CN117986353A - 重组人xvii型胶原蛋白、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本专利申请公开了一种重组人XVII型胶原蛋白、其制备方法及应用。所述重组人XVII型胶原蛋白为人XVII型胶原蛋白的截短蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。具有毛囊修复、所述重组人XVII型胶原蛋白来自传统上认为无生物活性的非G‑X‑Y结构区，但却具有良好的毛囊修复、毛发再生生物活性，甚至超过了促毛发生长的常用药米诺地尔。
Description
技术领域
本发明属于基因工程、合成生物学技术领域，涉及一种重组人XVII型胶原蛋白及制备方法和应用
背景技术
目前已经发现的胶原蛋白约有20种。各种类型的胶原蛋白的一个共同点就是其氨基酸排列有明显规律，会频繁出现G-X-Y重复结构，其中，G代表甘氨酸，X和Y代表另外两种氨基酸，最常见的是脯氨酸和羟脯氨酸。一般认为，胶原蛋白的G-X-Y结构区与其三螺旋结构的形成及生物学活性密切相关，而非G-X-Y结构区仅起到辅助作用。
人XVII型胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋白，是细胞中半桥粒的一种组成成分，在上皮细胞一基底膜的作用中发挥重要作用。
发明内容
发明人在研究中意外发现，一段来自人XVII型胶原蛋白的非G-X-Y结构区的截短蛋白具有显著的修复毛囊细胞、促进毛发再生的生物学活性。基于此，本发明的目的在于提供一种具有毛囊修复、毛发再生活性的重组人XVII型胶原蛋白。
本发明包括：
1.一种具有毛囊修复、毛发再生活性的重组人XVII型胶原蛋白，其为人XVII型胶原蛋白的截短蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白的核酸。
3.包含权利要求2所述的核酸的表达载体。
4.导入了权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以为毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌或枯草芽抱杆菌，优选为毕赤酵母。
5.一种生产权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白的方法，其包括：培养权利要求4所述的宿主细胞并收集细胞培养物的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其还包括对所述细胞培养物进行分离纯化的步骤，所述分离纯化采用盐析、色谱层析、离子交换层析、亲和层析、疏水层析、酸碱沉淀、膜分离中的一种或几种的组合。
7.一种产品，其包含权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白，所述产品为医药品、化妆品、保健品或医疗器械。
8.权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白在制备医药品、化妆品、保健品或医疗器械中的用途。
所述医药品、化妆品、保健品或医疗器械可以用于毛囊修复、毛发再生，例如可以为洗发水、洗发膏、护发素等产品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
1)本发明的重组人XVII型胶原蛋白来自传统上认为无生物活性的非G-X-Y结构区，但却具有良好的毛囊修复、毛发再生生物活性，甚至超过了促毛发生长的常用药米诺地尔。
2)本发明的重组人XVII型胶原蛋白是天然人XVII型胶原蛋白的截短蛋白，且不包含胶原区的C-端、N-端的氨基酸序列，免疫原性小。
3)本发明的重组人XVII型胶原蛋白可以在常用表达系统、特别是毕赤酵母工程菌中表达生产，表达量高且无内毒素隐患。而且，该重组人XVII型胶原蛋白可以不携带组氨酸标记等纯化标签，可通过分子筛进行纯化，最终直接可得目的蛋白，不需要额外切除组氨酸标记等纯化标签。
4)本发明的重组人XVII型胶原蛋白制备方法适于工业化大规模生产，并且制备出的产品没有动物来源的感染源，因此生物安全性更高。
附图说明
图1为显示实施例1的表达重组人XVII型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌的构建过程的图。
图2为实施例2中纯化得到的重组人XVII型胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图3为实施例3中重组人XVII型胶原蛋白在毛囊修复、毛发再生的功效试验毛囊细胞图。
具体实施方式
本发明提供一种可有效修复毛囊细胞，促进毛发再生的重组人XVII型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。针对宿主细胞表达进行密码子优选，在设计过程中两端分别添加EcoRI及NotI酶切位点以有利于后期基因操作。经过上述优化获得编码所述重组人XVII型胶原蛋白的基因。本发明还提供了含有所述基因的表达载体，所述载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。
在一个具体的实施方式中，所述表达载体为pPiczaA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了一种包含所述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞是指己引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括转化体和转化细胞，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。所述宿主细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽抱杆菌中的任意一不中。在一个具体的实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母X33。
本申请提供一种制备所述重组人XVII型胶原蛋白的方法，其包括如下步骤:利用上述的宿主细胞进行表达，然后进行分离纯化得到。所述将宿主细胞进行表达指的将宿主细胞进行培养，培养基和培养条件对于本领域技术人员来说是公知的。
在一个具体的实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母，得到毕赤酵母基因工程菌后，具体的培养条件如下:将毕赤酵母基因工程菌接种于YPD培养基中，于30℃，220rpm条件下培养22-24h，至OD600＝18-20作为上罐种子液，将种子液扩培后按10％接种量接入初始体积为5L的NBS 415发酵罐中，培养温度为28-30℃，pH＝5.0-6.0，溶氧控制在20％-30％，待甘油耗尽，开始进入甘油补料培养，至菌体湿重达到200g/L以上时，开始进行诱导培养。
对于表达方式，本发明不作任何限制，其可以根据需要进行确认，例如表达为诱导表达，对于诱导表达，其诱导剂为甲醇。
在一个具体的实施方式中，流加甲醇进行诱导培养，诱导阶段温度为28℃，pH为5.0，诱导48h放罐。
对于分离纯化的方法，本申请不作任何限制，其可以根据进行确定，例如可以使用盐析法、超滤法、亲和层析法和凝胶过滤层析法。
实施例1:SEQ ID NO：1所示的重组人XVII型胶原蛋白的表达
化学合成重组人XVII型胶原蛋白基因。合成时在5’端和3’分别加入了EcoRI和NotI识别位点和信号肽识别位点，经限制性内切酶SacI线性化后克隆至表达载体pPICZaA中，以毕赤酵母X33为表达宿主菌，通过电转化将获得的pPICzaA-XVII克隆质粒线性化后转化到X33中。以博来霉素梯度法挑选高拷贝阳性克隆，30.0C培养72h得到毕赤酵母基因工程菌。该毕赤酵母工程菌的简要构建过程如图1所示。
将上述得到的毕赤酵母基因工程菌接种于YPD培养基，培养至OD600＝25±3时，按10％接种量接入初始体积为5L的NBS 415发酵罐中，培养温度为30℃、p H＝5.5、OD控制在20％-30％，待甘油耗尽，开始进入甘油补料培养，至菌体湿重达到200g/L以上时，开始流加甲醇进行诱导培养，诱导阶段温度为28℃，pH为5.0，诱导48h放罐，离心收集上清液。
实施例2:重组人XVII型胶原蛋白的纯化
将实施例1离心收集的上清液超滤至初始体积的50％时，加入3-5倍体积的纯水，再经超滤浓缩至初始体积的5％。
将浓缩后的上清液加入60％饱和硫酸铵，常温下搅拌30min，9000rpm离心l0min后收集沉淀，将得到的沉淀溶解于500mL 0.05M，pH为7.0的PBS后经0.22um滤膜过滤；
超滤脱盐：G25脱盐柱脱盐，即采用25mL G25填料，操作过程与凝胶过滤层析步骤类似，每次上样6.5mL，收集8mL左右，上样l0min后即可完成脱盐。
经超滤浓缩至初始体积的20％-30％，然后置于-20℃冰箱预冻4h，然后转入真空冷冻干燥机中进行冻干，48h后收集冻干后蛋白，将冻干后的蛋白样品保存至-80℃冰箱，以便后期使用。图2为所述蛋白样品的SDS-PAGE电泳图。
实施例3:重组人XVII型胶原蛋白在毛囊修复、毛发再生的功效试验
1.猪毛囊的分离:取新鲜猪耳一只，放入加有冰块的容器中保存(保存时间不超过12h)。解剖时反复用自来水冲洗1min，75％乙醇冲洗2次.用手术剪刀沿耳廓边缘约5-8mm剪下皮肤，剪下的皮肤组织放入含1000U/mL青霉素和1000ug/mL链霉素的0.1mol/L的PBS中清洗10min，然后放入Williams E培养基。将上述切下的皮肤沿毛发生长方向进一步切成大约1.5mm厚度的皮肤小片，解剖显微镜下，用手术刀将生长期毛囊分离出来，并将皮脂腺开口水平以上部分切除，然后放入Williams E培养基中培养。
2.猪毛囊的体外无血清培养:毛囊培养在24孔板进行，每孔放1个毛囊，每孔加Williams E培养基1mL，内含L-谷酞胺2.0mmol/L，青霉素100U/mL和链霉素100ug/mL，放入37℃的5％ CO2的孵箱中培养。
3.实验分组:实验分为2组，每组10个生长期的毛囊。对照组Williams E培养基中加米诺地尔0.5mM；试验组在Williams E培养基中加入重组人XVII胶原蛋白0.5重量％。需要说明的是，本实施例中米诺地尔的用量为0.5mM，这是临床上考虑到安全性和治疗效果后推荐的最佳用量。而本发明的重组人XVII胶原蛋白安全无毒，如追求更好的治疗效果，其用量尚有提升的空间。
4.毛发生长情况观察:分别于培养的第1天和第7天，在倒置显微镜下，通过目镜测微器测量毛囊底部到毛发顶部的长度，2次测量结果相减为毛发生长长度，同时在倒置显微镜下观察毛球部的形态变化。
5.TUNEL法检测毛囊中的凋亡细胞：收集培养第7天的毛囊后，OCT包埋，制备成7um厚的冰冻切片，每个毛囊制备3张冰冻切片，取其结构最完整的1张切片染色。4％多聚甲醛固定30min，3％的H2O2中10min封闭内源性过氧化物酶活性，参照原位细胞凋亡检测试剂盒的说明进行操作，苏木素复染，脱水，透明，封片，观察，多媒体图像分析仪分析计数每张切片中凋亡细胞数。
6.统计学处理:实验数据用SPSS19.0统计软件进行统计学处理，统计变量以ˉx士s表示，采用双样本t检验，值取双侧a＝0.05。
试验结果：1.毛发生长长度:培养第7天，对照组和试验组毛囊平均毛发生长长度分别为(1.906士0.02)mm，(2.393士0.02)mm，对照组毛囊毛发生长长度低于试验组，两者存在显著性差异(P<0.001)。
7.毛囊毛球部形态变化：培养第7天，对照组毛囊已发生退行性改变，毛囊真皮鞘和外根鞘变薄，毛囊缩短，毛球部萎缩；试验组毛囊在5％重组人XVII胶原蛋白冻干物水溶液作用下，仍表现为生长期毛囊形态，毛囊形态结构变化程度小，毛母质细胞包裹着毛乳头。见图3。
8.TUNEL法检测毛囊中的凋亡细胞：培养第7天，对照组和试验组平均每个毛囊中凋亡细胞数分别为21.8士0.44和5.2士0.82，对照组毛囊中的凋亡细胞数要高于试验组，两者存在显著性差异(P<0.001)。
序列信息
SEQ ID NO：1
SGPSEGGSS STMYVSGPPG PPGPPGPPGS ISSSGQEIQQ YISEYMQSDSIRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTITGETFD YSELASHVVS YLRTSGYGVSLFSSSISS
SEQ ID NO：2
TCTGGTCCATCTGAAGGTGGTTCTTCTTCTACTATGTACGTTTCTGGTCCAC
CAGGTCCACCAGGTCCACCAGGTCCACCAGGTTCTATTTCTTCTTCTGGTC
AAGAAATTCAGCAGTACATCTCCGAATACATGCAATCCGATTCTATCAGAT
CTTACTTGTCCGGTGTTCAAGGTCCACCAGGTCCACCAGGTCCACCAGGT
CCAGTTACTACTATTACTGGTGAAACTTTTGACTACTCCGAGTTGGCTTCT
CATGTTGTCTCTTACTTGAGAACTTCTGGTTACGGTGTTTCTTTGTTTTCCT
CCTCTATTTCCTCT 。
Claims (8)
1.一种具有毛囊修复、毛发再生活性的重组人XVII型胶原蛋白，其为人XVII型胶原蛋白的截短蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白的核酸。
3.包含权利要求2所述的核酸的表达载体。
4.导入了权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以为毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌或枯草芽抱杆菌，优选为毕赤酵母。
5.一种生产权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白的方法，其包括：培养权利要求4所述的宿主细胞并收集细胞培养物的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其还包括对所述细胞培养物进行分离纯化的步骤，所述分离纯化采用盐析、色谱层析、离子交换层析、亲和层析、疏水层析、酸碱沉淀、膜分离中的一种或几种的组合。
7.一种产品，其包含权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白，所述产品为医药品、化妆品、保健品或医疗器械。
8.权利要求1所述的重组人XVII型胶原蛋白在制备医药品、化妆品、保健品或医疗器械中的用途。
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