能够作为制备治疗肿瘤或炎症的药物进行使用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的MMP9催化域重组蛋白免疫文库构建以及纳米抗体筛选流程。
图2是本申请实施例提供的候选纳米抗体的表达纯化与亲和力以及抑制作用表征。
图3是本申请实施例提供的VHH02-8D在体外对乳腺癌细胞的抑制作用分析图。
图4是本申请实施例提供的VHH02-8D在体内对小鼠乳腺癌模型的治疗作用分析图。
图5是本申请实施例提供的VHH02-8D在炎症性肠病模型中具有良好的治疗作用分析图。
图6是本申请实施例提供的VHH02-8D在小鼠结肠癌模型中的治疗作用。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体VHH02-8D，其中，纳米抗体VHH02-8D的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
本申请实施例第一方面提供的一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，纳米抗体包括纳米抗体VHH02-8D，其中，纳米抗体VHH02-8D的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示；该纳米抗体VHH02-8D能够特异性针对与肿瘤和炎症相关蛋白MMP9结合，能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，并且，提供的纳米抗体VHH02-8D在小鼠乳腺癌、结肠癌以及炎症性肠病模型中均发挥出良好的治疗作用，能够明显的抑制乳腺癌的转移，以及乳腺癌和结肠癌的发发展，还能通过抑制MMP9酶的活性从而很好的缓解结肠炎的炎症反应，可用于制备抗肿瘤抗炎症相关的药物，应用范围广泛。
在一些实施例中，纳米抗体VHH02-8D的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示，Seq.IDNO.1为：
DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHTLYTLAIGWFRQAPGKEREVISCISNSGRST YFANSAKGRFTMSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADFRPLGTCRDGGYHYWGQ GTQVTVSS。
在一些实施例中，纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。
其中，纳米抗体VHH02-8D中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2为DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS。
FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3为GWFRQAPGKER。
FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID NO.4为ANSAKGRFTMSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC。
FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5为YWGQGTQVTVSS。
CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6为GHTLYTLAI。
CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，SEQ ID NO.7为EVISCISNSGRSTYF。
CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，SEQ ID NO.8为AADFRPLGTCRDGGYH。
在一些实施例中，纳米抗体VHH02-8D的碱基序列如Seq.ID NO.9所示，Seq.IDNO.9为
GATGTTCAGCTGCAGGAAAGCGGCGGCGGTCTGGTTCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGTC
TGAGTTGTGCCGCAAGCGGTCATACCCTGTATACCCTGGCCATTGGTTGGTTTCGCCAG
GCACCGGGTAAAGAACGCGAAGTGATTAGCTGTATTAGCAATAGTGGCCGTAGTACCTA
TTTTGCAAATAGCGCAAAAGGTCGTTTTACCATGAGCCGTGATAATGCAAAAAATACCG
TGTATCTGCAGATGAATAGTCTGAAACCGGAAGATACCGCCGTTTATTATTGTGCAGCA
GATTTTCGTCCGCTGGGTACCTGTCGCGATGGTGGCTATCATTATTGGGGTCAGGGTACCCAGGTGACCGTTAGTAGT。
得到的纳米抗体VHH02-8D为特异性针对MMP9的纳米抗体，并且通过原核表达即具有高产量以及良好的结合活性。纳米抗体相对于传统抗体具有许多优点，其中一些主要的优点包括：(1)尺寸小：纳米抗体是小型抗体，通常由单一抗原结合域组成，这使它们能够更容易穿过细胞膜和组织，进入目标区域，提高药物传递效率。(2)亲和力高：纳米抗体通常具有较高的抗原亲和力，可以更紧密地结合目标分子，提供更高的特异性和效力。(3)稳定性高：纳米抗体具有较强的物理和化学稳定性，能够在各种环境条件下保持其活性，这对于制备、储存和运输非常有利。(4)人源化简单：纳米抗体可以通过工程技术轻松人源化，减少了免疫原性问题，降低了药物治疗中的不良反应风险。(5)可微生物表达：纳米抗体可以通过微生物表达系统(如大肠杆菌)进行生产，提高了制备效率，降低了生产成本。(6)渗透力强：由于其小尺寸，纳米抗体更容易渗透到组织深处，包括固体肿瘤等难以治疗的部位。(7)可识别隐藏表位：纳米抗体可以识别一些传统抗体难以达到的隐藏抗原表位，这对于研究和治疗特定疾病非常有帮助。(8)高度可定制：纳米抗体可以通过工程技术进行定制，以满足不同疾病和治疗需求，包括制备多肽结合、药物缀合等。
第二方面，本申请提供一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
S01.提供抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原进行羊驼免疫，收集羊驼血液并进行cDNA提取，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段；
S02.将目的DNA片段连接至载体中进行转化得到目的DNA-载体文库；
S03.将目的DNA-载体文库进行扩增得到噬菌体文库，再进行富集筛选，并进行单克隆抗体表达和纯化，得到抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体序列。
本申请第二方面提供的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，该制备方法使用抗肿瘤抗炎症相关的目的蛋白抗原对羊驼进行免疫来获得免疫文库，通过筛选获得针对MMP9催化域的特异性纳米抗体，该制备方法简单方便，有利于广泛应用。
步骤S01中，提供抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原进行羊驼免疫，收集羊驼血液并进行cDNA提取，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段。
在一些实施例中，抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原为MMP9抗原。在一些实施例中，提供的抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原为MMP9催化域重组蛋白。
步骤S02中，将目的DNA片段连接至载体中进行转化得到目的DNA-载体文库。
在一些实施例中，载体细胞选自噬菌粒pComb3X。
步骤S03中，将目的DNA-载体文库进行扩增得到噬菌体文库，再进行富集筛选，并进行单克隆抗体表达和纯化，得到抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体序列。
在一些实施例中，富集筛选的步骤中，进行2～3轮富集筛选。
在一些实施例中，构建了库容为3.45×109的文库，经过三轮筛选后得到了30个阳性克隆，并ELISA方法分别对这六个纳米抗体与MMP9催化域重组蛋白的亲和力进行评估，其中VHH02-8D的亲和力最好，因此挑选出来进行后续实验。
本申请实施例第三方面提供抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备防治肿瘤或炎症相关的药物中的应用。
本申请实施例第三方面提供的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备防治肿瘤或炎症相关的药物中的应用；由于抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，因此，有利于在制备防治肿瘤或炎症相关的药物中的应用。
本申请实施例第四方面提供抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备检测肿瘤或炎症的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请实施例第四方面提供的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备检测肿瘤或炎症的检测试剂或检测试剂盒中的应用；由于抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，因此，有利于在制备检测肿瘤或炎症的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本申请实施例第五方面提供一种治疗肿瘤或炎症的药物，药物包括抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体；其中，肿瘤包括乳腺肿瘤或结肠肿瘤，炎症包括肠炎。
本申请实施例第五方面提供的治疗肿瘤或炎症的药物，药物包括抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体；其中，肿瘤包括乳腺肿瘤或结肠肿瘤，炎症包括肠炎；由于提供的纳米抗体能够有效抑制MMP9蛋白酶的活性，能够作为MMP9抑制剂，因此，该纳米抗体能够作为制备治疗肿瘤或炎症的药物进行使用。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体及其制备方法
抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法如图1所示，具体包括如下：
(一)免疫文库构建
1.免疫：选用8月龄以上羊驼一头，取2ml阴性血清保存备用。观察3-5天后，启动免疫，免疫剂量1mg/次/头。分别0、14以及18天进行三次免疫(1mg抗原与弗式完全佐剂混匀乳化，对羊驼背部进行皮下多点免疫注射8点以上)，并在免疫7天后采血检测血清效价。三免检测效价合格，免疫加强，5天后，采集80ml外周血，分离血清加入Trizol保存备用。
2.cDNA获取：Trizol法提取总RNA，使用Takara反转录试剂盒对得到的总RNA进行反转录。
3.PCR扩增：抗体基因第一轮PCR，以cDNA为模板，每对引物扩增体系(20μL)如表1所示，扩增程序如表2所示。
表1
按照下表2配置并进行PCR反应：
表2
抗体基因序列第二轮PCR，以第一轮PCR产物700bp目标片段为模板，每对引物扩增体系(20μL)同表1所示，扩增程序同表2所示。使用胶回收试剂盒按说明书胶回收第二轮扩增片段，并用sfiI酶对回收获得的片段2μg以及pComb3X载体10μg分别进行酶切，50℃水浴锅中反应60min，然后进行切胶回收。将切胶回收的载体与目的片段进行连接，16℃过夜连接，反应体系(600μL).(连接体系如表3所示)。
表3
4.电转化：经纯化后的连接产物与XL1-Blue感受态冰浴混匀，分装80μL/杯于电转杯中，1800V电击，电击后混合物转入含氨苄青霉素和四环素的2×YT培养基中，使用2×YT定容至200mL。定容后的文库分别在37℃，250rpm条件下震荡培养复苏1小时，此时即为抗体菌液文库。从文库中分别取100μL菌液使用2×YT培养基按10倍稀释法(100μL菌液+900μL 2×YT)稀释1000倍后，吸取100μL稀释菌液涂布2×YT(含有氨苄青霉素和四环素)半固体培养基平皿，37℃过夜静置培养，次日计数单克隆菌落并计算转化子数量。计算转化子文库转化子数量:单克隆菌落计数×单位体积稀释倍数×文库总体积＝214×100000×200＝4.28×109。
5.文库质量分析:从文库涂布平皿中随机挑取36个克隆测序，其中原载体3个，套峰3个，错误序列1个，序列正确率80.5％，由此计算文库效价:单克隆菌落计数×单位体积稀释倍数×文库总体积×正确率＝214×100000×200＝4.28×109×80.5％＝3.45×109。
6.噬菌体文库表达扩增：将上一步剩余的文库菌液继续震荡37℃，250rpm培养1小时后，加入VCSM13辅助噬菌体静置侵染半小时，然后进一步培养37℃，250rpm培养1小时，最后离心收集菌体沉淀并重浮于100mL 2×YT培养基(含氨苄青霉素、四环素和卡那霉素)中，在30℃、225rpm的条件下过夜表达扩增。次日收集上清液，使用4％ PEG800和3％ Nacl冰浴、离心获得噬菌体沉淀。获得的噬菌体沉淀使用PBS(pH7.4)重悬溶解并使用0.2μm针头滤器过滤除菌，吸取10μL过滤文库，使用2×YT培养基100倍稀释法(10μL+990μL)稀释108倍后取10μL稀释液感染100μL XL1-blue，30分钟后涂布2×YT半固体培养基平皿，次日计数单克隆菌落数计算扩增文库噬菌体浓度。过滤后的文库加入体积7％的DMSO冻存于-80℃保存。
(二)纳米抗体筛选
1.包被：用PBS配制终浓度25μg/mL的抗原MMP9，在高吸附免疫8孔条中，加100μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被，而后弃去溶液，PBST溶液洗涤5次；
2.封闭：加入200μL封闭液(交替用5％脱脂牛奶和0.5％ BSA)封闭反应孔，室温下孵育1h后弃去溶液，PBST溶液洗涤5次；
3.加文库：加入100μL/孔扩增后噬菌体文库，室温孵育1h后弃液体，PBST清洗5次；
4.噬菌体的洗脱：加100μL/孔的0.1M HCl溶液，室温孵10min洗脱与抗原特异性结合的噬菌体，收集洗脱液800μL于1.5mL离心管中，加入1M Tris-HCl 64μL充分混匀以中和洗脱的噬菌体中的HCl，4℃保存；
5.感染细菌：将洗脱下来的噬菌体加入到用10mL的2×YT(含有10mg/L Tet)液体培养基培养的E.coli TG1(OD600 nm＝0.5)菌液中，37℃孵育1h；加入40mL的2×YT(含有2％glucose,100mg/L Amp)液体培养基，37℃，200rpm震荡培养至OD600 nm＝0.5；
6.辅助噬菌体超感染：向这50mL菌液，加入辅助噬菌体VSCM13达到1010pfu/mL的终浓度，37℃，200rpm震荡培养1h；
7.筛选扩增噬菌体：将50mL菌液5000rpm离心10min，弃上清(除去含葡萄糖、游离的噬菌体、和游离的辅助噬菌体)，取沉淀用50mL 2×YT(含有100mg/L Amp,50mg/L Kan，50μM IPTG)液体培养基中重悬，并转移液体至250mL三角瓶中，37℃,200rpm过夜培养(文库中的噬菌体具有氨苄青霉素抗性，辅助噬菌体VSCM13有卡那霉素抗性，故加双抗生素可筛选得到被文库噬菌体和辅助噬菌体同时感染了的E.coli TG1)。
8.将过夜培养的菌7000rpm离心，20min，取40mL上清，加入10mL PEG 8000/NaCl溶液(菌液上清：PEG 8000/NaCl＝1：4)，混匀后冰上静置1h以沉淀噬菌体。其余上清4℃保存，用于测定每轮筛选效价；
9.于4℃离心(10000rpm,20min)弃上清后，用1mL PBS重悬沉淀，4000rpm离心1min去除不溶于PBS的物质，得到用于下一轮筛选的噬菌体文库，以此为一轮筛选；
10.对得的噬菌体文库进行滴度测定，方法同1.的步骤8-9；
11.重复以上步骤进行3轮筛选。通过滴度计算富集程度和筛选效果，当富集比(与第一轮筛选的回收率比值)大于100倍以上时，认为筛选足够，进行ELISA检测。
12.分离噬菌体单克隆：把第3轮筛选所洗脱的噬菌体文库加入到10mL用2×YT(含有10mg/L Tet)液体培养基培养的E.coli TG1(OD 600nm＝0.5)菌液，37℃孵育1h；按10-1到10-4进行梯度稀释，然后各取100μL均匀涂布于2×YT(含有100mg/L Amp)固体平板上，37℃过夜培养；在过夜培养的平板上随机挑取96个明显的单菌落于分装有2×YT(含2％glucose,100mg/L Amp)液体培养基400μL，的96孔深孔板中，37℃，200rpm培养至OD 600nm＝0.5；加入400μL 2×YT液体培养基和终浓度为100mg/L Amp，50mg/L Kan，50μM IPTG，以及1010VSCM13辅助噬菌体，37℃，200rpm过夜培养；5000rpm离心10min，得到的上清为融合了单域抗体的单克隆噬菌体，转移上清到无菌的带封口膜的96孔深孔板中，4℃保存备用。
13.ELISA检测：用PBS配制终浓度25μg/mL的抗原MMP9，在高吸附的96酶标板加100μL/孔抗原蛋白，4℃过夜包被后弃去液体，用PBST清洗5次；同时包被相同浓度的BSA作为阴性对照；加入200μL封闭液(5％脱脂牛奶)，室温封闭1h后弃液体，PBST清洗5次；
8)分别加入分离培养的单个噬菌体的菌液上清100μL，室温轻微震荡2h后弃去液体，PBST清洗5次；每孔加入100μL稀释8000倍M13 Bacteriophage Antibody(HRP),MouseMab，室温孵育1h后弃去抗体，PBST清洗5次；加入100μL TMB底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，加入100μL 1M HCl终止反应并在OD450 nm处测定吸光度；选取具有明显阳性的单克隆菌液上清，各取100μL上清，重复以上步骤作为实验组，同时以相同浓度BSA替换抗原S1包被于酶标板中，进行与实验组相同的实验作为阴性对照组，以实验组与对照组吸光度的比值来判断阳性克隆，从而筛选出MMP9特异性纳米抗体并送测序。
(三)纳米抗体表达纯化与表征
1.表达纯化方法包括：
1)将pET23a-VHH重组质粒按照说明书转化到表达感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，并涂布在固体培养基中。
2)挑取单菌落于6mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养5h，然后按1:100转接到新鲜的250mL LB培养基中37℃、200rpm条件培养；待菌液OD 600nm＝0.6-0.8时，加终浓度为0.1mM IPTG诱导剂，16℃诱导培养15h。
3)将培养后菌液4000rpm,10min离心收集菌体，然后用Binding buffer(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH为7.4)重悬细菌，并进行超声破碎(350W，work5s，off3s，时间20min)。然后18000rpm,4℃离心15min，收集沉淀；
4)将沉淀用含有2M尿素，1mM EDTA的PBS重悬清洗后离心沉淀，随后使用含有1％TritonX100的PBS重悬超声充分洗涤后离心，取沉淀加入适量的6M尿素溶液使沉淀充分溶解后，于4℃、PBS中过夜透析，收集得到蛋白样品。
性能测试及结果分析
(一)测序及SDS-PAGE分析
把候选抗体送测序然后构建表达载体进行表达纯化并分别命名为VHH02-8D,VHH02-4Y,VHH02-6C,VHH02-9J,VHH02-2F和VHH02-3G；对表达纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测；蛋白浓度使用PierceTMBCA蛋白定量试剂盒进行测定。如图2的a所示为6个候选纳米抗体的命名以及表达纯化后的SDS-PAGE胶图。
得到的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体序列VHH02-8D的序列为：
DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGHTLYTLAIGWFRQAPGKEREVISCISNSGRSTYFANSAKGRFTMSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADFRPLGTCRDGGYHYWGQGTQVTVSS。
(二)ELISA法检测纳米抗体与MMP9的亲和作用:包被抗原并封闭，操作同上述ELISA；加入100μL/孔倍比稀释的单域抗体，于室温孵育1h后弃液体，PBS清洗5次；每孔加入100μL按1：3000稀释的Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT，室温轻微震荡1h后弃去抗体并使用PBST清洗5次；加入100μL TMB底物室温轻微震荡至样品明显产生蓝色，然后加入100μL 1MHCl终止反应，并在OD 450nm处测定其OD值。
结果如图2的b结果显示，候选的6个纳米抗体对MMP9均具有良好的亲和作用，其中以VHH02-8D最好。
(三)生物层干涉法(BLI)检测纳米抗体于MMP9的亲和作用：
1)MMP9生物素化：使用生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(NHS-Biotin)并按照其说明书操作对抗原MMP9进行生物素化，使其可以连接在分子相互作用仪配套的链霉素亲和素生物传感器上并用于检测；
2)将已生物素化的MMP9-Bio使用PBS稀释至0.1mg/mL；分别使用PBS稀释纳米抗体稀释成4个不同的浓度；按照说明书进行开机及程序设定，并提前水化链霉素亲和素生物传感器10min以上；然后使用150μL PBS平衡传感器直至基线平稳；将150μL MMP9-Bio放入样品槽中使抗原分子偶联到传感器上；使用150μL PBS平衡传感器直至基线平稳；使用150μL特定浓度的单域抗体同传感器上偶联的抗原分子进行结合；将结合纳米抗体的生物传感器放入150μL PBS中测定抗原抗体分子的解离；
3)重新装载新的链霉素亲和素生物传感器同抗原分子进行偶联，测定多个不同浓度抗体与抗原分子的结合与解离；
4)完成多个浓度的结合与解离后，使用仪器专用分析工具BLItz Pro 1.3.0.2分析数据，得到平衡解离常数kD。
结果表明VHH02-8D与MMP9的结合速度非常迅速，但存在一定的解离，如图2的c所示，BLI技术分析VHH02-8D(700nM、350nM、150nM)与MMP9的相互作用，根据仪器配套软件计算得出：亲和常数kD＝20.63nM，说明VHH02-8D对MMP9有理想的亲和力。
(四)明胶降解试剂盒检测纳米抗体对MMP9酶活性的抑制：稀释好不同浓度的纳米抗体分别与1μM的抗原在室温下孵育1小时，然后按照试剂盒(ab234057)说明书操作并把孵育后混合液加入到反应孔中，在酶标仪下检测实时荧光曲线来检测纳米抗体对MMP9酶活性的抑制作用。
结果如图2的d所示，表明VHH02-8D对MMP9酶活性具有明显的抑制作用，并且在浓度为125nM时就具有50％的抑制作用。
(五)纳米抗体VHH02-8D在体外对乳腺癌细胞系的迁移和侵袭具有抑制作用
1.划痕实验：按每孔1.2×106个4T1细胞铺6孔板，过夜培养至细胞密度为90％。第二天去除培养基后，加入每孔1mL PBS，使用200μL移液器吸头在孔底部划痕。去除PBS，每孔换2mL含有200μg/mL VHH02-8D的培养基继续培养细胞，每过24小时使用显微镜对细胞划痕进行拍照并计算愈合率。
2.Transwell:将matrixgel放置于4℃冰箱过夜融化，使用预冷的PBS稀释matrixgel基质胶至工作浓度，每个transwell上室加入800μL稀释后的matrixgel基质胶后放入37℃培养箱使基质胶凝固，1.5小时后取出培养板，使用无血清的培养基重悬4T1细胞并加入在基质胶上，然后将带有细胞的tranwell上室放置在含有1mL全培养基的下室上放入培养箱。24小时后，取出上室并去除上室的细胞悬液及基质胶。使用结晶紫染色并用PBS清洗后，使用显微镜对上室底部膜上的细胞拍照并计数，计算侵袭效率。
结果如图3的a所示，加入VHH02-8D共培养后，与对照组相比VHH02-8D组的细胞划痕在48小时后仍无明显变化，而对照组在48小时后划痕明显面积明显缩小，根据伤口愈合率分析，VHH02-8D组与对照组相比具有显著的统计学差异，说明VHH02-8D能够强烈抑制4T1细胞迁移。图3的b为使用Transwell实验检测VHH02-8D对4T1细胞侵袭的结果，加入了VHH02-8D后，穿过小孔的细胞明显减少，且与对照组比有明显的统计学差异，说明VHH02-8D能够有效抑制4T1细胞侵袭。VHH02-8D在体外对乳腺癌细胞系4T1的侵袭具有明显的抑制作用。
(六)VHH02-8D在体内对乳腺癌小鼠具有明显的治疗作用
1.小鼠乳腺癌模型建立：取4T1-luc细胞系使用RPMI-1640培养基培养至对数生长期，消化下细胞使用生理盐水稀释至6×105/mL并置于冰上。取6周龄BALB/c小鼠按每只100μL尾静脉注射4T1-luc细胞悬液。每只小鼠按每只每天100μg腹腔注射VHH02-8D，并监控记录小鼠体重及生存情况。
结果如图4的a所示，建模以及用药治疗后，第15天使用活体成像技术拍摄荧光表示肿瘤大小。结果表明，单独注射VHH02-8D可以限制乳腺癌细胞向肺部转移。同时我们还使用PDL1抗体与VHH02-8D联合治疗的方法，如图4的a所示，注射VHH02-8D纳米抗体100μg/只(5mg/kg)，或PDL1(200μg/只)(10mg/kg)，建模第15天拍摄荧光表示肿瘤大小。结果显示，VHH02-8D的保护效果与PDL1抗体的效果相当，两者联合治疗可以明显抑制乳腺癌细胞向肺部的转移。
图4的b表示的是空白组、肿瘤对照组、VHH02-8D组、PDL1组和VHH02-8D+PDL1组的生存曲线，结果显示VHH02-8D单独治疗可以有效减缓乳腺癌小鼠的死亡时间，且与PDL1抗体治疗效果相当，当两者联合使用时，能够大大的延长乳腺癌小鼠的存活时间。
将空白组、对照组、单独注射VHH02-8D、注射VHH02-8D联合PDL1抗体组、注射PDL1抗体的小鼠的肺部体重进行测定，如图4的c所示，可以看出，单独使用VHH02-8D治疗小鼠肺部重量明显减轻，表明肿瘤向肺部转移数目明显减少，且与单独注射PDL1抗体的效果相当，当两者联合治疗可以明显抑制乳腺癌细胞向肺部转移，肺部重量明显减轻。
进一步，对肺部细胞进行染色，如图4的d所示，图中分别为20倍镜下空白组、肿瘤对照组、VHH02-8D组、PDL1组和VHH02-8D+PDL1组的肺部细胞染色分析图；结果表明，单独使用VHH02-8D治疗限制了乳腺癌细胞向肺部的转移，转移数目明显减少，且与单独注射PDL1抗体的效果相当，当两者联合治疗可以明显抑制乳腺癌细胞向肺部转移。因此VHH02-8D可以作为治疗乳腺癌的潜力药物，并且可以通过与PDL1抗体联用大大增加治疗效果。
(七)VHH02-8D在体内对结肠炎小鼠的作用
1.实验小鼠分组：雌性C57BL/6J小鼠随机分组，分为三组分别是：空白对照组，DSS组以及VHH02-8D组，每组各5只。小鼠在本实验室适应性饲养7天，观察饮食、活动、大小便等情况并称重。
2.小鼠干预方法：空白对照组小鼠整个实验时期以纯水喂养，DSS组以及VHH02-8D组小鼠则以2.5％ DSS水溶液喂养7天；分别在第1、3、5、5.5、6、6.5天对治疗组小鼠进行腹腔注射VHH02-8D(溶于生理盐水)2.5mg/kg；DSS组和空白对照组以相同操作注射等体积生理盐水。
3.小鼠情况记录：开始喂DSS时记录初始体重并记为第0天，每天记录小鼠体重，观察粪便性状和便血情况。
4.小鼠处死和标本收集：第7天收集标本并处死小鼠，水合氯醛麻醉小鼠后进行眼球取血；打开腹腔收集小鼠肛门至盲肠保留完整结直肠，测定、记录和对比结肠长度；清洗结肠去除粪便杂物，选取结肠远端于适量的4％多聚甲醛进行固定，石蜡固定切片后进行HE染色。
在实验性结肠炎中，评估炎症程度的方法一般为计算DAI得分，依据小鼠体重变化、粪便性状和便血情况进行DAI评分，DAI＝体重指数得分+粪便形状得分+便血情况得分，分数越高代表结肠炎症状越严重。具体评分标准见表4。
表4疾病活性指数评分标准
病理学切片评分主要根据上皮屏障的受损情况以及炎症性细胞的浸润程度进行评分。通过显微镜(40X和100X)观察整个肠道病理切片,分对肠道炎症、上皮层溃疡以及隐窝损伤进行评分，具体评分细则如表5，总分为三者得分之和。
表5病理切片评分标准
组织石蜡切片和苏木素-伊红(HE)染色
组织脱水透明、石蜡包埋后切片，将切好的片子45℃烘干后可用于后续实验；
脱蜡复水：片子浸泡于二甲苯中，2缸，每次5min以脱去切片中的石蜡；随后分别依次于100％、90％、80％和70％酒精中浸泡，各2-3min，保证不要干片；最后浸入ddH2O中洗涤2次，每次2min，则可进行染色；
染色：将已用去离子水冲洗好的切片置于苏木精水溶液中染色10-30min，自来水冲洗2s；于1％盐酸乙醇中褪色，30s；自来水返蓝，20min；将切片分别置于50％以及80％乙醇中各2min；用伊红乙醇液染色1-2min；
脱水透明：依次置于95％、100％Ⅰ、100％Ⅱ乙醇中，各2min；随后置于二甲苯I和二甲苯II，各2min；
中性树胶封固：向切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，室温晾干，贴上标备用。
光学显微镜观察：染好的切片放在显微镜下观察，比较不同组之间小鼠结肠病理变化，并利用自动成像系统拍照。
结果如图5的a所示，每天观察记录体重变化及疾病活动指数，结果表明，DSS组小鼠体重于第5天后显著下降，相较于第0天，第7天处死前小鼠体重平均下降了17.5％；而VHH02-8D组小鼠体重的在第6天才开始下降，并且到第7天平均体重只下降了5.2％；从疾病活动指数来看，VHH02-8D最后得分平均在4.5，而DSS组最后的平均得分高达11分；并且小鼠的结肠长度来看如图5的b，VHH02-8D组的结肠与DSS组相比较也明显更长；表明VHH02-8D治疗可以明显减轻DSS诱导的结肠炎体重下降以及疾病症状。
进一步，对小鼠结肠炎实验中三组小鼠的结肠组织切片进行HE染色并进行对比分析，如图5的c所示，三组小鼠的结肠组织组织切片在HE染色后分别放大倍数40倍和100倍的显微镜镜下图可得，与DSS组相比，注射了VHH02-8D对小鼠结肠组织炎性细胞的浸润、隐窝破坏以及上皮层溃疡均有明显的改善，且组织病理学得分也显著降低。
结果充分表明，特异性MMP9的抑制剂VHH02-8D可以通过抑制MMP9的活性从而有效缓解结肠炎的炎症反应。
(八)VHH02-8D在体内对结肠癌小鼠的作用
1.实验小鼠分组：雌性C57BL/6J小鼠随机分组，分为三组分别是：空白对照组，DSS组以及VHH02-8D组，每组各8只。小鼠在本实验室适应性饲养60天，观察饮食、活动、大小便等情况并称重。
2.小鼠干预方法：空白对照组小鼠整个实验时期以纯水喂养，DSS组以及VHH02-8D组小鼠则分别在第5、26以及47天以2.5％ DSS水溶液连续喂养5天后换成蒸馏水喂养；在第0和43天腹腔注射AOM(12.5mg/kg)；对VHH02-8D组小鼠隔天进行腹腔注射VHH02-8D(溶于生理盐水)2.5mg/kg；DSS组和空白对照组以相同操作注射等体积生理盐水。
3.小鼠情况记录：开始喂DSS时记录初始体重并记为第0天，每天记录小鼠体重，观察粪便性状和便血情况。
4.小鼠处死和标本收集：第60天收集标本并处死小鼠，水合氯醛麻醉小鼠后进行眼球取血；打开腹腔收集小鼠肛门至盲肠保留完整结直肠，测定、记录和对比结肠长度以及对结肠上的肿瘤进行计数；清洗结肠去除粪便杂物，选取结肠远端于适量的4％多聚甲醛进行固定，石蜡固定切片后进行HE染色。
结果如图6的a所示，以2.5％ DSS诱导构建小鼠的结肠癌模型，分别在DSS处理阶段腹腔注射VHH02-8D抑制剂溶液或生理盐水(DSS组)，并以蒸馏水喂养的小组作为空白对照组，以观察VHH02-8D在结肠癌中的治疗效果。
如图6的b所示，为小鼠结肠炎相关结肠癌实验中三组小鼠的体重结果分析图，以及疾病活动指数。每天观察不同实验组小鼠的体重变化如图6的b左图所示；图6的b右为小鼠结肠炎相关结肠癌实验中三组小鼠的腹泻、便血以及体重变化综合得分结果分析图，结果表明，VHH02-8D组小鼠体重与空白对照组小鼠相似，无明显的体重丢失，而DSS组小鼠体重丢失明显，特别是在DSS处理阶段，体重急剧下降。从疾病活动指数来看，VHH02-8D组小鼠的得分比DSS组明显更低，表明VHH02-8D治疗能有效改善了小鼠便血、腹泻以及体重下降的症状。
图6的c为三组小鼠的结肠以及结肠上的肿瘤数目，图中可见，VHH02-8D治疗组的结肠与DSS组相比，其肿瘤数目明显见减少，且具有显著的统计学差异。表明VHH02-8D治疗可以减少结肠上的肿瘤形成。
进一步，进行结肠组织HE染色，染色结果如图6的d所示，图中依次为小鼠结肠癌实验中空白对照组、DSS组和VHH02-8D组三组小鼠的结肠组织切片在HE染色后分别放大倍数为40倍和100倍的显微镜镜下图；结肠组织HE染色结果表明，与DSS组相比，注射了VHH02-8D对小鼠结肠组织炎性细胞的浸润、隐窝破坏以及上皮层溃疡均有明显的改善。同时，明显限制了肿瘤的发生，结肠癌肿瘤数目明显减少。结果充分表明，特异性MMP9的抑制剂VHH02-8D可以通过抑制MMP9的活性从而有效缓解结肠癌的发展。
综上，本申请使用MMP9催化域重组蛋白对羊驼进行免疫来获得针对MMP9催化域的免疫文库，通过筛选获得针对MMP9催化域的特异性纳米抗体来开发新的MMP9纳米抗体抑制剂以应用于相关的癌症以及炎症性疾病的治疗。我们成功构建了库容为3.45×109，经过三轮筛选后得到了30个阳性克隆，随后我们选取前六个进行表达纯化，并ELISA方法分别对这六个纳米抗体与MMP9催化域重组蛋白的亲和力进行评估，其中VHH02-8D的亲和力最好，因此挑选出来进行后续实验。用生物膜层干涉技术进一步检测VHH02-8D与MMP9催化域亲和力kD为20.63nM；以及用小分子荧光底物来检测其对MMP9蛋白酶活性的抑制作用，VHH02-8D对MMP9蛋白酶活性的抑制作用非常明显，仅用125nM的纳米抗体就可以达到50％的抑制作用，说明VHH02-8D有巨大的潜力作为MMP9抑制剂，以用于治疗相关的疾病。因此首先用乳腺癌细胞系4T1通过划痕实验和侵袭实验验证了VHH02-8D对乳腺癌细胞系4T1的转移和侵袭具有明显的抑制作用。随后分别使用乳腺癌，结肠癌等小鼠肿瘤模型验证了VHH02-8D在体内对MMP9高表达对癌症模型均有很好的治疗作用，并且在乳腺癌模型中，还开发了VHH02-8D与抗PDL1抗体联合用药的治疗方法，大大了减缓了乳腺癌的发生和进程，并且明显的延长了乳腺癌模型小鼠的生存时间。除了在癌症模型中发挥作用，VHH02-8D在炎症性肠病模型中也能够明显的抑制溃疡性结肠炎所伴随的血便症状，同时降低溃疡性结肠炎所伴随的腹泻症状。因此本研究基于纳米抗体开发了一种全新的MMP9抑制剂，首次发现VHH02-8D可以治疗乳腺癌，结肠癌以及结肠炎等多种疾病，并有望作为广谱抗癌药物以及炎症治疗药物。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括纳米抗体VHH02-8D，其中，所述纳米抗体VHH02-8D的氨基酸序列如Seq.ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；其中，所述纳米抗体VHH02-8D中，FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体VHH02-8D的碱基序列如Seq.ID NO.9所示。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原进行羊驼免疫，收集所述羊驼血液并进行cDNA提取，以所述cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段；
将所述目的DNA片段连接至载体中进行转化得到目的DNA-载体文库；
将所述目的DNA-载体文库进行扩增得到噬菌体文库，再进行富集筛选，并进行纳米抗体表达和纯化，得到抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体序列。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤抗炎症相关目的蛋白抗原为MMP9催化域蛋白。
6.根据权利要求4所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述载体细胞选自噬菌粒pComb3X。
7.根据权利要求4所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述富集筛选的步骤中，进行2～3轮富集筛选。
8.权利要求1～3任一项所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备防治肿瘤或炎症相关的药物中的应用。
9.权利要求1～3任一项所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体在制备检测肿瘤或炎症的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
10.一种治疗肿瘤或炎症的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1～3任一项所述的抗肿瘤抗炎症相关的纳米抗体；其中，所述肿瘤包括乳腺肿瘤或结肠肿瘤，所述炎症包括肠炎。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130224210A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Gilead Biologics, Inc. Antibodies to matrix metalloproteinase 9
CN110885375A (zh) * 2019-12-20 2020-03-17 南京融捷康生物科技有限公司 特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体及产品与应用
CN113698486A (zh) * 2021-08-12 2021-11-26 深圳大学 Mmp-9纳米抗体及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130224210A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Gilead Biologics, Inc. Antibodies to matrix metalloproteinase 9
CN110885375A (zh) * 2019-12-20 2020-03-17 南京融捷康生物科技有限公司 特异性针对MMP9蛋白ZnMc结构域的单域抗体及产品与应用
CN113698486A (zh) * 2021-08-12 2021-11-26 深圳大学 Mmp-9纳米抗体及其制备方法与应用

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