CN117965746A - 位于猪10号染色体上与背膘厚相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记及其应用。所述的位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908位的T插入/缺失。该分子标记是通过全基因组关联分析得到，可显著影响猪100kg体重时背膘厚度的性状。本发明还提供了一种用于鉴定该分子标记的引物对，利用该分子标记和引物对可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于猪背膘厚度性状遗传改良中，从而减少猪背膘厚度，提高企业利润，增加核心竞争力。

Description

位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

猪肉，作为一种重要的蛋白质来源，受到全球消费者的广泛青睐。随着人们生活水平的提高，对瘦肉的偏好日益增加，导致市场上瘦肉的价格普遍高于肥肉。因此，猪的瘦肉率成为影响生猪养殖企业经济效益的一个重要因素。优质瘦肉型猪的选育成为育种工作的重中之重，全球育种目标也逐渐从脂肪型猪向瘦肉型猪转变。研究表明，猪背膘厚与瘦肉率呈显著负相关，因此背膘厚度常被用作猪瘦肉率的重要指标之一。育种工作者因此在尽量不影响猪肉口感的前提下，通过降低猪的背膘厚度来提高瘦肉率。这种对背膘厚的改良也将为生猪企业带来巨大的经济效益。

在过去的几十年里，育种工作者一直努力通过传统的选育方法努力降低猪的背膘厚度。但由于这个性状属于复杂的数量性状，受多基因调控，其改良进展缓慢，耗时较长。传统上，解析猪数量性状遗传机制的常用方法包括候选基因法(Candidate gene approach)和数量性状座位(QTL Mapping)定位法。然而，尽管候选基因法具有方法简单、操作方便等优点，但它只能针对已知生物学功能的基因；QTL定位方法所鉴定的候选位置基因的置信区域同样较大，这极大地限制了复杂性状分子标记在家畜遗传育种中的应用。随着高通量测序技术的发展及全基因组芯片的出现，全基因组关联分析(Genome wide associationstudy，GWAS)逐渐被科研人员发掘，其分析鉴定影响复杂形状的QTL置信区间普遍小于QTL定位方法。GWAS逐渐取代QTL定位成为研究猪经济形状遗传机制的首选方法。

碱基缺失现象是指DNA分子中一个或多个碱基(如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶)丢失的现象。DNA作为生物存储遗传信息的分子，由一系列特定顺序的碱基组成。这种缺失，通常用“del”来表示，缺失有时候会带来严重危害导致生物体功能损失；然而，在某些情况下，可以引入碱基缺失等微小遗传变异来改变生物体的基因组，从而影响物种的生产效率和农业生产效益，进而影响养殖场的盈利。因此，碱基缺失可能在特定基因中引起突变，从而改变生物体的性状，例如生长速度、抗病性、适应性等。

杜洛克猪，作为一种重要的商品猪品种，其生产性能直接影响到养殖场的经济效益。因此，近年来，育种工作者着重改良核心群杜洛克猪的背膘厚度性状，以便将改良优势有效遗传给商品猪后代，增强商品猪的生产竞争力，从而提高养殖场的经济效益。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述SNP分子标记的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴定上述SNP分子标记的引物对。

本发明的第四个目的在于提供上述引物对的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种猪的遗传改良方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记，其SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908位的T插入/缺失；

所述的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中序列中的M为T插入或T缺失，导致猪背膘厚度的差异；

所述的SNP分子标记，其SNP位点为SEQ ID NO:1序列标注位置为185位的T185-185的核苷酸插入/缺失；

所述的SNP分子标记在鉴定猪背膘厚度相关性状和猪遗传育种中的应用；

一种检测猪背膘厚度性状的方法，包含如下步骤：

检测猪10号染色体上上述SNP分子标记，所述分子标记的SNP位点单核苷酸T是否缺失；

所述的猪为杜洛克猪及其合成系；

所述的猪优选为S21系杜洛克猪及其合成系；

一种用于鉴定上述SNP分子标记的引物对，包含引物primer-F和primer-R，其核苷酸序列如下所示：

上游引物primer-F：5’-CCCACCCCATTTCTTCCAGT-3’；

下游引物primer-R：5’-AAGCACCAGTCTCATCCTCC-3’；

一种用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，包含上述引物对；

所述的引物对或试剂盒在鉴定影响种猪背膘厚度性状中的应用；

所述的引物对或试剂盒在猪分子标记辅助育种中的应用；

所述的引物对或试剂盒在降低猪背膘厚度中的应用；

一种筛选低背膘厚度性状的猪品种的方法，包含如下步骤：

检测猪的国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908bp处的基因型，选择第29505908bp处存在T基因型的纯合个体作为种猪；

所述的猪为杜洛克猪及其合成系；

所述的猪优选为S21系杜洛克猪及其合成系；

所述的检测猪的国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908bp处的基因型的方法，包含如下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用上述引物对或上述试剂盒中的引物对作为扩增引物，以上述待测猪的基因组DNA为模板DNA，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)对PCR扩增产物进行测序，得到测序结果；

(4)基于测序结果，确定所述的SNP分子标记的基因型；

一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中种猪的上述SNP分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908bp处存在T基因型的纯合个体作为种猪，淘汰该位点缺失T基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪背膘厚度；

所述的猪为杜洛克猪及其合成系；

所述的猪优选为S21系杜洛克猪及其合成系；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明研究并确定影响猪背膘厚相关的SNP分子标记位于猪的10号染色体上的核苷酸序列上，且该分子标记为单碱基插入/缺失类型的InDel分子标记；本发明验证了其对猪背膘厚性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，并将其应用于降低种猪背膘厚度的遗传改良中，从而提高猪瘦肉率，提高生产效益，提高企业经济利润，增加核心竞争力。并通过优选该SNP的优势等位基因，使其能够逐代增加优势等位基因频率，降低猪背膘厚度，加快猪遗传改良进展，从而有效提高种猪育种的经济效益。

(2)本发明提供一种鉴定上述位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可以建立高效精准的分子标记辅助育种技术。该技术能够快速准确地对性状进行选育改良，加快育种进程，应用这一技术于种猪背膘厚度性状的遗传改良中，将有助于降低猪的背膘厚度，进而提高企业利润，增加核心竞争力。

附图说明

图1是S21系杜洛克猪在10号染色体上关于100kg体重时种猪背膘厚的全基因组关联(GWAS)分析曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型猪在100kg体重时的背膘厚结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种S21系杜洛克种猪3769头，为种猪分公司核心群。

本实验共选取该资源群体S21系杜洛克种猪，猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

背膘厚度测定方法为猪倒数第3～4肋骨间距背中线5cm处背部皮肤至背最长肌膜的垂直距离。具体操作包括：所有S21系杜洛克猪在体重100kg左右(100±5kg)测定猪的体重数据，使用测背膘仪或游标卡尺，在猪的背部选定测量皮肤表面到第六根肋骨下方脂肪层的厚度。测量可以在多个位置进行，最后取平均值作为背膘厚度的结果。

(2)样本采集

收集上述种猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)猪全基因组50K SNP判型

从上述资源群体中选取的3769头S21系杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。经NanoDrop2000/2000C核酸蛋白检测仪检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL Loading Buffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina，美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到38769个SNP的有效基因型数据。

(4)全基因组关联(GWAS)分析

为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R语言GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。采用Bonferrini法确定SNP与背膘厚度性状关联程度的显著性阈值，基因组水平显著阈值为0.05除以有效SNP位点数量，即基因组显著水平阈值为1.29e-6，即0.05/38769(有效SNP数量)；染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量，即染色体显著水平阈值为2.58e-5，即1/38769(有效SNP数量)。

GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在S21系杜洛克猪中，在10号染色体中存在显著影响100kg背膘厚度的位点，最强关联的SNP为g.29505908delT(P值为6.61e-08)。

(5)不同基因型与背膘厚度表型的关联性分析

根据表1可知，分子标记的SNP位点g.29505908delT(SEQ NO:1中第185位核苷酸，即对应于国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908位T插入/缺失)与背膘厚度性状相关，说明此分子标记显著影响猪的背膘厚度性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而提高该群体的背膘厚度，进而加快育种进程。

另外根据表1及图2可知，TT基因型(纯合插入T)的个体的背膘厚度最薄，其中，TT基因型的个体背膘厚度表型平均值比-T基因型(缺失一个T)的个体背膘厚度表型平均值小0.06，比--基因型(纯合缺失T)的个体背膘厚度表型平均值小0.49。因此，在育种中逐步保留未缺失T基因型的纯合个体作为种猪，以逐代增加该位点的等位基因T的频率，可以显著降低猪背膘厚度，为养殖企业带来更多的经济效益。

表1分子标记的SNP位点g.29505908 delT与瘦肉率的相关性分析

注：①-表示T缺失；②总样品数为3769头，其中32个样品没有基因型数据。

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的10号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物。设计的引物的DNA序列如下所示：

上游引物primer-F：5’-CCCACCCCATTTCTTCCAGT-3’；

下游引物primer-R：5’-AAGCACCAGTCTCATCCTCC-3’；

(2)PCR扩增

配置10μL体系，其中DNA样品1μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，PCR mix 5μL，ddH₂O 3.4μL，PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后延伸为72℃5min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的SNP位点效应分析

本发明提供一个能显著降低杜洛克种猪背膘厚并提高杜洛克种猪瘦肉率SNP分子标记。使用该SNP分子标记进行标记辅助选择，能够极大地加快杜洛克种猪的背膘厚度育种进程。若本发明将影响猪背膘厚性状的分子标记位置的个体全部选育成纯合保留T基因型的个体，则能降低猪背膘厚，提高群体的瘦肉率，从而有效提高种猪育种的经济效益。由此可见，降低背膘厚度为养猪产业提供收益的潜力是巨大的。本SNP分子标记个体中，通过保留加系杜洛克该SNP的优势等位基因(T)，可最终实现提高商品猪的经济效益，从而增加企业的收益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种位于猪10号染色体上与背膘厚相关的SNP分子标记，其特征在于其SNP位点对应于国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908位的T插入/缺失；

所述的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中序列中的M为T插入或T缺失，导致猪背膘厚度的差异。

2.权利要求1所述的SNP分子标记在鉴定猪背膘厚度相关性状和猪遗传育种中的应用。

3.一种检测猪背膘厚度性状的方法，其特征在于包含如下步骤：

检测猪10号染色体上权利要求1所述的SNP分子标记，所述分子标记的SNP位点单核苷酸T是否缺失。

4.一种用于鉴定权利要求1所述的SNP分子标记的引物对，其特征在于包含引物primer-F和primer-R，其核苷酸序列如下所示：

上游引物primer-F：5’-CCCACCCCATTTCTTCCAGT-3’；

下游引物primer-R：5’-AAGCACCAGTCTCATCCTCC-3’。

5.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于包含权利要求4所述的引物对。

6.权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在鉴定影响种猪背膘厚度性状中的应用。

7.权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在猪分子标记辅助育种中的应用。

8.权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的试剂盒在降低猪背膘厚度中的应用。

9.一种猪的遗传改良的方法，其特征在于包含如下步骤：

确定种猪核心群中种猪的权利要求1所述的SNP分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第29505908bp处存在T基因型的纯合个体作为种猪，淘汰该位点缺失T基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪背膘厚度。

10.根据权利要求9所述的猪的遗传改良的方法，其特征在于：

所述的猪为杜洛克猪及其合成系。