CN117982590A - 一种用于防治禽球虫病的中药精油组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于防治禽球虫病的中药精油组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117982590A CN202410016863.1A CN202410016863A CN117982590A CN 117982590 A CN117982590 A CN 117982590A CN 202410016863 A CN202410016863 A CN 202410016863A CN 117982590 A CN117982590 A CN 117982590A
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刘琳
吴保庆
王健
郭晓银
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Abstract

本发明属于禽兽药物技术领域,公开了一种用于防治禽球虫病的中药精油组合物及其制备方法和应用,具体公开了一种中药组合物,由包括以下成分的原料制成:常山、青蒿、鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪、甘草、桉叶油和牛至油。本发明提供的中药组合物不仅具有驱虫、杀虫、祛湿功效,还能抗炎杀菌、清热解毒、止血止痢,加速肠道黏膜自我修复,同时能够提升群体免疫力,全面预防、治疗禽球虫病,且将有可能取代饲料中添加的抗球虫药及其他抗生素,为解决畜禽产品中的药物残留及日益增长的耐药性问题提供了可能。

Description

一种用于防治禽球虫病的中药精油组合物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属禽兽药物技术领域,具体涉及一种用于防治禽球虫病的中药精油组合物及其制备方法和应用。
背景技术
鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属球虫(Eimeria)引起的一类重要的寄生虫病,它主要寄生于鸡肠道黏膜上皮细胞,临床上主要表现为严重腹泻,排出的粪便中夹杂很多血液,部分患病鸡还会表现出明显的神经症状,表现为昏迷不能正常站立,在出现症状2~3d后死亡。鸡球虫病以出血性肠炎、血痢、雏鸡发病率高、生长迟缓、饲料转化率低和死亡率高为特征,会明显降低鸡群生产性能,给养禽业造成巨大的经济损失。鸡球虫病在临床养殖具有发病急、发病率高、致死率高、危害大的特点。
据中国药典记载,中草药具有清热解毒、除湿化痰、补气养血、固本培元、扶正祛邪等功效,对症用药可产生显著临床治疗效果。针对鸡球虫病,进行中兽医辨验证施治认为:该病属于温热病,“温热病”即瘟疫,亦称“温疫”或“热疫”,是感受自然界疫疠之气而引发的、多种流行性急性传染病的总称。所谓“疫疠之气”,又称毒气、戾气或杂气等,是指具有强烈传染性的致病邪气,其(邪气)与正气而言,现泛指各种致病因素,即诸如各类病原微生物、病毒、寄生虫等,其产生及其致病流行总是与久旱、酷热、水涝、反春、温室效应等反常气候有关。通过对鸡球虫病的临床发病症状、剖检情况进行中医临床辨证,较多学者认同鸡球虫病属于由湿热及外感虫邪所引起湿热血痢、虫积等证,多发生于湿热季节,一方面由于虫邪伤阴耗血伤津,另一方面由于湿热内蕴,脾阳受困,因此在初期病鸡表现为食少神怠,便溏带血,口渴喜饮,末期表现为血循不畅,鸡冠发白,进而消瘦,最终衰亡的观点。在八纲辨证中又将其辨证为先“实证”,后“虚证”。传统中兽药组方球虫散较早地用于禽球虫病防控,该组方包括白僵蚕275g、大黄135g、桃仁135g、白术80g、土鳖虫135g、桂枝80g、泽泻80g、猪苓名80g,具有清热解毒、驱虫杀虫、润肺燥湿等功效,能够一定程度减少球虫病造成的死亡,稳定生产状态。
中药主要功能表现在对机体免疫力的调控,如黄芪、黄芩、地黄等都有免疫增强作用,机体在对抗寄生虫感染过程中,免疫系统的迅速反应以及防御行为的迅速启动都直接影响疾病发展的最终结果以及动物的存活概率。球虫感染会损伤机体肠道,因此需要提前将肠道的内环境调整至最佳状态。中药及其有效成分能够通过对菌内酶的抑制作用、细胞膜功能的抑制或者对胞内能量传递过程的抑制以达到抑菌效果,实现对厌氧菌—梭菌的杀灭。除此之外,中药复方在防控疾病过程中协同益气生血、扶正祛邪、清热解毒等多重功效,能够确保杀灭球虫的同时改善肠道内环境,营造不利于球虫生长的环境,进而恢复健康。
通过专利检索,可以发现少数发明专利公开了对禽球虫病具有潜在治疗作用或症状缓解作用的中药组方。例如,中国专利文献CN115887546A公开了一种预防、治疗或辅助治疗球虫病的中药组合物,包括:50~100份的仙鹤草、70~140份的辣蓼、25~75份的白花蛇舌草,所述的中药组合物具有杀虫止痒、解毒消肿、止血止痢、杀菌的功能,增加家禽肠道健康以对抗球虫的感染;中专利文献CN116211933A公开了一种治疗和预防禽抗球虫的中药组合物,包括:青蒿10~20份、秦皮10~20份、使君子10~14份、苦楝皮8~12份、贯叶连翘5~10份、炒地榆4~8份、穿心莲4~8份、黄芪8~12份和熟地黄5~10份。各种药物相配合,达到驱虫解毒为主,止痢止血、补中益气为辅的效果,临床试验中能够显著恢复球虫感染导致的体重下降及出血情况,一定程度实现对球虫病的控制。
申请人通过对现有技术的分析后发现,已公开的中药制剂中种类繁多,很难依据中医理论进行科学辨证,只是围绕治疗目的一味地进行药物组合,而且对核心杀虫药物制备工艺探索并不清晰,导致中药复方防控效果有限,同时增加了治疗成本,很难实现在养殖终端的应用。针对这些问题,迫切需要开发一种全新的中药制剂产品并优化其制备方法,不仅实现对禽类球虫病的有效预防和治疗,还能更大限度提取中药活性成分,降低药物成本,实现对禽类球虫病的全方位防控,满足实际养殖生产工作的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于预防及治疗禽球虫病的中药组合物及其制备方法和应用。该药物预防效果明显,治疗起效快、治愈率高,且对生产无明显副作用,还能同时提高动物机体的免疫能力。
本发明第一方面的目的,在于提供一种中药组合物。
本发明第二方面的目的,在于提供本发明第一方面的中药组合物的制备方法。
本发明第三方面的目的,在于提供本发明第一方面的中药组合物的应用。
本发明第四方面的目的,在于提供一种产品。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供一种中药组合物,由包括以下成分的原料制成:常山、青蒿、鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪、甘草、桉叶油和牛至油。
在本发明一些实施方式中,所述组合物由包括以下重量份的原料制成:常山20~50份、青蒿10~50份、鬼箭羽10~30份、苦参3~15份、仙鹤草3~30份、侧柏叶5~30份、石榴皮3~25份、黄芩5~20份、白及5~15份、黄芪15~35份、甘草5~10份、桉叶油0.5~2份和牛至油0.5~2份。
在本发明一些实施方式中,所述组合物由包括以下重量份的原料制成:常山20~40份、青蒿10~30份、鬼箭羽10~20份、苦参8~15份、仙鹤草8~25份、侧柏叶10~30份、石榴皮9~25份、黄芩10~20份、白及6~15份、黄芪20~35份、甘草5~10份、桉叶油0.5~2份和牛至油0.5~2份。
在本发明一些实施方式中,所述组合物由包括以下重量份的原料制成:常山30~40份、青蒿25~30份、鬼箭羽10~20份,苦参8~12份,仙鹤草6~10份、侧柏叶8~12份、石榴皮10~15份、黄芩10~15份、白及6~10份、黄芪20~25份、甘草5~10份、桉叶油0.5~1份和牛至油0.5~1份。
本组方精选常山,性寒味苦,具有杀虫截疟,除痰消积之功效,主治球虫病;再选青蒿,性寒味苦,具有清虚热,杀原虫之功效,主要用于湿热黄疸、外感暑热及球虫病;再选鬼箭羽,性寒味苦,具有活血散瘀、解毒消肿、杀虫之功效,主治虫积腹内;再选苦参,性微寒,味苦,具有清热燥湿、杀虫去积、利水之功效,主治湿热泻痢、黄疸等症状;再选仙鹤草,性平味苦,具有收敛止血、止痢之功效,主治便血、血痢;再选侧柏叶,性寒味苦,具有清热解毒,凉血止痢之功效,主治热毒血痢,湿热肠黄;再选石榴皮,性温味酸,具有涩肠止泻,止血杀虫之功效,主治血痢虫积;再选黄芩,性寒味苦,具有清热燥湿、泻火解毒、止血之功效,主治泻痢,便血;再选黄芪,性甘、微温,补气升阳、固表止汗,利水消肿、托毒排脓,善治脾肺气虚、中气下陷等正气虚弱之症,为补气扶正诸药之首;再选甘草,性甘平,具有补脾益气、和中缓急、解毒之功效,主治脾胃虚弱、中毒等症状。
本组方中,常山、青蒿、鬼箭羽共为君药,具有驱虫杀虫、清热解毒之功效。苦参、仙鹤草、侧柏叶皆为臣药,发挥清热燥湿、收敛止血之功效,助君清下焦之热。石榴皮、黄芩为佐药,有涩肠止血、抗菌消炎之功效。甘草为使药,补脾益气,调和诸药,培育中焦,诸药合用,以对抗禽球虫及继发细菌感染对机体的损伤,实现迅速止血并控制血痢,加快机体肠道恢复,稳定鸡群健康生长。
在本发明一些实施方式中,所述组合物还包括硫酸锌、二乙二醇单乙醚和吐温。
在本发明一些实施方式中,所述组合物还包括硫酸锌0.01~0.05份、二乙二醇单乙醚1.5~6份和吐温1.5~6份。
在本发明一些优选实施方式中,所述组合物还包括硫酸锌0.01~0.03份、二乙二醇单乙醚1.5~3份和吐温1.5~3份。
本发明的第二个方面,提供本发明第一方面的中药组合物的制备方法,包括以下步骤:
将常山在酸性环境中进行提取,浓缩,得到药液A;
将青蒿在醇溶液中进行提取,浓缩,得到药液B;
将鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪和甘草混合,得到混合物;采用复合酶法对混合物进行酶解,加热水提,固液分离得药液C和药渣;对药渣进行水提,得到药液D;
将药液A、药液B、药液C和药液D混合,浓缩,得到药液E;
将桉叶油、牛至油、二乙二醇单乙醚、吐温混合得到乳化体系F;
将乳化体系F与药液E混合后,与硫酸锌混合,即得到中药组合物。
在本发明一些实施方式中,所述药液A的制备方法包括:将常山与盐酸按照料液比1:(4~6)混合,40~60℃提取1~4h,浓缩,即得到药液A。
在本发明一些实施方式中,所述提取的方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等。
在本发明一些优选实施方式中,所述药液A的制备方法包括:将常山与0.1~0.5M盐酸按照料液比1:(4~6)混合,40~60℃提取1~4h,减压浓缩至1:(1~2),即得到药液A;所述超声的功率为110~130W,超声5~8s,间歇5~8s。
在本发明一些实施方式中,所述药液B的制备方法包括:将青蒿与醇溶液按照料液比1:(7~15)混合,浸泡1~2h,40~60℃提取1~2h,浓缩,即得到药液B。
在本发明一些实施方式中,所述提取的方法包括煎煮提取、回流提取、浸渍提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等。
在本发明一些优选实施方式中,所述药液B的制备方法包括:将青蒿与60%~70%乙醇溶液按照料液比1:(7~15)混合,浸泡1~2h,40~60℃超声提取1~2h,减压浓缩至1:(1~2),即得到药液B;所述超声的功率为110~130W,超声5~8s,间歇5~8s。
在本发明一些实施方式中,所有中药材在使用之前均进行洗、切、烘干、粉碎,过5~20目筛。
在本发明一些实施方式中,所述复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶。
在本发明一些实施方式中,所述纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1~3):(1~4):(1~4)。
在本发明一些优选实施方式中,所述纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶的质量比为1:1:2:(2~3)。
在本发明一些实施方式中,所述纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶的酶复合剂酶活力为6万~10万U/g。
在本发明一些实施方式中,所述复合酶的添加量为所述混合物质量的1%~5%。
在本发明一些优选实施方式中,所述复合酶的添加量为所述混合物质量的2%~3%。
在本发明一些实施方式中,所述酶解的条件为:pH值为4.5~5.0,温度为45~55℃,时间为1~4h。
在本发明一些优选实施方式中,所述酶解的条件为:pH值为4.5~5.0,温度为45~55℃,时间为1~2h。
本发明采用复合酶解技术对中药材进行酶解以及超声提取技术,大幅提高中草药中有效药用成分的提取率,获得更高含量的中药活性成分。
在本发明一些实施方式中,所述药液C涉及加热水提制备方法条件为加热至微沸提取1~2h。
在本发明一些实施方式中,所述药液D的制备方法包括条件为药渣加入10~15倍体积水,加热至微沸提取1~2h。
在本发明一些实施方式中,将药液A、药液B、药液C和药液D混合,减压浓缩至总料液比1:2,即得到药液E。
本发明通过复合酶法提取能够更大限度发挥酶的酶解作用,促进中药活性成分的释放,更是聚焦提升对常山及青蒿中有效成分溶出,强化杀虫效果;本发明通过乳化工艺实现非水溶性精油与中药水提物均匀混合,既保证水溶性,又增强对球虫病继发梭菌感染的控制;此外,本复方最终制备过程融合了可溶性锌离子,强化药物对球虫感染后肠道损伤的修复功能,最终实现对球虫病的全方面防控和修复。
本发明的第三个方面,提供本发明第一方面的中药组合物在(a)~(g)至少一种中的应用:
(a)制备预防和/或治疗禽球虫病的产品;
(b)制备预防和/或治疗细菌感染的产品;
(c)制备预防和/或治疗禽球虫病所引发的细菌性继发感染的产品;
(d)制备预防和/或治疗禽西红柿粪/血粪的产品;
(e)制备预防和/或治疗禽肠炎的产品;
(f)制备增强家禽机体/肠道免疫力的产品;
(g)畜禽养殖。
在本发明一些实施方式中,所述细菌为产气荚膜梭菌、魏式梭菌中的至少一种。
在本发明一些实施方式中,所述产品包括药物。
本发明的第四个方面,提供一种包括本发明第一方面的中药组合物的产品。
在本发明一些实施方式中,所述产品还包括药学上可接受的辅料。
在本发明一些实施方式中,所述药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、防腐剂、色素、香精和溶剂中的至少一种。
在本发明一些实施方式中,所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等;所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、水、糊精、明胶或聚乙烯叱咯烷酮等;所述崩解剂选自微晶纤维素、羚甲基淀粉钠、交联聚乙烯叱咯烷酮、低取代轻丙基纤维素或交联羚甲基纤维素钠;所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁:所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇:所述润湿剂选自甘油、吐温-80、Z氧基氢化蓖麻油或卵磷脂:所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油,所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等:所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨(吐温)等:所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、甜菊素、安赛蜜、柠檬酸或糖精钠;所述防腐剂选自对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯中的至少一种。
在本发明一些实施方式中,所述产品包括药物。
在本发明一些实施方式中,所述药物的剂型为:注射剂、散剂、胶囊剂、片剂、膏剂、栓剂、气雾剂、口服剂、丸剂、滴剂、缓释片、混悬剂、颗粒剂、口含剂、冲剂、滴剂、丹剂、粉剂、溶液剂、霜剂、贴剂、锭剂或它们的任意形式组合。
本发明的有益效果是:
本发明提供的中药组合物不仅具有驱虫、杀虫、祛湿功效,还能抗炎杀菌、清热解毒、止血止痢,加速肠道黏膜自我修复,同时能够提升群体免疫力,全面预防、治疗禽球虫病。且将有可能取代饲料中添加的抗球虫药及其他抗生素,为解决畜禽产品中的药物残留及日益增长的耐药性问题提供了可能。
本发明提供的制备方法通过复合酶解液态提取以及针对常山和青蒿药材的超声提取,能够更大限度促进中药活性成分的溶出和收集,增强药物临床对球虫病的防治效果。
附图说明
图1为不同组方体外抑制球虫卵囊孢子化活性评价结果。
图2为盲肠球虫感染的临床解剖盲肠外观。
图3为盲肠球虫感染的卵囊检测结果图。
图4为试验1组D1和D7盲肠临床解剖盲肠外观。
图5为小肠球虫感染的临床解剖小肠外观。
图6为小肠球虫感染的卵囊检测结果图。
图7为试验1组D1和D7小肠临床解剖盲肠外观。
图8为高效液相色谱检测结果(没食子酸)。
图9为高效液相色谱检测结果(黄芩苷)。
图10为薄层色谱检测结果(青蒿)。
图11为薄层色谱检测结果(常山)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细地说明。
应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中涉及的中药材购于广州市大参林药店;纤维素酶(植物提取专用SPE-012,FFG-0665,酶活力≥2000U/g)、半纤维素酶(FDG-2255,酶活力≥5万U/g)、果胶酶(植物提取专用SPE-010,FFG-0658,酶活力≥5000U/g)、淀粉酶(植物提取专用SPE-011,FFG-0659,酶活力≥1000U/g)购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司;桉叶油及牛至油购自江西华隆植物香料有限公司。
实施例1
一种用于抗球虫的中药组合物,由包括以下重量份的组分制备:常山40份、青蒿30份、鬼箭羽15份、苦参10份、仙鹤草8份、侧柏叶10份、石榴皮13份、黄芩10份、白及6份、黄芪20份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法包括以下步骤:
(1)药材粉碎:按照中草药传统炮制工艺对常山、青蒿、鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪、甘草进行洗、切、烘干等前处理,再对各个药材分别进行粉碎,过10目筛。
(2)常山单独提取:配制0.2M的盐酸溶液,按照1:5的料液比进行超声提取,温度为50℃,功率为120W,超声5s,间歇5s,单次时间为1h,收集滤液,重复三次,合并滤液,按照1:2的比例进行减压浓缩,得到药液A。
(3)青蒿单独提取:配制65%无水乙醇溶液,按照1:10的料液比进行提取,先浸泡1h,50℃超声1h,超声功率为120W,超声5s,间歇5s,收集滤液,按照1:2的比例进行减压浓缩,得到药液B。
(4)复合酶解液态提取:取上述组合物中除常山、青蒿外的中药材,加入10倍体积的蒸馏水,调节pH至4.5~5.0,再加入总量为2%药物质量的复合酶(纤维素酶:半纤维素酶:果胶酶:淀粉酶质量比=1:1:2:2),启动酶解程序后,在提取罐中边搅拌边酶解1h,酶解温度控制在50±3℃,完成酶解后,加热至微沸提取1h,收集药液C;向剩余药渣中加入10倍体积蒸馏水,加热至微沸再提取1h,完成第二次提取,收集药液D。
(5)水相药液合并:合并药液A、B、C、D,减压浓缩至总料液比1:2,收集药液E。
(6)精油乳化体系配制:取桉叶油、牛至油、二乙二醇单乙醚、吐温-80,按照质量比1:1:3:3进行混合搅拌,直至均匀澄清,记为乳化体系F。
(7)水相/油相复合:将乳化体系F缓慢加入至药液E中,充分搅拌混匀,记为药液G。
(8)硫酸锌溶液配制:取组方量硫酸锌溶于少量无菌水中,直至完全溶解,得到硫酸锌溶液。
(9)最终配制:将硫酸锌溶液加入至药液G中,搅拌混匀,过滤,灭菌,灌装,即得到用于抗球虫的中药组合物。
实施例2
一种用于抗球虫的中药组合物,由包括以下重量份的组分制备:常山35份、青蒿25份、鬼箭羽15份、苦参10份、仙鹤草8份、侧柏叶10份、石榴皮13份、黄芩10份、白及6份、黄芪30份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
实施例3
一种用于抗球虫的中药组合物,由包括以下重量份的组分制备:常山40份、青蒿30份、鬼箭羽15份、苦参12份、仙鹤草8份、侧柏叶10份、石榴皮9份、黄芩10份、白及8份、黄芪30份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
实施例4
一种用于抗球虫的中药组合物,由包括以下重量份的组分制备:常山40份、青蒿30份、鬼箭羽15份、苦参8份、仙鹤草6份、侧柏叶8份、石榴皮15份、黄芩14份、白及6份、黄芪20份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
实施例5
一种用于抗球虫的中药组合物,与实施例1的区别仅在于:制备方法步骤(4)中复合酶为纤维素酶:半纤维素酶:果胶酶:淀粉酶=1:2:2:3。
实施例6
一种用于抗球虫的中药组合物,常山20份、青蒿15份、鬼箭羽20份、苦参10份、仙鹤草28份、侧柏叶25份、石榴皮13份、黄芩10份、白及6份、黄芪20份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
实施例7
一种用于抗球虫的中药组合物,常山45份、青蒿40份、鬼箭羽15份、苦参10份、仙鹤草8份、侧柏叶10份、石榴皮3份、黄芩5份、白及6份、黄芪20份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
实施例8
一种用于抗球虫的中药组合物,由包括以下重量份的组分制备:常山40份、青蒿30份、鬼箭羽15份、苦参3份、仙鹤草3份、侧柏叶5份、石榴皮20份、黄芩20份、白及6份、黄芪30份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
实施例9
一种用于抗球虫的中药组合物,与实施例1的区别在于,其制备方法不同(不单独提取常山,而是与其他药材共同进行复合酶解提取);
上述中药组合物的制备方法包括以下步骤:
(1)药材粉碎:按照中草药传统炮制工艺对常山、青蒿、鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪、甘草进行洗、切、烘干等前处理,再对各个药材分别进行粉碎,过10目筛。
(2)常山单独提取:配制0.2M的盐酸溶液,按照1:5的料液比进行超声提取,温度为50℃,功率为120W,超声5s,间歇5s,单次时间为1h,收集滤液,重复三次,合并滤液,按照1:2的比例进行减压浓缩,得到药液A。
(3)复合酶解液态提取:取上述组合物中除常山外的中药材,加入10倍体积的蒸馏水,调节pH至4.5~5.0,再加入总量为2%药物质量的复合酶,纤维素酶:半纤维素酶:果胶酶:淀粉酶质量比=1:1:2:2,启动酶解程序后,在提取罐中边搅拌边酶解1h,酶解温度控制在50±3℃,完成酶解后,加热至微沸提取1h,收集药液B,向剩余药渣中加入10倍体积蒸馏水,加热至微沸再提取1h,完成第二次提取,收集药液C。
(4)水相药液合并:合并药液A、B、C,减压浓缩至总料液比1:2,收集药液D。
(5)精油乳化体系配制:取桉叶油、牛至油、二乙二醇单乙醚、吐温-80,按照质量比1:1:3:3进行混合搅拌,直至均匀澄清,记为乳化体系E。
(6)水相/油相复合:将乳化体系E缓慢加入至药液D中,充分搅拌混匀,记为药液F。
(7)硫酸锌溶液配制:取组方量硫酸锌溶于少量无菌水中,直至完全溶解,得到硫酸锌溶液。
(8)最终配制:将硫酸锌溶液加入至药液F中,搅拌混匀,过滤,灭菌,灌装,即得到用于抗球虫的中药组合物。
实施例10
一种用于抗球虫的中药组合物,与实施例1的区别在于,其制备方法不同(不单独提取青蒿,而是与其他药材共同进行复合酶解提取);
上述中药组合物的制备方法包括以下步骤:
(1)药材粉碎:按照中草药传统炮制工艺对常山、青蒿、鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪、甘草进行洗、切、烘干等前处理,再对各个药材分别进行粉碎,过10目筛。
(2)青蒿单独提取:配制65%无水乙醇溶液,按照1:10的料液比进行提取,先浸泡1h,50℃超声1h,超声功率为120W,超声5s,间歇5s,收集滤液,按照1:2的比例进行减压浓缩,得到药液A。
(3)复合酶解液态提取:取上述组合物中除青蒿外的中药材,加入10倍体积的蒸馏水,调节pH至4.5~5.0,再加入总量为2%药物质量的复合酶,纤维素酶:半纤维素酶:果胶酶:淀粉酶质量比=1:1:2:2,启动酶解程序后,在提取罐中边搅拌边酶解1h,酶解温度控制在50±3℃,完成酶解后,加热至微沸提取1h,收集药液B,向剩余药渣中加入10倍体积蒸馏水,加热至微沸再提取1h,完成第二次提取,收集药液C。
(4)水相药液合并:合并药液A、B、C,减压浓缩至总料液比1:2,收集药液D。
(5)精油乳化体系配制:取桉叶油、牛至油、二乙二醇单乙醚、吐温-80,按照质量比1:1:3:3进行混合搅拌,直至均匀澄清,记为乳化体系E。
(6)水相/油相复合:将乳化体系E缓慢加入至药液D中,充分搅拌混匀,记为药液F。
(7)硫酸锌溶液配制:取组方量硫酸锌溶于少量无菌水中,直至完全溶解,得到硫酸锌溶液。
(8)最终配制:将硫酸锌溶液加入至药液F中,搅拌混匀,过滤,灭菌,灌装,即得到用于抗球虫的中药组合物。
实施例11
一种用于抗球虫的中药组合物,与实施例1的区别在于,其制备方法不同(将复合酶解提取调整为常规水提取);
上述中药组合物的制备方法包括以下步骤:
(1)药材粉碎:按照中草药传统炮制工艺对常山、青蒿、鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪、甘草进行洗、切、烘干等前处理,再对各个药材分别进行粉碎,过10目筛。
(2)常山单独提取:配制0.2M的盐酸溶液,按照1:5的料液比进行超声提取,温度为50℃,功率为120W,超声5s,间歇5s,单次时间为1h,收集滤液,重复三次,合并滤液,按照1:2的比例进行减压浓缩,得到药液A。
(3)青蒿单独提取:配制65%无水乙醇溶液,按照1:10的料液比进行提取,先浸泡1h,50℃超声1h,超声功率为120W,超声5s,间歇5s,收集滤液,按照1:2的比例进行减压浓缩,得到药液A。
(4)常规水提:取上述组合物中除常山、青蒿外的中药材,加入10倍体积的蒸馏水,升温至50±5℃,浸泡1h,继续升温至微沸(95~100℃),提取1h,收集药液B,向剩余药渣中加入10倍体积蒸馏水,加热至微沸再提取1h,完成第二次提取,收集药液C。
(5)水相药液合并:合并药液A、B、C,减压浓缩至总料液比1:2,收集药液D。
(6)精油乳化体系配制:取桉叶油、牛至油、二乙二醇单乙醚、吐温-80,按照质量比1:1:3:3进行混合搅拌,直至均匀澄清,记为乳化体系E。
(7)水相/油相复合:将乳化体系E缓慢加入至药液D中,充分搅拌混匀,记为药液F。
(8)硫酸锌溶液配制:取组方量硫酸锌溶于少量无菌水中,直至完全溶解,得到硫酸锌溶液。
(9)最终配制:将硫酸锌溶液加入至药液F中,搅拌混匀,过滤,灭菌,灌装,即得到用于抗球虫的中药组合物。
对比例1
一种用于抗球虫的中药组合物,由包括以下重量份的组分制备:常山40份、青蒿30份、鬼箭羽15份、苦参10份、仙鹤草14份、侧柏叶10份、石榴皮13份、黄芩10份、黄芪20份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
对比例2
一种用于抗球虫的中药组合物,由包括以下重量份的组分制备:常山40份、青蒿30份、鬼箭羽15份、苦参10份、仙鹤草8份、侧柏叶10份、石榴皮13份、黄芩10份、白及6份、黄芪20份、甘草5份、硫酸锌0.02份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
对比例3
一种用于抗球虫的中药组合物,常山40份、青蒿30份、鬼箭羽15份、苦参10份、仙鹤草8份、侧柏叶10份、石榴皮13份、黄连10份、白及6份、黄芪20份、甘草5份、桉叶油1份、牛至油1份、硫酸锌0.02份、二乙二醇单乙醚3份和吐温-80 3份;
上述中药组合物的制备方法同实施例1。
效果实施例
1.不同组方体外抑制球虫卵囊孢子化活性评价
本发明中药制剂中诸药配伍合理,旨在多种成分协同作用达到禽球虫病的有效防控,本发明由于实验数据较多,对方剂中药材组分、用量及制备方法进行多次调整并进行试验验证,在此列出实施例1~11和对比例1~3的体外抑制球虫卵囊孢子化能力对比结果。
按照具体实施方式中实施例1~11和对比例1~3的制备方法进行样品制备,对本发明的中药组合物的抗球虫效果进行说明:
方法:
球虫扩繁及卵囊分离纯化:将SPF级雏鸡饲养至14日龄,经口灌服混合球虫孢子化卵囊2×104个/只,第7天收集粪便,通过饱和食盐水漂浮法分离纯化卵囊。
药物体外干预球虫卵囊孢子化评价:将待测样品(实施例1~11以及对比例1~3的中药组合物)与5%重铬酸钾按照1:1混合后重悬卵囊,卵囊浓度为5×104个/mL,得到药物干预下的卵囊孢子化诱导体系,阴性对照采用PBS重悬卵囊,阳性对照组采用2.5%重铬酸钾重悬卵囊,将上述体系置于28℃条件下进行培养,分别于第0、1、2、3、4、5天使用改良麦氏虫卵计数板进行镜检,随机对视野内100个卵囊中的孢子化卵囊进行计数,计算各组卵囊孢子化率,重复3次,计算公式如下:孢子化率=孢子化卵囊数/卵囊总数×100%。
结果:实验结果如图1和表1所示,阳性对照组在孢子化诱导条件下刺激5天后卵囊孢子化率达到84.67%,相比之下阴性对照组只有25.33%的卵囊发生孢子化,证明诱导条件有效,在该条件下,实施例1~11和对比例1~3对表现出对卵囊孢子化诱导的抑制效果,但略有差异,除实施例6和实施例10之外,其他组孢子化率皆低于40%。从配方调整的角度,体外抑制活性:实施例7>实施例1≈实施例3≈实施例4≈实施例8≈对比例1≈对比例2≈对比例3>实施例2>实施例6,说明体外抑制球虫卵囊孢子化的能力主要与常山+青蒿的质量占比呈现正相关关系,但考虑球虫病临床表现是综合性的,仅仅杀虫并不足以缓解复杂的临床病情,因此需要做进一步评价。实施例1和实施例5抑制活性高于对实施例9~11,一方面说明按照常山、青蒿单独制备的工艺优于采用水提工艺,另一方面说明复合酶解工艺优于常规水提工艺,能够强化复方体外抗球虫效果。
表1孢子化率统计(%)
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2.体外抑菌效果评价
通过体外抑菌试验(肉汤稀释法)评估实施例1~11和对比例1~3的中药组合物以及市售产品驱球止痢合剂(兽药店购买,批次为2022052401,组方由常山480g,侧柏叶400g,仙鹤草400g,马齿苋400g,地锦草320g组成)对标准菌株产气荚膜梭菌(CICC 22949)和沙门氏菌(CICC 10437)的抑菌活性。
结果如表2所示,所有的试验例和对比例对产气荚膜梭菌和沙门氏菌的抑制能力相对于市售的驱球止痢合剂均有显著的提高,其中抑制能力效果最好的为实例4和实施例8,其次是实施例1、2、6、9和10以及对比例1,对两种菌的抑制效果一致。
与实例1相比,在实例4和实施例8的配方中提高石榴皮和黄芩的比例,从而使抑菌效果提高;在实施例7中降低这两味药材而导致抑菌效果显著降低;再结合实施例6、9和11以及对比例1的配方中其他药材比例改变但抑菌效果保持不变这一结果表明,抑菌药材在配方中的比例会明显影响配方的抑菌效果,从而影响对球虫病继发细菌感染的治疗效果。
与实例1相比,在对比例2的配方中不添加桉叶油和牛至油使抑菌效果下降,以及在对比例3配方中的黄芩被同样具有强抑菌效果的黄连替代反而使抑菌效果下降这一结果表明,配方中精油成分的使用,不仅使抑菌中药与抑菌精油的效果相加,而且具有协同作用,能够在相同用量的情况下,进一步提高培养的整体抑菌效果。
与实例1相比,在实施例11的提取工艺中,将酶解工艺替换为常规水提工艺,从而使配方的抑菌效果有下降。表明该配方对于常规水提工艺更适合复合酶解工艺,能够提高配方整体抑菌效果。
表2MIC/MBC检测结果
3.体内药效评价(盲肠球虫感染)
3.1试验设计
试验动物:广东省某鸡场,肉鸡存栏量近1万羽,近一周内死亡近200羽雏鸡,出现饮水量增加、饲料转化率下降并排出血粪等症状,病死鸡解剖观察盲肠出现明显出血、肿大(图2),并有盲肠芯,经对盲肠内容物利用饱和食盐水漂浮法进行卵囊鉴定,可见明显大量卵囊(图3),故确诊为盲肠球虫感染。饲喂本发明实施例1~11和对比例1~3的中药组合物进行药效评价。
试验分组:试验采用分组进行隔离饲养,严禁交叉接触,具体分组如下:1)对照组100羽(健康鸡,不使用任何药物);2)模型组100羽(发病鸡,不使用任何药物);3)试验1~11组各100羽(发病鸡,分别使用实施例1~11的中药组合物);4)试验12~14组各100羽(发病鸡,分别使用对比例1~3的中药组合物);5)试验15组100羽(发病鸡,使用中国专利文献CN104027420A中公开的对盲肠球虫有效的中药制剂,葛根10份,侧柏叶20份,贯众15份,仙鹤草10份,蜀漆10份,黄连10份,石榴皮10份,水150份)。
药物用法用量:试验组每升水中加入5mL中药组合物,连续使用5天,均自由采食和自由饮水。
3.2药效判断标准
(1)相对增重
用药前1天(Day 1)和用完药后第1天(Day 7)早晨各组随机选择20只空腹称重,记录并计算各组的相对增重率。
增重率=(M7-M1)/M1×100%,其中M1为用药前(Day 1)早晨空腹称重的重量,M7为用完药后(Day 7)早晨空腹称重的重量。
相对增重率=药物试验组或阳性对照药组的增重率/阴性对照组的增重率×100%。
(2)存活率
记录各组Day 1~Day7鸡总死亡数。
存活率=[(组内总鸡数-组内感染球虫死亡鸡数)/组内总鸡数]×100%
(3)盲肠内卵囊值
于Day 7对各组鸡群随机处死10只,摘取盲肠,取各盲肠内容物2g,混合,进行卵囊计数(饱和食盐漂浮法)。雏鸡卵囊比数(%)=空白对照组或实验组雏鸡卵囊数/模型组雏鸡卵囊数×100%,卵囊值评价标准见表3。
表3卵囊值评分标准
(4)盲肠病变值
肉眼观察步骤(3)解剖鸡只盲肠病理变化,进行病变评分,标准见表4,记录各组盲肠病变值:病变值=组内平均病变积分×10。
表4盲肠病变评分标准
(5)抗球虫指数(ACI)
ACI是评价药物抑制艾美耳球虫的一项药效指标。
ACI(抗球虫指数)=(相对增重率+存活率)-(卵囊值+病变值)。
ACI评价标准:
(1)若ACI<120时,说明达不到抗球虫的效果;
(2)若120≤ACI<160时,说明能够达到中等抗球虫效果;
(3)若160≤ACI<180时,说明能够达到良好抗球虫效果;
(4)若ACI>180时,说明达到优秀的抗球虫效果。
3.3试验结果
结果如表5所示,试验15个组的ACI指数均高于120,同时相对增重率、存活率显著高于模型组,病变值和卵囊值显著低于模型组,表明试验组均有抗球虫效果,其中试验1~5组的ACI指数均高于170,尤其试验1组和试验3组高于180,试验1组D1和D7盲肠解剖见图4,盲肠出血明显减少,内容物颜色正常,表明实施例1~5的组方有明显优于对比例的抗球虫效果,且实施例1达到了优秀的抗球虫效果。
试验6、9~11组与试验1组相比,病变值与卵囊值明显高于试验1组,同时试验9~11组的相对增重率和ACI值为全试验组最低组别部分,通过对比配方变化,这些组在不同方式上降低了常山和青蒿在整个配方中的比例,结果表明,常山、青蒿作为整个配方的主成分需要达到一定的比例才能发挥整体功效,才能从根源上解决盲肠球虫病的发生,同时也能表明常山、青蒿的单独提取以及酶解工艺的提取方式能够提高主成分的浓度,从而最大化地发挥抗球虫的效果。
试验7、13、14组与试验1组相比,主要的差异为病变值的显著提高,结合配方变化对比,试验7组减少了石榴皮、黄芩的比例,试验13组未添加桉叶油和牛至油,试验14组用黄连代替了黄芩。结果表明,石榴皮、黄芩、桉叶油和牛至油作为配方内的抑菌主成分,一旦减少其含量比例,会达不到抑菌的效果,造成球虫病的持续继发感染,而黄连同样作为抑菌中药但未能发挥良好的抑菌效果。也间接表示石榴皮、黄芩和精油存在一定的协同效果,提高整体配方的抑菌+效果。
试验8、12组与试验1组相比,主要的差异为病变值的显著升高,结合配方变化对比,试验8组减少仙鹤草、侧柏叶的比例,而试验12组中的白及用同等比例的仙鹤草代替,作为收敛止血功效的药材,在球虫病中发挥着减少肠道内壁出血、修复肠道的功效,所以一旦减少该功能药材的比例和种类均会造成球虫病出血症状的治疗。
表5盲肠球虫体内试验结果
注:试验1~11组为饲喂实例1~11的中药组合物;试验12~14组为饲喂对比例1~3的中药组合物;试验15组为饲喂其他专利(CN104027420A)中的中药组合物。
4.体内药效评价(小肠球虫感染)
4.1试验设计
试验动物与分组:广东省某鸡场,肉鸡存栏量近2万羽,近日场内出现大面积番茄粪,采食量降低近20%,病鸡解剖观察小肠有明显出血点(图5),并有盲肠芯,经对盲肠内容物利用饱和食盐水漂浮法进行卵囊鉴定,可见明显大量卵囊(图6),故确诊为小肠球虫感染。饲喂本发明实施例1~11和对比例1~3的中药组合物进行药效评价。
试验分组:试验采用分组进行隔离饲养,严禁交叉接触,具体分组如下:1)对照组100羽(健康鸡,不使用任何药物);2)模型组100羽(发病鸡,不使用任何药物);3)试验1~11组各100羽(发病鸡,分别使用实施例1~11的中药组合物);4)试验12~14组各100羽(发病鸡,分别使用对比例1~3的中药组合物);5)试验15组100羽(发病鸡,使用中国专利文献CN104027420A中公开的对小肠球虫有效的中药制剂,葛根10份,侧柏叶20份,贯众15份,仙鹤草10份,蜀漆10份,黄连10份,石榴皮10份,水150份)。
药物用法用量:试验组每升水中加入5mL中药组合物,连续使用5天,均自由采食和自由饮水。
4.2药效判断标准
(1)相对增重
用药前1天(Day 1)和用完药后第1天(Day 7)早晨各组随机选择20只空腹称重,记录并计算各组的相对增重率。
增重率=(M7-M1)/M1×100%,其中M1为用药前(Day 1)早晨空腹称重的重量,M7为用完药后(Day 7)早晨空腹称重的重量。
相对增重率=药物试验组或阳性对照药组的增重率/阴性对照组的增重率×100%。
(2)存活率
记录各组Day 1~Day7鸡总死亡数。
存活率=[(组内总鸡数-组内感染球虫死亡鸡数)/组内总鸡数]×100%
(3)小肠内卵囊值
于Day 7对各组鸡群随机处死10只,摘取小肠,取各小肠内容物2g,混合,进行卵囊计数(饱和食盐漂浮法)。雏鸡卵囊比数(%)=空白对照组或实验组雏鸡卵囊数/模型组雏鸡卵囊数×100%,卵囊值评价标准见表3。
(4)小肠病变值
肉眼观察步骤(3)解剖鸡只盲肠病理变化,进行病变评分,标准见表6,记录各组盲肠病变值:病变值=组内平均病变积分×10。
表6小肠病变评分标准
(5)抗球虫指数(ACI)
ACI是评价药物抑制艾美耳球虫的一项药效指标。
ACI(抗球虫指数)=(相对增重率+存活率)-(卵囊值+病变值)。
ACI评价标准:
(1)若ACI<120时,说明达不到抗球虫的效果;
(2)若120≤ACI<160时,说明能够达到中等抗球虫效果;
(3)若160≤ACI<180时,说明能够达到良好抗球虫效果;
(4)若ACI>180时,说明达到优秀的抗球虫效果。
4.3试验结果
本试验在小肠球虫感染期间,对鸡场使用实施例1~11中药制剂(试验1~11组)以及对比例1~3中药制剂(试验12~14组)及专利组方(试验15组)连续饲喂5天,实验结果如表7所示,在试验1~11组与试验12~14组之间的比较中,发现试验1~5组在治疗鸡球虫病发生和减少雏鸡死亡方面效果更优,其ACI值均大于180,综上,确定实施例1~5中配方中药组合物为最优配比,能够最大限度球虫病造成的血粪的出现和减少发病死亡率,其中实施例1的ACI值能达到189.58,D1和D7小肠解剖对比见图7,出血点明显减少,在治疗球虫发病和死亡方面更具有优势。
统计各实验组的存活率、相对增重率、病变值和卵囊值,并计算抗球虫指数,结果见表7。根据表7可以看出,实施例和对比例制备的中药液的肠道病变值和卵囊值显著低于模型组;从抗球虫指数来看,试验2组中常山、青蒿等药物的用量减少,导致其ACI值明显低于实施例中其余各组,结合实施例7中常山、青蒿的增加同样会使其ACI值高于其余对比例,说明在配方中常山、青蒿具有较好的杀灭球虫的效果。试验8组中抑菌药物(石榴皮、黄芩)的过多添加,降低了相对增重率及存活率,说明过多寒凉性的抑菌药物会对鸡只胃肠道造成一定影响。各个试验结果表明,实施例1制备的中药液治疗鸡球虫病的效果最好。
另外,发明人考虑到在中药提取中,不同的提取工艺往往会造成提取物中有效成分的差异,为了实现本发明的中药组合物中抗球虫活性成分的高效提取,从而进一步提高抗球虫效果,本发明使用复合酶法结合单独提取法对其进行有效成分提取,其中通过对常山、青蒿的单独提取结合复合酶解一起增加有效物质的含量。结果发现以单独提取法联合复合酶法提取该中药组方活性成分而制备的中药液,相较未完全使用单独提取法(试验组9、10)和未使用复合酶解法提取的中草药药液(试验组11)分别获得了更好的抗球虫效果。
表7小肠球虫体内试验结果
注:试验1~11组为饲喂实例1~11的中药组合物;试验12~14组为饲喂比例1~3的中药组合物;试验15组为饲喂其他专利(CN104027420A)中的中药组合物。
5.预防药效评价(小肠球虫感染)
5.1试验设计
试验动物与分组:广东省某鸡场,肉鸡存栏量近8000羽,16日龄,据养殖场场主介绍该鸡群不做球虫疫苗防控,通常19~21日龄会出现小肠球虫疾病,故饲喂本发明实施例1~11和对比例1~3的中药组合物进行预防药效评价。
试验分组:试验采用分组进行隔离饲养,严禁交叉接触,具体分组如下:1)对照组100羽(不使用任何药物);2)试验1~11组各100羽(分别使用实施例1~11的中药组合物);3)试验12~14组各100羽(分别使用对比例1~3的中药组合物);4)试验15组100羽(使用中国专利文献CN104027420A中公开的对小肠球虫有效的中药制剂,葛根10份,侧柏叶20份,贯众15份,仙鹤草10份,蜀漆10份,黄连10份,石榴皮10份,水150份)。
药物用法用量:试验组每升水中加入5mL中药组合物,连续使用5天,均自由采食和自由饮水。
5.2药效判断标准
(1)相对增重
用药前1天(Day 1)和用药后第1天(Day 7)早晨各组随机选择20只空腹称重,记录并计算各组的相对增重率。
增重率=(M7-M1)/M1×100%,其中M1为用药前(Day 1)早晨空腹称重的重量,M7为用完药后(Day 7)早晨空腹称重的重量。
相对增重率=药物试验组或阳性对照药组的增重率/阴性对照组的增重率×100%。
(2)存活率
记录各组Day 1~Day7鸡总死亡数。
存活率=[(组内总鸡数-组内感染球虫死亡鸡数)/组内总鸡数]×100%
(3)小肠内卵囊值
于Day 7对各组鸡群随机处死10只,摘取小肠,取各小肠内容物2g,混合,进行卵囊计数(饱和食盐漂浮法)。雏鸡卵囊比数(%)=空白对照组或实验组雏鸡卵囊数/模型组雏鸡卵囊数×100%,卵囊值评价标准见表3。
(4)小肠病变值
肉眼观察步骤(3)解剖鸡只盲肠病理变化,进行病变评分,标准见表6,记录各组盲肠病变值:病变值=组内平均病变积分×10。
(5)抗球虫指数(ACI)
ACI是评价药物抑制艾美耳球虫的一项药效指标。
ACI(抗球虫指数)=(相对增重率+存活率)-(卵囊值+病变值)。
ACI评价标准:
(1)若ACI<120时,说明达不到抗球虫的效果;
(2)若120≤ACI<160时,说明能够达到中等抗球虫效果;
(3)若160≤ACI<180时,说明能够达到良好抗球虫效果;
(4)若ACI>180时,说明达到优秀的抗球虫效果。
5.3试验结果
结果如表8所示,试验15个组的ACI指数均高于170,具有良好的抗球虫效果,同时相对增重率、存活率显著高于模型组,病变值和卵囊值显著低于模型组,表明试验组对于球虫病具有较好的预防效果,其中试验1~5组的ACI指数均高于190,尤其试验1组高达195.14,表明实施例1~5的组方明显优于对比例的抗球虫效果,且实施例1达到了优秀的抗球虫效果。
试验6组与试验1组相比,主要降低了常山和青蒿在整个配方中的比例,其病变值、卵囊值明显高于试验1组且ACI值、相对增重率远低于试验1组;而试验9组中青蒿单独提取,试验10组常山单纯提取,其抗球虫指数也明显低于试验1组。通过整体结果来看,常山、青蒿作为整个配方中的君药,需要达到一定的比例和含量,配方才能发挥优秀的抗球虫效果。
试验7、8组与试验1组相比,主要的差异为病变值的显著提高,这三个试验组通过对黄芩、石榴皮配比的增减,进而影响机体肠道中的病变情况。结果表明,石榴皮、黄芩作为配方内的抑菌主成分,一旦调整其含量比例,会达不到较好的抑菌效果,继而造成球虫病的感染和肠道的损伤。试验13组不添加精油体系,试验14组使用黄连替代黄芩,在全部试验组中,两组的相对增重率达到最低,也间接表示了石榴皮、黄芩和精油在抑菌方面存在一定的协同效果,三者的合理搭配能够提高整体配方的抑菌效果,起到较好的预防作用。
试验8、12组与试验1组相比,主要是收敛止血药材(仙鹤草、侧柏叶)比例的减少及变化,进而造成其肠道病变值的明显提高,也在一定程度上影响球虫病出血症状的治疗,说明在球虫病的治疗中仙鹤草、侧柏叶(合适比例)等具有止血功效的中药能够发挥着减少肠道内壁出血、修复肠道的作用。
表8小肠球虫体内试验结果
注:试验1~11组为饲喂实例1~11的中药组合物;试验12~14组为饲喂比例1~3的中药组合物;试验15组为饲喂其他专利(CN104027420A)中的中药组合物。
6.实施例1的中药组合物的制备方法对药材有效成分提取的提升效果
评估实施例1的中药组合物的制备方法对药材有效成分提取的提升作用。为验证实施例1的中药组合物的制备方法相比于实施例5和实施例11的优势,进行活性成分的含量对比。按照其制备方法,制备得到了样品1~3。
收集中药提取液,按照高效液相色谱法,选择比对两种提取方法中没食子酸、黄芩苷的含量,含量计算公式如下(计算过程中,因对照品含量较高(接近100%),故将其认定为1):
样品1~3中没食子酸和黄芩苷检测结果如图8~9及表9~12所示。采用实施例1的复合酶比例优于实施例5,但无显著性差异(p>0.05),二者相比实施例11未采用复合酶解制备的样品,黄芩苷和没食子酸的含量显著提升(p<0.05),能够一定程度增强中药效果。
表9峰结果(没食子酸)
表10峰结果(黄芩苷)
表11没食子酸含量测定(HPLC法)结果
注:a代表样品中没食子酸含量相比于样品3具有显著性差异,p<0.05。
表12黄芩苷含量测定(HPLC法)结果
注:a代表样品中黄芩苷含量相比于样品3具有显著性差异,p<0.05。
7.实施例1中药组合物的制备方法对青蒿药材有效成分提取的提升作用
评估实施例1中药制剂制备方法对青蒿药材有效成分提取的提升作用。为验证实施例1中制备方法相比于实施例9的优势,进行活性成分的比较。按照2种样品的制备方法,进行制备样品。
收集中药提取液,按照薄层色谱法:取青蒿药材粉末8g,加乙醇30mL,超声处理30min,滤过,滤液置水浴上蒸干,残渣加三氯甲烷1mL使溶解,作为对照药材溶液。另取青蒿素对照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液。取待测样品(实施例1或实施例9中制备得到)10mL置水浴上蒸干,残渣加三氯甲烷0.5mL使溶解,作为供试品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验,吸取对照品溶液4μL、对照药材溶液2μL、供试品溶液12μL点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(30℃~60℃)-乙酸乙酯(4:1)为展开剂。展开,取出,晾干,喷以2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,置日光下检视。在与对照品、对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
结果如图10所示显,同样点样量前提下,实施例1中青蒿素斑点强度强于实施例9,说明采用单独提取工艺能够增加青蒿中青蒿素活溶出,为提升抗球虫能力提供理论依据。
8.实施例1中药组合物的制备方法对常山药材有效成分提取的提升作用
评估实施例1中药制剂制备方法对常山药材有效成分提取的提升作用。为验证实施例1中药制剂制备方法相比于实施例10的优势,进行活性成分的比较。按照2种样品的制备方法,进行制备样品。
收集中药提取液,按照薄层色谱法:取常山药材粉末1.5g,加2%盐酸溶液20mL,超声处理30min,滤过,滤液加浓氨试液调pH至10,用三氯甲烷振摇提取3次,每次15mL,合并三氯甲烷层,置水浴上蒸干,残渣加0.5mL甲醇使溶解,作为对照药材溶液。取本品20mL,三氯甲烷萃取2次,每次25mL,滤过,滤液置水浴上蒸干,残渣加三氯甲烷0.5mL使溶解,作为供试品溶液。照薄层色谱法(附录0502)试验,吸取对照药材溶液2μL,供试品溶液0.99μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(9:1:0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。在与对照药材色谱相应的位置上,显1个相同的蓝色荧光斑点。
结果如图11所示,同样点样量前提下,实施例1中斑点强度强于实施例10,说明采用单独提取工艺能够增加常山活性成分的溶出,为提升抗球虫能力提供理论依据。
综上所述,本发明药物组合物对鸡球虫病可达到高效治疗效果。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种中药组合物,由包括以下成分的原料制成:常山、青蒿、鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪、甘草、桉叶油和牛至油。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物由包括以下重量份的原料制成:常山20~50份、青蒿10~50份、鬼箭羽10~30份、苦参3~15份、仙鹤草3~30份、侧柏叶5~30份、石榴皮3~25份、黄芩5~20份、白及5~15份、黄芪15~35份、甘草5~10份、桉叶油0.5~2份和牛至油0.5~2份。
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物由包括以下重量份的原料制成:常山20~40份、青蒿10~30份、鬼箭羽10~20份、苦参8~15份、仙鹤草8~25份、侧柏叶10~30份、石榴皮9~25份、黄芩10~20份、白及6~15份、黄芪20~35份、甘草5~10份、桉叶油0.5~2份和牛至油0.5~2份。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其特征在于,所述组合物还包括硫酸锌、二乙二醇单乙醚和吐温。
5.权利要求4所述的组合物的制备方法,包括以下步骤:
将常山在酸性环境中进行提取,浓缩,得到药液A;
将青蒿在醇溶液中进行提取,浓缩,得到药液B;
将鬼箭羽、苦参、仙鹤草、侧柏叶、石榴皮、黄芩、白及、黄芪和甘草混合,得到混合物;采用复合酶对混合物进行酶解,加热水提,固液分离得药液C和药渣;对药渣进行水提,得到药液D;
将药液A、药液B、药液C和药液D混合,浓缩,得到药液E;
将桉叶油、牛至油、二乙二醇单乙醚、吐温混合得到乳化体系F;
将乳化体系F与药液E混合后,与硫酸锌混合,即得到中药组合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述药液A的制备方法包括:将常山与盐酸按照料液比1:(4~6)混合,40~60℃提取1~4h,浓缩,即得到药液A;和/或,所述药液B的制备方法包括:将青蒿与醇溶液按照料液比1:(7~15)混合,浸泡1~2h,40~60℃提取1~2h,浓缩,即得到药液B。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法,所述复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1~3):(1~4):(1~4);和/或,所述复合酶的添加量为所述混合物质量的1%~5%。
9.权利要求1~4中任一项所述的中药组合物(a)~(g)至少一种中的应用:
(a)制备预防和/或治疗禽球虫病的产品;
(b)制备预防和/或治疗细菌感染的产品;
(c)制备预防和/或治疗禽球虫病所引发的细菌性继发感染的产品;
(d)制备预防和/或治疗禽西红柿粪/血粪的产品;
(e)制备预防和/或治疗禽肠炎的产品;
(f)制备增强家禽机体/肠道免疫力的产品;
(g)畜禽养殖。
10.一种产品,所述产品包括权利要求1~4中任一项所述的中药组合物。
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