CN117969830A - 猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents
猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，所述的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。本发明提供的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，可同时检测血清和乳汁样品，灵敏度高，特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体而言，尤其涉及猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是导致仔猪腹泻主要病原之一，死亡率高，给生猪养殖造成的危害严重。PEDV疫苗在PEDV防控中发挥着重要作用，但不同厂家疫苗和不同动物个体免疫母猪后诱导的抗体水平参差不齐，亟需开发评价免疫效果的抗体检测试剂盒，为母猪分娩前是否需要加强免疫提供科学的参考。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，其可同时检测血清和乳汁样品，灵敏度高，特异性强。
本发明所要解决的技术问题还在于，提供一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒的制备方法，其工艺简单，制造成本低。
本发明所要解决的技术问题还在于，提供一种猪流行性腹泻病毒检测方法，其可同时检测血清和乳汁样品，灵敏度高，特异性强。
为了解决上述问题，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，所述的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照；
其中，所述的抗原包被板为包被有PEDV-S蛋白的酶标板；
所述的样品稀释液为含有2％BSA的1×PBST溶液；
所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液；
所述酶标试剂为羊抗猪IgA酶标抗体；
所述的显色液为TMB单组分溶液；
所述终止液为硫酸溶液。
在一种实施方式中，所述的抗原包被板上PEDV-S蛋白的包被浓度为10μg/mL～15μg/mL。
在一种实施方式中，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.2时，试验成立，结果有效。
为解决上述问题，本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
制备抗原包被板；
分别配制样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液和终止液；
制备阳性对照和阴性对照；
将制备、配置完成的抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照装入检测试剂盒。
为解决上述问题，本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒的检测方法，采用所述的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S1、样品稀释；
S2、将稀释好的待测样品100μL/孔加样，同时设置阴阳性对照孔各2个。
S3、室温条件下避光孵育55min～65min。
S4、将浓缩洗涤液稀释，然后加入稀释后的洗涤液300μL/孔，洗板3次。
S5、每孔加入酶标试剂100μL。
S6、室温条件下避光孵育55min～65min。
S7、将浓缩洗涤液稀释，然后加入稀释后的洗涤液300μL/孔，洗板3次。
S8、每孔加入显色液100μL/孔，37℃避光显色14min～16min
S9、每孔加入100μL终止液，振荡混匀。
S10、单波长测定，设定酶标仪波长为450mm。
在一种实施方式中，待测乳汁用样品稀释液作1：300倍稀释，待测血清用样品稀释液作1：40倍稀释。
在一种实施方式中，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.2时，试验成立，结果有效。
在一种实施方式中，S/P值＝(样品OD450nm值-阴性对照OD450nm平均值)/(阳性对照OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值)。
阳性判定：样本S/P值>0.5判为阳性。
阴性判定：样本S/P值≤0.5判为阴性。
相应地，本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒的检测方法，采用所述的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
以及，所述猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒在猪流行性腹泻病毒的检测中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明提供的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，包括：抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照。其中，所述的抗原包被板为包被有PEDV-S蛋白的酶标板，基于CHO表达的高纯度S全长蛋白为包被原，可有效减少非特异性结合，且包被浓度低。所述的酶标抗体为羊抗猪IgA酶标抗体，采用的间接酶联免疫吸附测定原理，羊抗猪IgA-HRP具有级联效率，灵敏度高。所述样品稀释液采用特定配方制得，可有效减少非特异性结合，阴性样品背景值低。并且，本发明提供的试剂盒可同时检测血清和乳汁样品，灵敏度高，特异性强，与某进口主流商品化试剂盒一致性约95％。
附图说明
图1为不同样品稀释比例样本检测OD值；
图2为不同酶结合物(酶标试剂)加样量内部质控品检测OD值；
图3为不同TMB显色液加液量内部质控品检测OD值；
图4为不同终止液加液量内部质控品检测OD值；
图5为不同反应温度内部质控品检测OD值；
图6为不同样本反应时间内部内质控品检测OD值；
图7为不同酶结合物(酶标试剂)反应时间内部质控品检测OD值；
图8为不同TMB显色液反应时间内部质控品检测OD值；
图9为终止后放置不同时间内部质控品检测OD值；
图10为试剂盒特异性测试结果；
图11为与商品化试剂盒的比较结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1PEDV阴性血清、阳性血清的制备
1.1)制备阴性对照
制备用动物：3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行PEDV、CSFV、FMDV、CSFV、PCV2、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪。
血清制备与分装：对猪进行颈动脉放血致死，血液置于灭菌洁净的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管。
阴性对照制备：将阴性血清用样品稀释液稀释100倍，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。
1.2)制备阳性对照
制备用动物：3日龄的仔猪3头，对应母猪产前7天采血进行PEDV、CSFV、FMDV、CSFV、PCV2、PRRSV、TGEV抗体筛查，挑选全部阴性母猪所产的健康仔猪；
取商品化的PEDV疫苗，按时说明书进行稀释；
对3头猪进行颈部肌肉多点注射重组疫苗1mL，14日后进行二免，方法及剂量与首次相同，二免后每隔7天采血，采用中和法进行血清PEDV抗体检测；
采用中和法测定血清效价，选择PEDV中和抗体不低于1:128的猪用于阳性血清制备；
对满足条件的实验猪进行颈动脉放血，每头猪的血液保存在一个灭菌的三角烧瓶中，将析出的血清转移到离心瓶中，3000r/min离心5分钟，取上清，将上清混匀后0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管；
用样品稀释液将检验合格的阳性血清稀释成1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，各稀释度均用制造的试剂盒进行检测，选择OD450nm值≥1.1的最高稀释倍数，用样品稀释液按该稀释倍数将阳性血清进行稀释，混合均匀，用0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装，1mL/管或3mL/管。
实施例2猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒的制备(以包被原包被浓度为0.6μg/mL为例)
2.1)制备抗原包被板
酶联反应板的来源及标准购自厦门怡美佳酶标板，规格为96孔。包被将抗原用包被缓冲液稀释到0.6μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，37℃湿盒内孵育1.5小时后4℃放置12小时。取出，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置3分钟，拍干。PEDV-S蛋白为实验室自主表达，PEDV S蛋白序列为肇庆大华农生物药品有限公司提供的TPY7毒株扩增获得。
封闭向酶标板内加入封闭液(称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.5mL吐温-20、终浓度为0.01％(m/V)的ProClin300和终浓度为1％(m/V)BSA，溶解后调节pH值到7.2，然后加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装)300μL/孔，37℃湿盒中孵育120分钟。取出弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，300μL/孔，每次静置3分钟。干燥酶标板装架，37℃条件下烘干30分钟。装袋将酶标板、干燥剂装入铝箔袋，真空后密封。
2.2)配制样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液和终止液
2.2.1)配置样品稀释液为含有2％BSA的1×PBST溶液：称取0.27g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、3.58g十二水合磷酸氢二钠、8.0g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加0.05％的吐温-20(V/V)、终浓度为0.1％的防腐剂ProClin300sigma(V/V)和终浓度为2％BSA(m/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
2.2.2)配置浓缩洗涤液为25×PBST溶液：称取6.8g磷酸二氢钾、5g氯化钾、89.5g十二水合磷酸氢二钠、198.7g氯化钠，溶于800mL双蒸水中，添加
1.25％的吐温-20(V/V)和终浓度为0.1％的防腐剂ProClin300(V/V)，加双蒸水至1L，混合均匀，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
2.2.3)配置酶标试剂为羊抗猪IgA酶标抗体：抗体来源购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。用样品稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG进行1：20,000(V/V)稀释，再加入终浓度为0.01g/L的酚红，0.22μm滤膜过滤除菌，定量分装。
2.2.4)显色液为TMB单组分溶液：购自北京索莱宝生物科技有限公司。
2.2.5)终止液：取21.74mL浓硫酸缓缓加到含有178.26mL双蒸水的烧杯中，搅拌混匀后，定量分装。
2.3)试剂用量的确定
2.3.1)样本稀释比例的确定
用样本稀释液将5份厂内质控品(QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2)从原倍开始稀释，通过分析厂内质控品的OD值，选择最佳的样品稀释液和样本的加样量。从图1可以看出，当样本稀释比例>1:40时，灵敏度高，但特异性差；当样本稀释比例<1:40时，特异性好，但灵敏度低。综上所述，为了保证试剂盒的灵敏度，特异性，将样本稀释比例定为1:40，即加入样品稀释液195μl，然后加入样本5μl。
2.3.2)酶标试剂加液量的确定
将HRP标记PEDV抗原按确定浓度制成酶标试剂，以QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2五份内部质控品为研究材料，在加酶标试剂时，分别按40μl/孔、60μl/孔、80μl/孔、100μl/孔、120μl/孔、140μl/孔、160μl/孔、180μl/孔加入酶标试剂，以内部质控品OD值的高低来确定最佳的酶标试剂加液量。从图2可以看出，当酶标试剂加液量>100μl时，灵敏度高，但是特异性不好；当酶标试剂加液量<100μl时，灵敏度低。根据以上分析，同时为了保证产品质量，将酶标试剂加液量定为100μl。
2.3.3)TMB显色液加样量的确定
以QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2五份内部质控品为研究材料，在加TMB显色液时，每孔分别按50μl、100μl、150μl、200μl加入，以内部质控品OD值的高低来确定最佳的TMB显色液加液量，测试结果参照图3。有图4可以看出出，当终止液的加样量为≥90μl时，5份质控品的OD值没有变化，说明加入90μl终止液即可终止反应。为了保证产品质量，同时考虑到操作方便，将终止液的加样量定为100μl。
2.4)反应条件的确定
2.4.1)加样后包被板反应温度的确定
以QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2五份内部质控品为研究材料，分别在4℃、16℃、25℃、37℃进行操作，以内部质控品OD值的高低来确定最佳的反应温度。从图5可以看出，当反应温度为16℃和25℃时，特异性好但灵敏度低；37℃时，灵敏度高，但特异性不好；25℃时，灵敏度高、特异性好，综上所述，将反应温度定为25℃。
2.4.2)样本反应时间的确定
以QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2五份内部质控品为研究材料，参考万泰试剂盒检测方法进行检测，在加样后分别在25℃温育30、40、50、60、70、80分钟，以内部质控品OD值的高低来确定最佳的样本反应时间。从图6可以看出，当样本反应时间<60分钟，特异性好，但灵敏度低；反应时间>60分钟时，灵敏度高，但特异性差。根据以上分析，将样本反应时间定为60分钟。
2.4.3)酶标试剂反应时间的确定
以QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2五份内部质控品为研究材料，在加完酶标试剂后分别在25℃温育30、40、50、60、70、80分钟，以内部质控品OD值的高低来确定最佳的酶标试剂反应时间。从图7可以看出，当酶标试剂反应时间<60分钟后，特异性好，但灵敏度低；反应时间>60分钟时，灵敏度高，但特异性差，根据以上分析，同时为了保证产品质量，将酶标试剂反应时间定为60分钟。
2.4.4)TMB显色液反应时间的确定
以QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2五份内部质控品为研究材料，在加完底物A液和底物B液后分别在25℃温育5、10、15、20、25、30分钟，以内部质控品OD值的高低来确定最佳的TMB显色液反应时间。从图8可以看出，当TMB显色液反应时间≥10分钟后，3份阳性质控品OD值都趋于平缓，同时2份阴性质控品OD值都小于0.1，显示特异性很好。根据以上分析，同时为了保证产品质量，将TMB显色液反应时间定为15分钟。
2.4.5)反应终止后稳定性
以QP1#、QP2#、QP3#、QN1、QN2五份内部质控品为研究材料，在加完终止液后分别在0、5、10、15、20、25分钟读取OD值，以内部质控品OD值的高低来确定反应终止后读值的有效时间。从图9可以看出，当终止后放置时间≥15分钟后，3份阳性质控品OD值开始明显下降，所以为了保证实验结果的准确性，应在终止后15分钟内读值。
4)将制备、配置完成的抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照装入检测试剂盒，检测试剂盒的主要组成如表1所示。
表1检测试剂盒的主要组成
| 主要组成成分 | 规格 | 数量 | 主要组成成分 | 规格 | 数量 |
| 密封包被板 | 96孔 | 5块 | 浓缩洗涤液 | 200mL | 1瓶 |
| 阳性对照 | 5mL | 1瓶 | TMB显色液 | 60mL | 1瓶 |
| 阴性对照 | 5mL | 1瓶 | 终止液 | 50mL | 1瓶 |
| 样品稀释液 | 150mL | 1瓶 | 封板膜 | 张 | 5 |
| 酶标试剂 | 50mL | 1瓶 | 说明书 | 份 | 1 |
实施例3特异性试验
使用建立的ELISA方法最优条件分别检测5份已知的PEDV、PRV、CSFV、PPV、PRRSV阳性血清，并以IDEXX PEDV试剂盒作为对照，分析试剂盒的特异性。检测结果图10显示，除PEDV血清检测为阳性以外，其他病原的阳性血清检测均为阴性，说明该试剂盒的特异性良好，与其它阳性血清无交叉反应。
实施例4重复性试验
取3块同一时间包被的ELISA酶标板进行批内重复试验，在相同条件下检测7份不同样品并对检测结果进行统计学分析。检测结果显示，批内重复试验CV值小于10％，证明该方法在批内具有一定的可重复性。
表2同一时间包被的ELISA酶标板的重复性试验结果
取3块不同时间包被的ELISA酶标板进行批间重复试验，在相同条件下检测7份不同样品并对检测结果进行统计学分析。检测结果显示，批间重复试验CV值小于10％，证明该方法在批间具有一定可重复性。
表3不同时间包被的ELISA酶标板的重复性试验结果
实施例5与商品化试剂盒进行比较
用建立ELISA板检测91份不同抗体效价的血清盒乳汁样品，同时与IDEXX试剂盒的检测结果相对比。检测结果图11显示自研试剂盒与IDEXX试剂盒S/P符合性好，一致系数(R2)为0.924。
综上，本发明构建的猪流行性腹泻抗体检测试剂盒应用于检测猪流行性腹泻疫苗免疫猪或者猪感染猪流行性腹泻后诱导产生的猪流行性腹泻病毒特异性抗体。本发明利用能够稳定表达重组猪流行性腹泻病毒蛋白(S1蛋白)作为包被抗原，建立一种简便、特异的夹心ELISA方法。本发明还为检测猪流行性腹泻病毒抗体提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂盒。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (9)
1.一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照；
其中，所述的抗原包被板为包被有PEDV-S蛋白的酶标板；
所述的样品稀释液为含有2％BSA的1×PBST溶液；
所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液；
所述酶标试剂为羊抗猪IgA酶标抗体；
所述的显色液为TMB单组分溶液；
所述终止液为硫酸溶液。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的抗原包被板上PEDV-S蛋白的包被浓度为10μg/mL～15μg/mL。
3.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒，其特征在于，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.2时，试验成立，结果有效。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备抗原包被板；
分别配制样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体、显色液和终止液；
制备阳性对照和阴性对照；
将制备、配置完成的抗原包被板、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液、阳性对照和阴性对照装入检测试剂盒。
5.一种猪流行性腹泻病毒的检测方法，其特征在于，采用如权利要求1～3任一项所述的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
S1、样品稀释；
S2、将稀释好的待测样品100μL/孔加样，同时设置阴阳性对照孔各2个。
S3、室温条件下避光孵育55min～65min。
S4、将浓缩洗涤液稀释，然后加入稀释后的洗涤液300μL/孔，洗板3次。
S5、每孔加入酶标试剂100μL。
S6、室温条件下避光孵育55min～65min。
S7、将浓缩洗涤液稀释，然后加入稀释后的洗涤液300μL/孔，洗板3次。
S8、每孔加入显色液100μL/孔，37℃避光显色14min～16min
S9、每孔加入100μL终止液，振荡混匀。
S10、单波长测定，设定酶标仪波长为450mm。
6.如权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒的检测方法，其特征在于，待测乳汁用样品稀释液作1：300倍稀释，待测血清用样品稀释液作1：40倍稀释。
7.如权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒的检测方法，其特征在于，阴性对照孔每孔OD450nm读数应<0.2时，试验成立，结果有效。
8.如权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒的检测方法，其特征在于，S/P值＝(样品OD450nm值-阴性对照OD450nm平均值)/(阳性对照OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值)。
阳性判定：样本S/P值>0.5判为阳性。
阴性判定：样本S/P值≤0.5判为阴性。
9.如权利要求1～3任一项所述的猪流行性腹泻病毒IgA抗体检测试剂盒在猪流行性腹泻病毒的检测中的应用。
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